CN113461623A - 一种抗病毒化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗病毒化合物及其制备方法和应用，所述抗病毒化合物的结构式为：

本发明首次合成了一种具有优异抗病毒活性的吩嗪‑1‑羧酸酰胺类衍生物：N‑(1‑苯乙基)吩嗪‑1‑甲酰胺，并且验证了该化合物可有效抑制禽传染性支气管炎病毒在Vero细胞中的增殖和复制，同时对Vero细胞表现出较低的细胞毒性，因此可将该化合物用于制备治疗和/或预防抗冠状病毒药物，具体为抗禽传染性支气管炎病毒药物，其所需剂量低，制备方法简单，可有效降低了生产使用成本，为有效预防和/或治疗禽传染性支气管炎病毒所引发的疾病提供了新的途径和选择，也为抗其他冠状病毒药物的研发和使用提供借鉴。

Description

一种抗病毒化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种抗病毒化合物及其制备方法和应用。

背景技术

禽传染性支气管炎(IB)是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的禽类的一种急性、高度接触性呼吸道传染病，过热、严寒、拥挤、通风不好及维生素、矿物质供应不足均可促使本病发生，该病具有传染性强、传播快、潜伏期短、发病率高，病死率高等特性。IBV属于冠状病毒属的一个代表种，是冠状病毒科中的一种γ-冠状病毒，其主要传播方式是病鸟从呼吸道排出病毒，经空气飞沫传染给易感鸟，此外可通过被污染的饲料、饮水、笼具等经消化道传染。而针对IBV所引起的疾病，目前普遍采取的防控方式是接种疫苗以及中药喂服，然而由于IBV具有丰富的遗传多样性，导致疫苗免疫失败或防效不佳，而中药喂服的方式往往采用的剂量比较大，目前尚无安全高效的抗IBV药物。

吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylic acid,PCA)是一种重要的含氮杂环化合物,广泛存在于许多微生物的代谢物中,如链霉菌Streptomyces、假单胞菌Pseudomonads等。20世纪50年代，科学家从微生物Streptomyces chromogenus sp.代谢物中分离得到吩嗪-1-羧酸，发现其具有抗结核菌、抑制海藻生长等活性，从而受到了极大的关注。目前关于吩嗪-1-羧酸及其衍生物的研究主要集中在农用杀菌剂中，对于抗肿瘤抗病毒活性的研究相对较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗病毒化合物及其制备方法和应用，本发明合成了吩嗪-1-羧酸酰胺类衍生物，具体为N-(1-苯乙基)吩嗪-1-甲酰胺，研究发现该化合物可有效抑制禽传染性支气管炎病毒在非洲绿猴肾细胞(Vero)中复制，并在Vero细胞中表现出较低的细胞毒性，为有效预防和/或治疗禽传染性支气管炎病毒所引发的疾病提供了新的途径和选择，也为抗其他冠状病毒药物的研发和使用提供了借鉴。

本发明的目的之一在于提供一种抗病毒化合物，所述化合物的结构式为：

本发明的目的之二在于提供了一种药物组合物，所述药物组合物中包括上述抗病毒化合物。

进一步地，所述药物组合物中还包括：药剂学上可接受的辅料。

本发明的目的之三在于提供了所述抗病毒化合物和/或所述药物组合物在制备治疗和/或预防抗冠状病毒药物中的应用。

进一步地，所述冠状病毒选自禽传染性支气管炎病毒。

进一步地，所述抗病毒化合物的浓度不高于40.26μg/mL。

进一步地，所述抗病毒化合物的浓度为4.01～20μg/mL。

本发明的目的之四在于提供了所述抗病毒化合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1、将吩嗪-1-羧酸溶解于二氯甲烷中，加入DMF作催化剂，将反应液降温至0～5℃；

步骤2、缓慢加入草酰氯，反应6～10小时，得到吩嗪-1-甲酰氯；

步骤3、称取1-苯基乙胺溶解于二氯甲烷中，同时加入三乙胺作缚酸剂，将反应液降温至0-5℃，滴加溶解有上述吩嗪-1-甲酰氯的二氯甲烷溶液，0～5℃反应1～3h后，加热回流反应至反应完全；

