CN113398284A - 一种肿瘤靶向核素诊断与治疗分子探针及制备方法和应用 - Google Patents

一种肿瘤靶向核素诊断与治疗分子探针及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肿瘤靶向核素诊断与治疗分子探针及制备方法和应用，属于化学技术领域。本发明先通过CuAAC反应使得化合物G1的炔基和AmBF3的叠氮基发生成环反应，获得了标记前体Bim‑H1，然后通过同位素交换法成功合成了NIRF/PET双模态探针18F‑Bim‑H1，此探针既包含放射性核素18F，具有易量化、组织穿透能力强的优势；本发明先通过CuAAC反应使得化合物G1的炔基和AmBF3的叠氮基发生成环反应，获得了标记前体RT‑H2，然后选择Iodogen作为氧化剂成功合成了NIRF/Cherenkov双模态探针131I‑RT‑H2，此探针可以有效抑制HeLa细胞的增殖，对肿瘤具有治疗作用。

Description

一种肿瘤靶向核素诊断与治疗分子探针及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种肿瘤靶向核素诊断与治疗分子探针及制备方法和应用，属于化学技术领域。
背景技术
肿瘤是指生物体内由多种因素导致的其细胞异常生长而引发的疾病，按其对生物体的特性及危害又分为恶性肿瘤和良性肿瘤。恶性肿瘤，又称为癌症，有转移性和浸润性。癌症严重威胁人类健康，在人口老龄化、紧张的生活节奏、不良生活习惯以及大气污染等因素的共同作用下，癌症的发病率越来越高，发病年龄越来越年轻化。如何实现癌症的早期精准诊断已经成为目前亟待解决的问题。
生物素(Biotin)是一种水溶性维生素，别名维生素H。生物素可以促进生物体内脂肪、蛋白质的代谢，并且在合成维生素C过程中发挥着重要作用。生物素是细胞生长、增殖的必要物质，肿瘤细胞对于生物素的需要远远大于正常细胞。已经证明，生物素受体(Biotinreceptor，BR)在多种肿瘤细胞(Colo-26结肠癌细胞、肺癌细胞A549、宫颈癌细胞HeLa、乳腺癌细胞4T1、卵巢癌细胞ID8)中高表达。生物素属于小分子化合物，结构稳定，可以连接羧基、氨基、叠氮基等化学结构，进而通过化学合成的方法构建靶向分子探针，所以生物素可以作为一种生物标志物用于肿瘤的特异性成像。
公开号为CN112341474A的专利申请文本中公开了两个具有良好水溶性的花菁类肿瘤靶向探针(G1和G2)。引入PEG改善了花菁探针的亲水性，连接生物素增强了探针的肿瘤靶向性。在体外实验中，吸收、荧光光谱和辛醇-水分配系数均证明探针G1和G2具有较低的聚集趋势。体外细胞摄取实验和体内荧光成像实验均表明探针G1和G2可以特异性识别HeLa肿瘤细胞。但是，G1和G2荧光成像不易量化、组织穿透有限，并且，G1和G2均荧光探针无法抑制肿瘤细胞的增长。
因此，亟需找到一种易量化、组织穿透能力强且可抑制肿瘤细胞增长的生物素受体靶向的分子探针。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种生物素靶向的分子探针，所述生物素靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure BDA0003120446760000021
或者，所述生物素靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure BDA0003120446760000022
在本发明的一种实施方式中，所述分子探针的标记前体具有如下所示结构：
Figure BDA0003120446760000031
或者，所述分子探针的标记前体具有如下所示结构：
Figure BDA0003120446760000032
本发明还提供了一种制备上述生物素靶向的分子探针的方法，所述方法为：将CuSO4·5H2O、L-抗坏血酸钠盐和THPTA配体溶解在无机溶剂中，得到溶解液；在溶解液中加入化合物G1和AmBF3，得到混合液；在混合液中加入有机溶剂后进行反应，得到分子探针的标记前体；对分子探针的标记前体进行放射性标记，得到上述生物素靶向的分子探针；
或者，所述方法为：将CuSO4·5H2O、L-抗坏血酸钠盐和THPTA配体溶解在无机溶剂中，得到溶解液；在溶解液中加入化合物G1和4-(2-叠氮乙基)-苯酚，得到混合液；在混合液中加入有机溶剂后进行反应，得到分子探针的标记前体；对分子探针的标记前体进行放射性标记，得到上述生物素靶向的分子探针。
在本发明的一种实施方式中，化合物G1具有如下所示结构：
Figure BDA0003120446760000041
在本发明的一种实施方式中，所述4-(2-叠氮乙基)-苯酚的制备方法为：将叠氮化钠溶解于溶剂中，得到溶解液1；将4-(2-溴乙基)-苯酚溶解于DMF中，得到溶解液2；将溶解液1和溶解液2混合后进行反应，得到4-(2-叠氮乙基)-苯酚。
在本发明的一种实施方式中，所述反应为：在氮气保护下，于20～30℃进行反应。
在本发明的一种实施方式中，所述无机溶剂为H2O；所述有机溶剂为DMF。
在本发明的一种实施方式中，所述DMF在混合液中的添加量为：混合液中的溶剂比例是DMF：H2O＝5：1。
本发明还提供了上述分子探针在肿瘤显像中的应用。
本发明还提供了一种靶向肿瘤的显像剂，所述显像剂含有上述分子探针。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明先通过CuAAC反应使得化合物G1的炔基和AmBF3的叠氮基发生成环反应，获得了标记前体Bim-H1，然后通过同位素交换法成功合成了NIRF/PET双模态探针18F-Bim-H1；探针18F-Bim-H1具有以下优势：
第一，此探针既保留了化合物G1原有的花菁染料的荧光骨架，又包含放射性核素18F，其中，18F主导的PET成像易量化、组织穿透能力强，可以对深层组织处的肿瘤进行成像，因此，此探针在构建针对肿瘤组织的NIRF/PET双模态成像中具有极高的应用前景；
第二，通过同位素交换法制备此探针的18F离子转化率高达92％，纯化后的RCP>95％，整个标记过程无需使用制备型HPLC，且整个标记过程可以在1h以内完成，简单有效；
第三，此探针对肿瘤的体内靶向性极强，研究表明，此探针及其标记前体可以对HeLa荷瘤小鼠的肿瘤进行精准成像。
2、本发明先通过CuAAC反应使得化合物G1的炔基和AmBF3的叠氮基发生成环反应，获得了标记前体RT-H2，然后选择Iodogen作为氧化剂成功合成了NIRF/Cherenkov双模态探针131I-RT-H2；探针131I-RT-H2具有以下优势：
