CN113439087A - 重组蛋白的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组蛋白的制备方法，其具备：增殖降低工序，其用于降低表达重组蛋白的重组细胞的细胞增殖；以及生产工序，其用于在降低细胞增殖的状态下，在蛋白质生产培养基中培养重组细胞以生产重组蛋白；其中，在增殖降低工序中，通过使用包含至少一个改造后的形态形成控制因子在内的重组细胞作为重组细胞，来降低重组细胞的细胞增殖。

Description

重组蛋白的制备方法
技术领域
本发明涉及一种重组蛋白的制备方法。本发明还涉及一种增加每个细胞的重组蛋白生产量的方法。
背景技术
已知在使用了重组细胞生产重组蛋白中，细胞增殖的富集度未必与重组蛋白的生产能力有关。例如，在专利文献1中，公开了一种方法，其特征在于降低了所述诱导表达后的菌体增殖，具体是一种丝心蛋白样蛋白质的制备方法，其包括：在培养基中培养具有编码丝心蛋白样蛋白质的基因的大肠杆菌；诱导编码丝心蛋白样蛋白质的基因的表达；以及采集丝心蛋白样蛋白质。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2015/178466号
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供一种重组蛋白的制备方法，其在降低重组细胞的细胞增殖的同时，提高重组蛋白的生产能力。
用于解决问题的方法
本发明人等发现，在重组蛋白的制备中，通过使用具有改造后的形态形成控制因子的细胞作为宿主，可以在降低重组细胞的细胞增殖的同时，提高每个细胞的重组蛋白的生产量。本发明基于该新的见解而完成。
本发明涉及例如下述各发明。
[1]一种重组蛋白的制备方法，其具备：增殖降低工序，其用于降低表达重组蛋白的重组细胞的细胞增殖；以及生产工序，其用于在降低细胞增殖的状态下，在蛋白质生产培养基中培养上述重组细胞以生产上述重组蛋白；其中，在上述增殖降低工序中，通过使用包含至少一个改造后的形态形成控制因子在内的重组细胞作为上述重组细胞，来降低上述重组细胞的细胞增殖。
[2]根据[1]所述的制备方法，其中，上述改造后的形态形成控制因子是突变型细胞骨架蛋白。
[3]根据[2]所述的制备方法，其中，上述突变型细胞骨架蛋白是突变型MreB。
[4]根据[3]所述的制备方法，其中，上述突变型形态形成控制因子包含与MreB具有至少90％的序列一致性的氨基酸序列。
[5]根据[3]或[4]所述的制备方法，其中，上述突变型形态形成控制因子在MreB的第53个氨基酸残基丙氨酸中具有突变。
[6]根据[3]～[5]中任一项所述的制备方法，其中，上述突变型形态形成控制因子具有MreB的第53个氨基酸残基丙氨酸被苏氨酸取代的突变。
[7]根据[1]所述的制备方法，其中，上述重组细胞是导入了用于控制细胞骨架蛋白功能的蛋白质的表达盒的细胞。
[8]根据[7]所述的制备方法，其中，控制上述细胞骨架蛋白功能的蛋白质为sulA。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的制备方法，其中，上述蛋白质生产培养基包含天然来源成分。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的制备方法，其中，上述重组蛋白的疏水性为-1.0以上。
[11]根据[1]～[10]中任一项所述的制备方法，其中，上述重组蛋白为结构蛋白质。
[12]根据[1]～[11]中任一项所述的制备方法，其中，上述重组蛋白为丝心蛋白。
[13]根据[1]～[12]中任一项所述的制备方法，其中，上述重组蛋白为蜘蛛丝丝心蛋白。
[14]根据[1]～[13]中任一项所述的制备方法，其中，上述重组细胞为杆菌。
[15]根据[1]～[14]中任一项所述的制备方法，其中，上述重组细胞为属于埃希氏菌属的微生物。
[16]一种方法，具体是一种增加每个细胞的重组蛋白的生产量的方法，其包括：增殖降低工序，其用于降低表达重组蛋白的重组细胞的细胞增殖；以及生产工序，其用于在降低细胞增殖的状态下，在蛋白质生产培养基中培养上述重组细胞以生产上述重组蛋白；其中，在上述增殖降低工序中，通过使用包含至少一个改造后的形态形成控制因子在内的重组细胞作为上述重组细胞，来降低上述重组细胞的细胞增殖。
[17]根据[16]所述的方法，其中，上述改造后的形态形成控制因子是突变型细胞骨架蛋白。
[18]根据[16]所述的方法，其中，上述重组细胞是导入了用于控制细胞骨架蛋白功能的蛋白质的表达盒的细胞。
发明效果
根据本发明，可以提供一种重组蛋白的制备方法，其在降低重组细胞的细胞增殖的同时，提高重组蛋白的生产能力。
附图说明
图1是表示MreB突变株和野生型MreB菌株的平均粒径相对于培养时间而绘制的图。
图2是表示生产培养开始后16小时的MreB突变株和野生型MreB菌株的细胞自身的重量(从干燥菌体重量中减去生产后的重组蛋白的重量)的图。
图3是表示MreB突变株和野生型MreB菌株在生产培养开始后16小时的细胞增殖的图。
图4是表示MreB突变株和野生型MreB菌株的改造丝心蛋白生产量(每个细胞的生产量)的图。
图5是表示MreB突变株和野生型MreB菌株的改造丝心蛋白生产量(每个培养基的生产量)的图。
图6是表示sulA诱导表达菌株和Control菌株的平均粒径相对于培养时间而绘制的图。
图7是表示sulA诱导表达菌株和Control菌株的细胞增殖(细胞浓度)相对于培养时间而绘制的图。
图8是表示sulA诱导表达菌株和Control菌株在生产培养开始后24小时的细胞数的图。
图9是表示sulA诱导表达菌株和Control菌株的改造丝心蛋白生产量(每个细胞的生产量)的图。
图10是表示sulA诱导表达菌株和Control菌株的改造丝心蛋白生产量(每个培养基的生产量)的图。
图11是表示利用HK022噬菌体的溶源化机理，将改造丝心蛋白表达盒装入宿主基因组DNA中的方法的概要的概略图。
图12是表示利用
Figure GDA0003231527920000041
噬菌体的溶源化机理，将改造丝心蛋白表达盒装入宿主基因组DNA中的方法的概要的概略图。
图13是表示利用λ噬菌体所具有的同源重组系统，将改造丝心蛋白表达盒装入宿主基因组DNA中的方法的概要的概略图。
具体实施方式
以下，对本发明具体实施方式详细进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施方式。
(重组蛋白的制备方法)
本实施方式所涉及的重组蛋白的制备方法至少具备：增殖降低工序，其用于降低表达重组蛋白的重组细胞的细胞增殖；以及生产工序，其用于在降低细胞增殖的状态下，在蛋白质生产培养基中培养重组细胞以生产重组蛋白。此外，本实施方式所涉及的重组蛋白的制备方法是在增殖降低工序中，通过使用包含至少一个改造后的形态形成控制因子在内的重组细胞作为重组细胞，来降低重组细胞的细胞增殖。
(形态形成控制因子)
在本说明书中，“形态形成控制因子”是指与细胞的形态形成或形态控制相关的蛋白质。细胞的形态例如包括细胞的刚性、形状、大小。作为形态形成控制因子，例如可以列举出与细胞伸长、细胞宽度和细胞极性的形成或控制相关的蛋白质。作为形态形成控制因子的具体实例，可以列举出细胞骨架蛋白、控制细胞骨架蛋白功能的蛋白质和肽聚糖合成酶等。
在原核细胞中，例如，大肠杆菌等许多细菌中，细胞由肽聚糖(由短肽交联的糖链)覆盖。在这些细菌中，当细胞伸长和分裂时，可以通过严格控制已经存在的肽聚糖的分解和新合成的肽聚糖的插入，来保持其形态而不会使细胞破裂。认为细胞骨架蛋白的功能之一是控制肽聚糖合成酶的细胞内定位。即，最终决定细胞的形态的是处于周质区域的肽聚糖，但是控制用于合成肽聚糖的酶的是细胞质内的细胞骨架蛋白。
作为细菌的细胞骨架蛋白，例如可以列举出FtsZ微管蛋白和MreB肌动蛋白。作为肽聚糖合成酶，例如可以列举出PBP3(FtsI)和PBP2。在分裂相关蛋白质中，FtsZ微管蛋白在最开始局部存在于分裂面，并形成分裂环(Z环)。进一步地将十几种相关蛋白质依次向Z环聚合，与PBP3形成被称为divisome的超分子复合物。MreB与细胞伸长所必需的PBP2等形成被称为elongasome的复合体。此外，作为elongasome的构成因子，可以列举出RodZ、RodA、MreC以及MreD等。
作为真核细胞的细胞骨架蛋白，例如可以列举出crescentin、细胞骨架的ParM和SopA等。
(改造后的形态形成控制因子)
在本说明书中，“改造后的形态形成控制因子”是指通过置换、缺失、插入、添加或突变或人工表达调节进行改造的形态形成控制因子。人工表达调节是指诱导、降低或抑制核酸或基因的表达，并分别诱导、降低或抑制蛋白质或多肽的生成。形态形成控制因子的表达量可以通过将形态形成控制因子装入到表达盒中并将其导入细胞内来改变。进一步地，形态形成控制因子的表达量可以通过在形态形成控制因子的序列中增加增强子或其他调节序列等来改变。也可以包含其他的改变。或者也可以是所述组合。
(突变型形态形成控制因子)
在本说明书中，“突变型形态形成控制因子”是指与野生型形态形成控制因子的氨基酸序列相比，具有相当于置换、缺失、插入和/或添加1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的形态形成控制因子。另外，突变型形态形成控制因子还包括野生型形态形成控制因子的完全缺失(例如，通过编码该形态形成控制因子的基因从染色体DNA中脱落、编码该形态形成控制因子的基因不再表达等以使其不再作为蛋白质进行表达)。突变型形态形成控制因子优选由与野生型形态形成控制因子的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列构成，更优选由具有95％以上的序列一致性的氨基酸序列构成，进一步优选由具有99％以上的序列一致性的氨基酸序列构成。突变型形态形成控制因子可以是丢失野生型形态形成控制因子所具有的生物活性的一部分或全部的因子。
具有突变型形态形成控制因子的细胞例如可以通过以下方法得到：通过对自然界中存在的细胞进行筛选的方法、在诱发A22(S-(3,4-Dichlorobenzyl)-isothiourea)等药剂处理和/或紫外线照射等突变的基础上进行筛选的方法、通过基因工程方法来获取具有突变型形态形成控制因子的细胞的方法。
