CN113425456B - Ecm梯度微纤维管及其制备装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医疗卫生技术领域，提供了一种ECM梯度微纤维管及其制备装置，包括微流控装置和装有质量浓度为2％的氯化钙的收集池，该微流控装置包括方形毛细管，该方形毛细管用环氧树脂固定在玻片的中央；方形毛细管中装载有注射池毛细管和收集池毛细管，注射池毛细管和收集池毛细管同轴排列并用树脂固定；注射池毛细管中插入有5孔毛细管，5孔毛细管用树脂固定在注射池毛细管中；5孔毛细管的每个孔中插入一根毛细管作为外接管，外接管用树脂固定在5孔毛细管的孔中；微流控装置用夹子固定在装有质量浓度为2‑5％的氯化钙的收集池上，微流控装置下缘的收集池毛细管浸在装有质量浓度为2‑5％的氯化钙的收集池中。
Description
技术领域
本发明涉及医疗卫生技术领域，更具体地说，是涉及一种ECM梯度微纤维管及其制备装置。
背景技术
细胞外基质(ECM)是复杂的结构体，其围绕并支持在哺乳动物或人体组织中发现的细胞。哺乳动物或人体组织的ECM包括结构蛋白(胶原蛋白和弹性蛋白)、特异性(specialized)蛋白(原纤维蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白)以及蛋白多糖。主要的纤维结构蛋白胶原蛋白和弹性蛋白负责组织强度和弹性，并在促进细胞生长和分化中起显著的作用。因此，ECM在人体组织中有着重要的作用。现有技术中已经开发出合成ECM纤维导管以及其他人造血管、组织的方法和和装置。
CN102899249A公开了将细胞外基质ECM和形成血管的细胞注入产生血管的装置的形成血管的通道中产生血管的方法。该方法提供一种产生体外血管的装置和方法。一种产生血管的装置，包括：a)与槽入口流体连通的槽通道；b)与源入口流体连通、基本上与槽通道平行的源通道；c)与形成血管的通道入口流体连通的形成血管的通道，其在槽通道和源通道之间设置成与槽通道和源通道的一侧接触，且基本上平行于源通道和槽通道；d)与第一培养通道入口流体连通的第一培养通道，其设置成与槽通道的另一侧接触，且基本上平行于槽通道；和e)与第二培养通道入口流体连通的第二培养通道，其与源通道的另一侧接触，且基本上平行于源通道，其中，多个微结构构造成允许包含在每个通道中的生物化学物质之间相互作用，且以设定的间隔被布置在各个相邻的通道的界面上。
CN102137926A公开了一种促进由成纤维细胞生成ECM和/或促进生物体系中成纤维细胞迁移的方法，本发明涉及促进生物体系中由一种或多种成纤维细胞生成细胞外基质的一种或多种成分和/或促进生物体系中一种或多种成纤维细胞的迁移的方法。所述方法包括将生物体系中的一种或多种成纤维细胞暴露于有效量的具有过氧化物酶活性的物质。
CN110201223A涉及可降解合成高分子与天然细胞外基质复合材料、人工血管及其制备方法，制备过程中的可降解合成高分子组分可选择一种或多种材料配比，可通过静电纺丝、湿法纺丝、熔融纺丝、3D打印、浇筑、相分离、粒子沥滤等多种技术制备成具有不同纤维直径、不同纤维排布、不同孔径、不同孔结构的支架材料。其中的天然细胞外基质组分其来源广泛，可选择不同种动物来源的血管组织(如猪、牛的动脉、静脉等)或者人类捐献者的血管组织(如脐带等)，并且可根据需求灵活调整其成分与含量。通过该制备技术制得的复合材料与人工血管既具有良好的力学性能、可控的空间结构及适宜的降解速度，又具有极佳的生物相容性与生物诱导活性。本发明的制备工艺简单，可控性高，条件温和，适合大规模工业化生产。