第一，此探针使用131I核素，131I核素具有较长的半衰期(半衰期为8.02天)，可在活体中获得更佳的靶本比；
第二，此探针使用131I核素，131I核素含有较高能量的β射线，可以产生切伦科夫效应，发出蓝色辉光，这种光信号可以被光学成像系统捕捉，体外实验表明，此探针的溶液可以发出切伦科夫辐射，其信号强度与探针的放射性剂量成正比，体内动物实验表明，注射此探针的溶液后，在小鼠的HeLa肿瘤中发现了明亮的切伦科夫辐射信号，肿瘤摄取明显高于肌肉，T/M在12h达到2.85±0.23，在24h达到3.56±0.19；
第三，选择Iodogen作为氧化剂制备此探针的131I-转化率高达74％，纯化后的RCP>97％，整个标记过程无需使用制备型HPLC，且整个标记过程可以在3.5min左右完成，简单有效；
第四，此探针对肿瘤的体内靶向性极强，研究表明，此探针及其标记前体可以对HeLa荷瘤小鼠的肿瘤进行精准成像；
第五，此探针对肿瘤具有治疗作用，体外细胞毒性实验表明，此探针可以有效抑制HeLa细胞的增殖，因此，此探针在开发针对肿瘤的治疗型探针中具有极高的应用前景。
附图说明
图1：生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1的合成路线。反应条件：(a)五水硫酸铜，THPTA，抗坏血酸钠，DMF/水＝5/1。
图2：生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1的ESI-MS分析结果。
图3：生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1的HPLC谱图。
图4：生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1的核磁共振氢谱图。
图5：生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1的核磁共振碳谱图。
图6：生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的标记前体RT-H2的合成路线。反应条件：(a)25℃；(b)L-抗坏血酸钠盐，THPTA，CuSO4·5H2O，25℃。
图7：生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的标记前体RT-H2的ESI-MS分析结果。
图8：生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的标记前体RT-H2的HPLC谱图。
图9：生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的标记前体RT-H2的核磁共振氢谱图。
图10：生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的标记前体RT-H2的核磁共振碳谱图。
图11：生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1分别与HeLa细胞和LO2细胞孵育12h后的细胞活力。
图12：生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1分别与HeLa细胞和LO2细胞孵育24h后的细胞活力。
图13：生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1与LO2细胞孵育12h的明场图像(左列)和荧光图像(右列)。比例尺＝50μm。
图14：生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1与HeLa细胞孵育12h的明场图像(左列)和荧光图像(右列)。比例尺＝50μm。
图15：裸鼠在通过尾静脉注射生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1后不同时间点的NIR图像。
图16：裸鼠在通过尾静脉注射生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1后不同时间点肾脏、肝脏和肌肉的平均荧光强度。
图17：裸鼠在通过尾静脉注射生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1后不同时间点的NIR图像(腹部向上)。
图18：裸鼠在通过尾静脉注射生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1后不同时间点肿瘤和主要器官的体外荧光图像。
图19：裸鼠在通过尾静脉注射生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1后不同时间点肿瘤和主要器官的荧光强度。
图20：裸鼠在通过尾静脉注射生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的标记前体RT-H2后不同时间点的近红外荧光成像。
图21：裸鼠在通过尾静脉注射生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的标记前体RT-H2后不同时间点肾脏、肝脏和肌肉的平均荧光强度。
图22：裸鼠在通过尾静脉注射生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的标记前体RT-H2后不同时间点的近红外荧光成像(腹部向上)。
图23：裸鼠在通过尾静脉注射生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的标记前体RT-H2后不同时间点肿瘤和主要器官的体外荧光图像。
图24：裸鼠在通过尾静脉注射生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的标记前体RT-H2后不同时间点肿瘤和主要器官的荧光强度。
图25：荷瘤小鼠在通过尾静脉注射生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1后不同时间点的NIR图像。
图26：生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的合成路线。