作为利用基因工程方法的方法，例如有导入随机突变的方法、导入部位特异性突变的方法。在前者的导入随机突变的方法中，例如，也可以使用随机突变试剂盒(BDDiversify PCR Random Mutagenesis(CLONTECH社制))。此外，在后者的导入部位特异性突变的方法中，例如也可以使用部位特异性突变试剂盒(Mutan-K(宝生物公司制))。
其中，优选通过利用基因工程方法的方法来获取具有突变型形态形成控制因子的细胞，但是并不限定于该方法。
作为突变型形态形成控制因子，优选为突变型细胞骨架蛋白，更优选为突变型MreB。突变型MreB与野生型MreB的氨基酸序列(序列号1)相比，具有相当于置换、缺失、插入和/或添加1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
作为突变型MreB，例如，可以列举出在野生型MreB(序列号1)的第14个氨基酸残基S、第20个氨基酸残基A、第23个氨基酸残基L、第53个氨基酸残基A、第74个氨基酸残基R、第84个氨基酸残基F、第143个氨基酸残基E、第158个氨基酸残基T、第185个氨基酸残基S、第207个氨基酸残基G、第209个氨基酸残基L、第276个氨基酸残基E和第322个氨基酸残基L等的1个或多个氨基酸残基中具有突变的MreB。作为突变型MreB，优选地列举出在选自野生型MreB(序列号1)的第53个氨基酸残基A、第74个氨基酸残基R、第84个氨基酸残基F和第185个氨基酸残基S中的1个或多个氨基酸残基具有突变的MreB。
作为突变型MreB的更具体的例子，例如相对于野生型MreB(序列号1)，可以列举出具有相当于置换S14A、A20V、L23R、A53T、R74C、R74L、F84V、E143A、A158T、S185F、G207C、L209R、E276D和L322Q等中的1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的MreB。作为突变型MreB，相对于野生型MreB(序列号1)，优选为具有相当于置换选自E143A、R74L、A53T、S185F、F84V、更优选地选自R74L、A53T、S185F、F84V、G207C和L208R中的1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的MreB，更优选为具有相当于置换选自A53T、S185F和F84V中的1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的MreB。
(控制细胞骨架蛋白功能的蛋白质)
作为控制作为形态形成控制因子的细胞骨架蛋白功能的蛋白质，例如，在原核生物中，可以列举出sulA、yeeV、slmA和Min家族蛋白质(MinC、D和E)。除此之外，在Bacillus属等的一部分微生物中，可以列举出ezrA和Noc。
sulA是SOS系统的构成因子，通过与FtsZ相互作用来抑制FtsZ的聚合。当sulA蓄积在细胞内时，该细胞成为没有隔膜的长丝状细胞(Journal of bacteriology,1993年,175:1118-1125.)。野生型sulA具有序列号6所示的氨基酸序列，并且编码该序列的sulA基因例如具有序列号7所示的核酸序列。编码本实施方式中的形态形成控制因子sulA的核酸序列与序列号7中所记载的核酸序列具有至少90％、优选有93％、95％、98％或99％的序列一致性。
yeeV(CbtA)是IV型toxin-antitoxin(TA)系统的Toxin。yeeV分别与FtsZ和MreB相互作用，并起到抑制作用。在FtsZ中，抑制该GTP依赖性聚合，在MreB中，抑制该ATP依赖性聚合。由于FtsZ和MreB控制细胞的大小和形态，因此已知当过剩地表达抑制它们的yeeV时，细胞会变大(Molecular microbiology，2011年，79:109-118、及PLoS genetics，2017年，13:e1007007.)。
(包含改造后的形态形成控制因子的重组细胞)
在包含改造后的形态形成控制因子在内的重组细胞中，其包括：细胞内具有通过使用基因工程方法等人工操作来改造野生型形态形成控制因子的形态控制因子的细胞、在自然界中经过突变且细胞内具有与野生型不同的形态形成控制因子的细胞、将形态形成控制因子装入表达盒中后导入细胞内且改造形态形成控制因子的表达量的细胞等。
(重组细胞)
本实施方式所涉及的重组细胞是表达重组蛋白的细胞。本实施方式所涉及的重组细胞例如也可以是包括编码重组蛋白(以下也称为“目标蛋白质”)的核酸序列、以及与该核酸序列可操作地连接的1个或多个调节序列(以下，有时也称为“目标蛋白质表达盒”)的细胞。本实施方式所涉及的重组细胞可以是包含1个表达盒的细胞，也可以是包含多个表达盒(例如，2个、3个、4个、5个)的细胞。
调节序列是对宿主中的重组蛋白(目标蛋白质)的表达进行调控的序列(例如启动子、增强子、核糖体结合序列、转录终止序列等)，可以根据宿主的种类适当选择。调节序列可以是外源性序列，也可以是内源性序列(宿主衍生的调节序列)。
包含目标蛋白质表达盒的重组细胞例如可以通过利用至少包含编码目标蛋白质的核酸序列在内的表达载体转化宿主细胞的方法来获得。该表达载体可以是包含目标蛋白质表达盒的载体。本实施方式所涉及的重组细胞可以是在基因组DNA外具有目标蛋白质表达盒的细胞，也可以是将目标蛋白质表达盒装入基因组DNA中的细胞，但是优选为将目标蛋白质表达盒装入基因组DNA中的细胞。
作为转化宿主细胞的方法，可以使用公知的方法，例如，可以列举出使用质粒载体转化宿主细胞的方法。
作为将目标蛋白质表达盒装入基因组DNA中的方法，可以使用公知的方法，例如，可以列举出在λ噬菌体的双链断裂修复中应用重组机理的λred法、Red/ET同源重组法、利用pUT-mini Tn5的转座子活性的转移法。例如，使用BIOMEDAL公司的“转座子基因导入试剂盒：pUTmini-Tn5 Kit”等，按照试剂盒所记载的方法，可以将目标蛋白质表达盒装入宿主细胞基因组DNA中。此时，也可以通过对至少包含编码目标蛋白质的核酸序列在内的DNA片段进行重组以使其与宿主细胞基因组DNA中的1个或多个调节序列可操作地连接，从而将目标蛋白质表达盒装入宿主细胞基因组DNA中。
作为转化宿主细胞的方法，优选为：通过λ噬菌体的整合酶并经由宿主细胞基因组DNA中的附着位点(attB位点)和载体上的附着位点(attP位点)将目标蛋白质表达盒装入宿主细胞基因组DNA中的方法、以及使用Red重组酶系统将目标蛋白质表达盒装入宿主细胞基因组DNA中的方法，其中该Red重组酶系统应用具有同源重组中不可缺少的3个基因即外源(exo)、β(bet)、γ(gam)基因的辅助质粒pKD46。
作为宿主细胞，可以使用细菌等原核生物的细胞、以及酵母细胞、丝状真菌细胞、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞等真核生物的细胞中的任一种。但是，从增殖迅速且降低培养成本的观点出发，宿主细胞优选为细菌等原核细胞的细胞。宿主细胞可以是球菌、螺旋菌、杆菌中的任一种，优选为杆菌。
作为细菌等原核生物宿主细胞，可以列举属于埃希氏菌属、短芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、微杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属和假单胞菌属等的微生物。作为原核生物的优选例子，例如，可以列举出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌、棒状杆菌、以及乳球菌等。宿主细胞优选为属于大肠埃希氏菌属的微生物，特别是大肠杆菌(Escherichia coli)。
作为属于埃希氏菌属的微生物，可以列举例如大肠杆菌BL21(Novagen公司)、大肠杆菌BL21(DE3)(Life Technologies公司)、大肠杆菌BLR(DE3)(默克密理博公司)、大肠杆菌DH1、大肠杆菌GI698、大肠杆菌HB101、大肠杆菌JM109、大肠杆菌K5(ATCC 23506)、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)、大肠杆菌No.49、大肠杆菌Rosetta(DE3)(Novagen公司)、大肠杆菌TB1、大肠杆菌Tuner(Novagen公司)、大肠杆菌Tuner(DE3)(Novagen公司)、大肠杆菌W1485、大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌(Escherichiacoli)XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue等。宿主细胞优选为大肠杆菌(Escherichia coli)。
作为转化上述宿主细胞的方法，只要是向上述宿主细胞导入DNA的方法均可以使用。可以列举例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]、原生质体法(日本特开昭63-248394号公报)、或Gene,17,107(1982)、Molecular&GeneralGenetics,168,111(1979)中记载的方法等。
属于短芽孢杆菌属的微生物的转化可以利用例如Takahashi等的方法(J.Bacteriol.,1983,156:1130-1134)、Takagi等的方法(Agric.Biol.Chem.,1989,53:3099-3100)、或Okamoto等的方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.,1997,61:202-203)来实施。
