CN113480528A - 一种专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂及其制备方法，属于光敏剂技术领域，该咪唑类光敏剂通过在咪唑的2,5位分别引入吸电(Acceptor)的吡啶鎓盐和供电(Donor)的三苯胺形成D‑A结构，增强分子内电荷转移效应并降低分子轨道HOMO‑LUMO能隙，促进了荧光发射波长红移和1O2敏化效率的显著提升，同时对线粒体具有专一靶向性，有效解决了现有技术中存在的1O2敏化效率效率值低、荧光发射波长短和荧光成像对比度低等问题。

Description

一种专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂及 其制备方法
技术领域
本发明涉及光敏剂技术领域，具体涉及到一种专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂及其制备方法。
背景技术
在各种成像技术中，荧光成像凭借其低成本、极好的灵敏度、出色的时间分辨率和良好的再现性已被公认为是一种无创和强大的成像技术。此外，光动力治疗(PDT)作为一种具有高时空精度的微创和可靠的肿瘤治疗方式，通过在光照辐照下激活光敏剂产生细胞毒性活性氧(ROS)以诱导细胞死亡，受到科研人员和医学工作者的广泛关注。相比于传统的化学治疗方式而言，PDT可以有效地避免细胞对药物产生的耐药性，并且由于光照辐射的可控性可以最大程度减轻副作用。
线粒体作为一种重要的细胞器，不仅是真核细胞的能量来源，而且在信号传导、细胞生长和死亡以及细胞分化过程中扮演着重要的角色，其功能障碍与肿瘤的发生和进程有着多方面的密切关联。线粒体是单线态氧(1O2)的首要作用位点，在PDT治疗中能诱导细胞的早期凋亡而更为敏感。基于此，靶向线粒体已成为提高PDT治疗效率的新策略。近年来，一系列具有线粒体靶向性的光敏剂被相继合成并应用于生物成像和光动力治疗的研究中。然而，已报道的光敏剂面临着荧光发射波长较短或具有相对低的1O2敏化效率值，限制了它们在PDT领域的进一步应用。因此，开发具有显著增强的1O2敏化效率和更长荧光发射的新型线粒体靶向光敏剂具有重要的价值。
发明内容
针对上述不足，本发明的目的是提供一种专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂及其制备方法，可有效解决现有技术中存在的1O2敏化效率效率值低、荧光发射波长短和荧光成像对比度低等问题，同时该咪唑类光敏剂对线粒体具有专一靶向性。
为达上述目的，本发明采取如下的技术方案：
本发明提供一种专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂，其结构通式如下所示：
Figure BDA0003214285340000021
其中，R1为甲基、取代芳基或苄基；R2为甲基或羟乙基；X-为BF4 -或PF6 -。
进一步地，取代芳基为被一个或多个R1a取代的苯环；其中，R1a为C1～C10烷基、C1～C10烷氧基或卤素。
本发明中的咪唑类光敏剂通过在咪唑的2,5位分别引入吸电(Acceptor)的吡啶鎓盐和供电(Donor)的三苯胺形成D-A(Donor-Acceptor)结构，增强分子内电荷转移效应并降低分子轨道HOMO-LUMO能隙，促进了荧光发射波长红移和1O2敏化效率的显著提升，同时对线粒体具有专一靶向性。
本发明还提供上述专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤(1)：将2,5-(杂)芳基取代咪唑、4-甲基吡啶盐、添加剂和溶剂加入反应器中，惰性气体保护下，于-40～90℃温度下搅拌反应0.1～240小时，冷却至室温，然后对反应体系进行分离纯化，制得咪唑类光敏剂前体；其中，2,5-(杂)芳基取代咪唑:4-甲基吡啶盐:添加剂的摩尔比为1:(0.001～50):(0.001～100)；
步骤(2)：将步骤(1)所得的咪唑类光敏剂前体、四氟硼酸盐或六氟磷酸盐和溶剂加入反应器中，于-40～40℃温度下搅拌0.1～120小时，冷却至室温，然后对反应体系进行分离纯化，制得专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂；其中，咪唑类光敏剂前体:四氟硼酸酸盐或六氟磷酸盐的摩尔比为1:(1～100)；
2,5-(杂)芳基取代咪唑的结构通式如下所示：
Figure BDA0003214285340000031
R1为甲基、取代芳基或苄基；
5-甲基吡啶盐的结构通式如下所示：
Figure BDA0003214285340000032