图27：纯化前，生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的HPLC谱图。
图28：纯化后，生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的HPLC谱图。
图29：生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的合成路线。
图30：纯化前，生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的HPLC谱图。
图31：纯化后，生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的HPLC谱图。
图32：生物素靶向的分子探针131I-RT-H2在HeLa细胞及经阻断的HeLa细胞中的细胞摄取值。
图33：生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1在PBS缓冲液中孵育不同时间后的HPLC谱图。
图34：生物素靶向的分子探针131I-RT-H2在PBS缓冲液中孵育不同时间后的HPLC谱图。
图35：荷瘤小鼠在通过尾静脉注射生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1后不同时间点的PET图像。
图36：Na131I和生物素靶向的分子探针131I-RT-H2分别与HeLa细胞孵育4h后的细胞活力。
图37：生物素靶向的分子探针131I-RT-H2与HeLa细胞孵育不同时间后的切伦科夫图像。
图38：生物素靶向的分子探针131I-RT-H2与HeLa细胞孵育不同时间后的切伦科夫辐射强度。
图39：不同辐射剂量生物素靶向的分子探针131I-RT-H2与HeLa细胞孵育4h后的切伦科夫图像。
图40：不同辐射剂量生物素靶向的分子探针131I-RT-H2与HeLa细胞孵育4h后的切伦科夫辐射强度。
图41：荷瘤小鼠在通过尾静脉注射生物素靶向的分子探针131I-RT-H2后不同时间点的切伦科夫图像。
图42：荷瘤小鼠在通过尾静脉注射生物素靶向的分子探针131I-RT-H2后不同时间点肿瘤和肌肉的切伦科夫辐射强度。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1：一种生物素靶向的分子探针的标记前体
本实施例提供了一种生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1，所述标记前体Bim-H1具有如下所示结构：
Figure BDA0003120446760000091
实施例2：一种制备生物素靶向的分子探针的标记前体的方法
本实施例提供了实施例1所述生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1的制备方法，所述方法包括如下步骤：
将CuSO4·5H2O(6.3mg,0.025mmol,0.5eq)、L-抗坏血酸钠盐(9.9mg,0.05mmol,1eq)和THPTA配体(THPTA,10.84mg,0.025mmol,0.5eq)溶解在H2O(200μL)中，得到溶解液；在溶解液中加入G1(G1的合成参照专利一种荧光显像探针及其制备方法和应用，申请号：2020112181003)(55.95mg,0.05mmol,1eq)和AmBF3(2-叠氮乙基-N，N-二甲基氨基甲基-三氟硼酸盐)(29.4mg,0.15mmol,3eq)，得到混合液；在混合液中加入DMF(二甲基甲酰胺)，控制混合液的溶剂比例是DMF：H2O＝5：1后，在氮气的保护下，于25℃搅拌1.5h，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪旋干溶剂后，通过半制备高效液相色谱仪纯化(半制备高效液相色谱纯化条件见表1)，得到粗产物；将粗产物冻干，得到生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1(Bim-H1的合成路线见图1)。
通过电喷雾质谱(ESI-MS)对Bim-H1进行表征，表征结果见图2。由图2可知，通过半制备型高效液相分离出纯度>97％的Bim-H1溶液，通过减压蒸馏去除溶液中的乙腈后，将剩余液体放至真空冷冻干燥机冻干。以43％的产率获得深绿色油状固体Bim-H1(28.3mg,0.0215mmol)。Bim-H1的化学式是C67H96BClN12O7S+([M]+)，通过Chemdraw软件计算的ESI-MS数值是1315.7，实测值是1315.6。
通过高效液相(高效液相表征条件见表2)对Bim-H1进行表征，表征结果见图3。由图3可知，Bim-H1的保留时间(tR)是17.6min，纯度大于95％。G1的炔基和AmBF3发生点击缩合反应形成三氮唑环状结构，Bim-H1的亲水性增强，极性增大，所以Bim-H1相比G1的保留时间(21.9min)提前了4.3min。
用氘代氯仿(500μL)溶解Bim-H1(21mg)，进行核磁共振氢谱、碳谱检测，检测结果见图4～5。
氢谱：1H NMR(400MHz，chloroform-d)δ8.35(dd，J＝13.7，9.9Hz，2H)，8.01(s，1H)，7.43–7.35(m，6H)，7.25(d，J＝7.3Hz，2H)，7.18(d，J＝7.8Hz，2H)，6.26(d，J＝14.1Hz，1H)，6.19(d，J＝14.0Hz，1H)，4.58(s，4H)，4.17(s，4H)，3.96–3.87(m，4H)，3.65–3.57(m，20H)，3.53(s，2H)，3.41(s，2H)，3.13(d，J＝9.5Hz，4H)，2.91–2.88(m，2H)，2.63(s，4H)，2.25–2.22(m，4H)，1.95(s，2H)，1.71(s，16H)，1.42(s，2H)，1.25(s，4H)。
碳谱：13C NMR(101MHz，CDCl3)δ172.79，172.13，151.05，145.19，144.53，142.08，141.94，141.09，140.94，128.97，128.89，127.97，127.72，125.51，125.23，122.21，122.18，110.89，110.75，101.73，100.98，70.30，70.27，70.23，69.95，69.78，69.33，62.40，55.51，54.89，50.40，49.38，49.23，44.43，43.75，40.48，40.45，39.27，35.45，29.68，28.17，28.14，27.93，27.82，26.37，26.35，26.01，25.43，22.34，20.72。