用于转化的载体(以下简称为“载体”。)的种类可以根据宿主的种类适当选择质粒载体、病毒载体、柯斯质粒(cosmid)载体、福斯质粒(fosmid)载体、人工染色体载体等。作为载体，可以列举例如pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均由Boehringer Mannheim公司销售)、pKK233-2(Pharmacia公司制)、pSE280(Invitrogen公司制)、pGEMEX-1(Promega公司制)、pQE-8(QIAGEN公司制)、pKYP10(日本特开昭58-110600号公报)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司制)、pTrs30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrs32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2[由大肠杆菌IGHA2(FERMB-400)制备、日本特开昭60-221091号公报]、pGKA2[由大肠杆菌IGKA2(FERMBP-6798)制备、日本特开昭60-221091号公报]、pTerm2(美国专利4686191号、美国专利4939094号、美国专利5160735号)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(Pharmacia公司制)、pET系统(Novagen公司制)等。
在使用大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，可以列举pUC18、pBluescriptII、pSupex、pET22b、pCold等作为优选的载体。
作为属于短芽孢杆菌属的微生物的优选载体的具体例，可以列举作为枯草杆菌载体公知的pUB110、或pHY500(日本特开平2-31682号公报)、pNY700(日本特开平4-278091号公报)、pHY4831(J.Bacteriol.,1987,1239-1245)、pNU200(鹈高重三、日本农艺化学会志1987,61:669-676)、pNU100(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1989,30:75-80)、pNU211(J.Biochem.,1992,112:488-491)、pNU211R2L5(日本特开平7-170984号公报)、pNH301(Appl.Environ.Microbiol.,1992,58:525-531)、pNH326、pNH400(J.Bacteriol.,1995,177:745-749)、pHT210(日本特开平6-133782号公报)、pHT110R2L5(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1994,42:358-363)、或大肠杆菌与属于短芽孢杆菌属的微生物的穿梭载体pNCO2(日本特开2002-238569号公报)等。
作为启动子，只要在宿主细胞中发挥功能则没有限制。可以列举例如trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子、T7启动子等来源于大肠杆菌或噬菌体等的启动子。此外，也可以使用将两个Ptrp串联而成的启动子(Ptrp×2)、tac启动子、lacT7启动子、let I启动子这样人为地进行了设计改造的启动子等。
优选使用将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列与起始密码子之间调节为适当距离(例如6～18个碱基)的质粒。未必需要转录终止序列，但是优选在编码目标蛋白质的基因的正下方配置转录终止序列。
作为真核生物的宿主细胞，可以列举例如酵母和丝状真菌(霉菌等)。
作为酵母，可以列举例如属于酵母(Saccharomyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、丝孢酵母(Trichosporon)属、许旺酵母(Schwanniomyces)属、毕赤酵母(Pichia)属、假丝酵母(Candida)属、耶氏酵母属和汉逊酵母属等的酵母。
使用酵母作为宿主细胞的情况下的载体通常优选包含复制起点(需要在宿主细胞中扩增的情况)和用于大肠杆菌中的载体的增殖的筛选标志物、用于酵母中的重组蛋白表达的诱导型启动子和终止子、以及用于酵母的筛选标志物。
在载体为非整合载体的情况下，优选进一步包含自主复制序列(ARS)。由此，能够提高载体在细胞内的稳定性(Myers、A.M.、et al.(1986)Gene 45:299-310)。
作为使用酵母作为宿主细胞的情况下的载体，可以列举例如YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、YIp、pHS19、pHS15、pA0804、pHIL3Ol、pHIL-S1、pPIC9K、pPICZα、pGAPZα、pPICZ B等。
作为以酵母为宿主细胞时的启动子的具体例子，可以列举出半乳糖诱导型gal 1启动子和gal 10启动子；铜诱导型CPU 1启动子；硫胺素诱导型的nmt1启动子；以及甲醇诱导型的AOX1启动子、AOX2启动子、DHAS启动子、DAS启动子、FDH启动子、FMDH启动子、MOX启动子、ZZA1、PEX5-、PEX8-和PEX14-启动子等。
作为向酵母中导入载体的方法，只要是将DNA导入酵母中的方法则均可以使用，可以列举例如电穿孔法(Methods Enzymol.,194,182(1990))、原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81,4889(1984))、乙酸锂法(J.Bacteriol.,153,163(1983))、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929(1978)记载的方法等。
作为丝状真菌，可以列举例如属于顶孢霉(Acremonium)属、曲霉(Aspergillus)属、黑粉霉(Ustilago)属、木霉(Trichoderma)属、链孢霉(Neurospora)属、镰孢霉(Fusarium)属、腐质霉(Humicola)属、青霉(Penicillium)属、毁丝霉(Myceliophtora)属、灰霉(Botryts)属、稻瘟霉(Magnaporthe)属、毛霉(Mucor)属、绿僵菌(Metarhizium)属、红曲霉(Monascus)属、根霉(Rhizopus)属和根毛霉属的菌等。
作为以丝状真菌为宿主细胞时的启动子的具体例子，可以列举出水杨酸诱导型PR1a启动子；放线菌酮诱导型Placc启动子；以及奎宁酸诱导型Pqa-2启动子等。
载体向丝状真菌中的导入可以使用现有公知的方法进行。可以列举例如Cohen等的方法(氯化钙法)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69:2110(1972)]、原生质体法[Mol.Gen.Genet.,168:111(1979)]、感受态细胞法[J.Mol.Biol.,56:209(1971)]、电穿孔法等。
在制备本实施方式所涉及的重组细胞时，与目标蛋白质表达盒的装入和向形态形成控制因子导入突变的顺序不作限定。即，可以在具有改造后的形态形成控制因子的宿主细胞中装入目标蛋白质表达盒，也可以对具有目标蛋白质表达盒的宿主细胞导入改造后的形态形成控制因子。
(目标蛋白质)
通过本实施方式所涉及的重组蛋白的制备方法来生产的目标蛋白质并没有特别限制，可以使用任意的蛋白质。在此，目标蛋白质是指通过本实施方式所涉及的制备方法进行生产后，以回收利用等为目的的蛋白质。作为目标蛋白质，可以列举出优选以工业规模制备的任意的蛋白质，例如，可以列举出可用于工业的蛋白质、可用于医疗的蛋白质以及结构蛋白质等。作为可用于工业或医疗的蛋白质的具体例子，可以列举出酶、调节蛋白、受体、肽类激素、细胞因子、膜或转运蛋白、用于预防接种的抗原、疫苗、抗原结合蛋白、免疫刺激蛋白、过敏源、以及全长抗体或抗体片段或衍生物等。作为结构蛋白质的具体例子，可以列举出丝心蛋白(例如，蜘蛛丝、蚕丝等)、角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、节肢弹性蛋白、和这些蛋白质的片段、以及来源于它们的蛋白质等。
在本说明书中，丝心蛋白包含天然来源的丝心蛋白和改造丝心蛋白。在本说明书中，“天然来源的丝心蛋白”是指具有与天然来源的丝心蛋白相同的氨基酸序列的丝心蛋白，“改造丝心蛋白”是指具有与天然来源的丝心蛋白不同的氨基酸序列的丝心蛋白。
丝心蛋白可以是蜘蛛丝丝心蛋白。“蜘蛛丝丝心蛋白”包含天然蜘蛛丝丝心蛋白和来源于天然蜘蛛丝丝心蛋白的改造丝心蛋白。作为天然蜘蛛丝丝心蛋白，例如，可以列举出蜘蛛产生的蛛丝蛋白。
丝心蛋白例如可以是包含式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的结构域序列的蛋白质。本实施方式所涉及的丝心蛋白可以在结构域序列的N末端侧和C末端侧中的任意一个末端侧或两个末端侧进一步附加有氨基酸序列(N末端序列和C末端序列)。N末端序列和C末端序列典型地为不具有丝心蛋白中特征性的氨基酸基序的重复的区域，由约100个残基的氨基酸构成，但不限于此。
在本说明书中，"结构域序列"为生成丝心蛋白特有的结晶区(典型地，相当于氨基酸序列的(A)n基序)和非晶区(典型地，相当于氨基酸序列的REP)的氨基酸序列，是指式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的氨基酸序列。在此，(A)n基序表示以丙氨酸残基为主的氨基酸序列，氨基酸残基数为2～27个。(A)n基序的氨基酸残基数可以是2～20、4～27、4～20、8～20、10～20、4～16、8～16或10～16的整数。此外，只要(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于全部氨基酸残基数的比例为40％以上即可，可以为60％以上、70％以上、80％以上、83％以上、85％以上、86％以上、90％以上、95％以上或100％(意味着其仅由丙氨酸残基构成)也可以。在结构域序列中存在两个以上的(A)n基序可以至少7个仅由丙氨酸残基构成。REP表示由2～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。REP可以是由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示2～300的整数，也可以是10～300的整数。两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。
