CN113430261A - 血清中脑部细胞来源的外泌体环状rna作为脑梗诊断标志物的应用 - Google Patents
血清中脑部细胞来源的外泌体环状rna作为脑梗诊断标志物的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113430261A CN113430261A CN202110545817.7A CN202110545817A CN113430261A CN 113430261 A CN113430261 A CN 113430261A CN 202110545817 A CN202110545817 A CN 202110545817A CN 113430261 A CN113430261 A CN 113430261A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- circ
- seq
- cerebral infarction
- detecting
- exosome
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 66
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 title claims abstract description 63
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 title claims abstract description 58
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title abstract description 35
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 title abstract description 11
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 title description 21
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims abstract description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 15
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 abstract description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 abstract description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 abstract description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 14
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 102000006941 Amino Acid Transport System X-AG Human genes 0.000 description 8
- 108010008063 Amino Acid Transport System X-AG Proteins 0.000 description 8
- 102100037029 Transmembrane protein 119 Human genes 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 5
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 5
- 101000598051 Homo sapiens Transmembrane protein 119 Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 101710170979 Transmembrane protein 119 Proteins 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 2
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 2
- CCEKAJIANROZEO-UHFFFAOYSA-N sulfluramid Chemical group CCNS(=O)(=O)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F CCEKAJIANROZEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 1
- -1 L1CAM Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 201000007455 central nervous system cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000025997 central nervous system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001627 cerebral artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002610 neuroimaging Methods 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001757 thermogravimetry curve Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了血清中脑部细胞来源的外泌体环状RNA作为脑梗诊断标志物的应用。与脑梗相关的外泌体环状RNA标志物或其组合，包括下列中的任意一种或多种：circ‑0007290,circ‑0049637,circ‑0000607,circ‑0004808,circ‑0000097。检测所述的与脑梗相关的外泌体环状RNA标志物或其组合的试剂在制备脑梗诊断或辅助诊断试剂中的应用。发明人通过高通量测序和定量PCR在近200例患者中分析发现血清中的外泌体内的5种环状RNA可以有效的将脑梗患者从正常人和临床症状与脑梗相似的非脑梗患者中区分开，ROC曲线下面积均大于0.83，可作为检测标志物应用于脑梗的诊断。