表1半制备高效液相色谱纯化条件
Time/min Flow(mL/min) H<sub>2</sub>O(0.1％TFA)％ CH<sub>3</sub>CN(0.1％TFA)％
0 3 60％ 40％
3 3 60％ 40％
30 3 0％ 100％
35 3 10％ 90％
40 3 60％ 40％
表2高效液相表征条件
Time/min Flow(mL/min) H<sub>2</sub>O(0.1％TFA)％ CH<sub>3</sub>CN(0.1％TFA)％
0 1 60％ 40％
3 1 60％ 40％
30 1 0％ 100％
35 1 10％ 90％
40 1 60％ 40％
实施例3：一种生物素靶向的分子探针的标记前体
本实施例提供了一种生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的标记前体RT-H2，所述标记前体RT-H2具有如下所示结构：
Figure BDA0003120446760000111
实施例4：一种制备生物素靶向的分子探针的标记前体的方法
本实施例提供了实施例3所述生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的标记前体RT-H2的制备方法，所述方法包括如下步骤：
4-(2-叠氮乙基)-苯酚的合成：将叠氮化钠(182.3mg,2.805mmol,5eq)溶解于H2O(0.5mL)中，得到溶解液1；将4-(2-溴乙基)-苯酚(112.7mg,0.561mmol,1eq)溶解于DMF(2.5mL)中，得到溶解液2；将溶解液1和溶解液2加入到反应瓶中，在氮气保护下，于25℃搅拌8h，得到反应液；将反应液通过半制备高效液相色谱仪纯化(半制备高效液相色谱纯化条件见表1)，得到4-(2-叠氮乙基)-苯酚。
探针前体RT-H2的合成：将CuSO4·5H2O(5.5mg,0.022mmol,0.5eq)、L-抗坏血酸钠盐(8.5mg,0.043mmol,1eq)和THPTA配体(THPTA,9.5mg,0.022mmol,0.5eq)溶解在H2O(200μL)中，得到溶解液；在溶解液中加入G1(G1的合成参照公开号为CN112341474A的专利申请文本)(48.3mg,0.043mmol,1eq)和4-(2-叠氮乙基)-苯酚(14mg,0.086mmol,2eq)，得到混合液；在混合液中加入DMF(二甲基甲酰胺)，控制混合液的溶剂比例是DMF：H2O＝5：1后，在氮气的保护下，于25℃下搅拌1.5h，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪旋干溶剂后，通过半制备高效液相色谱仪纯化(半制备高效液相色谱纯化条件见表1)，得到粗产物；将粗产物冻干，得到生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的标记前体RT-H2(RT-H2的合成路线见图6)。
通过电喷雾质谱(ESI-MS)对RT-H2进行表征，表征结果见图7。由图7可知，通过半制备型高效液相分离出纯度>98％的RT-H2溶液，通过减压蒸馏去除溶液中的乙腈后，将剩余液体放至真空冷冻干燥机冻干。最终以41％的产率获得深绿色固体RT-H2(28.3mg,0.0176mmol)。RT-H2的化学式是C70H93ClN11O8S+([M]+)，通过Chemdraw软件计算的ESI-MS数值是1282.7，实测值是1282.66。
通过高效液相(高效液相表征条件见表2)对RT-H2进行表征，表征结果见图8。由图8可知，RT-H2的保留时间(tR)是19.8min，纯度大于96％。G1的炔基和4-(2-叠氮乙基)-苯酚发生点击缩合反应，RT-H2相比G1增加了苯酚结构，极性增大，所以RT-H2相比G1的保留时间(21.9min)提前了2.1min。
用氘代氯仿(500μL)溶解RT-H2(21mg)，进行核磁共振氢谱、碳谱检测，检测结果见图9～10。
氢谱：1H NMR(400MHz，chloroform-d)δ8.30(d，J＝13.7Hz，2H)，7.96(d，J＝8.4Hz，1H)，7.71(d，J＝7.4Hz，2H)，7.34(s，4H)，7.18(d，J＝18.5Hz，4H)，6.82(d，J＝12.4Hz，4H)，6.20(d，J＝15.7Hz，2H)，5.30(d，J＝18.7Hz，1H)，4.50(d，J＝6.2Hz，4H)，4.29(s，2H)，4.14(d，J＝6.4Hz，4H)，3.83(s，2H)，3.58(s，18H)，3.50(s，2H)，3.37(s，2H)，3.17(d，J＝3.1Hz，1H)，3.04(s，2H)，2.82(d，J＝32.7Hz，4H)，2.57(s,2H)，2.21–2.17(m，4H)，1.99(d，J＝5.0Hz，2H)，1.64(d，J＝28.9Hz，18H)，1.40(s，6H)。
碳谱：13C NMR(101MHz，CDCl3)δ172.59，172.17，156.68，150.79，148.36，144.52，143.96，141.99，141.22，140.97，136.59，129.91，129.89，129.55，127.70，127.64，127.27，127.06，125.16，125.00，122.19，119.90，116.04，111.27，111.00，110.85，101.64，101.28，70.34，70.28，69.98，69.86，55.60，51.97，50.16，49.24，47.23，43.80，40.17，39.14，35.96，35.65，31.91，29.78，29.70，29.63，29.36，29.32，28.33，28.17，27.22，25.58，22.69，14.13。
实验例1：标记前体的脂质/水分配系数实验
本实验例提供了实施例1所述生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1的脂质/水分配系数实验，具体过程如下：