作为天然来源的丝心蛋白，可以列举出例如包含式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的结构域序列的蛋白质。作为天然来源的丝心蛋白的具体示例，例如可以列举出昆虫或蜘蛛类产生的丝心蛋白。
作为昆虫产生的丝心蛋白，可以列举例如家蚕(Bombyx mori)、野桑蚕(Bombyxmandarina)、天蚕(Antheraea yamamai)、柞蚕(Anteraea pernyi)、枫蚕(Eriogynapyretorum)、蓖麻蚕(Pilosamia Cynthia ricini)、樗蚕(Samia cynthia)、樟蚕(Caligurajaponica)、印度柞蚕(Antheraea mylitta)、琥珀蚕(Antheraea assama)等蚕产生的蚕丝蛋白和雀蜂(Vespa simillima xanthoptera)的幼虫吐出的蜂丝蛋白。
作为昆虫产生的丝心蛋白的更具体的示例，可以列举例如蚕·丝心蛋白L链(GenBank登录号M76430(碱基序列)和AAA27840.1(氨基酸序列))。
作为蜘蛛类产生的丝心蛋白，可以列举例如大腹园蛛、十字园蛛、肥胖园蛛、五纹园蛛和野岛园蛛(Araneus nojimai)等属于园蛛属(Araneus属)的蜘蛛、青新园蛛、嗜水新园蛛、灌木新园蛛和类青新园蛛等属于新园蛛属(Neoscona属)的蜘蛛、小岬蛛等属于岬蛛属(Pronus属)的蜘蛛、蟾蜍曲腹蛛和对称曲腹蛛等属于曲腹蛛属(Cyrtarachne属)的蜘蛛、库氏棘腹蛛和乳突棘腹蛛等属于棘腹蛛属(Gasteracantha属)的蜘蛛、何氏瘤腹蛛和六刺瘤腹蛛等属于瘤腹蛛属(Ordgarius属)的蜘蛛、悦目金蛛、小悦目金蛛和横纹金蛛等属于金蛛属(Argiope属)的蜘蛛、双峰尾园蛛等属于尾园蛛属(Arachnura属)的蜘蛛、褐吊叶蛛等属于吊叶蛛属(Acusilas属)的蜘蛛、红云斑蛛、花云斑蛛和全色云斑蛛等属于云斑蛛属(Cytophora属)的蜘蛛、丑锥头蛛等属于锥头蛛属(Poltys属)的蜘蛛、八瘤艾蛛、四突艾蛛、圆腹艾蛛和黑尾艾蛛等属于艾蛛属(Cyclosa属)的蜘蛛和日本壮头蛛等属于壮头蛛属(Chorizopes属)的蜘蛛所产生的蛛丝蛋白、以及前齿肖蛸、锥腹肖蛸、直伸肖蛸和鳞纹肖蛸等属于肖蛸属(Tetragnatha属)的蜘蛛、纵条银鳞蛛、肩斑银鳞蛛和小肩斑银鳞蛛等属于银鳞蛛属(Leucauge属)的蜘蛛、棒络新妇和斑络新妇等属于络新妇属(Nephila属)的蜘蛛、美丽麦蛛等属于麦蛛属(Menosira属)的蜘蛛、柔弱粗螯蛛等属于锯螯蛛属(Dyschiriognatha属)的蜘蛛、红斑寇蛛、哈氏寇蛛、几何寇蛛和间斑寇蛛等属于寇蛛属(Latrodectus属)的蜘蛛、以及属于育儿网蛛属(Euprosthenops属)的蜘蛛等属于肖蛸科(Tetragnathidae科)的蜘蛛所产生的蛛丝蛋白。作为蛛丝蛋白，可以列举例如MaSp(MaSp1和MaSp2)、ADF(ADF3和ADF4)等牵引丝蛋白、MiSp(MiSp1和MiSp2)等。
作为来源于角蛋白的蛋白质，例如，可以列举出山羊(Capra hircus)的I型角蛋白等。
作为来源于胶原蛋白的蛋白质，例如，可以列举出包含式3：[REP2]p中所表示的结构域序列的蛋白质(其中，在式3中，p表示5～300的整数。REP2表示由Gly-X-Y构成的氨基酸序列，X和Y表示Gly以外的任意的氨基酸残基。存在两个以上的REP2彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。)
作为来源于弹性蛋白的蛋白质，例如，可以列举出NCBI的GenBank登录号AAC98395(人)、I47076(羊)、NP786966(牛)等具有氨基酸序列的蛋白质。
作为来源于节肢弹性蛋白的蛋白质，例如，可以列举出包含式4：[REP3]q中所表示的结构域序列的蛋白质(其中，在式4中，q表示4～300的整数。REP3表示由Ser-J-J-Tyr-Gly-U-Pro构成的氨基酸序列。J表示任意的氨基酸残基，特别优选为选自由Asp、Ser和Thr组成的组中的氨基酸残基。U表示任意的氨基酸残基，特别优选为选自由Pro、Ala、Thr和Ser组成的组中的氨基酸残基。存在两个以上的REP4彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。)
目标蛋白质可以是亲水性蛋白质，也可以是疏水性蛋白质。作为目标蛋白质，求出用于构成目标蛋白质的所有氨基酸残基的疏水性指标(亲水指数，HI)的总和，然后将该总和除以所有氨基酸残基数后得到的值(平均HI，以下也表示为“疏水性”)优选为-1.0以上。关于氨基酸残基的疏水性指标，使用公知的指标(Hydropathy index：Kyte J，&DoolittleR(1982)”A simple method for displaying the hydropathic character of aprotein”，J.Mol.Biol.，157，pp.105-132)。具体而言，各氨基酸的疏水性指标如下述表1所示。
[表1]
氨基酸 HI 氨基酸 HI
异亮氨酸(Ile) 4.5 色氨酸(Trp) -0.9
缬氨酸(Val) 4.2 酪氨酸(Tyr) -1.3
亮氨酸(Leu) 3.8 脯氨酸(Pro) -1.6
苯丙氨酸(Phe) 2.8 组氨酸(His) -3.2
半胱氨酸(Cys) 2.5 天冬酰胺(Asn) -3.5
蛋氨酸(Met) 1.9 天冬氨酸(Asp) -3.5
丙氨酸(Ala) 1.8 谷氨酰胺(Gln) -3.5
甘氨酸(Gly) -0.4 谷氨酸(Glu) -3.5
苏氨酸(Thr) -0.7 赖氨酸(Lys) -3.9
丝氨酸(Ser) -0.8 精氨酸(Arg) -4.5
在本发明的一实施方式中，目标蛋白质的疏水性可以为-0.9以上、-0.8以上、-0.7以上、-0.6以上、-0.5以上、-0.4以上、-0.3以上、-0.2以上、-0.1以上、0以上、0.1以上、0.2以上、0.3以上或0.4以上，此外，目标蛋白质的疏水性还可以为1.0以下、0.9以下、0.8以下、0.7以下、0.6以下或0.5以下。
目标蛋白质的分子量没有特别限定，例如可以为10kDa以上且700kDa以下。目标蛋白质的分子量例如可以为20kDa以上、30kDa以上、40kDa以上、50kDa以上、60kDa以上、70kDa以上、80kDa以上、90kDa以上或100kDa以上，例如还可以为600kDa以下、500kDa以下、400kDa以下、300kDa以下或200kDa以下。通常，蛋白质的分子量越大，就越容易凝聚。
(增殖降低工序)
增殖降低工序是用于降低表达重组蛋白的重组细胞的细胞增殖的工序。在本实施方式所涉及的重组蛋白的制备方法中，通过使用上述的重组细胞(包含至少一个改造后的形态形成控制因子在内的重组细胞)作为重组细胞，来降低重组细胞的细胞增殖。
在增殖降低工序中，可以通过在后述的蛋白质生产培养基中培养包含至少一个的改造后的形态形成控制因子在内的重组细胞，来降低该重组细胞的细胞增殖。
(生产工序)
生产工序是用于在降低细胞增殖的状态下，在蛋白质生产培养基中培养重组细胞来生产重组蛋白的工序。也可以同时实施增殖降低工序和生产工序。
用于培养重组细胞的蛋白质生产培养基并没有特别限定，可以根据重组细胞的种类，从公知的天然培养基或合成培养基中选择。作为蛋白质生产培养基，例如，可以使用液体培养基，该液体培养基根据需要含有从碳源、氮源、磷酸源、硫源、维生素类、矿物质、营养缺陷型所需的营养素、以及其他各种有机成分或无机成分中选择的成分。培养基成分的种类和浓度可以由本领域技术人员进行适当设定。
蛋白质生产培养基优选包含天然来源成分。天然来源成分是指天然产物(例如酵母)本身、来源于天然产物的提取物(例如Yeast Extract))等的成分。天然来源成分通常是所包含的成分种类和各自含量没有完全特定的成分。天然来源成分例如包含选自由维生素类、低分子肽(例如，氨基酸残基数为2～20的肽)和氨基酸组成的组中的至少1种。
作为碳源，可以列举出葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖或淀粉的水解物等糖类、甘油、山梨糖醇等醇类、富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。
作为碳源，可以是1种，也可以以任意比例混合2种以上的碳源。蛋白质生产培养基中的碳源浓度可以为0.1w/v％～50w/v％左右，优选为0.5w/v％～40w/v％左右，更优选为1w/v％～30w/v％左右，特别优选为5w/v％～20w/v％左右。在本实施方式中，优选使用甘油或葡萄糖作为碳源，也可以以任意比率混合甘油或葡萄糖和其他碳源。碳源中的甘油或葡萄糖的比率优选为10％重量以上，更优选为50％重量以上，特别优选为70％重量以上。培养开始时的碳源的优选初始浓度如上所述，但是也可以根据培养中的碳源的消耗来适当添加碳源。
作为氮源，可以列举出硝酸盐、铵盐、氨气、氨水等无机氮盐、氨基酸、蛋白胨、提取物类、作为玉米淀粉制造工业中的副产物的玉米浆(CSL)等有机氮源。作为蛋白胨，可以列举出酪蛋白胨、兽肉蛋白胨、心肌蛋白胨、明胶蛋白胨、或大豆蛋白胨等。作为提取物类，可以列举出肉提取物、酵母提取物、心脏浸出液(心脏浸液)等。作为包含氨基酸或肽的氮源，更优选为低分子肽和氨基酸含量高的氮源。
作为磷酸源，可以列举出磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等磷酸盐、焦磷酸等磷酸聚合物。
作为硫源，可以列举出硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐等无机硫化合物、半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽等含硫氨基酸。