但到目前为止，虽然现有技术中存在一些人造导管的制备方法，但是这些方法中用于制备出的外周神经缺损的人造血管、导管大都是均匀浓度的，没有考虑到化学因子对细胞迁移的趋向性，而载有浓度梯度的导管大多通过化学方法接枝蛋白或药物，制备困难而且过程繁琐，其制成的导管生物兼容性差。因此亟需研发出一种具有ECM梯度的微纤维管及其制备装置。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ECM梯度微纤维管及其制备装置，构建了一个促进和引导神经生长的去细胞支架浓度梯度管，用于外周神经长段缺损修复，以解决背景技术中提出的技术问题中的至少一项。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种ECM梯度微纤维管的制备装置，包括微流控装置和装有质量浓度为2-5％的氯化钙的收集池，该微流控装置包括方形毛细管，该方形毛细管用环氧树脂固定在玻片的中央；所述的方形毛细管中装载有注射池毛细管和收集池毛细管，所述的注射池毛细管和收集池毛细管同轴排列并用树脂固定；所述的注射池毛细管中插入有5孔毛细管，所述的5孔毛细管用树脂固定在所述的注射池毛细管中；所述的5孔毛细管的每个孔中插入一根毛细管作为外接管，所述的外接管用树脂固定在所述5孔毛细管的孔中；所述的微流控装置用夹子固定在装有2-5％氯化钙的收集池上，所述微流控装置下缘的收集池毛细管浸在装有2-5％氯化钙的收集池中。
所述的5孔毛细管的尖端与所述注射池毛细管的管壁接触。
所述的5孔毛细管的每个孔中插入的外接管包括第一高浓度ECM外接管、第一低浓度ECM外接管、聚乙烯醇外接管、第二高浓度ECM外接管和第二低浓度ECM外接管。
所述的第一高浓度ECM外接管和第二高浓度ECM外接管通过医用微管连接到高浓度ECM无菌注射器的出口上。
所述的高浓度ECM无菌注射器固定在高浓度ECM微量注射泵上，所述的高浓度ECM无菌注射器中吸取有5-10mg/ml-1％的ECM-海藻酸钠水溶液。
所述的第一低浓度ECM外接管和第二低浓度ECM外接管通过医用微管连接到低浓度ECM无菌注射器的出口上。
所述的低浓度ECM无菌注射器固定在低浓度ECM微量注射泵上，所述的低浓度ECM无菌注射器中吸取有1-3mg/ml-1％的ECM-海藻酸钠水溶液。
所述的聚乙烯醇外接管通过医用微管连接到聚乙烯醇无菌注射器的出口上。
所述的聚乙烯醇无菌注射器固定在聚乙烯醇微量注射泵上，所述的聚乙烯醇无菌注射器中吸取有质量浓度为10-15％的聚乙烯醇。
本发明还提供一种ECM梯度微纤维管，该ECM梯度微纤维管采用上述的制备装置制备而成。
本发明的有益效果包括：
本发明所述的ECM梯度微纤维管及其制备装置采用新型的微流控技术，可以人为地设计组装微流控装置得到理想的材料构型。本发明所述的ECM梯度微纤维管能够在一条纤维管上实现去细胞支架浓度梯度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明所述的ECM梯度微纤维管的制备装置的结构示意图。
图2为本发明所述的ECM梯度微纤维管的制备装置的装配示意图。
图3为本发明实施例1制备的ECM梯度微纤维管桥接大鼠1cm坐骨神经缺损实验的神经丝NF-200免疫荧光染色图。
图4为本发明实施例1制备的ECM梯度微纤维管桥接大鼠1cm坐骨神经缺损实验的髓鞘MBP免疫荧光染色图。
图5为本发明实施例1制备的ECM梯度微纤维管的浓度梯度测试。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