R2为甲基或羟乙基，X’-为阴离子；
咪唑类光敏剂前体的结构通式如下所示：
Figure BDA0003214285340000033
R1为甲基、取代芳基或苄基，R2为甲基或羟乙基，X’-为阴离子。
进一步地，步骤(1)中2,5-(杂)芳基取代咪唑:4-甲基吡啶盐:添加剂的摩尔比为1:(1～10):(1～100)，优选为1:(1～5):(20～50)。
进一步地，咪唑类光敏剂前体:四氟硼酸酸盐或六氟磷酸盐的摩尔比为1:(1～50)，优选为1:(1～10)。
进一步地，步骤(1)中反应温度为-10～75℃，优选为50～75℃；反应时间为1～10小时。
进一步地，步骤(2)中反应温度为10～40℃，优选为25～30℃；反应时间为1～48小时。
进一步地，步骤(1)中添加剂为三乙胺、二异丙基胺、环己二胺、六(亚甲基)四胺、四甲基二乙胺、二甲基二乙胺、吡啶和哌啶中的至少一种。
进一步地，步骤(2)中四氟硼酸盐为四氟硼酸钠、四氟硼酸钾、四氟硼酸铵或四氟硼酸银；六氟磷酸盐为六氟磷酸钠、六氟磷酸钾、六氟磷酸铵或六氟磷酸银。
进一步地，步骤(1)和(2)中溶剂均为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、二甲基亚砜、苯、邻二氯苯、氯苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯、环己烷、石油醚、叔戊醇、1,4-二氧六环、1,2-二氯乙烷、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺中的至少一种。
进一步地，步骤(1)中2,5-(杂)芳基取代咪唑的反应浓度为0.01～10mol/L，4-甲基吡啶盐的反应浓度为0.001～10mol/L。
进一步地，步骤(2)中咪唑类光敏剂前体的反应浓度为0.001～10mol/L。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、本发明提供了一种专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂，通过在咪唑的2,5位分别引入吸电(Acceptor)的吡啶鎓盐和供电(Donor)的三苯胺形成D-A(Donor-Acceptor)结构，增强分子内电荷转移效应并降低分子轨道HOMO-LUMO能隙，促进了荧光发射波长红移和1O2敏化效率的显著提升，同时对线粒体具有专一靶向性，有效解决了现有技术中存在的1O2敏化效率效率值低、荧光发射波长短和荧光成像对比度低等问题。
2、与现有专一靶向线粒体的光敏剂相比，本发明中的咪唑类光敏剂，性能更加优异，具体体现为：
(1)斯托克斯位移大，在溶剂中的荧光发射波长可以达到650nm以上，有效地减少了荧光染料的自吸收，提高荧光成像的分辨率；
(2)分子轨道HOMO-LUMO能隙小，其水溶液(含1‰的DMSO)在白光照射下能高效产生1O2；
(3)光稳定性比大多数市售线粒体荧光靶向试剂好，在长时间氙灯照射下荧光发射强度无显著降低；
(4)在HeLa细胞中能专一靶向线粒体，并在白光照射下对HeLa细胞实现“影像导航”的高效光动力杀伤效果。
3、本发明提供的专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的制备方法具有操作简单、原料廉价易得和产物收率高等特点，具有实际的应用价值。
附图说明
图1为本发明专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的合成步骤图；
图2为本发明实施例1所合成咪唑类光敏剂TITPy的分子结构和核磁氢谱；
图3为本发明所合成TITPy的水溶液(含1‰的DMSO)在白光照射下的1O2敏化效率测试曲线；
图4为本发明所合成的TITPy、市售线粒体染色剂MitoTracker Green FM在HeLa细胞中的共定位荧光共聚焦成像图；
图5为黑暗条件下不同浓度TITPy水溶液处理后HeLa细胞的存活率柱状图；
图6为白光照射下不同浓度TITPy水溶液处理后HeLa细胞的存活率柱状图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本例提供一种专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂(TITPy)的合成，如图1所示，具体包括以下步骤：