作为维生素类，可以列举出生物素、氯化胆碱、氰钴铵、叶酸、肌醇、烟酸、4-氨基苯甲酸、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫铵、胸腺嘧啶核苷等。作为维生素源，可以列举出麦芽提取物、马铃薯提取物、番茄汁等各种提取物。
作为矿物质，除了磷(P)以外，还可以列举出硫(S)、钾(K)、钙(Ca)、镁(Mg)、铁(Fe)、钠(Na)等。
生产工序中的培养例如可以通过通气培养或振荡培养在好氧条件下进行。培养可以通过分批培养(batch culture)、流加培养(fed-batch culture)、连续培养(continuousculture)或它们的组合来实施。蛋白质生产培养基的pH例如可以为3.0～9.0。培养温度例如可以为15～40℃。培养时间例如可以为1～60小时。
培养条件并没有特别限制，只要能使上述重组细胞增殖且在表达目标蛋白质的重组细胞中积累目标蛋白质即可。另外，在目标蛋白质表达期间，重组细胞可以增殖，也可以不进行增殖。培养条件在目标蛋白质表达前的期间内和开始表达后的期间内可以相同，也可以不相同。
培养温度通常对细胞的增殖有很大的影响。一般而言，增殖的下限温度是细胞中水分的冻结温度即0℃或比其稍低的温度，上限温度由蛋白质、核酸等高分子化合物的变性温度决定。对于某个菌株，可增殖的温度范围比较窄，例如，大肠杆菌中增殖的下限温度为0～15℃，上限为46℃，增殖的最适宜温度为36～42℃左右。当根据增殖的最适宜温度对微生物进行分类时，可以分为最适宜温度为20℃以下的嗜冷菌、最适宜温度为20～45℃的嗜温菌、最适宜温度为45℃以上的嗜热菌。在此，增殖的最适宜温度是指所培养的微生物获得最大比增殖速度的温度，此外，比增殖速度是指每单位微生物量的增殖速度，是微生物固有的值，并且根据培养条件而发生变化。
在本发明的一实施方式中，“增殖的最适宜温度”是指，在培养开始时，pH、溶解氧浓度等培养温度以外的条件为恒定时，微生物能够获得最大比增殖速度的温度。在本发明的一实施方式中，当重组细胞表达目标蛋白质时(当目标蛋白质的表达为诱导型的情况下，在诱导表达后)，通过调节培养温度等，将上述重组细胞冷却或维持在比重组细胞的增殖的最适宜温度低的温度，从而可以在重组细胞中增加目标蛋白质的表达量。比重组细胞的增殖的最适宜温度低的温度，例如可以是比重组细胞的增殖的最适宜温度的下限值低3～25℃的温度，也可以是比下限值低8～20℃的温度，还可以是比下限值低10～18℃的温度，还可以是比下限值低12℃～18℃的温度，还可以是比下限值低14℃～17℃的温度，还可以是比下限值低3～10℃的温度，还可以是比下限值低5～8℃的温度。
(重组蛋白的诱导表达)
本实施方式所涉及的重组细胞可以是能够诱导目标蛋白质表达的细胞。重组蛋白的诱导表达是通过激活诱导型启动子的转录(编码目标蛋白质的核酸的转录)来进行的。诱导型启动子的激活可以根据诱导型启动子的种类，依照本技术领域公知的方法来进行。
例如，当使用通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等诱导剂(表达诱导剂)而激活的诱导型启动子时，可以通过将该诱导剂添加到培养液中来诱导重组蛋白的表达。可以将诱导剂一次或多次地添加到培养液中，此外，也可以通过连续进料将其添加到培养液中。也可以通过流加底物溶液中含有诱导剂的方式来进料。所添加的诱导剂的量可以根据诱导剂和诱导型启动子的种类来设定，例如，每1g重组细胞的干燥重量可以为0.1～30μg的范围，优选为0.5～20μg的范围。
此外，例如，当使用通过温度升高或降低来激活的诱导型启动子时，可以通过升高或降低培养液的温度来诱导重组蛋白的表达。例如，当使用通过温度升高来激活的λ噬菌体的PR启动子或PL启动子时，可以通过将增殖时的培养液温度设为20～37℃的范围来抑制增殖时的重组蛋白的表达，然后可以通过使培养液温度升高到38～44℃来诱导重组蛋白的表达。此时，为了减轻热冲击蛋白质的影响，如日本特开平6-292563号公报所述，通过将增殖时的培养液的pH设为6.5～7.5，且通过在开始重组蛋白的诱导表达的时间点将培养液的pH变更为4.5～6.5来，可以更稳定地进行诱导表达。
从进行重组细胞增殖的阶段过渡到诱导重组蛋白表达的阶段的时期并没有特别限制，可以根据培养系统的构成、生产过程的设计来进行适当设定。从有效地生产重组蛋白的观点出发，优选地在重组细胞的增殖达到对数增殖期的中期～后期时，开始诱导重组蛋白的表达。
重组细胞的增殖从延迟期或诱导期(培养初期的细胞数增加缓慢的时期)开始，经过对数增殖期(每单位时间内细胞数以2倍的对数增加的时期)，到达稳定期(未发现细胞的净数量发生变化的时期)。对数增殖期的中期是指细胞数处于延迟期的细胞数和稳定期的细胞数的中间程度的时期，对数增殖期的后期是指从中期到稳定期的时期。作为开始诱导重组蛋白表达的时期的具体例子，例如当稳定期的OD600的值约为150的重组细胞时，优选OD600的值达到30～110的时期，更优选该值达到40～90的时期，进一步优选该值达到50～80的时期。
诱导重组蛋白表达的时间可以根据所使用的宿主、目标蛋白质的种类来设定，直至达到设定好的生产量。由于生产速度根据培养液温度等培养条件的变化而变化，因此不需要唯一地确定诱导重组蛋白表达的时间。可以根据下一工序的重组蛋白的分离和纯化进展来设定诱导重组蛋白表达的时间。此外，在工业生产中优选设定诱导重组蛋白表达的时间，以免影响并列进行的重组细胞的增殖和该增殖的重组细胞的迁移。
(预培养工序)
本实施方式所涉及的重组蛋白的制备方法可以进一步具备预培养工序。预培养工序是在增殖抑制工序之前，在预培养培养基中培养重组细胞的工序。预培养培养基的具体形态与上述蛋白质生产培养基中说明的形态相同。
在本实施方式所涉及的重组蛋白的制备方法中，作为预培养培养基，优选使用营养成分比蛋白质生产培养基丰富的培养基。由此，可以增加用于增殖抑制工序和生产工序的重组细胞的数量。
(增加每个细胞的重组蛋白生产量的方法)
上述本发明也可以作为增加每个细胞的重组蛋白生产量的方法。即，一实施方式所涉及的增加每个细胞的重组蛋白生产量的方法是一种在增殖降低工序中，通过使用包含至少一个改造后的形态形成控制因子在内的重组细胞作为重组细胞，来降低重组细胞的细胞增殖的方法，其包括：增殖降低工序，其用于降低表达重组蛋白的重组细胞的细胞增殖；以及生产工序，其用于在降低细胞增殖的状态下，在蛋白质生产培养基中培养重组细胞以生产重组蛋白。该方法的具体方式和优选方式如上所述。
[实施例]以下，基于实施例更具体地对本发明进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施例。
[实施例1](1)重组细胞(表达改造丝心蛋白的大肠杆菌菌株)的制备
(目标蛋白质)
根据来源于金纺蜘蛛(Nephila clavipes)的丝心蛋白(GenBank登录号：P46804.1、GI：1174415)的碱基序列和氨基酸序列，来设计具有序列号2所示的氨基酸序列的改造丝心蛋白(以下也称为“PRT966”)。序列号2所示的氨基酸序列具有相对于来源于金纺蜘蛛的丝心蛋白氨基酸序列，以提高生产性能为目的对氨基酸残基执行置换、插入和缺失后获得的氨基酸序列，并且进一步地将序列号3所示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)添加至N末端。
接下来，合成编码PRT966的核酸。该核酸中，在5’末端附加有NdeI位点、在终止密码子下游附加有EcoRI位点。将该核酸克隆至克隆载体(pUC118)中。然后，用NdeI和EcoRI对该核酸进行限制性酶处理，并进行切除后，重组为pET-22b(+)载体，以获得pET-22(+)/PRT966载体。
(将改造丝心蛋白表达盒装入大肠杆菌基因组DNA中)
作为宿主，使用大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株，并使用以下(a)～(c)的方法将改造丝心蛋白表达盒装入基因组DNA中的3个位置处，并获得具有3个改造丝心蛋白表达盒的重组细胞。
(a)attHK022
利用HK022噬菌体的溶源化机理将第1个改造丝心蛋白表达盒装入基因组DNA中。该机理是宿主基因组DNA中的特定部位(attB位点)与噬菌体基因组的特定部位(attP(HK022)位点)之间的序列特异性的重组。
图11是表示利用HK022噬菌体的溶源化机理，将改造丝心蛋白表达盒装入宿主基因组DNA中的方法的概要的概略图。首先，用NdeI和EcoRI对pET-22(+)/PRT966载体进行限制性酶处理，切除编码PRT966的核酸后，重组到具有attP(HK022)位点的质粒载体attHK022-Cm2中，获得了attHK022-T7p-PRT966-T7t-FRT-Cm2-ori_R6K-FRT载体。接下来，将attHK022-T7p-PRT966-T7t-FRT-Cm2-ori_R6K-FRT载体导入宿主中，通过宿主基因组DNA中的attB位点与该载体的attP(HK022)位点之间的序列特异性的重组，将改造丝心蛋白(PRT966)表达盒装入宿主基因组DNA中。另外，在宿主中预先导入具有int基因的辅助质粒pAH69(J.Bact 183：6384-6393)以表达整合酶。之后，通过导入辅助质粒pCP20(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97：6640-6645)以表达FLP，除去了在FRT序列中夹杂的氯霉素抗性基因和ori_R6K区域。
(b)
Figure GDA0003231527920000221
利用
Figure GDA0003231527920000222
噬菌体的溶源化机理，将第2个改造丝心蛋白表达盒装入宿主基因组DNA中。该机理是宿主基因组DNA中的特定部位(attB位点)与噬菌体基因组的特定部位(
Figure GDA0003231527920000223
位点)之间的序列特异性的重组。
图12是表示利用
Figure GDA0003231527920000224
噬菌体的溶源化机理，将改造丝心蛋白表达盒装入宿主基因组DNA中的方法的概要的概略图。首先，用NdeI和EcoRI对pET-22(+)/PRT966载体进行限制性酶处理，切除编码PRT966的核酸后，重组到具有
Figure GDA0003231527920000225
位点的质粒载体