将实施例1所述生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1(20μL，100μM)和H2O(1mL)依次添加到正辛醇(1mL)中，得到混合液；将混合液充分震荡后离心3min。吸取150μL有机相测量其吸光度。根据标准曲线计算其浓度(Co)。G0的脂质/水分配系数(logP)可根据以下公式计算：
Log P＝lg(Co/CW)；
其中，Co代表标记前体在正辛醇中的浓度，Cw代表标记前体在水中的浓度。
由于G1连接了亲水基团AmBF3得到了Bim-H1，因此预测Log P Bim-H1<Log P G0。实验结果显示Bim-H1的Log P是0.449±0.025，验证了预测。
实验例2：标记前体的生物相容性评估实验
本实验例提供了实施例1所述生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1的生物相容性评估实验，通过3-(4，5--二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT法)来测定，具体过程如下：
先将1×104个HeLa细胞或LO2细胞(HeLa细胞和LO2细胞购自中科院上海细胞库)接种到分别添加有100μL DMEM高糖培养基(购自BI公司)和1640培养基(购自BI公司)的96孔板中(1个空白对照组和5个实验组，每个实验组设置为3加药孔)。于37℃、5％(v/v)CO2培养箱中培养12h至细胞贴壁后，去除原培养基，加入200μL含不同浓度的(3.125、6.25、12.5、25和50μM)实施例1所述生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1的溶液(溶剂为购自BI公司的完全培养基)到各实验孔中，继续在相同的条件下培养12和24h。孵育结束后，每个孔添加20μL MTT(MTT溶解在pH7.4的磷酸盐缓冲液中，浓度5mg/mL)，再于37℃下孵育4h。除去孔内上清液后，加入150μL的DMSO溶解甲瓒，用酶标仪记录490nm波长下的吸光度值，并根据公式：细胞存活率％＝(加药组的平均吸光度值/空白组的平均吸光度值)×100％，对细胞毒性进行评估。对照组只用培养基于相同条件下分别孵育12和24h。评估结果见图11～12。
由图11～12可知，Bim-H1对于HeLa细胞和LO2细胞的细胞毒性随着时间的孵育时间的延长略有增加，并且显示出浓度依赖性。当探针浓度是50μM，孵育时间是12h时，HeLa细胞的细胞活力为92.05±2.43％，LO2细胞的细胞活力为95.46±3.31％；当探针浓度是50μM，孵育时间是24h时，细胞活力略微下降，HeLa细胞的细胞活力为90.93±2.22％，LO2细胞的细胞活力为90.84±2.70％。可见，Bim-H1是低毒性的，可以用于后续的细胞、动物实验。
实验例3：标记前体的细胞摄取实验
本实验例以LO2和HeLa细胞分别作为生物素受体低表达的阴性细胞和高表达的阳性细胞，进行实施例1所述生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1的细胞摄取实验，具体过程如下：
先将1×104个HeLa细胞或LO2细胞(HeLa细胞和LO2细胞购自中科院上海细胞库)接种到分别添加有200μL DMEM高糖培养基(购自BI公司)和1640培养基(购自BI公司)的6孔板中。于37℃、5％(v/v)CO2培养箱中培养12h至细胞贴壁后，去除原培养基，加入200μL含25μM实施例1所述生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1的溶液(溶剂为购自BI公司的完全培养基)到各实验孔中，继续在相同的条件下培养6h。孵育结束后，将细胞用PBS洗涤3次，每孔加入PBS(200μL)维持细胞形态，并通过荧光显微镜观察细胞。观察结果见图13～14。
由图13～14可知，在和探针共同孵育12h后，Bim-H1和HeLa肿瘤细胞表面的生物素受体发生特异性结合，被内化到细胞内部，因此通过荧光显微镜观察到明亮的荧光。相反，在LO2阴性细胞中，几乎没有发现荧光信号。可见，Bim-H1可以特异性识别HeLa细胞。
实验例4：标记前体的生物代谢实验
本实验例提供了实施例1所述生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1以及实施例3所述生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的标记前体RT-H2的生物代谢实验，具体过程如下：
选择4～6周龄的裸鼠(雌，购自常州卡文斯公司)，用生理盐水稀释Bim-H1及RT-H2至25μM，通过尾静脉注射标记前体溶液(200μL)。在标记前体注射后的1、3、8、12、24、48、72、120h的时间点，使用异氟烷对裸鼠进行麻醉，并通过IVIS Spectrum荧光成像系统获取裸鼠的近红外荧光图像，通过成像系统的Living Image Software对裸鼠的肝脏、肾脏、肌肉部位平均荧光强度进行定量。检测结果见图15～17以及图20～22。
由于动物的表皮、肌肉等组织会对荧光信号有一定的遮挡作用，另选4～6周龄的裸鼠(雌，购自常州卡文斯公司)，用生理盐水稀释Bim-H1及RT-H2至25μM，通过尾静脉注射标记前体溶液(200μL)。在标记前体注射后的第3h后对裸鼠进行安乐死、解剖，对主要器官组织进行近红外荧光成像，通过Living Image Software计算各个器官的平均荧光强度，综合活体成像和离体生物分布结果，判断探针主要的代谢器官。检测结果见图18～19以及图23～24。
如图15～17所示，将Bim-H1(25μM，200μL)注射到小鼠体内，观察到1h内小鼠体内有明亮的荧光信号，说明Bim-H1随着血液循环分布到小鼠全身。并且，在小鼠肾脏、肝脏处的荧光强度明显高于肌肉等其他组织。通过肝脏、肾脏、肌肉处的荧光强度曲线可以看出肾脏、肝脏对Bim-H1的摄取在注射后1h达到峰值，并随着时间逐渐减弱。由此可判断，Bim-H1主要通过小鼠的肝脏和肾脏代谢。如图18～19所示，肝脏、肾脏的荧光强度较高，此结果与图15～17一致，说明肝脏、肾脏是Bim-H1的主要代谢器官。
如图20～22所示，将RT-H2(25μM，200μL)注射到小鼠体内，观察到1h内小鼠体内有明亮的荧光信号，说明RT-H2随着血液循环分布到小鼠全身。并且，在小鼠肾脏、肝脏处的荧光强度，明显高于肌肉等其他组织。通过肝脏、肾脏、肌肉处的荧光强度曲线可以看出肾脏、肝脏对RT-H2的摄取在注射后1h达到峰值，并随着时间逐渐减弱。由此可判断，RT-H2的主要代谢器官是肝脏和肾脏。如图23～24所示，肝脏、肾脏的荧光强度较高，此结果与图20～22一致，说明RT-H2在肝脏、肾脏的摄取较高。