需要说明的是，当部件被称为“固定于”或“设置于”另一个部件，它可以直接或者间接位于该另一个部件上。当一个部件被称为“连接于”另一个部件，它可以是直接或者间接连接至该另一个部件上。术语“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置为基于附图所示的方位或位置，仅是为了便于描述，不能理解为对本技术方案的限制。术语“第一”、“第二”仅用于便于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明技术特征的数量。“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
如图1和图2所示，本发明所述的ECM梯度微纤维管的制备装置包括微流控装置和装有质量浓度为2-5％的氯化钙的收集池3，该微流控装置包括方形毛细管1，该方形毛细管1用环氧树脂固定在玻片2的中央；所述的方形毛细管1中装载有注射池毛细管4和收集池毛细管5，所述的注射池毛细管4和收集池毛细管5同轴排列并用树脂固定；所述的注射池毛细管中插入有5孔毛细管，所述的5孔毛细管用树脂固定在所述的注射池毛细管中；所述的5孔毛细管的每个孔中插入一根毛细管作为外接管，所述的外接管用树脂固定在所述5孔毛细管的孔中；所述的微流控装置用夹子固定在装有2-5％氯化钙的收集池上，所述微流控装置下缘的收集池毛细管5浸在装有2-5％氯化钙的收集池中。
所述的5孔毛细管的尖端14与所述注射池毛细管的管壁13接触。
所述的5孔毛细管的每个孔中插入的外接管包括第一高浓度ECM外接管6、第一低浓度ECM外接管7、聚乙烯醇外接管8、第二高浓度ECM外接管9和第二低浓度ECM外接管10。
所述的第一高浓度ECM外接管6和第二高浓度ECM外接管9通过医用微管连接到高浓度ECM无菌注射器17的出口上。
所述的高浓度ECM无菌注射器17固定在高浓度ECM微量注射泵18上，所述的高浓度ECM无菌注射器17中吸取有5-10mg/ml-1％的ECM-海藻酸钠水溶液(即5mg/ml去细胞支架的1％海藻酸钠水溶液，都为质量浓度)。
所述的第一低浓度ECM外接管7和第二低浓度ECM外接管10通过医用微管连接到低浓度ECM无菌注射器19的出口上。
所述的低浓度ECM无菌注射器19固定在低浓度ECM微量注射泵20上，所述的低浓度ECM无菌注射器19中吸取有1-3mg/ml-1％的ECM-海藻酸钠水溶液(即1mg/ml去细胞支架的1％海藻酸钠水溶液，都为质量浓度)。
所述的聚乙烯醇外接管8通过医用微管连接到聚乙烯醇无菌注射器15的出口上。
所述的聚乙烯醇无菌注射器15固定在聚乙烯醇微量注射泵16上，所述的聚乙烯醇无菌注射器15中吸取有质量浓度为10-15％的聚乙烯醇。
本发明中所述的微流控装置的组装过程包括：
用环氧树脂将方形毛细管固定在玻片中央，将收集池毛细管和注射池毛细管装载在方形管中，调整位置确保它们同轴排列并用树脂将它们固定。将5孔毛细管插入装载好的注射池毛细管中使其尖端触碰到注射池毛细管壁，用树脂将其固定后，向每个孔中插入一根毛细管作为外接管，用树脂将其固定。微流控装置装载好后用乙醇浸泡晾干备用。
具体的，本发明中利用所述的ECM梯度微纤维管制备装置，来制备ECM梯度微纤维管的方法包括以下步骤：
将100mg/ml ECM凝胶与4％海藻酸钠溶液混合配制成终浓度为5-10mg/ml-1％以及1-3mg/ml-1％的ECM-海藻酸钠水溶液，并配制2-5％氯化钙和10-15％聚乙烯醇(PVA)。用1ml无菌注射器分别吸取不同浓度的ECM-海藻酸钠溶液以及PVA，将注射器固定在微量注射泵上并使用医用微管按顺序连接在微流控装置上。连接完成后用夹子将微流控装置固定在装有2-5％氯化钙的收集池上，确保微流控装置下缘浸在收集池中。装置连接完成后，设置注射泵流速：内相PVA溶液注射泵(即聚乙烯醇微量注射泵16)流速为0.5-1.5ml/h，外相注射泵(即高浓度ECM微量注射泵18和低浓度ECM微量注射泵20)流速为2-5ml/h。