步骤4、分液，有机层用稀盐酸清洗，分出有机层后脱溶剂得粗品，粗品经重结晶，抽滤，烘干得黄色固体，即为所述抗病毒化合物。

进一步地，所述吩嗪-1-羧酸、DMF和草酰氯的摩尔浓度比为100：1：150。

进一步地，所述吩嗪-1-甲酰氯和1-苯基乙胺的摩尔浓度比为1：1.1。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首次合成了一种具有优异抗病毒活性的吩嗪-1-羧酸酰胺类衍生物：N-(1-苯乙基)吩嗪-1-甲酰胺，并且验证了该化合物可有效抑制禽传染性支气管炎病毒(IBV)在非洲绿猴肾细胞(Vero)中的增殖和复制，同时还在Vero细胞中表现出较低的细胞毒性，因此可将该化合物用于制备治疗和/或预防抗冠状病毒药物，具体为抗禽传染性支气管炎病毒药物，其制备方法简单快速，并且所需剂量低，从而有效降低了生产使用成本，为有效预防和/或治疗禽传染性支气管炎病毒所引发的疾病提供了新的途径和选择，也为抗其他冠状病毒药物的研发和使用提供借鉴。

附图说明

图1为本发明实施例1中式I化合物的合成路线图；

图2为本发明实施例2中不同浓度的式I化合物对Vero细胞的抑制率；

图3为本发明实施例2中不同浓度的式I化合物处理预感染IBV-3ab-Luc的Vero细胞的荧光值检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1抗病毒化合物制备

所述抗病毒化合物的合成路线图如图1所示，制备方法具体如下：

步骤1、于100mL单口瓶中，加入吩嗪-1-羧酸(10mmol)和50mL二氯甲烷，同时加入DMF(0.1mmol)作催化剂，室温搅拌使固体完全溶解，冰浴降温至0-5℃。

步骤2、向上述反应液中缓慢加入草酰氯(15mmol)，待反应液稳定后，加热回流反应8小时，于旋蒸仪上将溶剂脱干，制得吩嗪-1-甲酰氯备用；

步骤3、准确称取1-苯基乙胺(11mmol)置于100mL三口瓶中，加入30mL二氯甲烷使其完全溶解，同时加入1.1g三乙胺(11.0mol)作缚酸剂；将反应液在冰浴条件下降温至0-5℃，滴加溶解有上述制得的吩嗪-1-甲酰氯(10mmol)的二氯甲烷溶液30ml，控制滴加速度，滴加完毕后，保温0～5℃反应2h后，撤去冰浴继续加热回流反应2h，点板监测，直至反应完全。

步骤4、分液，有机层用50ml稀盐酸(1N)水洗两遍，分出有机层，脱溶剂得粗品，用乙酸乙酯和二氯甲烷(体积比1:1)进行重结晶，抽滤，烘干得黄色固体。

合成得到的化合物的产率、熔点、核磁共振和高分辨质谱数据为：Yellow solidin 91％yield；m.p.161.6–163.7℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ11.56(d,J＝6.8Hz,1H),9.02(dd,J＝7.2,1.6Hz,1H),8.40(dd,J＝8.8,1.6Hz,1H),8.25–8.33(m,1H),8.07–8.14(m,1H),7.90–8.01(m,3H),7.61(d,J＝7.6Hz,2H),7.45(t,J＝7.6Hz,2H),7.34(t,J＝7.6Hz,1H),5.45–5.64(m,1H),1.80(d,J＝6.8Hz,3H).HRESIMS:m/z 328.1438[M+H]+(calcd forC₂₁H₁₈N₃O,328.1444).

其结构式如式I化合物所示：

与式I化合物同时合成的还有下述式II和式III两种化合物，结构式如下：

实施例2化合物毒性初筛和抗病毒活性检测

1、毒性初筛

测定实施例1制备得到的式I、式II和式III化合物的细胞毒性，具体为：

DMSO溶解三种化合物，使其浓度为10mg/mL，超声波震荡1min，使化合物充分溶解，常温密封保存备用。将复苏后传代3次的非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)从T75细胞培养瓶接种到12孔细胞培养板培养，每孔约接种细胞5×10⁴个，37℃，5％CO₂恒温培养至长满板底50％时加入三种化合物，每种化合物以10μg/mL浓度处理，另设一个DMSO空白对照组，37℃，5％CO₂恒温培养至对照组细胞镜检下长满板底时停止处理。真空泵吸干每孔中的上清液，用2mL PBS小心清洗3次，每孔加入500μL 0.25％Trypsin-EDTA浸润10秒后吸出，室温消化1min，加入1mL含0.1％台盼蓝的PBS重悬细胞，转移至1.5mL离心管中，倒置显微镜下血球计数板细胞计数，并记录数据(蓝色细胞不记入其中)。