实验例5：标记前体的荧光成像实验
本实验例提供了实施例1所述生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的标记前体Bim-H1的荧光成像实验，具体过程如下：
选择4～6周龄的HeLa荷瘤小鼠(购自常州卡文斯公司)，用生理盐水稀释Bim-H1至25μM，通过尾静脉注射，标记前体溶液(200μL)。在标记前体注射后的1、3、8、12、24、48、72的时间点，使用异氟烷对HeLa荷瘤进行麻醉，并通过IVIS Spectrum荧光成像系统获取HeLa荷瘤的近红外荧光图像，通过成像系统的Living Image Software对HeLa荷瘤的肿瘤、肌肉处的平均荧光强度进行定量。本实验本实验设置了对照组，对照组以ICG作为阴性探针，ICG是常用的NIRF染料，对肿瘤组织不具有靶向性。检测结果见图25。
如图25所示，在注射Bim-H1后6h，已经在肿瘤处观察到明亮的荧光信号，肝脏、肾脏的信号较强。随着时间的延长，探针从肝脏、肾脏等非靶组织逐渐清除，背景值逐渐清除，肿瘤处的荧光信号从6h一直持续至72h。在对照组(尾静脉注射ICG)实验中，0～72h，未在肿瘤处发现特异性摄取，以上实验结果表明Bim-H1可以特异性靶向HeLa肿瘤。
实施例5：一种生物素靶向的分子探针
本实施例提供了一种生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1，所述分子探针18F-Bim-H1具有如下所示结构：
Figure BDA0003120446760000171
实施例6：一种制备生物素靶向的分子探针的方法
本实施例提供了实施例5所述生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的制备方法，所述方法包括如下步骤：
哒嗪-盐酸缓冲液的配置：在西林瓶中加入H2O(4100μL)和DMF(6150μL)，然后加入哒嗪(1000μL)和浓盐酸(1050μL)，超声震荡5min。使用pH计测得溶液在2.0～2.5范围以内，放于冰箱保存。
放射性标记：分别使用NaHCO3溶液(0.5mol/L，10mL)与H2O(10mL)活化QMA柱，将回旋加速器产生的18F离子传靶通过QMA柱，此过程会使得18F离子吸附于QMA柱内。取哒嗪-盐酸缓冲液(300μL)将18F离子洗脱至1.5mL离心管内，然后加入实施例2制得的Bim-H1(0.75μmol，80μL)，充分震荡，将离心管置于80℃的油浴锅内，反应30min，期间每隔10min，摇动一次离心管。反应结束后，取反应液(2μL)，加入适量H2O稀释，用放射性HPLC检测反应过程中18F离子的转化率(18F-Bim-H1的合成路线见图26，HPLC检测结果见图27)。
放射性纯化：首先活化C18柱，吸取乙醇(10mL)注入C18柱，然后用H2O(10mL)冲洗。将反应液加入到西林瓶中，加入H2O(10mL)稀释并充分震荡，将稀释后的反应液用注射器注入C18柱，再用H2O(30mL)冲洗C18柱，洗去18F离子，然后用乙醇(500μL)注入C18柱，将18F-Bim-H1淋洗至离心管中。使用放射性HPLC测试产物的放射化学纯度(RCP)(HPLC检测结果见图28)。并计算放射化学产率(RCY)。
通过18F-19F同位素交换法，对Bim-H1进行放射性核素标记，引入核素18F，以此构建双模态探针18F-Bim-H1。由于18F的半衰期是109.8min，不宜进行长时间的标记与纯化过程。本实施例的一步法标记在30min之内就可以完成，纯化过程不需要使用放射性HPLC，简单有效。如图27所示，标记过程中18F离子转化率可达到92％。如图28所示，纯化后18F-Bim-H1的放射性化学纯度>95％，实际标记产率为15.15％。
实施例7：一种生物素靶向的分子探针
本实施例提供了一种生物素靶向的分子探针131I-RT-H2，所述分子探针131I-RT-H2具有如下所示结构：
Figure BDA0003120446760000191
实施例8：一种制备生物素靶向的分子探针的方法
本实施例提供了实施例7所述生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的制备方法，所述方法包括如下步骤：
放射性标记：通过涂覆法将20.19μg的Iodogen固定在1.5mL离心管内，加入实施例4制得的RT-H2(50μg，0.039μmol，1eq)，加入Na131I(9μL，1mCi)，再加入60μLPBS缓冲液，在25℃下孵育3.5min。使用放射性HPLC监测131I-转化率(131I-RT-H2的合成路线见图29，HPLC检测结果见图30)。
放射性纯化：首先活化C18柱，吸取乙醇(10mL)注入C18柱，然后用H2O(10mL)冲洗。将反应液加入到西林瓶中，加入H2O(10mL)稀释并充分震荡，将稀释后的反应液用注射器注入C18柱，再用H2O(30mL)冲洗C18柱，洗去18F离子，然后用乙醇(500μL)注入C18柱，将131I-RT-H2淋洗至离心管中。使用放射性HPLC测试产物的放射化学纯度(RCP)(HPLC检测结果见图31)。并计算放射化学产率(RCY)。
选择最佳的反应条件，反应4min后，吸出反应液体，反应溶液与固相氧化剂Iodogen分离，视为反应结束。如图30所示，131I-的保留时间为4.1min，131I-RT-H2的保留时间为21.1min，131I-的转化率为74％。如图31所示，标记产物131I-RT-H2的纯度大于97％，可以用于后续实验。
实验例6：分子探针的细胞摄取实验
本实验例提供了实施例7所述生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的细胞摄取实验，具体过程如下：
先将1×104个HeLa细胞(HeLa细胞购自中科院上海细胞库)接种到添加有200μLDMEM高糖培养基(购自BI公司)的6孔板中。于37℃、5％(v/v)CO2培养箱中培养12h至细胞贴壁后，去除原培养基，加入500μL含2μCi实施例**所述实施例**所述生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的溶液(溶剂为购自BI公司的完全培养基)到各实验孔中，继续在相同的条件下培养6h。培养过程中，分别于培养第0.5、1、2、4、5、6h吸出含2μCi实施例**所述实施例**所述生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的溶液，每孔加入PBS(500μL)，用刮板刮取细胞，并用γ计数器测量细胞内的放射性剂量。本实验设置了阻断组，即预先配置生物素溶液(浓度为400μM)，每孔加入生物素溶液(200μL)，孵育2小时，然后每孔加入500μL含2μCi实施例7所述生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的溶液(溶剂为购自BI公司的完全培养基)，在相同时间点测量细胞内的放射性剂量。测量结果见图32。
由图32可知，在实验组，随着131I-RT-H2与HeLa肿瘤细胞孵育时间的延长，细胞对131I-RT-H2的摄取逐渐增加，在4h时达到平台值，为3.95±0.16％AD。在阻断组中，使用过量生物素与HeLa细胞孵育2h，HeLa细胞对131I-RT-H2的摄取明显减少，在2h时已经达到平台值，为1.56±0.14％AD，只有实验组的39.5％。过量的生物素占据了HeLa细胞表面大部分的BR位点，导致HeLa细胞对131I-RT-H2的摄取值下降。此结果证明，131I-RT-H2在HeLa细胞的摄取是由生物素介导的。
实验例7：分子探针的体外稳定性实验
本实验例提供了实施例5所述生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1以及实施例7所述生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的体外稳定性实验，具体过程如下：
将PBS(200μL)置于离心管中，加入探针18F-Bim-H1(1mCi)或131I-RT-H2(500μCi)，在37℃下孵育0.5、1、3和4h，并用放射性HPLC检测其RCP。比较不同时间点的放射化学纯度，评估探针的稳定性。评估结果见图33～34。
由图33可知，在37℃下，孵育3h时，探针18F-Bim-H1的纯度为92％，孵育4h时，探针18F-Bim-H1的纯度为87％，在0～4h，并未发生脱氟现象，说明探针18F-Bim-H1的稳定性较强，可以进行后续实验。
由图34可知，孵育5h时，探针131I-RT-H2的纯度为94％，孵育4h时，探针131I-RT-H2的纯度为90％，在0～7h，未发生脱碘现象，这说明探针131I-RT-H2的稳定性较好，可以进行后续实验。
实验例8：生物素靶向的分子探针的PET成像实验
本实验例提供了实施例5所述生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1的PET成像实验，具体过程如下：
将活力良好，肿瘤大小合适的HeLa荷瘤小鼠(购自常州卡文斯实验动物公司)用含有2vt％异氟烷的氧气以1.5L/min的流速麻醉。小鼠的四肢与尾巴固定后，将溶解在200μL生理盐水中的260μCi的生物素靶向的分子探针18F-Bim-H1通过尾静脉注射。探针注射完毕后立即执行60min的动态PET扫描。感兴趣区域(ROI)的组织药物摄取通过ASIProVM软件进行定量分析。肿瘤与肌肉定量结果用每毫升肌肉肿瘤肿瘤摄取量占总给药量的比值(％ID/mL)表示。实验结果见图35。
由图35可知，在注射后0.5h，探针18F-Bim-H1遍布小鼠全身。整个过程，肝脏、肾脏、肠道处的摄取值较高。2h之后，小鼠体内的探针18F-Bim-H1逐渐被代谢出体外，由于18F核素的衰变，小鼠体内的PET信号也逐渐减弱。探针18F-Bim-H1在肿瘤处的摄取在整个扫描过程中并非达到最优显像效果。从荧光成像实验的结果来看，Bim-H1在HeLa荷瘤小鼠体内合适的成像时间点在6h及以后，0～5h小鼠体内肝脏、肠道处的背景值较高，Bim-H1还未从非靶组织中清除。因此，预测探针18F-Bim-H1合适的成像时间应该在6h及以后。然而，18F的半衰期只有109.8min，可通过选择长半衰期的核素对Bim-H1进行标记，可达到更优的PET显像效果。
实验例9：分子探针的细胞毒性实验
本实验例提供了实施例7所述生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的生物细胞毒性实验，通过3-(4，5--二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT法)来测定，具体过程如下：
先将1×104个HeLa细胞(HeLa细胞购自中科院上海细胞库)接种到分别添加有100μL DMEM高糖培养基(购自BI公司)和1640培养基(购自BI公司)的96孔板中(1个空白对照组和5个实验组，每个实验组设置为3加药孔)。于37℃、5％(v/v)CO2培养箱中培养24h至细胞贴壁后，去除原培养基，加入200μL含不同浓度的(2.5、5、10、20、40μCi)实施例7所述生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的溶液和Na131I溶液(溶剂为购自BI公司的完全培养基)到各实验孔中，继续在相同的条件下培养4h。培养结束后，用PBS洗去放射性溶液，每个孔加入200μL完全培养基，在37℃下继续孵育24h。孵育结束后，每个孔添加20μL MTT(MTT溶解在pH7.4的磷酸盐缓冲液中，浓度5mg/mL)，再于37℃下孵育4h。除去孔内上清液后，加入150μL的DMSO溶解甲瓒，用酶标仪记录490nm波长下的吸光度值，并根据公式：细胞存活率％＝(加药组的平均吸光度值/空白组的平均吸光度值)×100％，对细胞毒性进行评估。对照组只用培养基于相同条件下培养4h。根据实验组和对照组的平均吸光度的比值评价探针131I-RT-H2和Na131I的细胞毒性。评估结果见图36。
由图36可知，在Na131I与HeLa细胞共孵育4h后，用PBS清洗细胞，并继续孵育24h。在0～10μCi范围内，Na131I的细胞毒性很低，细胞活力保持在92％以上，可见Na131I并没有保留在HeLa细胞内，对HeLa细胞的影响很小。相反，在0～10μCi范围内，131I-RT-H2对HeLa细胞的影响较大，在10μCi时细胞活力只有83.73±1.67％，20μCi时，细胞活力下降为77.87±2.54％。这说明131I-RT-H2被HeLa细胞膜上的生物素受体识别并且内化到细胞内部，之后131I释放出的β射线使得HeLa细胞死亡。Ding等人设计了探针131I-2PEG-(GEBP11)3(具体可见参考文献：Zhang J,et al.Targeted radiotherapy with tumor vascular homingtrimeric GEBP11 peptide evaluated by multimodality imaging for gastriccancer.J Control Release,2013,172(1):322-329.)，该探针可以被Co-HUVEC细胞特异性摄取，并且在10μCi剂量时，细胞活力下降为53.28±2.42％。可见，131I标记的分子探针可以被肿瘤细胞特异性识别，131I释放出的β射线会有效抑制肿瘤细胞的生长。
实验例10：生物素靶向的分子探针的切伦科夫成像实验
本实验例提供了实施例5所述生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的切伦科夫成像实验，具体过程如下：
先将1×104个HeLa细胞(HeLa细胞购自中科院上海细胞库)接种到分别添加有100μL DMEM高糖培养基(购自BI公司)和1640培养基(购自BI公司)的96孔板中(1个空白对照组和5个实验组，每个实验组设置为3加药孔)。于37℃、5％(v/v)CO2培养箱中培养24h至细胞贴壁后，去除原培养基，加入200μL含不同浓度的(0、1、2μCi)实施例7所述生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的溶液(溶剂为购自BI公司的完全培养基)到各实验孔中，继续在相同的条件下培养4h。孵育结束后，在孵育后不同时间点(0、1、4h)，通过IVIS Spectrum荧光成像系统获取HeLa细胞的切伦科夫图像，成像时间设置为5min，成像核素选择131I。实验结果见图37～40。
由图37～40可知，在同一放射性剂量下，随着时间的延长，HeLa细胞摄取了更多的131I-RT-H2产生了更强的切伦科夫光信号，孵育4h产生的光信号强度是孵育1h的1.46倍。在相同条件下，随着131I-RT-H2放射性剂量的增大，HeLa细胞摄取131I-RT-H2后产生的切伦科夫光信号更强。131I-RT-H2(2μCi)与HeLa细胞共孵育后产生的光信号强度是131I-RT-H2(1μCi)的1.82倍。
实验例11：生物素靶向的分子探针的切伦科夫成像实验
本实验例提供了实施例5所述生物素靶向的分子探针131I-RT-H2的Cherenkov成像实验，具体过程如下：
选取肿瘤体积达到280mm3(a≈9mm；b≈8mm)的HeLa荷瘤小鼠(购自常州卡文斯实验动物公司)用含有2vt％异氟烷的氧气以1.5L/min的流速麻醉。小鼠的四肢与尾巴固定后，将溶解在400μL生理盐水中的1mCi的生物素靶向的分子探针131I-RT-H2通过尾静脉注射。在注射后不同时间点(0、8、12、24、36h)，通过IVIS Spectrum荧光成像系统获取HeLa荷瘤小鼠的切伦科夫图像，成像时间设置为5min，成像核素选择131I。实验结果见图41～42。
由图41～42可知，在注射后8h，已经在肿瘤处观察到较强的切伦科夫辐射信号，在8～36h，发现探针131I-RT-H2积聚在肿瘤处。通过定量分析也可以看出，在8、12、24和36h，肿瘤处的荧光强度明显高于肌肉。以上实验结果表明131I-RT-H2可以特异性靶向HeLa肿瘤组织。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种生物素靶向的分子探针，其特征在于，所述生物素靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure FDA0003120446750000011
或者，所述生物素靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure FDA0003120446750000012
2.如权利要求1所述的分子探针，其特征在于，所述分子探针的标记前体具有如下所示结构：
Figure FDA0003120446750000013
或者，所述分子探针的标记前体具有如下所示结构：
Figure FDA0003120446750000021
3.一种制备权利要求1或2所述分子探针的方法，其特征在于，所述方法为：将CuSO4·5H2O、L-抗坏血酸钠盐和THPTA配体溶解在无机溶剂中，得到溶解液；在溶解液中加入化合物G1和AmBF3，得到混合液；在混合液中加入有机溶剂后进行反应，得到分子探针的标记前体；对分子探针的标记前体进行放射性标记，得到生物素靶向的分子探针；
或者，所述方法为：将CuSO4·5H2O、L-抗坏血酸钠盐和THPTA配体溶解在无机溶剂中，得到溶解液；在溶解液中加入化合物G1和4-(2-叠氮乙基)-苯酚，得到混合液；在混合液中加入有机溶剂后进行反应，得到分子探针的标记前体；对分子探针的标记前体进行放射性标记，得到生物素靶向的分子探针。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，化合物G1具有如下所示结构：
Figure FDA0003120446750000022
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述4-(2-叠氮乙基)-苯酚的制备方法为：将叠氮化钠溶解于溶剂中，得到溶解液1；将4-(2-溴乙基)-苯酚溶解于DMF中，得到溶解液2；将溶解液1和溶解液2混合后进行反应，得到4-(2-叠氮乙基)-苯酚。
6.如权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，所述反应为：在氮气保护下，于20～30℃进行反应。
7.如权利要求3～6任一项所述的方法，其特征在于，所述无机溶剂为H2O；所述有机溶剂为DMF。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述DMF在混合液中的添加量为：混合液中的溶剂比例是DMF：H2O＝5：1。
9.权利要求1或2所述的分子探针在肿瘤显像中的应用。
10.一种靶向肿瘤的显像剂，其特征在于，所述显像剂含有权利要求1或2所述的分子探针。
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