Figure GDA0003231527920000226
中，获得了
Figure GDA0003231527920000228
载体。接下来，用上述(a)的方法将
Figure GDA0003231527920000229
载体导入到装有第1个改造丝心蛋白表达盒的宿主中，通过宿主基因组DNA中的attB位点与该载体的
Figure GDA0003231527920000227
位点之间的序列特异性的重组，将第2个改造丝心蛋白(PRT966)表达盒装入宿主基因组DNA中。之后，通过导入辅助质粒pCP20以表达FLP，除去了夹杂在FRT序列中的卡那霉素抗性基因。
(c)λRed_manX
利用λ噬菌体所具有的同源重组系统，将第3个改造丝心蛋白表达盒装入宿主基因组DNA中。该同源重组系统是通过位于噬菌体基因组的Red区域的exo、bet、gam基因产物产生同源重组的系统。
图13是表示利用λ噬菌体所具有的同源重组系统，将改造丝心蛋白表达盒装入宿主基因组DNA中的方法的概要的概略图。首先，以pET-22(+)/PRT966载体为模板，通过使用将改造导入至T7启动子的引物的PCR法，来扩增改造丝心蛋白表达盒(依次包含manX5’同源序列-SPT3启动子-PRT966-T7终止子)。同样地，以pKD13-Cm载体为模板，通过PCR法来扩增氯霉素抗性基因表达盒(依次包含T7终止子同源序列-FRT-氯霉素抗性基因-FRT-manX3’同源序列)。使用In-Fusion(注册商标)克隆系统(宝生物株式会社制)连接两种PCR产物。接下来，用上述(a)和(b)的方法将所连接的DNA片段导入到装有第1个改造丝心蛋白表达盒和第2个改造丝心蛋白表达盒的宿主中，通过宿主基因组DNA中的manX5’同源序列和DNA片段上的manX5'同源序列之间的同源重组、以及宿主基因组DNA中的manX3’同源序列和DNA片段上的manX3'同源序列之间的同源重组，将第3个改造丝心蛋白(PRT966)表达盒装入宿主基因组DNA中。另外，在宿主中预先导入具有exo、bet和gam基因的辅助质粒pKD46(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97：6640-6645)，以表达各个基因。之后，通过导入辅助质粒pCP20以表达FLP，除去了在FRT序列中夹杂的氯霉素抗性基因。
(2)导入MreB突变
通过PCR法获得编码MreB基因的蛋白质的区域(CDS)，使用In-Fusion mix(宝生物)克隆到pKOV质粒(J.Bacteriology 179：6228-6237)中。为了将第53个氨基酸转换为苏氨酸，通过使用了A2T-F引物(5’-AGCGTAACTGCAGTAGGTCATG-3’)和A2T-R引物(5’-TACTGCAGTTACGCTTTTCGGT-3’)的PCR法，对编码导入了突变的MreB的核酸进行扩增后，用In-Fusion mix反应后，转化在上述(1)中获取的重组细胞。使用所获得的菌株，通过J.Bacteriology 179：6228-6237中记载的方法，将MreB-A53T突变导入该菌株的基因组中，并获得了MreB(A53T)突变株。
(3)改造丝心蛋白的表达和评估
用以下的方法培养通过上述(1)和(2)的方法获得的重组细胞(在基因组DNA中具有3个改造丝心蛋白表达盒，且具有MreB(A53T)突变的重组细胞。以下，也称为“MreB突变株”)，并对改造丝心蛋白的表达量进行解析。作为比较，对通过上述(1)的方法获得的重组细胞(在基因组DNA中具有3个改造丝心蛋白表达盒，MreB中不具有突变的重组细胞。以下也称为“野生型MreB菌株”。)也同样地进行评估。
MreB突变株和野生型MreB菌株分别在2mL的LB培养基中培养15小时。将该培养液添加到100mL的预培养培养基(表2的种子培养用培养基)中以使得OD600为0.005。将培养液温度保持于30℃，进行烧瓶培养直至OD600达到5为止(约15小时)，得到种子培养液。
[表2]
Figure GDA0003231527920000241
将该种子培养液添加到加有500ml的蛋白质生产培养基(表3的生产培养基)的发酵罐中，以使OD600达到0.05。将培养液温度保持于37℃，在pH6.9下控制恒定而进行培养。此外，将培养液中的溶解氧浓度维持于溶解氧饱和浓度的20％。
[表3]
Figure GDA0003231527920000242
在蛋白质生产培养基中的葡萄糖完全消耗后，立即以6g/小时的速度添加进料溶液(表4的流加底物溶液)。将培养液温度保持于37℃，在pH6.9下控制恒定而进行培养。此外，将培养液中的溶解氧浓度维持于溶解氧饱和浓度的20％，进行16小时培养。然后，向培养液中添加1M的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)以使终浓度达到0.1mM，诱导表达改造丝心蛋白。使用由添加IPTG前和添加IPTG后的培养液制备的菌体进行SDS-PAGE，根据依赖于IPTG添加的目标改造丝心蛋白尺寸的条带的出现，确认到目标改造丝心蛋白的表达。
[表4]
Figure GDA0003231527920000251
将回收的菌体用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)进行清洗。使清洗后的菌体悬浮在包含约1mM的PMSF的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中，利用高压均质器(GEA Niro Soavi公司制)将细胞破碎。将破碎的细胞离心分离，得到沉淀物。利用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)清洗所得到的沉淀物，直至达到高纯度为止。将清洗后的沉淀物以达到100mg/mL的浓度的方式悬浮在8M胍缓冲液(8M胍盐酸盐、10mM磷酸二氢钠、20mM NaCl、1mM Tris-HCl、pH7.0)中，在60℃下用搅拌器搅拌30分钟，使其溶解。溶解后，使用透析管(三光纯药株式会社制造的纤维素管36/32)在水中进行透析。通过离心分离来回收透析后得到的白色凝聚蛋白质，用冷冻干燥机去除水分，通过回收冷冻干燥粉末，而获得改造丝心蛋白(PRT966)。
将获得的冷冻干燥粉末进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并使用Totallab(nonlineardynamics ltd.)进行图像解析，以评估改造丝心蛋白的生产量。将野生型MreB菌株的诱导时间为32小时的值作为100％时的相对值，计算出由冷冻干燥粉末的重量计算的各个改造丝心蛋白的生产量(每个细胞的生产量)。
在培养期间，定期取出一部分培养液，利用颗粒计数分析仪(CDA-1000，希森美康)来测量重组细胞的平均粒径。
(4)结果
图1是表示MreB突变株和野生型MreB菌株的平均粒径相对于培养时间而绘制的图。横轴C0是从种子培养切换到生产培养的时间点，T0是通过表达诱导剂开始生产重组蛋白的时间点。MreB突变株在种子培养时营养丰富的培养基中，在大量细胞分裂增殖的同时，细胞的宽度比野生型MreB菌株大。之后，将其转移到生产培养基时，如图1的C0(向生产培养基的移植时间点)到T0(诱导表达时间点)之间所示，即使生产培养基的营养成分被同化野生型MreB菌株仍会继续细胞分裂，与此相对地，MreB突变株的增殖缓慢，野生型MreB菌株的平均粒径急速减少，与此相对地，MreB突变株几乎没有平均粒径的变化，在改造丝心蛋白诱导表达以后，MreB突变株的平均粒径与野生型MreB菌株相比仍然增加了30％左右。
图2是表示生产培养开始后16小时的MreB突变株和野生型MreB菌株的细胞自身的重量(从干燥菌体重量中减去生产后的重组蛋白的重量)的图。
图3是表示MreB突变株和野生型MreB菌株在生产培养开始后16小时的细胞增殖的图。如图2和图3所示，可知MreB突变株的增殖与野生型MreB菌株相比降低。
图4是表示MreB突变株和野生型MreB菌株的改造丝心蛋白生产量(每个细胞的生产量)的图。如图4所示，MreB突变株产生的改造丝心蛋白的生产量与野生型MreB菌株相比，在诱导表达后16小时增加了33％，在诱导表达后32小时增加了35％左右。
图5是表示MreB突变株和野生型MreB菌株的改造丝心蛋白生产量(每个培养基的生产量)的图。如图5所示，MreB突变株产生的改造丝心蛋白的生产量与野生型MreB菌株相比，在诱导表达后16小时增加了33％左右。
由结果可知，通过使用MreB突变株，在改造丝心蛋白生产培养时细胞增殖降低，从而每个细胞的改造丝心蛋白的收率明显提高。此外，与目标蛋白质相比，菌体数量少，因此在可以减轻破碎操作方面，与使用野生型MreB菌株相比，确认使用了MreB突变株在改造丝心蛋白的制备中更为有利。
[实施例2](1)诱导表达改造丝心蛋白的大肠杆菌菌株的制备
与实施例1相同，获得具有改造丝心蛋白PRT966的pET-22(+)/PRT966载体。此外，与实施例1相同，以大肠杆菌BL21(DE3)菌株为宿主，获得具有3个改造丝心蛋白表达盒的重组细胞。
(2)诱导表达形态形成控制因子sulA的大肠杆菌菌株的制备
(形态形成控制因子的表达盒载体的制备)
通过使用了下述sulA_F和sulA_R的引物组的PCR，对编码sulA基因的蛋白质的区域(CDS)进行扩增。此外，通过使用了下述RBS-4和pET-MCS_F的引物组的PCR，将具有attP(P21)位点的质粒载体attP21-KmR2线性化并扩增。使用NEBuilder HiFi DNA AssemblyMaster Mix(New England Biolabs Japan株式会社)，按照添附手册将扩增的这2个片段连接，并获得attP21-T7p-sulA-T7t-FRT-KmR2-ori_R6K-FRT载体。
sulA_F:5’-TTTAAGAAGGAGATATACATATGTACACTTCAGGCTATGCAC-3’(序列号8)
sulA_R:5’-TGTCGACGGAGCTCGAATTCTTAATGATACAAATTAGAGTGAATTTTTAGCCCGG-3’(序列号9)
RBS-4:5’-ATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAA-3’(序列号10)