Description
技术领域
本发明属于医学诊断领域，涉及与脑梗相关的外泌体内环状RNA标志物及其应用。
背景技术
脑梗死又称缺血性脑卒中，是指局部脑组织因血液循环障碍，缺血、缺氧而发生的软化坏 死。脑梗死主要是由于供应脑部血液的动脉出现粥样硬化和血栓形成，使管腔狭窄甚至闭塞， 导致局灶性急性脑供血不足而发病；也有因异常物体(固体、液体、气体)沿血液循环进入脑 动脉或供应脑血液循环的颈部动脉，造成血流阻断或血流量骤减而产生相应支配区域脑组织软 化坏死者。脑梗死是严重危害人类健康的重大疾病，是具有高发病率和高致死率的一种神经系 统疾病，病死率平均10％～15％，致残率极高，且极易复发，复发性中风的死亡率大幅度增加。 目前脑梗死的诊断主要依赖于临床症状和影像学检查。其中，临床症状由于患者描述差异以及 易与脑部其它疾病发作症状类似而仅能用于粗略的初步判断；而影像学检查往往仅能在发病 6h后才能显示脑内变化。且对细小梗死部位不敏感，不能反映脑细胞损害的程度。此外，神 经影像学相关设备配置要求很高，开机检查费用也非常昂贵，导致大部分中小型医院无法配置 并进行检测。
外泌体是具有脂质双层膜结构、直径为30～100nm的微小囊泡。外泌体可以将包裹其内的 脂质、蛋白质、RNA等物质特异性运输到靶细胞调控靶细胞的功能，从而参与细胞与细胞之间 的相互调控。机体几乎所有细胞都可产生外泌体。组成中枢神经系统的细胞如星形胶质细胞、 小胶质细胞、少突胶质细胞、神经元等在病理、生理刺激时亦可分泌外泌体。外泌体在中枢神 经系统中广泛存在，携带重要的生物活性分子，在神经细胞间交流通讯发挥着重要的信使功能， 与中枢神经系统肿瘤、创伤、炎症感染、退行性疾病等发生发展关系密切，对中枢神经系统疾 病的诊断及治疗起着重要的作用。中枢神经系统分泌的外泌体被细胞分泌出来之后可以进入血 液中，这些血液中的外泌体可以反映中枢神经系统组成细胞的生理与病理状态，因此其成为一 种极具希望的潜在的中枢神经系统疾病诊断的标志物。在本发明中，我们研发了能够从血液中 分离脑部细胞来源外泌体的新方法，并且通过高通量测序和定量PCR技术鉴定了一组与脑梗相 关的脑部细胞来源外泌体的环状RNA。
发明内容
本发明的目的是提供与脑梗相关的外泌体环状RNA标志物或其组合。
本发明的另一目的是提供所述标志物或其组合的应用。
本发明的又一目的是提供检测所述标志物或其组合的试剂及其应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
与脑梗相关的外泌体环状RNA标志物或其组合,选自circ-0007290,circ-0049637, circ-0000607,circ-0004808,circ-0000097中的任意一种或多种；circ-0007290的序列如 SEQ ID NO.1所示，circ-0049637如SEQ ID NO.2所示，circ-0000607如SEQ ID NO.3所示， circ-0004808如SEQ ID NO.4所示，circ-0000097如SEQ ID NO.5所示。
检测所述的与脑梗相关的外泌体环状RNA标志物或其组合的试剂在制备脑梗诊断或辅助 诊断试剂中的应用。
作为本发明的一种优选，所述的检测所述的与脑梗相关的外泌体环状RNA标志物或其组合 的试剂选自PCR引物、探针、基因芯片。
作为本发明的进一步优选，所述的与脑梗相关的外泌体环状RNA标志物组合选自circ-0007290,circ-0049637,circ-0000607,circ-0004808,circ-0000097中的任意两种、三种、四种或五种环状RNA的组合。
作为本发明的进一步优选，所述的与脑梗相关的外泌体环状RNA标志物组合选自以下表格 中的任意一种：
作为本发明的更进一步优选，检测circ-0007290的引物序列如SEQ ID NO.6和SEQID NO.7 所示，检测circ-0049637的引物序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，检测circ-0000607 的引物序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，检测circ-0004808的引物序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示，检测circ-0000097的引物序列如SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.15 所示。
一种用于脑梗诊断或辅助诊断的引物组合物，包含检测所述的与脑梗相关的外泌体环状 RNA标志物或其组合的引物组合物；优选检测circ-0007290的引物序列如SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示，检测circ-0049637的引物序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，检测 circ-0000607的引物序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，检测circ-0004808的引物 序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示，检测circ-0000097的引物序列如SEQ ID NO.14 和SEQ ID NO.15所示。
一种脑梗诊断或辅助诊断试剂，包含本发明所述的引物组合物。
作为本发明的一种优选，所述的脑梗诊断或辅助诊断试剂包含检测circ-0007290, circ-0049637,circ-0000607,circ-0004808以及circ-0000097的引物。
有益效果：