(1)向干燥的反应器中加入2,5-(杂)芳基取代咪唑1(87mg，0.2mmol，R1为甲基)、N-甲基吡啶碘盐(48mg，0.2mmol)、四氢呋喃(2mL)和甲醇(6mL)，哌啶(3drops，10mmol)，氮气保护下在75℃条件下回流6小时；冷至室温，加入10mL二氯甲烷稀释，再经硅藻土过滤并用10～20mL的二氯甲烷洗涤，减压移去溶剂，剩余物用中性氧化铝柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1,v/v)分离纯化，真空干燥后得深红色咪唑类光敏剂前体2(75％yield)；
(2)向干燥的反应器中加入咪唑类光敏剂前体2(65mg，0.1mmol)、四氟硼酸铵(105mg，1mmol)、二氯甲烷(6mL)和甲醇(10mL)，空气条件下室温搅拌24小时；加入10mL二氯甲烷稀释，再经硅藻土过滤并用10～20mL的二氯甲烷洗涤，减压移去溶剂，剩余物用中性氧化铝柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1,v/v)分离纯化，真空干燥后得深红色固体目标产物-专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂TITPy(91％yield)。
本例还对咪唑类光敏剂前体2和目标产物-TITPy进行表征，TITPy核磁图谱如图2所示，通过核磁共振氢谱(1H NMR)、碳谱(13C NMR)、氟谱(19F NMR)以及高分辨质谱证实了本发明中咪唑类光敏剂的结构。检测所用仪器为：Bruker AV II-400MHz型核磁共振仪，其中TMS为内标，溶剂CDCl3和DMSO-d6为氘代溶剂；Waters-Q-TOF-Premier(ESI)型高分辨质谱仪。
咪唑类光敏剂前体2的表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝8.82(d,J＝6.8Hz,2H),8.24-8.18(m,3H),7.58-7.55(q,J＝4.0Hz,J＝9.6Hz,2H),7.42(d,J＝8.4Hz,2H),7.37-7.33(m,4H),7.26-7.22(m,1H),7.16(s,1H),7.12-7.08(m,6H),7.06-7.04(d,J＝8.8Hz,2H),4.23(s,3H),3.83(s,3H)ppm.13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ＝152.1,147.2,146.8,144.9,142.0,140.1,136.9,136.0,133.4,132.8,129.7,129.5,127.8,126.0,124.5,123.7,123.1,122.5,122.4,122.3,46.8,33.7ppm.HRMS(ESI+):计算值C34H29N4S[M]+525.2107,实测值525.2114。
目标产物-TITPy的表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝8.82(d,J＝6.8Hz,2H),8.23-8.17(m,3H),7.58-7.54(q,J＝4.0Hz,J＝12Hz,2H),7.42(d,J＝8.8Hz,2H),7.37-7.33(m,4H),7.26-7.21(m,1H),7.16(s,1H),7.12-7.08(m,6H),7.06-7.04(d,J＝8.4Hz,2H),4.23(s,3H),3.83(s,3H)ppm(如附图2).19F NMR(100MHz,CDCl3):δ＝-148.2,-148.3ppm.HRMS(ESI+):计算值C34H29N4S[M]+525.2107,实测值525.2111。
实施例2
本例提供一种专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的合成，与实施例1的区别仅在于：将2,5-(杂)芳基取代咪唑1中R1由甲基替换为苄基，N-甲基吡啶碘盐替换为N-羟乙基吡啶碘盐，其余步骤及参数均相同。
本例最终制得的目标产物-专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的收率为89％。
实施例3
本例提供一种专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的合成，与实施例1的区别仅在于：将四氟硼酸铵替换为六氟磷酸钾，其余步骤及参数均相同。
本例最终制得的目标产物-专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的收率为92％。
实施例4
本例提供一种专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的合成，与实施例1的区别仅在于：将2,5-(杂)芳基取代咪唑1中R1由甲基替换为
Figure BDA0003214285340000081
(
Figure BDA0003214285340000082
代表为与2,5-(杂)芳基取代咪唑1中N原子的化学键连接)，其余步骤及参数均相同。
本例最终制得的目标产物-专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的收率为85％。
实施例5
本例提供一种专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的合成，与实施例1的区别仅在于：将2,5-(杂)芳基取代咪唑1中R1由甲基替换为
Figure BDA0003214285340000083
(
Figure BDA0003214285340000084
代表为与2,5-(杂)芳基取代咪唑1中N原子的化学键连接)，其余步骤及参数均相同。
本例最终制得的目标产物-专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的收率为83％。
实施例6
本例提供一种专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的合成，与实施例1的区别仅在于：步骤(1)中2,5-(杂)芳基取代咪唑1的用量不变，调整2,5-(杂)芳基取代咪唑1:4-甲基吡啶盐:添加剂的摩尔比为1:10:100；步骤(2)中咪唑类光敏剂前体2的用量不变，调整咪唑类光敏剂前体2:四氟硼酸铵1:100，其余步骤及参数均相同。
本例最终制得的目标产物-专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的收率为88％。
实施例7：咪唑类光敏剂TITPy的水溶液(含1‰的DMSO)在白光照射下的1O2敏化效率测试
取2μL光敏剂TITPy(实施例1制得)的DMSO溶液(5mM)和10μL指示剂ABDA的DMSO溶液(10mM)溶于2mL水溶液并加入比色皿中，然后在5mW cm-2的白光灯下以20s的间隔照射溶液，测定溶液紫外吸收光谱的变化(如附图3，图3中曲线从上至下依次代表为0～3min所得的测试结果)。实验结果可以看出，光照后ABDA在416nm的吸光度迅速降低，说明TITPy的水溶液在白光照射下能高效产生1O2。
实施例8：光敏剂TITPy和市售线粒体染色剂MitoTracker Green FM在HeLa细胞中的共定位荧光共聚焦成像
首先，向含有10％胎牛血清的DMEM(H)培养基中通入5％CO2，将HeLa细胞于37℃下培养24小时。将培养基去除，首先加入光敏剂TITPy(10μM，实施例1制得)后孵育30分钟，然后加入市售线粒体染色剂MitoTracker Green FM(100nM)继续培养30分钟。待培养结束后，取出培养玻底皿，用磷酸盐缓冲液清洗2～3次后，将培养玻底皿经荧光共聚焦显微镜成像(如附图4)。实验结果可以看出，光敏剂TITPy在线粒体内的荧光成像和市售线粒体染色剂MitoTracker Green FM染料基本重叠，皮尔森相关系数(Pearson’s correlationcoefficient；Rr)达到95％，说明光敏剂TITPy具有优异的线粒体示踪效果，能专一靶向HeLa细胞内的线粒体。
实施例9：咪唑类光敏剂TITPy的生物相容性(暗毒性)测试
将HeLa细胞在96孔板中(5×103个/孔)孵育24h使其贴壁。随后，去除原培养基，加入含有不同浓度梯度实施例1制得的TITPy(0、1、2.5、5、7.5、10μM)的新鲜培养基并继续孵育24h。随后，用PBS洗涤细胞两次后用CCK-8检测细胞的存活率(如图5)。实验结果可以看出，随着TITPy浓度的梯度增加，HeLa细胞没有明显的死亡，表明在该浓度范围内TITPy的暗毒性很低，表现出很好的生物相容性。
实施例10：咪唑类光敏剂TITPy的细胞相容性(暗毒性)测试
将HeLa细胞在96孔板中(5×103个/孔)孵育24h使其贴壁。随后，去除原培养基，加入含有不同浓度梯度实施例1制得的TITPy(0、1、2.5、5、7.5、10μM)的新鲜培养基并继续孵育24h。随后，用PBS洗涤细胞两次，加入新鲜培养基并用白光灯以5mW/cm2的功率照射细胞30min。激光照射后的细胞在细胞培养箱中继续孵育4h后用CCK-8检测HeLa细胞的存活率(如图6)。实验结果可以看出，随着TITPy浓度的梯度增加，HeLa细胞的存活率呈梯度下降，表明TITPy的光毒性随浓度提高而逐渐增加。