pET-MCS_F:5’-GAATTCGAGCTCCGTCGAC-3’(序列号11)
对于扩增sulA的PCR，按照添附手册，将终浓度分别为0.2μM的引物和OD～0.01的BL21(DE3)细胞悬浊液与PrimeSTAR(注册商标)Max(宝生物株式会社制)混合，并且在98℃10秒、55℃5秒、72℃30秒的条件下进行30个循环。对于线性化并扩增attP21-KmR2的PCR，也同样地使用终浓度分别为0.2μM的引物和PrimeSTAR(注册商标)Max(宝生物株式会社制)，以1ng的attP21-KmR2载体为模板，在98℃10秒、55℃5秒、72℃30秒的条件下进行30个循环。所获得的表达载体的碱基序列通过桑格法进行确认。
(将形态形成控制因子的表达盒装入宿主染色体上)
接下来，将在染色体上具有3个通过(1)的方法获得的改造丝心蛋白表达盒的重组细胞作为宿主细胞，将attP21-T7p-sulA-T7t-FRT-KmR2-ori_R6K-FRT载体导入宿主，通过宿主染色体上的attB位点与该载体的attP(P21)位点之间的序列特异性的重组，将sulA表达盒装入宿主染色体上。另外，在宿主中预先导入具有int基因的辅助质粒pAH121(J.Bact183：6384-6393)，以表达整合酶。
(3)改造丝心蛋白的表达和评估
对通过上述(1)和(2)的方法获得的重组细胞(在染色体上具有3个改造丝心蛋白表达盒，且具有sulA的表达盒的重组细胞。以下，也称为“sulA诱导表达菌株”。)用与实施例1同样的方法进行培养，并对改造丝心蛋白的表达量进行解析。作为比较，对通过上述(1)的方法获得的重组细胞(在染色体上具有3个改造丝心蛋白表达盒，并且不具有sulA表达盒的重组细胞。以下，也称为“Control菌株”)也进行同样的评估。
在培养期间，定期取出一部分培养液，利用颗粒计数分析仪(CDA-1000，希森美康)来测量重组细胞的粒子浓度(细胞浓度)。
(4)结果
图6是表示sulA诱导表达菌株和Control菌株的平均粒径相对于培养时间而绘制的图。横轴T0是通过表达诱导剂开始生产重组蛋白(改造丝心蛋白)的时间点，T后的数字表示诱导表达后的经过时间。在改造丝心蛋白诱导表达以后，发现sulA诱导表达菌株的平均粒径增大，另一方面，Control菌株几乎没有变化。
图7是表示以改造丝心蛋白诱导表达时(T0)的Control菌株为基准(100％)时的Control菌株和sulA诱导表达菌株的细胞浓度(细胞数)相对值的变化的图。如图7所示，在改造丝心蛋白诱导表达后24小时，Control菌株的细胞浓度(细胞数)增加到127％，与此相对地，sulA诱导表达菌株的细胞浓度(细胞数)反而降低。
图8是表示sulA诱导表达菌株的细胞浓度(细胞数)相对于改造丝心蛋白诱导表达后24小时的Control菌株(100％)的相对值的图。
图9是表示以Control菌株为基准(100％)时的sulA诱导表达菌株的每个细胞的改造丝心蛋白生产量的相对值的图。如图9所示，sulA诱导表达菌株产生的每个细胞的改造丝心蛋白的生产量与Control菌株相比，在诱导表达后24和28小时增加到约200％以上。
图10是表示以Control菌株为基准(100％)时的sulA诱导表达菌株的每个培养基的改造丝心蛋白生产量的相对值的图。如图10所示，sulA诱导表达菌株产生的每个培养基的改造丝心蛋白的生产量与Control菌株相比，在诱导表达后24小时增加到约126％。
由结果可知，通过使用sulA诱导表达菌株，在改造丝心蛋白生产培养时细胞增殖降低，从而每个细胞的改造丝心蛋白的收率明显提高。此外，与目标蛋白质相比，菌体数量少，因此在可以减轻破碎操作方面，与使用了通常的改造丝心蛋白表达重组细胞(Control菌株)相比，确认使用sulA诱导表达菌株在改造丝心蛋白的制备中更为有利。
序列表
<110> Spiber株式会社
<120> 重组蛋白的制备方法
<130> FP19-1358-00
<160> 11
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 347
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 1
Met Leu Lys Lys Phe Arg Gly Met Phe Ser Asn Asp Leu Ser Ile Asp
1 5 10 15
Leu Gly Thr Ala Asn Thr Leu Ile Tyr Val Lys Gly Gln Gly Ile Val
20 25 30
Leu Asn Glu Pro Ser Val Val Ala Ile Arg Gln Asp Arg Ala Gly Ser
35 40 45
Pro Lys Ser Val Ala Ala Val Gly His Asp Ala Lys Gln Met Leu Gly
50 55 60
Arg Thr Pro Gly Asn Ile Ala Ala Ile Arg Pro Met Lys Asp Gly Val
65 70 75 80
Ile Ala Asp Phe Phe Val Thr Glu Lys Met Leu Gln His Phe Ile Lys
85 90 95
Gln Val His Ser Asn Ser Phe Met Arg Pro Ser Pro Arg Val Leu Val
100 105 110
Cys Val Pro Val Gly Ala Thr Gln Val Glu Arg Arg Ala Ile Arg Glu
115 120 125
Ser Ala Gln Gly Ala Gly Ala Arg Glu Val Phe Leu Ile Glu Glu Pro
130 135 140
Met Ala Ala Ala Ile Gly Ala Gly Leu Pro Val Ser Glu Ala Thr Gly
145 150 155 160
Ser Met Val Val Asp Ile Gly Gly Gly Thr Thr Glu Val Ala Val Ile
165 170 175
Ser Leu Asn Gly Val Val Tyr Ser Ser Ser Val Arg Ile Gly Gly Asp
180 185 190
Arg Phe Asp Glu Ala Ile Ile Asn Tyr Val Arg Arg Asn Tyr Gly Ser
195 200 205
Leu Ile Gly Glu Ala Thr Ala Glu Arg Ile Lys His Glu Ile Gly Ser
210 215 220
Ala Tyr Pro Gly Asp Glu Val Arg Glu Ile Glu Val Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Leu Ala Glu Gly Val Pro Arg Gly Phe Thr Leu Asn Ser Asn Glu Ile
245 250 255
Leu Glu Ala Leu Gln Glu Pro Leu Thr Gly Ile Val Ser Ala Val Met
260 265 270
Val Ala Leu Glu Gln Cys Pro Pro Glu Leu Ala Ser Asp Ile Ser Glu
275 280 285
Arg Gly Met Val Leu Thr Gly Gly Gly Ala Leu Leu Arg Asn Leu Asp
290 295 300
Arg Leu Leu Met Glu Glu Thr Gly Ile Pro Val Val Val Ala Glu Asp
305 310 315 320
Pro Leu Thr Cys Val Ala Arg Gly Gly Gly Lys Ala Leu Glu Met Ile
325 330 335
Asp Met His Gly Gly Asp Leu Phe Ser Glu Glu
340 345
<210> 2
<211> 1179
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PRT966
<400> 2
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Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ile
980 985 990
Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala
995 1000 1005
Gly Ile Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Ile Tyr Gly Pro Tyr Gly Pro
1010 1015 1020
Gly Ile Ser Gly Pro Gly Ser Gly Val Phe Gly Ile Gly Pro Tyr
1025 1030 1035
Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Pro
1040 1045 1050
Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ile Ser Ala Ala Ala Ala
1055 1060 1065
Ala Gly Pro Gly Ser Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Ile
1070 1075 1080
Asn Gly Pro Gly Ser Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro
1085 1090 1095
Gly Ile Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile Tyr Val Phe Gly Pro
1100 1105 1110
Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala
1115 1120 1125
Ala Gly Ile Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly
1130 1135 1140
Pro Gly Ile Ser Gly Ser Gly Val Phe Gly Pro Gly Val Phe Gly
1145 1150 1155
Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Val
1160 1165 1170
Phe Gly Pro Gly Ala Ser
1175
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His标签
<400> 3
Met His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser
1 5 10
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A2T-F引物
<400> 4
agcgtaactg cagtaggtca tg 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A2T-R引物
<400> 5
tactgcagtt acgcttttcg gt 22
<210> 6
<211> 169
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 6
Met Tyr Thr Ser Gly Tyr Ala His Arg Ser Ser Ser Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Ala Ser Lys Ile Ala Arg Val Ser Thr Glu Asn Thr Thr Ala Glu Leu
20 25 30
Ile Ser Glu Val Val Tyr Arg Glu Asp Gln Pro Met Met Thr Gln Leu
35 40 45
Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gln Gln Leu Gly Gln Gln Ser Arg Trp Gln
50 55 60
Leu Trp Leu Thr Pro Gln Gln Lys Leu Ser Arg Glu Trp Val Gln Ala
65 70 75 80
Ser Gly Leu Pro Leu Thr Lys Val Met Gln Ile Ser Gln Leu Ser Pro
85 90 95
Cys His Thr Val Glu Ser Met Val Arg Ala Leu Arg Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Ser Val Val Ile Gly Trp Leu Ala Asp Asp Leu Thr Glu Glu Glu His
115 120 125
Ala Glu Leu Val Asp Ala Ala Asn Glu Gly Asn Ala Met Gly Phe Ile
130 135 140
Met Arg Pro Val Ser Ala Ser Ser His Ala Thr Arg Gln Leu Ser Gly
145 150 155 160
Leu Lys Ile His Ser Asn Leu Tyr His
165
<210> 7
<211> 510
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 7
atgtacactt caggctatgc acatcgttct tcgtcgttct catccgcagc aagtaaaatt 60
gcgcgtgtct ctacggaaaa cactacagcc gagcttatca gtgaagttgt ctatcgcgaa 120
gatcagccca tgatgacgca acttctactg ttgccattgt tacagcaact cggtcagcaa 180
tcgcgctggc aactctggtt aacaccgcaa caaaaactga gtcgggaatg ggttcaggca 240
tctgggctac ccttaacgaa agtaatgcag attagccagc tctccccttg ccacactgtg 300
gagtcaatgg ttcgcgcttt acgcacgggc aattacagtg tggtgatcgg ttggttggca 360
gatgatttga ctgaagaaga gcatgctgaa cttgttgatg cggcaaatga aggtaacgct 420
atggggttta ttatgcgtcc ggtaagcgca tcctctcacg ccacgagaca actttccggg 480
ctaaaaattc actctaattt gtatcattaa 510
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sulA_F引物
<400> 8
tttaagaagg agatatacat atgtacactt caggctatgc ac 42
<210> 9
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sulA_R引物
<400> 9
tgtcgacgga gctcgaattc ttaatgatac aaattagagt gaatttttag cccgg 55
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RBS-4引物
<400> 10
atgtatatct ccttcttaaa gttaaacaaa 30
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pET-MCS_F引物
<400> 11
gaattcgagc tccgtcgac 19

Claims (18)

1.一种重组蛋白的制备方法，其具备：增殖降低工序，其用于降低表达重组蛋白的重组细胞的细胞增殖；
以及生产工序，其用于在降低细胞增殖的状态下，在蛋白质生产培养基中培养所述重组细胞以生产所述重组蛋白；
其中，在所述增殖降低工序中，通过使用包含至少一个改造后的形态形成控制因子在内的重组细胞作为所述重组细胞，来降低所述重组细胞的细胞增殖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述改造后的形态形成控制因子是突变型细胞骨架蛋白。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述突变型细胞骨架蛋白是突变型MreB。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述突变型形态形成控制因子包含与MreB具有至少90％的序列一致性的氨基酸序列。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其中，所述突变型形态形成控制因子在MreB的第53个氨基酸残基丙氨酸中具有突变。
6.根据权利要求3～5中任一项所述的制备方法，其中，所述突变型形态形成控制因子具有MreB的第53个氨基酸残基丙氨酸被苏氨酸取代的突变。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述重组细胞是导入了用于控制细胞骨架蛋白功能的蛋白质的表达盒的细胞。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，控制所述细胞骨架蛋白功能的蛋白质为sulA。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的制备方法，其中，所述蛋白质生产培养基包含天然来源成分。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的制备方法，其中，所述重组蛋白的疏水性为-1.0以上。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的制备方法，其中，所述重组蛋白为结构蛋白质。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的制备方法，其中，所述重组蛋白为丝心蛋白。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的制备方法，其中，所述重组蛋白为蜘蛛丝丝心蛋白。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的制备方法，其中，所述重组细胞为杆菌。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的制备方法，其中，所述重组细胞为属于埃希氏菌属的微生物。
16.一种增加每个细胞的重组蛋白的生产量的方法，该方法包括：
增殖降低工序，其用于降低表达重组蛋白的重组细胞的细胞增殖；
以及生产工序，其用于在降低细胞增殖的状态下，在蛋白质生产培养基中培养所述重组细胞以生产所述重组蛋白；
其中，在所述增殖降低工序中，通过使用包含至少一个改造后的形态形成控制因子在内的重组细胞作为所述重组细胞，来降低所述重组细胞的细胞增殖。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述改造后的形态形成控制因子是突变型细胞骨架蛋白。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述重组细胞是导入了用于控制细胞骨架蛋白功能的蛋白质的表达盒的细胞。
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