本发明以精准医疗的新型医学概念与医疗模式为指引，在长期的基础研究和临床实践中发 现血清中的脑部细胞来源的外泌体内的特定5种环状RNA中的任意一个或其组合在脑梗患者与 正常人和临床症状与脑梗相似的非脑梗患者中均具有显著的差异。发明人通过高通量测序和定 量PCR在近200例患者中分析发现血清中的外泌体内的5种环状RNA可以有效的将脑梗患者从 正常人和临床症状与脑梗相似的非脑梗患者中区分开，ROC曲线下面积均大于0.83。总体来说， 这5个优选的环状RNA或其组合均可作为检测标志物应用于脑梗的诊断。
附图说明
图1.分离的外泌体特征。(A)电镜下外泌体。(B)Nanosight检测外泌体直径。(C)Western blotting检测外泌体特异性蛋白CD63,L1CAM,GLAST和TMEM119。
图2.血清中脑部细胞来源外泌体环状RNA表达谱。(A)火山图。蓝色的点代表在脑梗血清脑 部来源外泌体中下降的环状RNA；红色的点代表在脑梗血清脑部来源外泌体中上升的环状RNA； 黑色的点代表在脑梗血清脑部来源外泌体中不变的环状RNA。(B)血清脑部来源外泌体差异环 状RNA热图。蓝色代表在脑梗血清脑部来源外泌体中下降的环状RNA；红色的点代表在脑梗血 清脑部来源外泌体中上升的环状RNA。
图3.图A-E分别为circ-0007290,circ-0049637,circ-0000607,circ-0004808和circ-0000097在脑梗患者血清外泌体(stoke)和非脑梗对照者(non-stroke)中含量。
图4.图A-E分别为circ-0007290,circ-0049637,circ-0000607,circ-0004808、circ-0000097诊断脑梗的受试者工作特征曲线。
图5.circ-0007290,circ-0049637,circ-0000607,circ-0004808、circ-0000097多指标组 合诊断脑梗的受试者工作特征曲线。
具体实施方式
实施例1血清中脑部来源外泌体鉴定
收集脑梗患者与非脑梗患者血清，各5ml，分离外泌体利用电镜、Nanosight和western进 blotting进行鉴定。
第一步；血清中脑部来源外泌体RNA分离：
1)来自每个检测对象的5ml血清，在转速300g、室温的条件下离心10分钟，去除沉淀保留 上清；
2)将上一步获得的上清在转速10000g、室温的条件下离心30分钟，去除沉淀保留上清；
4)向第三步获得的上清中加入偶联L1CAM(L1 cell adhesion molecule),GLAST(Glutamate aspartate transporter)和TMEM119(transmembrane protein119)抗体的磁珠，室温孵育1h 后，利用磁性分离柱分离磁珠。
5)收集磁珠，利用洗脱缓冲液(0.1M Glycine，0.1％(v/v)Tween-20，pH2.5)将磁珠结合的 外泌体洗脱下来，进行电镜，Nanosight和Western blotting检测。
检测结果：
对分离的外泌体进行电镜检测，检测结果如图1A所示，外泌体直径约为100-200nm并呈 现双层膜结构；Nanosight检测也显示分离得到的外泌体直径在100-200nm(图1B)；Western blotting检测结果表明，分离的外泌体具有外泌体标志蛋白CD63,并且含有脑部细胞外泌体特 异性蛋白L1CAM,GLAST和TMEM119(图1C)。
实施例2血清中脑部来源外泌体环状RNA表达谱鉴定
收集3例脑梗患者与3例非脑梗患者血清，各5ml，分离外泌体，利用高通量测序检测外 泌体内环状RNA(circRNA)表达。
第一步；血清中脑部来源外泌体RNA分离：
1)来自每个检测对象的5ml血清，在转速300g、室温的条件下离心10分钟，去除沉淀保留 上清；
2)将上一步获得的上清在转速10000g、室温的条件下离心30分钟，去除沉淀保留上清；
4)向第三步获得的上清中加入偶联L1CAM(L1 cell adhesion molecule),GLAST(Glutamate aspartate transporter)和TMEM119(transmembrane protein119)抗体的磁珠，室温孵育1h 后，利用磁性分离柱分离磁珠。
5)收集磁珠，利用洗脱缓冲液(0.1M Glycine，0.1％(v/v)Tween-20，pH2.5)将磁珠结合的 外泌体洗脱下来，利用Trizol提取外泌体内RNA，通过高通量测序，检测外泌体内环状 RNA(circRNA)。
检测结果：
对分离的外泌体提取RNA后，利用高通量测序检测外泌体内环状RNA。检测结果发现脑梗 患者和非脑梗患者血清脑部来源外泌体内都存在者丰富的环状RNA，并且火山图(图2A)和热 图(图2B)分析表明脑梗患者与非脑梗患者相比，血清脑部来源外泌体内环状RNA存在着显 著差异，其中有95个环状RNA上升，412个环状RNA下降。进一步分析数据我们发现 circ-0007290,circ-0049637,circ-0000607,circ-0004808和circ-0000097五条环状RNA 在脑梗环状血清脑部细胞来源外泌体中显著上升。基于此，我们后期重点检测这五条环状RNA。
实施例3血清中能够作为脑梗早期诊断的脑部来源外泌体环状RNA定量检测
收集500例脑梗患者与200例非脑梗患者血清，各5ml，分离脑部细胞来源外泌体，利用 高通量测序检测外泌体内环状RNA(circRNA)表达。
第一步；血清中脑部来源外泌体RNA分离：
1)来自每个检测对象的5ml血清，在转速300g、室温的条件下离心10分钟，去除沉淀保留 上清；
2)将上一步获得的上清在转速10000g、室温的条件下离心30分钟，去除沉淀保留上清；
4)向第三步获得的上清中加入偶联L1CAM(L1 cell adhesion molecule),GLAST(Glutamate aspartate transporter)和TMEM119(transmembrane protein119)抗体的磁珠，室温孵育1h 后，利用磁性分离柱分离磁珠。
5)收集磁珠，利用洗脱缓冲液(0.1M Glycine，0.1％(v/v)Tween-20，pH2.5)将磁珠结合的 外泌体洗脱下来，利用Trizol提取外泌体内RNA，通过环状RNA特异性引物(表1)，对环状 RNA进行定量PCR(qRT-PCR)检测。
表1
检测结果