首先同时打开三个注射泵(即聚乙烯醇微量注射泵16、高浓度ECM微量注射泵18和低浓度ECM微量注射泵20)使液体充满装置，待收集池中出现混合管后关闭高浓度ECM外相通道(即高浓度ECM微量注射泵18)只打开低浓度ECM通道(即低浓度ECM微量注射泵20)，待低浓度ECM11成管稳定后，关闭低浓度ECM通道打开高浓度ECM通道即可得到梯度浓度ECM微纤维管。图2中可以看出低浓度ECM11和高浓度ECM12成管后得到梯度浓度ECM微纤维管的状态。
本发明还提供一种ECM梯度微纤维管，该ECM梯度微纤维管采用上述的制备装置按照实施例1-3的工艺制备而成。
实施例是利用本发明装置制备ECM梯度微纤维管的方法技术方案。
具体的，本发明ECM是细胞外基质，实施例中ECM来源于健康成年猪坐骨神经。优选地，ECM样品的处理方法：来源于取新鲜猪坐骨神经，用手术剪剪成小段后浸泡于1％TrionX-100中以120rpm转速4℃振摇12h。用磷酸盐缓冲液PBS摇洗3遍后浸泡于1％十二烷基硫酸钠SDS溶液中继续振摇48h。接着用PBS摇洗12h洗去残留的SDS后将去细胞样品冷冻干燥。将冻干的去细胞样品用打粉机打成粗粉，并用1mg/ml胃蛋白酶常温消化48h，最后调节溶液pH值约为7.4后-80℃分装保存样品。
实施例1
一种ECM梯度微纤维管的制备方法，包括以下步骤：
第一步、将100mg/ml ECM凝胶与质量浓度为4％的海藻酸钠溶液混合配制成终浓度为5mg/ml-1％以及1mg/ml-1％的ECM-海藻酸钠水溶液，并配制质量浓度为2％的氯化钙和质量浓度为10％的聚乙烯醇；
第二步、用1ml的无菌注射器分别吸取不同浓度的ECM-海藻酸钠水溶液以及聚乙烯醇，将无菌注射器固定在微量注射泵上并使用医用微管按顺序连接在微流控装置上；连接完成后用夹子将微流控装置固定在装有质量浓度为2％的氯化钙的收集池上，确保微流控装置下缘浸在收集池中；
第三步、连接完成后，设置注射泵流速：内相PVA溶液注射泵流速为0.5ml/h，外相注射泵流速为2ml/h；
第四步、所述的微量注射泵包括聚乙烯醇微量注射泵、高浓度ECM微量注射泵和低浓度ECM微量注射泵，首先同时打开所述的聚乙烯醇微量注射泵、高浓度ECM微量注射泵和低浓度ECM微量注射泵，使液体充满所述的微流控装置，待收集池中出现混合管后关闭高浓度ECM外相通道，只打开低浓度ECM通道，待低浓度ECM成管稳定后，关闭低浓度ECM通道打开高浓度ECM通道，得到梯度浓度ECM微纤维管。
实施例2
一种ECM梯度微纤维管的制备方法，包括以下步骤：
第一步、将100mg/ml ECM凝胶与质量浓度为4％的海藻酸钠溶液混合配制成终浓度为8mg/ml-1％以及1mg/ml-1％的ECM-海藻酸钠水溶液，并配制质量浓度为3％的氯化钙和质量浓度为12％的聚乙烯醇；
第二步、用1ml的无菌注射器分别吸取不同浓度的ECM-海藻酸钠水溶液以及聚乙烯醇，将无菌注射器固定在微量注射泵上并使用医用微管按顺序连接在微流控装置上；连接完成后用夹子将微流控装置固定在装有质量浓度为3％的氯化钙的收集池上，确保微流控装置下缘浸在收集池中；
第三步、连接完成后，设置注射泵流速：内相PVA溶液注射泵流速为0.8ml/h，外相注射泵流速为5ml/h；
第四步、所述的微量注射泵包括聚乙烯醇微量注射泵、高浓度ECM微量注射泵和低浓度ECM微量注射泵，首先同时打开所述的聚乙烯醇微量注射泵、高浓度ECM微量注射泵和低浓度ECM微量注射泵，使液体充满所述的微流控装置，待收集池中出现混合管后关闭高浓度ECM外相通道，只打开低浓度ECM通道，待低浓度ECM成管稳定后，关闭低浓度ECM通道打开高浓度ECM通道，得到梯度浓度ECM微纤维管。
实施例3
一种ECM梯度微纤维管的制备方法，包括以下步骤：
第一步、将100mg/ml ECM凝胶与质量浓度为4％的海藻酸钠溶液混合配制成终浓度为5mg/ml-1％以及2mg/ml-1％的ECM-海藻酸钠水溶液，并配制质量浓度为2％的氯化钙和质量浓度为10％的聚乙烯醇；
第二步、用1ml的无菌注射器分别吸取不同浓度的ECM-海藻酸钠水溶液以及聚乙烯醇，将无菌注射器固定在微量注射泵上并使用医用微管按顺序连接在微流控装置上；连接完成后用夹子将微流控装置固定在装有质量浓度为2％的氯化钙的收集池上，确保微流控装置下缘浸在收集池中；
第三步、连接完成后，设置注射泵流速：内相PVA溶液注射泵流速为0.5ml/h，外相注射泵流速为3ml/h；
第四步、所述的微量注射泵包括聚乙烯醇微量注射泵、高浓度ECM微量注射泵和低浓度ECM微量注射泵，首先同时打开所述的聚乙烯醇微量注射泵、高浓度ECM微量注射泵和低浓度ECM微量注射泵，使液体充满所述的微流控装置，待收集池中出现混合管后关闭高浓度ECM外相通道，只打开低浓度ECM通道，待低浓度ECM成管稳定后，关闭低浓度ECM通道打开高浓度ECM通道，得到梯度浓度ECM微纤维管。
对于实施例制备的ECM梯度纤维管的物理性质和性能表征如表1所示。
表1
实施例4
ECM梯度微纤维管桥接大鼠1cm坐骨神经缺损实验
取8周龄SD大鼠，随机分组，适应性饲养后，将SD大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉，取右下肢股骨下缘切口，钝性分离肌肉暴露坐骨神经。用玻璃分针剥离神经后行坐骨神经横断形成1cm神经缺损。组1为将装载有实施例1的ECM梯度微纤维管的硅胶管以9/0国产尼龙线端对端缝合与神经断端；组2为将装载有对比例1的ECM梯度微纤维管的硅胶管以9/0国产尼龙线端对端缝合与神经断端；组3为将装载有对比例2的ECM梯度微纤维管的硅胶管以9/0国产尼龙线端对端缝合与神经断端。术后青霉素20万u/d肌注7天。其中，对比例1为仅注射浓度为5mg/ml-1％的ECM溶液制备的ECM纤维管(制备方法同实施例1)；对比例2为仅注射浓度为1mg/ml-1％的ECM溶液(制备方法同实施例1)。
术后2周、4周及8周，行行为学脚步印记检测，按照公式计算坐骨神经功能指数SFI。坐骨神经功能指数是通过测量分析大鼠行走时患侧和健侧脚印并通过公式计算来表示神经损伤后运动功能恢复情况的一项重要指标。SFI越小功能恢复越差反之恢复越好。术后8周，取出移植段标本，多聚甲醛固定，冰冻包埋，5um层厚纵向切片，行神经丝NF-200和髓鞘MBP免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察神经生长及对接情况。
结果评价：
各组术后2周、4周及8周的行为学指标SFI情况，如表2所示。
| SFI得分 | 2周 | 4周 | 8周 |
| 实施例1 | -76.7±4.0 | -63.2±2.5 | -57.6±1.1 |
| 对比例1 | -87.2±3.8 | -78.9±3.3 | -69.1±2.5 |
| 对比例2 | -79.4±4.2 | -75.8±2.7 | -71.6±1.4 |
从上表可知，实施例1组的ECM梯度微纤维管促进了神经损伤后运动功能的恢复。术后8周移植段免疫荧光染色图3和图4中可知ECM梯度微纤维管促进神经纤维呈轴向排列生长和轴突再髓鞘化。
而对比例1的高浓度ECM纤维管在早期时运动功能恢复较差，在4周后明显好转，对比例2的低浓度ECM纤维管在早期运动功能恢复较好，随着时间延长运动功能指标改善较差。
实施例5
ECM梯度微纤维管浓度梯度表征
为验证本发明制备方法制备的产品对于ECM梯度浓度的有效性，以实施例1的产物为样品。对于实施例1中得到ECM梯度微纤维管，测试其沿径向的浓度梯度。首先获取特定长度的ECM纤维管，长度为1cm，接着通过纤维管中心线，(中心线选取纤维管的轴线并且垂直于血管横截面)，然后通过根据所确定的中心线，在纤维管上确定等分距离的5点，ABCDE，测量特定ECM的浓度，如图5所示。以标准5mgECM为参比，结果如表2。
表2
| ECM | A | B | C | D | E |
| ％ | 25％ | 45％ | 65％ | 85％ | 95％ |
可以看出，本发明制备的ECM梯度微纤维管，具有明显ECM浓度梯度，具有良好的强度、柔软性和弹性，组织活性高，生物相容性高，能够满足作为组织工程血管的需要。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种ECM梯度微纤维管的制备装置，其特征在于：所述的制备装置包括微流控装置和装有质量浓度为2-5％的氯化钙的收集池，该微流控装置包括方形毛细管，该方形毛细管用环氧树脂固定在玻片的中央；所述的方形毛细管中装载有注射池毛细管和收集池毛细管，所述的注射池毛细管和收集池毛细管同轴排列并用树脂固定；所述的注射池毛细管中插入有5孔毛细管，所述的5孔毛细管用树脂固定在所述的注射池毛细管中；所述的5孔毛细管的每个孔中插入一根毛细管作为外接管，所述的外接管用树脂固定在所述5孔毛细管的孔中；所述的微流控装置用夹子固定在装有质量浓度为2-5％的氯化钙的收集池上，所述微流控装置下缘的收集池毛细管浸在装有质量浓度为2-5％的氯化钙的收集池中；
所述的5孔毛细管的每个孔中插入的外接管包括第一高浓度ECM外接管、第一低浓度ECM外接管、聚乙烯醇外接管、第二高浓度ECM外接管和第二低浓度ECM外接管。
2.如权利要求1所述的ECM梯度微纤维管的制备装置，其特征在于，所述的5孔毛细管的尖端与所述注射池毛细管的管壁接触。
3.如权利要求2所述的ECM梯度微纤维管的制备装置，其特征在于，所述的第一高浓度ECM外接管和第二高浓度ECM外接管通过医用微管连接到高浓度ECM无菌注射器的出口上。
4.如权利要求3所述的ECM梯度微纤维管的制备装置，其特征在于，所述的高浓度ECM无菌注射器固定在高浓度ECM微量注射泵上，所述的高浓度ECM无菌注射器中吸取有5-10mg/ml-1％的ECM-海藻酸钠水溶液。
5.如权利要求2所述的ECM梯度微纤维管的制备装置，其特征在于，所述的第一低浓度ECM外接管和第二低浓度ECM外接管通过医用微管连接到低浓度ECM无菌注射器的出口上。
6.如权利要求4所述的ECM梯度微纤维管的制备装置，其特征在于，所述的低浓度ECM无菌注射器固定在低浓度ECM微量注射泵上，所述的低浓度ECM无菌注射器中吸取有1-3mg/ml-1％的ECM-海藻酸钠水溶液。
7.如权利要求2所述的一种ECM梯度微纤维管的制备装置，其特征在于，所述的聚乙烯醇外接管通过医用微管连接到聚乙烯醇无菌注射器的出口上。
8.如权利要求7所述的一种ECM梯度微纤维管的制备装置，其特征在于，所述的聚乙烯醇无菌注射器固定在聚乙烯醇微量注射泵上，所述的聚乙烯醇无菌注射器中吸取有质量浓度为10-15％的聚乙烯醇。
9.一种ECM梯度微纤维管，其特征在于，所述的ECM梯度微纤维管采用如权利要求1至8任一项所述的制备装置制备而成。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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