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本领域的技术人员不经创造性劳动即对所描述的具体实施例做的修改或补充或采用类似的方式替代仍属本专利的保护范围。

Claims (9)

1.一种专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂，其特征在于，其结构通式如下所示：
Figure FDA0003214285330000011
其中，R1为甲基、取代芳基或苄基；R2为甲基或羟乙基；X-为BF4 -或PF6 -。
2.如权利要求1所述的专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂，其特征在于，所述取代芳基为被一个或多个R1a取代的苯环；其中，R1a为C1～C10烷基、C1～C10烷氧基或卤素。
3.权利要求1或2所述的专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤(1)：将2,5-(杂)芳基取代咪唑、4-甲基吡啶盐、添加剂和溶剂加入反应器中，惰性气体保护下，于-40～90℃温度下搅拌反应0.1～240小时，冷却至室温，然后对反应体系进行分离纯化，制得咪唑类光敏剂前体；其中，2,5-(杂)芳基取代咪唑:4-甲基吡啶盐:添加剂的摩尔比为1:(0.001～50):(0.001～100)；
步骤(2)：将步骤(1)所得的咪唑类光敏剂前体、四氟硼酸盐或六氟磷酸盐和溶剂加入反应器中，于-40～40℃温度下搅拌0.1～120小时，冷却至室温，然后对反应体系进行分离纯化，制得专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂；其中，咪唑类光敏剂前体:四氟硼酸酸盐或六氟磷酸盐的摩尔比为1:(1～100)；
2,5-(杂)芳基取代咪唑的结构通式如下所示：
Figure FDA0003214285330000021
R1为甲基、取代芳基或苄基；
4-甲基吡啶盐的结构通式如下所示：
Figure FDA0003214285330000022
R2为甲基或羟乙基，X’-为阴离子；
咪唑类光敏剂前体的结构通式如下所示：
Figure FDA0003214285330000023
R1为甲基、取代芳基或苄基，R2为甲基或羟乙基，X’-为阴离子。
4.如权利要求3所述的专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的制备方法，其特征在于，所述2,5-(杂)芳基取代咪唑:4-甲基吡啶盐:添加剂的摩尔比为1:(1～10):(1～100)。
5.如权利要求3所述的专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的制备方法，其特征在于，所述咪唑类光敏剂前体:四氟硼酸酸盐或六氟磷酸盐的摩尔比为1:(1～50)。
6.如权利要求3-5任一项所述的专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的制备方法，其特征在于，所述添加剂为三乙胺、二异丙基胺、环己二胺、六(亚甲基)四胺、四甲基二乙胺、二甲基二乙胺、吡啶和哌啶中的至少一种。
7.如权利要求3-5任一项所述的专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的制备方法，其特征在于，所述四氟硼酸盐为四氟硼酸钠、四氟硼酸钾、四氟硼酸铵或四氟硼酸银；所述六氟磷酸盐为六氟磷酸钠、六氟磷酸钾、六氟磷酸铵或六氟磷酸银。
8.如权利要求3所述的专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和(2)中溶剂均为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、二甲基亚砜、苯、邻二氯苯、氯苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯、环己烷、石油醚、叔戊醇、1,4-二氧六环、1,2-二氯乙烷、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺中的至少一种。
9.如权利要求3所述的专一靶向线粒体且高效产生单线态氧的咪唑类光敏剂的制备方法，其特征在于，所述2,5-(杂)芳基取代咪唑的反应浓度为0.01～10mol/L，所述4-甲基吡啶盐的反应浓度为0.001～10mol/L，所述咪唑类光敏剂前体的反应浓度为0.001～10mol/L。
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