对分离的外泌体提取RNA后，利用环状RNA特异性引物对环状RNA进行定量PCR(qRT-PCR) 检测，检测结果表明circ-0007290,circ-0049637,circ-0000607,circ-0004808和 circ-0000097含量在脑梗患者血清外泌体中显著高表达(图3)。
进一步，利用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristiccurve,简称 ROC曲线)分析发现，circ-0007290,circ-0049637,circ-0000607,circ-0004808和 circ-0000097能够有效区分脑梗患者和非脑梗对照，其曲线下面积分别为0.8317,0.8440,0.8973,0.8563,0.8772(图4)。通过二元逻辑回归分析，
(1)当circ-0007290,circ-0049637,circ-0000607,circ-0004808和circ-0000097五 个指标两两组合使用时，我们一共得到10种组合，这10种组合和对应的曲线下面积如表格2 所示，其最大曲线下面积为0.953(图5A和表2)。
(2)当circ-0007290,circ-0049637,circ-0000607,circ-0004808和circ-0000097五 个指标三个指标组合使用时，我们一共得到10种组合，这10种组合和对应的曲线下面积如表 格2所示，其最大曲线下面积为0.953(图5B和表2)。
(4)当circ-0007290,circ-0049637,circ-0000607,circ-0004808和circ-0000097 五个指标四个指标组合使用时，我们一共得到5种组合，这5种组合和对应的曲线下面积如表 格2所示，其最大曲线下面积为0.953(图5C和表2)。
(5)当circ-0007290,circ-0049637,circ-0000607,circ-0004808和circ-0000097五 个指标组合使用时，我们一共得到1种组合，这种组合和对应的曲线下面积如表格2所示，其 最大曲线下面积为0.957(图5D和表2)。
表2
序列表
<110> 镇江维思生物科技有限责任公司
南京大学
<120> 血清中脑部细胞来源的外泌体环状RNA作为脑梗诊断标志物的应用
<150> 2021105321013
<151> 2021-05-17
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 403
<212> DNA
<213> 人类( Homo sapiens)
<400> 1
attgctagtc atagtggcta tgtgcagatt gactggaaga gagttgaaaa agatgtaaat 60
aaagcaaaaa gacagattaa gaaacgagcg aacaaagcag cacctgaaat caacaattta 120
attgaagaag caacagaatt tatcaagcag aacattgtga tatccagtgg atttgtggga 180
ggctttttgc tcggacttgc atcttaagga catgaatatt ctcccataac ggattcaact 240
atgagaagag aagtggcagc aataaggcag tctctcaaaa gtcatactgc cagagtctct 300
agggcaagga gaaacaacta gctggacaat actcaattca caacttagca ttttgccatc 360
tgaagcttgg caaactagta tctgctgtaa aacaacctat atg 403
<210> 2
<211> 1911
<212> DNA
<213> 人类( Homo sapiens)
<400> 2
gcggcgtccg tccgtactgc agagccgctg ccggagggtc gttttaaagg gcccgcgcgt 60
tgccgccccc tcggcccgcc atgctgctat ccgtgccgct gctgctcggc ctcctcggcc 120
tggccgtcgc cgagcctgcc gtctacttca aggagcagtt tctggacgga gacgggtgga 180
cttcccgctg gatcgaatcc aaacacaagt cagattttgg caaattcgtt ctcagttccg 240
gcaagttcta cggtgacgag gagaaagata aaggtttgca gacaagccag gatgcacgct 300
tttatgctct gtcggccagt ttcgagcctt tcagcaacaa aggccagacg ctggtggtgc 360
agttcacggt gaaacatgag cagaacatcg actgtggggg cggctatgtg aagctgtttc 420
ctaatagttt ggaccagaca gacatgcacg gagactcaga atacaacatc atgtttggtc 480
ccgacatctg tggccctggc accaagaagg ttcatgtcat cttcaactac aagggcaaga 540
acgtgctgat caacaaggac atccgttgca aggatgatga gtttacacac ctgtacacac 600
tgattgtgcg gccagacaac acctatgagg tgaagattga caacagccag gtggagtccg 660
gctccttgga agacgattgg gacttcctgc cacccaagaa gataaaggat cctgatgctt 720
caaaaccgga agactgggat gagcgggcca agatcgatga tcccacagac tccaagcctg 780
aggactggga caagcccgag catatccctg accctgatgc taagaagccc gaggactggg 840
atgaagagat ggacggagag tgggaacccc cagtgattca gaaccctgag tacaagggtg 900
agtggaagcc ccggcagatc gacaacccag attacaaggg cacttggatc cacccagaaa 960