根据统计，其中空白对照组DMSO细胞计数为1.52×10⁶个，式I化合物处理组细胞计数为1.87×10⁶个，式II化合物处理组细胞计数为0.36×10⁶个，式III化合物处理组细胞计数为0.5×10⁶个。结果显示，除式I化合物外，其余两种化合物在10μg/mL处理浓度下，对Vero细胞有较大毒性，故选用式I化合物进行后续抗病毒试验。

2、式I化合物对Vero细胞IC₅₀值的测定

确定式I化合物对细胞的最高无毒浓度并计算IC₅₀值，具体方法如下：

将式I化合物粉末用DMSO分别配成200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL系列梯度浓度。6孔细胞培养板每孔加入约4×10⁵个Vero细胞(培养液：90％DMEMbasic+10％FBS)，待孔内细胞长至一半左右时加入药剂处理。空白对照组为Vero细胞中加等体积的DMSO的培养液，另设本底对照：培养液+MTT(噻唑蓝)、无细胞。每组3次重复。待对照组细胞长至90％左右时，用MTT法检测，酶标仪570nm处测量每孔OD值，统计并计算重复孔的OD值平均数，并根据OD值计算细胞存活率：(药品处理OD值-本底对照OD值)/(对照组OD值-本底对照OD值)。

不同浓度的式I化合物对细胞的相对抑制率如图2所示，结果表明，式I化合物对于Vero细胞的IC₅₀值为40.26μg/mL。

3、抗病毒活性检测

验证所述式I化合物对IBV病毒的抗病毒活性，具体操作步骤如下：

取6孔细胞培养板每孔加入约4×10⁵个Vero细胞(培养液：90％DMEM basic+10％FBS)，待孔内细胞长至90％左右时，更换无FBS的培养基，实验组每孔加入感染复数MOI＝1的IBV-3ab-Luc(即带有Luciferase标签的IBV病毒)感染2h后再次弃上清液，更换无FBS的培养基，分别加入5种不同浓度的式I化合物DMSO溶液：以式I化合物对Vero细胞IC₅₀值的一半为最大处理浓度，倍比稀释成5个浓度梯度：20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL。同时设置对照组：将式I化合物DMSO溶液替换为等体积DMSO溶液外，其余处理相同。每组设3次重复。另设一组不加IBV-3ab-Luc病毒，只含有Vero细胞及20μg/mL的式I化合物DMSO溶液的空白组。感染16h后弃上清，Promega E1500 Luciferase Assay System检测细胞内的荧光素酶的酶活，并计算EC₅₀值

不同浓度的式I化合物处理预感染IBV-3ab-Luc的Vero细胞的荧光值如图3所示，结果显示，大于5μg/mL的式I化合物均可显著抑制IBV病毒，经计算其对于禽传染性支气管炎病毒的EC₅₀值为4.01μg/mL。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗病毒化合物，其特征在于，所述抗病毒化合物的结构式为：

2.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包括如权利要求1所述的抗病毒化合物。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中还包括：药剂学上可接受的辅料。

4.如权利要求1所述的抗病毒化合物和/或权利要求2-3任一项所述的药物组合物在制备治疗和/或预防抗冠状病毒药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒选自禽传染性支气管炎病毒。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗病毒化合物的浓度不高于40.26μg/mL。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗病毒化合物的浓度为4.01～20μg/mL。

8.如权利要求1所述的抗病毒化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1、将吩嗪-1-羧酸溶解于二氯甲烷中，加入DMF作催化剂，将反应液降温至0～5℃；

步骤2、缓慢加入草酰氯，反应6～10小时，得到吩嗪-1-甲酰氯；

步骤3、称取1-苯基乙胺溶解于二氯甲烷中，同时加入三乙胺作缚酸剂，将反应液降温至0-5℃，滴加溶解有上述吩嗪-1-甲酰氯的二氯甲烷溶液，0～5℃反应1～3h后，加热回流反应至反应完全；

步骤4、分液，有机层用稀盐酸清洗，分出有机层后脱溶剂得粗品，粗品经重结晶，抽滤，烘干得黄色固体，即为所述抗病毒化合物。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述吩嗪-1-羧酸、DMF和草酰氯的摩尔浓度比为100：1：150。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述吩嗪-1-甲酰氯和1-苯基乙胺的摩尔浓度比为1：1.1。

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