ttgacaaccc cgagtattct cccgatccca gtatctatgc ctatgataac tttggcgtgc 1020
tgggcctgga cctctggcag gtcaagtctg gcaccatctt tgacaacttc ctcatcacca 1080
acgatgaggc atacgctgag gagtttggca acgagacgtg gggcgtaaca aaggcagcag 1140
agaaacaaat gaaggacaaa caggacgagg agcagaggct taaggaggag gaagaagaca 1200
agaaacgcaa agaggaggag gaggcagagg acaaggagga tgatgaggac aaagatgagg 1260
atgaggagga tgaggaggac aaggaggaag atgaggagga agatgtcccc ggccaggcca 1320
aggacgagct gtagagaggc ctgcctccag ggctggactg aggcctgagc gctcctgccg 1380
cagagctggc cgcgccaaat aatgtctctg tgagactcga gaactttcat ttttttccag 1440
gctggttcgg atttggggtg gattttggtt ttgttcccct cctccactct cccccacccc 1500
ctccccgccc tttttttttt ttttttttaa actggtattt tatctttgat tctccttcag 1560
ccctcacccc tggttctcat ctttcttgat caacatcttt tcttgcctct gtccccttct 1620
ctcatctctt agctcccctc caacctgggg ggcagtggtg tggagaagcc acaggcctga 1680
gatttcatct gctctccttc ctggagccca gaggagggca gcagaagggg gtggtgtctc 1740
caacccccca gcactgagga agaacggggc tcttctcatt tcacccctcc ctttctcccc 1800
tgcccccagg actgggccac ttctgggtgg ggcagtgggt cccagattgg ctcacactga 1860
gaatgtaaga actacaaaca aaatttctat taaattaaat tttgtgtctc c 1911
<210> 3
<211> 606
<212> DNA
<213> 人类( Homo sapiens)
<400> 3
actgcaaatg aacactggac tccatgcata ttaaatgaag cagacaaaat tatatacaag 60
cttatacgac ttgatagtct tagcgcctac tggaatgtaa attgcagcat gtcttaccag 120
agatcaaggg aacagatttt ggatcagctg aaaaatgaaa ttcttacaag tggaaatata 180
cccccaaatt atcaatacat tttccagcca atatcagcct ctgcaaaact ctacatgaat 240
ccttatgcag aatcagagct caaaacgccc aaactggatt gcaacataga aatacaaaat 300
attgccattg aactgaccaa acctcagtac ttaagtatga ttgacctttt ggagtcagtg 360
gattatatgg ttaggaatgc gccttatagg aaatacaagc cttatttacc acttcatacc 420
aatggtcgac gatggtggaa atatgcaatt gattctgttc ttgaagttca tataagaagg 480
tatacacaga tgtggtcatg gagtaacata aaaaagcaca ggcagttact caagagttat 540
aaaattgcct acaaaaacaa gttaacacag tctaaagtct cagaagaaat acagaaagaa 600
attcag 606
<210> 4
<211> 246
<212> DNA
<213> 人类( Homo sapiens)
<400> 4
tgaaagccct gtgtaaggaa tgtgtagtag aacgttgtcg catattgcgt ctgaagaacc 60
aactaaatga agattataaa actgttaata atctgctgaa agcagcagta aagggcagcg 120
atggattttg ggtggggaag tcctccttgc ggagttggcg ccagctagct cttgaacagc 180
tggatgagca agatggtgat gcagaacaaa gcaacggaaa gatgaacggt agcaccttaa 240
ataaag 246
<210> 5
<211> 210
<212> DNA
<213> 人类( Homo sapiens)
<400> 5
gtaatctatt taaagaagac accagaagaa gcctacagag cactcctgtc tggctcaaac 60
cccccctatc ttccattcag ggatgcttcc tttggaaatt gcacttacaa tctcaccatt 120
ctcgactgtt tgcagggaat cagaaaggga ttacaacatg gattttttga ctttgagaca 180
tttgatgtgg atgaatatga acattatgag 210
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgctgtaaaa caacctatat gattgct 27
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agcctcccac aaatccactg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaattttgtg tctccgcggc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tccttgaagt agacggcagg 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
accaatggtc gacgatggt 19
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccagtgttca tttgcagtct ga 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgccagctag ctcttgaaca 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cttacacagg gctttcactt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgcagggaat cagaaaggga 20
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtgtcttctt taaatagatt acctca 26
Claims (8)
1.与脑梗相关的外泌体环状RNA标志物或其组合,其特征在于,选自circ-0007290,circ-0049637,circ-0000607,circ-0004808,circ-0000097中的任意一种或多种；circ-0007290的序列如SEQ ID NO.1所示，circ-0049637如SEQ ID NO.2所示，circ-0000607如SEQ ID NO.3所示，circ-0004808如SEQ ID NO.4所示，circ-0000097如SEQ ID NO.5所示。
2.检测权利要求1所述的与脑梗相关的外泌体环状RNA标志物或其组合的试剂在制备脑梗诊断或辅助诊断试剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的检测权利要求1所述的与脑梗相关的外泌体环状RNA标志物或其组合的试剂选自PCR引物、探针、基因芯片。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的与脑梗相关的外泌体环状RNA标志物组合选自circ-0007290,circ-0049637,circ-0000607,circ-0004808,circ-0000097中的任意两种、三种、四种或五种环状RNA的组合。
5.根据权利要求3或4所述的应用,其特征在于,检测circ-0007290的引物序列如SEQID NO.6和SEQ ID NO.7所示，检测circ-0049637的引物序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，检测circ-0000607的引物序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，检测circ-0004808的引物序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示，检测circ-0000097的引物序列如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示。
6.一种用于脑梗诊断或辅助诊断的引物组合物，其特征在于包含检测权利要求1～4中任一项所述的与脑梗相关的外泌体环状RNA标志物或其组合的引物组合物。
7.根据权利要求6所述的引物组合物，其特征在于检测circ-0007290的引物序列如SEQID NO.6和SEQ ID NO.7所示，检测circ-0049637的引物序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，检测circ-0000607的引物序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，检测circ-0004808的引物序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示，检测circ-0000097的引物序列如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示。
8.一种脑梗诊断或辅助诊断试剂，其特征在于包含权利要求6所述的引物组合物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2021105321013 | 2021-05-17 | ||
| CN202110532101 | 2021-05-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113430261A true CN113430261A (zh) | 2021-09-24 |
Family
ID=77802453
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110545817.7A Pending CN113430261A (zh) | 2021-05-17 | 2021-05-19 | 血清中脑部细胞来源的外泌体环状rna作为脑梗诊断标志物的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113430261A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111349698A (zh) * | 2020-03-27 | 2020-06-30 | 镇江维思生物科技有限责任公司 | 与中枢神经系统感染疾病相关的外泌体内核酸标志物及其应用 |
| CN111534584A (zh) * | 2020-06-10 | 2020-08-14 | 南通大学 | 作为急性脑梗死诊断标志物的血清外泌体miR-410-3p的应用及其检测方法 |
| CN112156103A (zh) * | 2020-09-10 | 2021-01-01 | 暨南大学附属第一医院（广州华侨医院） | 一种环状RNA circ-FoxO3在制备防治缺血性脑卒中产品中的应用 |
| CN112176055A (zh) * | 2020-10-27 | 2021-01-05 | 江阴市人民医院 | hsa_circ_0069922作为标志物的应用 |
-
2021
- 2021-05-19 CN CN202110545817.7A patent/CN113430261A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111349698A (zh) * | 2020-03-27 | 2020-06-30 | 镇江维思生物科技有限责任公司 | 与中枢神经系统感染疾病相关的外泌体内核酸标志物及其应用 |
| CN111534584A (zh) * | 2020-06-10 | 2020-08-14 | 南通大学 | 作为急性脑梗死诊断标志物的血清外泌体miR-410-3p的应用及其检测方法 |
| CN112156103A (zh) * | 2020-09-10 | 2021-01-01 | 暨南大学附属第一医院（广州华侨医院） | 一种环状RNA circ-FoxO3在制备防治缺血性脑卒中产品中的应用 |
| CN112176055A (zh) * | 2020-10-27 | 2021-01-05 | 江阴市人民医院 | hsa_circ_0069922作为标志物的应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LEI ZUO ET AL.,: ""Circulating Circular RNAs as Biomarkers for the Diagnosis and Prediction of Outcomes in Acute Ischemic Stroke"", 《STROKE》 * |
| ZHAOFEI DONG ET AL.,: ""CircRNA expression profiles and function prediction in peripheral blood mononuclear cells of patients with acute ischemic stroke"", 《J CELL PHYSIOL》 * |
| 李武等: ""外泌体及其miRNA在神经系统常见疾病诊断和治疗中的研究进展"", 《生命科学研究》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20190264283A1 (en) | URINE EXOSOME mRNAS AND METHODS OF USING SAME TO DETECT DIABETIC NEPHROPATHY | |
| JP5934726B2 (ja) | 疾患マーカーの存在を被験者の血液サンプルで分析する方法 | |
| CN105400880B (zh) | 急性心肌梗死早期诊断标志物 | |
| AU2016361646B2 (en) | Method for assessing the risk of complications in patients with systemic inflammatory response syndrome (SIRS) | |
| CN109762899B (zh) | 一种利用尿液外泌体进行非侵入式检测患膀胱癌的概率的试剂盒 | |
| CN111560435A (zh) | 一种用于结直肠癌检测的dna甲基化试剂盒及使用方法、应用 | |
| CN111172287A (zh) | 外泌体lncRNA RN7SL5P作为内参基因在胃癌lncRNA检测中的应用 | |
| CN113774058B (zh) | 血清中脑部细胞来源的外泌体环状rna作为阿尔兹海默症诊断标志物的应用 | |
| CN111378756A (zh) | 肺结节良恶性甄别的标志物及其用途 | |
| CN114277031A (zh) | hsa_circ_0006420环状RNA及其在胶质瘤诊断、预后评估中的应用 | |
| CN107419008B (zh) | 一种早期精确诊断帕金森病的方法和试剂盒 | |
| CN113430261A (zh) | 血清中脑部细胞来源的外泌体环状rna作为脑梗诊断标志物的应用 | |
| CN109136374B (zh) | 一种辅助诊断颅内动脉瘤的检测试剂盒及其应用 | |
| CN115287347B (zh) | 犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变生物标志物及其应用 | |
| WO2014032899A1 (en) | Diagnosis and treatment of lupus nephritis | |
| CN103160582A (zh) | 可用于检测与2型糖尿病相关的gck基因甲基化程度的试剂盒及其应用 | |
| CN113355417B (zh) | 一种map3k10基因片段及引物在制备颅内动脉瘤检测试剂盒中的用途 | |
| CN112852950B (zh) | 急性心肌梗死生物标志物及其应用 | |
| CN111349698A (zh) | 与中枢神经系统感染疾病相关的外泌体内核酸标志物及其应用 | |
| CN109777873B (zh) | 一种非侵入式检测患膀胱癌的概率的试剂盒 | |
| CN113025707A (zh) | 生物标志物在制备诊断湿热困脾型2型糖尿病的产品中的应用、试剂盒 | |
| CN107557441B (zh) | 胶质瘤诊断标志物Circ2:23823258|23823569及应用 | |
| CN109266737B (zh) | 一种用于辅助诊断sca3/mjd的外泌体生物标志物及其筛选鉴定方法 | |
| CN116064768A (zh) | 视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断分子标记物circRNA试剂盒及应用 | |
| CN107557471B (zh) | 胶质瘤诊断标志物Circ6:22020339|22020542及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210924 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |