CN113398112A - FA介导的BBA/CM-β-CD靶向递药系统、制备方法及其应用 - Google Patents

FA介导的BBA/CM-β-CD靶向递药系统、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，尤其涉及FA介导的BBA/CM‑β‑CD靶向递药系统、制备方法及其应用。本申请成功制备了经FA修饰并携载有BBA的羧甲基‑β‑环糊精包合物靶向递药系统BBA/FA‑PEG‑CM‑β‑CD，可以抑制结肠癌，并对肿瘤部位具有明确的靶向性；同时，其体内作用时间长、安全性高，能有效克服丁酸较差的药代动力学特征和狭窄的安全剂量以及BBA水溶性差、生物利用度低等缺点。这些发现为结肠癌的临床治疗提供了极为重要的新思路、新方法。

Description

FA介导的BBA/CM-β-CD靶向递药系统、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及FA介导的BBA/CM-β-CD靶向递药系统、制备方法及其应用。
背景技术
结肠癌(ColonCancer)是一种常见发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界处。国内的一项流行病学数据显示，结肠癌的发病率已跃居第4位，病死率居第5位。结肠癌主要为腺癌、黏液腺癌、未分化癌，其大体形态呈息肉状、溃疡型等。结肠癌的发病与生活习惯、饮食、遗传因素、炎症性肠病等有关。近年来我国结肠癌发病率呈逐年上升趋势，严重影响人们的生命健康，治疗结肠癌成为了亟待解决的问题。
目前，国内外对结肠癌的治疗主要包括外科手术和药物治疗。对于结肠癌，首选是外科手术切除，术后一般能达到60％-80％的五年生存率。然而，在肝转移的患者中有80％-90％无法获得根治性切除。目前临床上用于治疗结肠癌的常规药物主要包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨、替加氟、伊立替康、奥沙利铂、丁酸等。丁酸治疗结肠癌主要是作为组蛋白去乙酰化抑制剂，促进组蛋白高乙酰化，降低DNA转录活性，抑制结肠癌细胞增殖。由于丁酸较差的药代动力学特征和狭窄的安全剂量限制了它以传统的剂型在各种疾病治疗中的应用。肿瘤细胞对这些化疗药物产生了耐药性，其分子机制包括降低细胞内药物浓度、改变代谢或改变治疗的靶点。此外，药物副作用也限制了最大允许量，导致药物浓度不足以达到肿瘤的有效治疗浓度。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种FA介导的BBA/CM-β-CD靶向递药系统、制备方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种药物，其特征在于：所述药物为2-丁酰氧基-5-丁酰胺基苯甲酸。
本发明还提供了一种FA介导的BBA/CM-β-CD靶向递药系统的构建方法，以功能性PEG作为连接臂，利用酰胺反应原理，将FA连接到CM-β-CD表面，再利用饱和水溶液法与BBA混合制备目标递药系统BBA/FA-PEG-CM-β-CD；BBA为权利要求1中所述的2-丁酰氧基-5-丁酰胺基苯甲酸。
进一步地，FA-PEG-CM-β-CD的制备方法包括：向CM-β-CD溶液中加入NHS，搅拌混合后加入EDC，搅拌混合后，加入溶解后的FA-PEG-NH2，室温反应，冷冻干燥，得到FA-PEG-CM-β-CD。
进一步地，BBA/FA-PEG-CM-β-CD的制备方法包括：向溶液FA-PEG-CM-β-CD中加入BBA，加入甲醇溶解，除去甲醇后冷冻干燥，得到BBA/FA-PEG-CM-β-CD。
本发明还提供了利用上述的构建方法制备的结肠癌细胞靶向药物。结肠癌细胞包括人结肠癌细胞CaCo-2和SW620。
本发明还提供了如上述的靶向药物在制备治疗结肠癌的试剂中的应用。
本发明还提供了如上述的2-丁酰氧基-5-丁酰胺基苯甲酸在制备治疗结肠癌的试剂中的应用。
本发明还提供了2-丁酰氧基-5-丁酰胺基苯甲酸的合成方法，将2-羟基-5-丁酰胺苯甲酸与丁酸酐混合溶解，滴加浓硫酸，于80～85℃之间搅拌反应；冷却结晶，真空干燥得到2-丁酰氧基-5-丁酰胺基苯甲酸。
进一步地，2-羟基-5-丁酰胺苯甲酸的合成方法包括，向5-氨基水杨酸中加入饱和碳酸氢钠溶液，搅拌溶解；冰浴条件下向其中加入含有丁酰氯的丙酮溶液，室温反应；除去溶剂，剩余液体冷却后加盐酸酸化，溶液浑浊，抽滤，得到淡巧克力色沉淀即为2-羟基-5-丁酰胺苯甲酸。
本发明还提供了2-丁酰氧基-5-丁酰胺基苯甲酸的含量测定方法：采用高效液相色谱法测定BBA含量。色谱柱：Diamonsil C18柱(4.6*250mm,5μm)；流动相：乙腈：0.1mol/L乙酸＝50:50；检测波长：240nm；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本申请开发了新的药物BBA，通过两步化学反应，将丁酰氯和丁酸酐连接到5-ASA上，经过提纯得到纯净的BBA，经核磁氢谱、碳谱及质谱检测证明药物制备成功。在细胞增值抑制实验中，经过48h、72h孵育后，BBA的细胞存活率明显低于丁酸钠和5-ASA，另外，在动物药效学研究中，各治疗组裸鼠肿瘤大小形态的差别以及H&E染色进一步证明了BBA的抗癌功效明显强于单独的NaB和5-ASA原料药，其中TUNEL实验结果也得到类似的抗癌结果。这可能是丁酸通过抑制组蛋白去乙酰化作用及5-ASA抑制NF-κB和清除自由基治疗炎症反应作用联合，增强了单独的丁酸和5-ASA药效。
本申请开发了一种新的药物递送系统BBA/FA-PEG-CM-β-CD，并揭示了BBA/FA-PEG-CM-β-CD显著提高了对结肠癌细胞的治疗效率，同时对受试小鼠无毒性。通过化学合成法，用功能性PEG为连接臂，制备了FA-PEG-CM-β-CD，并通过再利用饱和水溶液法制备BBA/FA-PEG-CM-β-CD并证明其具有良好的体外靶向性。同时，与BBA/CM-β-CD相比，BBA/FA-PEG-CM-β-CD能增强BBA的稳定性，保护BBA避免被胃肠道代谢降解，并能显著提高SW620细胞的细胞凋亡和细胞摄取。MTT实验及细胞凋亡的结果表明，与BBA相比，BBA/FA-PEG-CM-β-CD对SW620细胞增强了细胞生长抑制作用，诱导细胞形态改变和凋亡。在动物药效学研究中，各治疗组裸鼠肿瘤大小形态的差别也得到了上述类似的抑制效果。其中BBA、BBA/CM-β-CD及BBA/FA-PEG-CM-β-CD对SW620、CaCo-2结肠癌细胞增殖抑制作用表现出剂量依赖性，以及对结肠癌荷瘤裸鼠的抗肿瘤作用均现出时间依赖性。在增强肿瘤生长抑制作用的同时，通过血常规、相关脏器药物分布检测，BBA/FA-PEG-CM-β-CD对受试小鼠显示出无毒性，因此其具有作为抗癌剂开发的巨大潜力。
附图说明
图1是目标药物递送系统BBA/FA-PEG-CM-β-CD到达结肠癌部位发挥作用示意图；
图2是BBA的合成；
图3是2-羟基-5-丁酰胺苯甲酸的结构表征；
图4是BBA的结构表征；
图5是CM-β-CD和FA-PEG-CM-β-CD的结构表征：通过核磁共振仪和傅里叶红外分光光度仪测定CM-β-CD(A)、FA-PEG-NH2(B)和FA-PEG-CM-β-CD(C)的核磁共振氢谱和红外光谱图(D)；
图6是FA-PEG-CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD的物理表征：通过傅里叶红外分光光度仪测定出BBA、FA-PEG-CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD的红外光谱图(A)。通过衍射谱仪测定出BBA、FA-PEG-CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD的XRD图谱(B)。通过扫描电镜测定出FA-PEG-CM-β-CD(C)和BBA/FA-PEG-CM-β-CD(D)的扫描电镜图；
图7是BBA、BBA/CM-β-CD andBBA/FA-PEG-CM-β-CD在pH7.4的溶出介质中考察的释放行为；
图8是BBA/FA-PEG-CM-β-CD的细胞增殖抑制实验：将CaCo-2细胞与不同浓度的BBA、BBA/CM-β-CD，BBA/FA-PEG-CM-β-CD以及FA-PEG-CM-β-CD溶液共同孵育24h(A)，48h(C)，72h(E)；SW620细胞进行同样的操作也孵育24h(B)，48h(D)，72h(F)；CaCo-2(G)和SW620(H)细胞与30μM的NaB、5-ASA、BBA、BBA/CM-β-CD、BBA/FA-PEG-CM-β-CD、FA-PEG-CM-β-CD溶液共同孵育48h，5-FU作为阳性对照。通过MTT试剂盒检测两种细胞与制剂在孵育不同时间段后的细胞存活率(n＝5)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001用于各组之间比较统计学差异；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001用于制剂组与BBA组之间比较统计学差异；
图9是对CaCo-2和SW620细胞的共聚焦激光扫描结果(A)和定量分析(B)：用Coumarin6标记BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD进行绿色荧光检测。37℃孵育2h后，用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞。使用Imagej软件分析绿色荧光强度，采用2-way ANOVA(***P<0.001,****P<0.0001)评价差异的显著性。各组数据以平均值±标准差表示(n＝3)；
图10是流式细胞仪检测AnnexinV/PI结合的散点图显示早期凋亡、晚期凋亡和坏死象限的细胞百分比；
图11是流式细胞术分析SW620细胞的细胞周期(A)。不同试剂孵育48h后，细胞周期变化如(B)所示。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,***P<0.0001；
图12是不同给药组在SW620异位移植瘤模型裸鼠的体内荧光成像：口服游离荧光DiD和包载DiD的包合物，在给药后3h、8h和12h观察不同给药组模型裸鼠的体内荧光分布(A)；在12h后处死裸鼠解剖分离心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织，在动物活体成像系统下观察(B)。通过Image J半定量分析裸鼠活体荧光(C)及组织荧光强度(D)。结果被表示为Mean±SD(n＝3)的形式。*P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001用来评估各组间的统计学差异；
图13是血浆中BBA、BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD的药物代谢动力学曲线。在给药后BALB/C裸鼠血浆中的BBA、BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD药物随时间变化的曲线图，结果表示为Mean±SD(n＝3)；
图14是各组制剂不同时间点在SW620荷瘤裸鼠的组织分布。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001评估差异的显著性。各组数据以平均值±SD表示(n＝3)；
图15是不同治疗方法对SW620移植瘤模型的抗肿瘤作用：每组SW620荷瘤裸鼠接种后第10d，每2d给予不同制剂：Saline(作为对照)、FA-PEG-CM-β-CD、5-ASA、NaB、BBA、5-FU、BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD。实验期间，第一次给药后每2d监测肿瘤体积(mm3)(A)。植入后25d对小鼠实施安乐死。测量肿瘤重量(B)，显示各组肿瘤组织代表性图像(C)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001用于各组之间比较统计学差异；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001用于制剂组与Saline组之间比较统计学差异；
图16是采用标准H&E染色(400×)测定坏死率和TUNEL法(400×)(D)检测凋亡；
图17是心脏、肝、肺、肾脏和肿瘤组织的H&E(400×)的组织病理学结果。
具体实施方式
本发明披露了FA(叶酸)介导的BBA/CM-β-CD靶向递药系统、制备方法及其应用，本发明目标药物递送系统BBA/FA-PEG-CM-β-CD到达结肠癌部位发挥作用示意图如图1所示。本发明拟通过两步化学反应制备得到BBA(2-丁酰氧基-5-丁酰胺基苯甲酸，图2)，然后选择功能性PEG作为连接臂，利用酰胺反应原理，将FA连接到CM-β-CD表面，再利用饱和水溶液法制备BBA/FA-PEG-CM-β-CD。本发明通过MTT实验验证目标递药系统的细胞增殖抑制作用；并通过激光共聚焦断层扫描技术检测SW620和CaCo-2细胞内荧光标记的分布情况；进行流式细胞仪检测细胞凋亡情况。另外，通过细胞周期试验观察目标递药系统作用于细胞周期的影响。此外，本发明还采取异位移植瘤方式建立动物模型，进行了实时荧光成像分析，以检测荧光标记的BBA/FA-PEG-CM-β-CD在体内的分布，并在裸鼠结肠癌模型中进行了体内研究，来评估BBA/FA-PEG-CM-β-CD的抑制作用。
本发明构建的靶向递药系统BBA/FA-PEG-CM-β-CD，可以抑制结肠癌，并对肿瘤部位具有明确的靶向性；同时，其体内作用时间长、安全性高，能有效克服丁酸较差的药代动力学特征和狭窄的安全剂量以及BBA水溶性差、生物利用度低等缺点。这些发现为结肠癌的临床治疗提供了极为重要的新思路、新方法。
统计分析：本发明中所有数据用SPSS 20.0进行统计学分析。计数资料用数字和百分比表示，计量资料用均数和标准差表示。析因设计的方差分析，检验时间和处理因素之间的作用。如果时间和处理因素之间有统计学差异，则用单因素方差分析，统计分析同一时间各处理因素对结果的影响。两两间的比较，用SNK法，检验水准设定为0.05。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1、2-丁酰氧基-5-丁酰胺基苯甲酸(BBA)的制备
1、2-羟基-5-丁酰胺苯甲酸的合成
称取0.4g(1.31mmol)5-氨基水杨酸置于50mL单口圆底烧瓶中，加入16mL饱和碳酸氢钠溶液搅拌溶解，在冰浴下，于圆底烧瓶中缓慢滴加入含有丁酰氯0.27mL的丙酮溶液8mL。滴加完毕，磁力搅拌，室温反应4h。TLC检测反应完全，减压旋蒸除去溶剂，剩余液体冷却后加0.5mL盐酸酸化，溶液浑浊，抽滤，得到淡巧克力色沉淀，最后真空干燥12h。
如图3所示，显示了2-羟基-5-丁酰胺苯甲酸样品的1H NMR和13C-NMR谱图，证实了2-羟基-5-丁酰胺苯甲酸样品的合成。2-羟基-5-丁酰胺苯甲酸的特征峰出现在(g)和(h)处，丁酰基的信号出现在(a)、(b)和(c)。其核磁氢谱的结构表征为:1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.97(s,1H),9.84(s,1H),8.10(s,1H),7.64(s,1H),6.88(s,1H),2.24(t,J＝7.3Hz,2H),1.58(s,2H),0.90(s,3H).其核磁碳谱的结构表征为:13C NMR(101MHz,DMSO)δ172.44(s),171.39(s),157.32(s),131.54(s),127.82(s),120.60(s),117.42(s),112.93(s),39.00(s),19.05(s),14.25(s).
2、2-丁酰氧基-5-丁酰胺基苯甲酸(BBA)的合成
于干燥的圆底烧瓶中加入2-羟基-5-丁酰胺苯甲酸0.16g(0.546mmol)和3mL丁酸酐，振摇反应液使2-羟基-5-丁酰胺苯甲酸溶解，然后缓慢滴加2滴浓硫酸。水浴加热，控制水浴温度在80～85℃之间，磁力搅拌5h。反应完毕，稍冷后，将反应液倒入盛有150mL冰水的烧杯中，搅拌5min，放置2h。待结晶析出完全后，减压过滤，真空干燥12h。
如图4所示，显示了BBA样品的1H NMR和13C-NMR谱图，证实了BBA样品的合成。BBA的特征峰出现在(i)处。在2-羟基-5-丁酰胺苯甲酸的基础上，(a)-(e)的峰值发生改变。BBA的核磁氢谱的结构表征为:1H NMR(400MHz,Acetone)δ9.29(s,1H),8.29(s,1H),7.96(s,1H),7.08(s,1H),2.54(s,2H),2.36(s,2H),1.70(s,4H),0.98(d,J＝17.7Hz,6H).其核磁碳谱的结构表征为:13C NMR(101MHz,Acetone)δ172.79(s),172.48(s),166.18(s),147.33(s),138.60(s),125.35(s),125.12(s),123.10(s),39.90(s),36.73(s),30.30(s),19.90(s),19.11(s),14.35(d,J＝8.6Hz).
3、BBA含量测定方法建立及验证
本申请中采用高效液相色谱法测定BBA含量。色谱柱：Diamonsil C18柱(4.6*250mm,5μm)；流动相：乙腈：0.1mol/L乙酸＝50:50；检测波长：240nm；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL。
本实施例确定了检测波长，选择240nm作为UV检测波长，检测灵敏度为0.01AUFS。对专属性进行考察，在液相色谱图中，BBA的保留时间6.299min，BBA/FA-PEG-CM-β-CD的保留时间为6.32min，而FA-PEG-CM-β-CD在此处没有吸收峰，对于BBA的测定没有干扰，表明该色谱条件符合BBA的体外含量测定要求。建立了BBA在浓度1～500μg/mL的范围的标准曲线，回归方程为：Y＝23407X-4944.2(R2＝0.9999)。对建立的色谱方法进行重复性考察、精密度试验、回收率实验，该方法满足测定要求。
实施例2、FA修饰的2-丁酰氧基-5-丁酰胺基苯甲酸/羧甲基-β-环糊精包合物(BBA/FA-PEG-CM-β-CD)的制备及性质表征
BBA/CM-β-CD包合物具有良好的缓释效果，可提高药效、降低毒副作用；但BBA/CM-β-CD较难通过肿瘤细胞质膜，导致目标细胞对其摄取率较低。因此，本申请中选择FA修饰BBA/CM-β-CD，进一步提高肿瘤细胞对BBA/CM-β-CD的摄取率。
FA介导的靶向给药系统可使药物主动靶向于靶器官或靶细胞，实现叶酸－药物载体偶联物的主动靶向运输，从而提高药物的靶向性，降低药物的毒副作用，使药物更好地发挥疗效，达到高效抗肿瘤的目的，FA与其他配体相比，具有对受体亲和力高、特异性强、偶联性好、成本低、易获得、非免疫原性等优点。
在本申请中，通过化学合成方式，用功能性PEG为连接臂，利用酰胺反应原理，将FA连接到CM-β-CD表面，通过细胞增殖抑制实验等一系列细胞实验及动物安全性评价、动物药效实验等一系列动物实验，证明FA明显提高目标递药系统靶向性及抗癌疗效。
在实验初期，发明人选择通过化学合成将FA直接连在CM-β-CD表面，但在实验中发现FA的溶解性极差，只能通过超声溶解在DMSO中，也极难从DMSO中提取产物FA-CM-β-CD，而且FA-CM-β-CD同样难溶于水，与预想不符，无法增强药物的水溶性。最终，选择COOH-PEG2000-NH2作为接头，通过酰胺键将CM-β-CD与FA连接，形成FA修饰的环糊精FA-PEG-CM-β-CD，这也为BBA提供多种优势，如延长半衰期、降低免疫原性、更高的生物稳定性、更好的水溶性、更低的抗原性以及对细胞或组织的特异性靶向能力。
1、FA-PEG-CM-β-CD的合成
精密称取18.5mg CM-β-CD(0.012mmol,Mn＝1541.237)溶于3mL UP水，向其中加入NHS(1.4mg,0.0122mmol)，搅拌15min后，加入EDC(4.29mg,0.0224mmol)，强力搅拌3min，取20mg FA-PEG-NH2(0.01mmol,Mn＝2,000)，溶解于1mL的UP水，加入CM-β-CD溶液中，避光搅拌，室温反应24h，3,000D透析，冷冻干燥，得到FA-PEG-CM-β-CD。
图5显示了CM-β-CD、FA-PEG-NH2和FA-PEG-CM-β-CD样品的1H NMR谱图，证实了FA-PEG-CM-β-CD样品的合成。如图5A所示，CM-β-CD的特征峰出现在3.81ppm处。如图5B所示，FA-PEG-NH2(c)的特征峰出现在2.66ppm处。如图5C所示，在FA-PEG-CM-β-CD样品中，观察到新的峰值为3.79ppm和2.80ppm。由此推断FA-PEG-NH2连接到CM-β-CD表面。红外光谱如图5D所示：CM-β-CD(d)中3416cm-1处和1599cm-1处为羧基中(υO-H)和(υC＝O)的特征吸收峰，FA-PEG-NH2(c)中3499cm-1处为氨基中(υN-H)的特征吸收峰与羟基(υO-H)的重叠，FA-PEG-CM-β-CD(a)中3434cm-1和1653cm-1为酰胺键中(υN-H)和(υC＝O)的特征吸收峰，进一步证明本实验成功制备得到FA-PEG-CM-β-CD。
2、BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD的制备
BBA/CM-β-CD的制备：精密称取26.3mg CM-β-CD于圆底烧瓶中，加入4ml UP水溶解，另称取5.0mg BBA于烧杯中，加入4mL甲醇，搅拌完全溶解，用吸管缓慢滴加于圆底烧瓶中，避光超声40min，35℃旋蒸除去甲醇，冷冻干燥，得到BBA/CM-β-CD。
BBA/FA-PEG-CM-β-CD的制备：精密称取20.0mg FA-PEG-CM-β-CD于圆底烧瓶中，加入4mL UP水溶解，另称取5.0mg BBA，加入4mL甲醇溶解，搅拌完全溶解，用吸管缓慢滴加于圆底烧瓶中，40℃避光超声40min，35℃旋蒸除去甲醇，冷冻干燥，得到BBA/FA-PEG-CM-β-CD。
3、BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物递送系统的性质表征
(1)扫描电镜分析
分别取少量FA-PEG-CM-β-CD、BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物均匀固定于样品台上，导电胶粘样、喷金镀膜后置于场发射扫描电镜中观察其表面形态特征。
(2)红外光谱分析
分别对BBA、FA-PEG-CM-β-CD、BBA及FA-PEG-CM-β-CD的混合物和BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物进行红外光谱测试。固体样品采用KBr压片法处理，即将100mg的KBr与1mg样品在干燥状态下充分研磨、混合均匀，然后压成1mm厚的薄片后进行扫描。
(3)X-衍射分析
分别对BBA、FA-PEG-CM-β-CD、BBA及FA-PEG-CM-β-CD的混合物和BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物进行X-衍射测试。
红外光谱如图6A所示：BBA(a)在3295cm-1附近处有酰胺键特征峰(υN-H)，在1699cm-1附近处有苯环的强吸收峰；在BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物(d)的红外光谱中，BBA(a)和FA-PEG-CM-β-CD(b)的吸收峰并不只是简单的重叠，BBA(a)的部分特征峰消失或减弱，如3295cm-1附近N-H伸缩振动峰消失，并且FA-PEG-CM-β-CD(b)的1103cm-1处(υC-O-C)伸缩振动峰减弱，由此推断BBA和FA-PEG-CM-β-CD形成了包合物。XRD图谱如图6B所示：X衍射图谱中BBA(a)出现明显的结晶衍射峰，而FA-PEG-CM-β-CD(b)和BBA/FA-PEG-CM-β-CD(d)包合物没有明显的晶体衍射峰。与BBA(a)的衍射图谱相比，BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物(d)的峰位置发生偏移，测量角发生改变，特征峰消失，提示了BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物的生成，初步证明了环糊精包合作用的发生。由图6C&D所示：用扫描电镜(SEM)观察FA-PEG-CM-β-CD(C)和BBA/FA-PEG-CM-β-CD(D)包合物2种粉末的外部形态。FA-PEG-CM-β-CD(C)以块状物存在，经环糊精包合后，在机械力作用下晶型错位，边界变形，形成体积较小的球形颗粒，堆叠于部分块状物上，说明BBA被包入FA-PEG-CM-β-CD中，进一步证明本实验成功制备了BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物。
(4)BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物包封率考察
精密称取BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物粉末10mg于容量瓶中，用乙腈定容至5mL，1,000×g离心15min，吸取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，实施例1中的色谱条件进行检测，记录BBA的色谱峰面积，可计算得到游离药量(Mfree)。
精密称取BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物粉末10mg于容量瓶中，用甲醇定容至5mL，进行破乳处理(超声30min)，0.22μm滤膜过滤，取续滤液，实施例1中的色谱条件进行检测，记录BBA的色谱峰面积，可计算得到包合物总药量(Mtotal)，平行测定三次。按公式(1)、(2)分别计算BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物的包封率和载药量。
Entrapment Efficiency(％)＝(Mtotal-Mfree)/Mtotal×100……(1)
Drug Loading(mg/g)＝(Mtotal-Mfree)/Mnanoparticles……(2)
表1不同投料比BBA/FA-PEG-CM-β-CD的体外表征
Figure BDA0003118593140000081
表2不同反应温度BBA/FA-PEG-CM-β-CD的体外表征
Figure BDA0003118593140000082
Figure BDA0003118593140000091
表3不同反应时间BBA/FA-PEG-CM-β-CD的体外表征
Figure BDA0003118593140000092
通过对不同投料比、反应温度和反应时间包合物的载药量和包封率考察，由表1-3可以看出，在BBA:FA-PEG-CM-β-CD投料比为1:2，温度为40℃，反应时间为40min条件下制备出的BBA/FA-PEG-CM-β-CD包封率最高，为88.01±8.50。
(5)BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物稳定性考察
(a)高温试验
精密称取BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物1g，置于称量瓶中，敞口放置在60℃烘箱中10d，分别于第0d、第5d和第10d取样，根据稳定性考察项目，重点考察包合物的外观、气味、质量及指标成分含量。若有效成分含量下降5％，则于40℃条件，同法操作。如60℃无明显变化，则不再进行40℃实验。
(b)高湿试验
精密称取BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物1g，敞口置于相对湿度分别为75％±5％、95％±5％的密闭容器(25℃)中10d。选择NaCl饱和溶液(相对湿度约75％±5％)，KNO3饱和溶液(相对湿度约92.5％)。分别于第0d、第5d和第10d取样。
表4.BBA/FA-PEG-CM-β-CD的高温试验
Figure BDA0003118593140000093
表5.BBA/FA-PEG-CM-β-CD的高湿试验
Figure BDA0003118593140000094
Figure BDA0003118593140000101
通过对高温和高湿条件包合物的包封率考察，由表4-5可以看出，在0～10d间，随温度、湿度升高，包合物的包封率几乎没有发生改变，集中在(83.58％±1.02％)～(87.91％±0.50％)，其外观性状、质量基本不变，说明BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物在高温和高湿条件下，仍具有良好的稳定性。
(6)体外释放行为研究
分别精密称取BBA/CM-β-CD包合物、BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物，置于装有200mL的pH为1.2和7.4的PBS杯中，并加0.5％吐温80，分别在第0.25h、0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h、96h取样。取样方法：调节转速，在37℃下匀速搅拌，分别于上述时间点取样1mL(同时补充等量同温溶液介质)，样品经0.22μm滤膜过滤，取续滤液，按实施例1中的色谱条件进行检测，计算各采样点时样品中的药物浓度和累积释放率。同批样品测定3份，结果取平均值。
本实施例以pH 7.4和pH 1.2的PBS溶液作为释放介质，采用透析法考察不同载药包合物的体外释放行为。经考察发现BBA在pH 1.2的条件下不溶解。结果如图7所示，在pH7.4的条件下，BBA在48h内释放完全。BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD的药物释放则呈现明显的双相释放特征。在前24h释放较快，此后，释药速度逐渐缓慢，药物的释放时间可延长至96h。到96h时，BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD的累积释放百分率分别为82.65％±6.03％和82.93％±6.93％，且BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD的体外释放曲线基本吻合，表明FA修饰对于药物的释放行为基本无影响。
实施例3包合物的体外研究
1、细胞增殖抑制实验
(1)本实施例以CaCo-2细胞(人克隆结肠腺癌细胞)和SW620细胞(人结肠癌细胞)为模型细胞，采用MTT法评价5-ASA、NaB、5-FU、BBA、FA-PEG-CM-β-CD、BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD的体外抗癌作用。取对数生长期细胞，用10％Gibco胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的DMEM培养液配成单个细胞悬液，细胞浓度为3.5×104cells/mL，于96孔板中每孔接种100μL混悬液，设空白细胞对照孔，在5％CO2培养箱培养过夜。在96孔板的外围加入PBS，防止在培养过程中液体蒸发过多。
(2)弃去原有培养基，将培养板分别加入不同浓度的BBA、FA-PEG-CM-β-CD、BBA/CM-β-CD、BBA/FA-PEG-CM-β-CD，以及原料药5-ASA、NaB和阳性对照5-FU，每组设四复孔，37℃、5％的CO2、饱和湿度条件下培养24h、48h、72h。
(3)分别在24h、48h、72h后，每孔加入MTT液(5mg/mL)20μL，同样条件继续培养4h，之后小心吸弃孔内培养液，每孔加入100μL DMSO，振荡10min，使结晶充分溶解；在酶联仪上测570nm处吸光度(OD570)，重复测3次。
计算方法：由OD值计算细胞存活率，评价细胞增值抑制作用
Cell Viability(％)＝(Asample-Ablank)/(Acontrol-Ablank)×100……(3)
结果如图8所示，本实施例采用MTT定量考察不同制剂组与CaCo-2和SW620细胞共孵育24h、48h和72h三个不同时间段后的细胞抑制作用，在30μM、40μM浓度的制剂表现出更明显的细胞抑制作用。如图8A所示，CaCo-2细胞与30μM、40μM的不同制剂共孵育24h，BBA/CM-β-CD组细胞存活率分别为69.714％±5.973％、61.691％±4.547％；BBA/FA-PEG-CM-β-CD组的细胞存活率为75.136％±1.354％、56.090％±1.512％。不同制剂与SW620细胞孵育24h后(图8B)，药物浓度为30μM、40μM的BBA/CM-β-CD组细胞存活率为82.785％±4.814％、72.348％±1.218％；BBA/FA-PEG-CM-β-CD组的细胞存活率为70.874％±3.627％、57.286％±2.531％，显著低于BBA/CM-β-CD组，与相同浓度的BBA组比较，细胞存活率明显降低(##P<0.01)，说明增强了对SW620细胞的抑制作用。
如图8C所示，CaCo-2细胞与30μM、40μM的给药组共孵育48h，药物浓度在30μM、40μM时BBA/CM-β-CD组的细胞存活率依次为52.552％±1.858％、40.964％±2.266％，BBA/FA-PEG-CM-β-CD组的细胞存活率为36.662％±1.264％、35.142％±1.599％，显著低于BBA/CM-β-CD组。不同制剂与SW620细胞孵育48h后(图8D)，药物浓度在30μM、40μM时，BBA/CM-β-CD组的细胞存活率依次为48.528％±4.088％、44.211％±4.660％，BBA/FA-PEG-CM-β-CD组的细胞存活率为35.329％±2.728％、26.546％±3.274％，显著低于BBA/CM-β-CD组。与相同浓度的BBA组比较，30μM的BBA/FA-PEG-CM-β-CD显著性降低细胞存活率(####P<0.0001)，明显增强了对细胞的抑制作用，表现出更高水平的体外抗癌活性。
如图8E所示，CaCo-2细胞与30μM、40μM的给药组共孵育72h，药物浓度在30μM、40μM时BBA/CM-β-CD组的细胞存活率依次为61.380％±4.480％、48.759％±2.214％，BBA/FA-PEG-CM-β-CD组的细胞存活率为38.886％±3.320％、34.906％±1.234％，与相同浓度的BBA组比较，30μM的BBA/FA-PEG-CM-β-CD显著性降低细胞存活率(###P<0.001)。不同制剂与SW620细胞孵育72h后(图8F)，药物浓度在30μM、40μM时BBA/CM-β-CD组的细胞存活率为64.059％±1.472％、58.091％±2.125％，BBA/FA-PEG-CM-β-CD组的细胞存活率为40.639％±2.148％、30.943％±2.336％，与相同浓度的BBA组比较，40μM的BBA/FA-PEG-CM-β-CD显著性降低SW620细胞存活率(###P<0.001)，提高了药物对细胞的增殖抑制作用。
不同浓度制剂与CaCo-2和SW620细胞共孵育24h、48h和72h，得到的结果显示，BBA、BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD制剂组对于CaCo-2和SW620细胞都具有细胞增殖抑制，其中对SW620细胞的增值抑制作用更为明显，为后续实验选择SW620细胞作为细胞模型提供依据。其中，孵育48h后，除阳性对照组5-FU外，30μM BBA/FA-PEG-CM-β-CD组的细胞存活率最低，细胞活力为26.5％，抑制率达到73.5％，表明其细胞增殖抑制作用最强，药物抗癌活性最高。同时，如实验预测的结果，5-FU作用CaCo-2和SW620时(图8G&8H)，与BBA组相比显著地降低了细胞活力(###P<0.001)，增强了细胞抑制作用。与NaB和5-ASA相比，经孵育48h的30μM BBA显示出显著的细胞生长抑制效应差异(####P<0.0001)，进一步证明本申请中合成的药物BBA对比于单独的NaB和5-ASA，细胞增殖抑制作用更强。
2、细胞摄取实验
BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物作为药物递送系统，能否将药物递送至靶细胞内是评价目标递药系统靶向性的重要指标。本申请以CaCo-2细胞和SW620作为细胞模型，为了考察细胞对BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD的摄取情况，用Coumarin 6绿色荧光探针对BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD进行标记，分别制得带有绿色荧光的BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD。
将生长状态良好并处于对数生长期的SW620和CaCo-2细胞悬液浓度调整为3×105cells/mL，于24孔培养板放入爬片，每孔加入1mL单细胞悬液，每孔细胞数约为3×105，设3个复孔，进行细胞培养24h，待贴壁。弃去原有培养基，分别加入BBA/FA-PEG-CM-β-CD和BBA/CM-β-CD稀释液1mL，置于培养箱培养2h，除去培养液，用PBS充分洗涤2次，然后加入4％多聚甲醛固定30min，再用PBS洗涤2次，然后用DAPI染色5min，再把染液吸除，用PBS离心洗涤3次。取出细胞爬片，盖于在载玻片上，并用50％甘油封片，用激光共聚焦断层扫描技术检测SW620和CaCo-2细胞内荧光标记的分布情况，并利用Image J软件对其半定量分析。
如图9所示，不同药物剂型与CaCo-2、SW620细胞孵育，BBA/FA-PEG-CM-β-CD在SW620细胞中的Coumarin 6荧光信号明显强于CaCo-2细胞，说明BBA/FA-PEG-CM-β-CD更有效地进入SW620细胞，验证了上述细胞增殖抑制实验结果，同样为后续实验的细胞模型提供了依据。同时被CaCo-2、SW620细胞摄取，BBA/FA-PEG-CM-β-CD组细胞中Coumarin 6绿色荧光信号明显高于BBA/CM-β-CD组，说明FA配体特异性识别细胞表面FA受体，增强体外靶向性，提高了肿瘤细胞对BBA/FA-PEG-CM-β-CD的摄取效率。
3、细胞凋亡实验
在上述实验基础上，本实施例选择以SW620细胞为细胞模型，考察BBA、BBA/FA-PEG-CM-β-CD和BBA/CM-β-CD作用于SW620的细胞凋亡情况。
BBA、BBA/FA-PEG-CM-β-CD和BBA/CM-β-CD作用于SW620细胞48h后，进行凋亡试剂盒处理。把细胞培养液吸出至10mL离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞。至消化完毕时，吸弃胰酶消化液，将该细胞培养液加入细胞培养板，将细胞从壁上吹打下来并混匀，转移到离心管内，335×g离心5min，弃上清，收集细胞，用2mL PBS轻轻重悬细胞并计数。计算并取重悬细胞1×106cells，335×g离心5min，弃上清，加入195μL Annexin V-FITC结合液并轻轻重悬细胞。加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10min。加入10μL PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。进行流式细胞仪检测，按公式计算细胞凋亡率，实验重复3次取平均值[27]。
Apoptosis Rate＝Proportion of early apoptotic cells+Proportion oflate apoptotic cells……(4)
如图10所示，不同药物剂型与SW620细胞孵育48h，与Blank组比较，0.5％DMSO作为溶剂不影响SW620细胞的凋亡情况；BBA、BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD明显诱导SW620细胞凋亡，BBA诱导的细胞凋亡率为32.21％±8.26％，BBA/CM-β-CD诱导的细胞凋亡率为46.28％±9.4％，其中BBA/FA-PEG-CM-β-CD诱导细胞凋亡最明显，细胞凋亡率为51.56％±8.54％，说明经过孵育48h，BBA/FA-PEG-CM-β-CD的细胞凋亡诱导最明显。
4、细胞周期实验
在上述细胞凋亡实验基础上，本申请选择以SW620细胞为细胞模型，考察BBA、BBA/FA-PEG-CM-β-CD和BBA/CM-β-CD对细胞的周期影响。
取对数生长期的SW620平铺于6孔板(6×105个/孔)。置于5％CO2培养箱中培养，当细胞的融合度达到70％～80％时，吸取原培养液弃除，再继续加入含相同药物浓度的BBA、BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD培养液并继续培养48h。按照以下细胞周期试剂盒的方法进行操作：收集孔板中的细胞培养液转移至离心管中，用胰酶消化后，加入前面收集的细胞培养液，吹打下贴壁细胞，并轻轻吹散细胞，收集至离心管中。335×g离心5min，沉淀细胞，小心吸除上清。加入1mL冰浴PBS溶液，重悬细胞，670×g离心5min；弃除上清后，离心管中加入预冷的70％的酒精1mL；轻轻吹打混匀，4℃固定24h，待细胞固定后，335×g离心5min，收集细胞，并将其上清液去除，再加入l mL冰浴较冷的PBS重悬细胞；335×g离心5min，吸除上清液，轻轻弹击离心管底部以适当分散细胞，避免细胞成团，每管加入RNaseA(50X)10uL以及碘化丙啶(20X)25uL，并同时加入缓冲液0.5mL，缓慢并充分重悬细胞沉淀。37℃避光温浴30min；4℃冰浴避光存放；之后采用流式细胞仪检测。
如图11A&B所示，0.5％DMSO、FA-PEG-CM-β-CD、BBA、BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD与SW620细胞孵育48h后，与Blank组比较，0.5％DMSO作为溶剂不影响SW620细胞周期，BBA、BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD处于G0/G1期的百分比显著性增加(**P<0.01)，同时S期的细胞明显减少，有显著性差异(****P<0.0001)，证明SW620肿瘤细胞周期阻滞在G0/G1期；与BBA组比较，BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD在G0/G1期细胞含量更高，S期细胞含量更低，证明BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD相比与BBA能更好地将细胞周期阻滞在G0/G1，进一步证明BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD增强了药物对细胞周期阻滞影响。
细胞凋亡和细胞周期实验结果显示，只有细胞凋亡实验结果显示实验组各组有明显差异，细胞周期实验结果无明显差异，说明BBA、BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD抑制SW620细胞不是通过阻滞G0/G1细胞周期的机制，而是主要通过细胞凋亡机制抑制SW620细胞。
实施例4包合物的组织分布研究
1、体内HPLC方法建立及验证
高效液相色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×150mm,5μm)；流动相：乙腈/0.1moL乙酸水＝22:78；检测波长：240nm；流速：1mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL。
本实施例对色谱方法的专属性进行考察，结果显示，血浆、脏器组织匀浆中的物质均不会干扰丁酸的分离测定，样品中的丁酸能够得到较好的分离，保留时间约为5.0min。显示出该方法的专属性能够达到分析丁酸的标准。并针对不同组织分别制定了标准曲线，考察精密度、回收率符合测定要求。
2、小鼠结肠癌模型的建立及确认
为了建立裸鼠异位移植瘤疾病模型，经泸州医学院动物伦理委员会批准，实验前雄性4周龄BALB/C裸鼠自由饮水，自由进食，适应性饲养5d后，室内环境为SPF级。适应饲养一周后于第0d，取对数生长期SW620细胞以生理盐水配制成细胞悬液进行接种。接种细胞浓度为8×107cells/mL，每只裸鼠接种量0.2mL，以碘消毒裸鼠皮肤，1mL注射器抽取细胞悬液，接种到裸鼠皮下，构建裸鼠异位移植瘤动物模型。
3、BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物的体内分布及靶向性研究
本申请利用活体成像技术来研究BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物的体内分布及靶向性。首先将DID标记在包合物上，然后通过口服到模型裸鼠体内，用IVIS成像系统进行分析，并照相记录。观察在3h，8h和12h其在体内的荧光情况。观察模型裸鼠中的荧光分布，并以游离DID、DID-CM-β-CD和DID-FA-PEG-CM-β-CD在正常裸鼠中的分布作为对照。
上述体内实验考察完毕后，立即心脏取血，处死裸鼠，全血于1509×g离心5min，置于2mL EP管中备用。迅速分离出各组裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏以及裸鼠肿瘤，用IVIS成像系统进行分析上述12h脏器及肿瘤组织的荧光强度，并照相记录。
实验结果如图12所示，各时间点包裹荧光物质DiD的DiD-CM-β-CD和DiD-FA-PEG-CM-β-CD的体内荧光信号均强于Healthy组和Saline组，在3h后肿瘤组织周围荧光信号增强；对DiD组、DiD-CM-β-CD组和DiD-FA-PEG-CM-β-CD组裸鼠解剖分离心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织用活体成像系统拍照，并使用Image J软件对荧光信号半定量分析，从图12B&D可以看出，DiD-FA-PEG-CM-β-CD在肿瘤组织中荧光强度明显高于DiD、DiD-CM-β-CD组(****P<0.0001)，三种制剂在肝脏、肾脏中荧光明显；相比于DiD-CM-β-CD组，DiD-FA-PEG-CM-β-CD组在肾脏中能观察到更低水平的荧光(****P<0.0001)。DiD-CM-β-CD组和DiD-FA-PEG-CM-β-CD在肝的荧光强度明显低于DID(****P<0.0001)，说明包合物可以显著改善药物在肝聚集的情况。结合上述药动学及组织分布结果，可以得出，FA修饰CM-β-CD包合物能延长药物BBA的半衰期，减低毒副作用，该药物递送系统具有一定的肿瘤靶向作用。
3、BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物药代动力学研究
对已造模的雄性BALB/C裸鼠进行药代动力学考察，采用灌胃的方式给药，给药剂量0.366g/kg。给药前禁食不禁水12h。随机分为3组：BBA组、BBA/CM-β-CD包合物组、BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物组。
给药后实验组分别于15min、30min、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h、72h时间点心脏取血0.3mL，将全血迅速以2012×g离心5min，分离血浆后按上述“生物样品处理方法”操作，取上清液进行HPLC分析，测定峰面积，计算各组丁酸的药物浓度。采用Graphpad6.01软件作曲线图。
运用DAS ver.2.1.1统计软件计算BBA、BBA/CM-β-CD、BBA/FA-PEG-CM-β-CD口服灌胃给药后血浆中时量曲线下面积AUC0-t(mg/L*h)、药峰浓度Cmax(mg/L)、半衰期T1/2z(h)等药物代谢动力学参数。
表6.BALB/C裸鼠血浆中BBA、BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD的药动学参数(n＝3)
Figure BDA0003118593140000151
由图13药动学曲线可以看出，相比于BBA，在已造模的BALB/C裸鼠体内BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD的作用时间更长，作用更持久，这也与体外释放实验相对应，证实了BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD药物递送系统具有良好的缓释及长效作用的特点。此外，与体外释放实验比较，药动学曲线明显增加了体内吸收过程；通过表6的药动学参数可以看出BBA/FA-PEG-CM-β-CD的体内驻留时间和半衰期明显较BBA/CM-β-CD更长，生物利用度更高。
4、HPLC法考察药物组织分布
取已造模的雄性BALB/C裸鼠20只，分别随机分为三大组，每组15只。每只裸鼠分别通过口服灌胃给药，给药剂量为0.366g/kg。按给药方案的不同分为：第一大组为BBA组，3只/小组，共4个小组。第二大组为BBA/CM-β-CD组，3只/小组，共4个小组，第三大组为BBA/FA-PEG-CM-β-CD组，3只/小组，共4个小组。上述三大组均于给药后1h，3h，8h和12h将裸鼠处死，立即分离心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肿瘤组织，精确称重后，各加入三倍量的生理盐水匀浆，按上述“生物样品处理方法”处理后，HPLC进样检测，记录丁酸的色谱峰面积，计算出各样品药物浓度。采用Graphpad 6.01软件作柱状图。
如图14所示，在3h之前，BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD在血液中的分布低于BBA，在8h-12h时间段内，BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD在血液中的药物浓度明显高于BBA(****P<0.0001)，这说明BBA被CM-β-CD包载制成载药包合物后，能够显著延长血液循环时间。在1h(Figure 16A)、3h(Figure 16B)、8h(Figure 16C)和12h(Figure 16D)各个时间点，BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD主要分布在血液、肝脏、肾脏和肿瘤组织，在肿瘤组织中的荧光强度均高于BBA组，存在显著性差异(****P<0.0001)，其中BBA/FA-PEG-CM-β-CD的荧光强度明显高于BBA/FA-PEG-CM-β-CD组。在1h-12h时间段内，BBA、BBA/CM-β-CD、BBA/FA-PEG-CM-β-CD在脾部位的浓度均处于低水平，BBA/FA-PEG-CM-β-CD在肺脏的药物浓度低于BBA/CM-β-CD，有显著性差异(*P<0.05)，表明BBA/FA-PEG-CM-β-CD具有一定靶向性。
实施例5包合物的体内药效学研究
1、实验分组
将40只BALB/C裸鼠随机分成8组：阳性对照组(5-FU)，生理盐水组(Saline)，丁酸钠组(NaB)，5-氨基水杨酸(5-ASA)组，游离药物组(BBA)，载药包合物组(BBA/CM-β-CD)，FA修饰的载药包合物组(BBA/FA-PEG-CM-β-CD)及空白包合物组(FA-PEG-CM-β-CD)。每天通过给药一次，连续给药14d，给药剂量为0.366g/kg。
2、药效学评价
本课题以SW620肿瘤细胞异位移植瘤模型作为疾病模型，考察BBA/FA-PEG-CM-β-CD包合物的体内抗肿瘤作用。肿瘤移植10d后，观察8组SW620荷瘤裸鼠肿瘤体积，这些老鼠每天接受一次治疗。造模成功的小鼠在治疗前开始称重和测量肿瘤，在治疗期间每2d继续测量一次，直到小鼠牺牲，用游标千分尺测量肿瘤的两个轴(L，最长轴；W，最短轴)，同时测定体重。抗肿瘤活性通过肿瘤生长抑制(tumor growth,TGI)来评估，TGI是第14d，治疗组(TG)相对于生理盐水处理组(CG)的平均肿瘤重量(MTW)，根据公式(5)、(6)计算肿瘤体积(V)和平均肿瘤重量(MTW)
V(％)＝L×W2……(5)
MTW(％)＝(MTWTG-MTWCG)/MTWCG×100……(6)
另外，采用病理组织学分析，每2d观察一次生存状况，并连续2周给药。治疗结束后，处死所有小鼠，取其肿瘤组织。肿瘤组织经H&E染色，倒置显微镜下观察。
肿瘤生长抑制作用：SW620荷瘤裸鼠于肿瘤植入后第25d处死。图15显示了不同制剂对SW620荷瘤裸鼠的抗肿瘤活性。由图15A可知，与Saline组比较，BBA组和BBA/FA-PEG-CM-β-CD组肿瘤体积明显减小，有显著性差异(****P<0.0001)，表明有明显的抗肿瘤作用。其中，BBA/FA-PEG-CM-β-CD的抗癌作用明显强于BBA。图15C显示，与Saline对照组相比，其他给药组均有明显变化。平均肿瘤重量差异显示在图15B，5-ASA、NaB、BBA、5-FU、BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD肿瘤抑制率是31.33％±7.17％，15.30％±5.61％，41.76％±7.56％，85.85％±2.89％，67.20％±6.57％，78.56％±8.48％。与Saline组比较，NaB组和BBA组的肿瘤重量明显下降，有显著性差异(###P<0.001)，抑制率明显提高，其中，BBA组肿瘤重量比NaB组更小，抑制率更低，证明了本实验合成的BBA提高了NaB的抑制作用。与BBA组肿瘤重量比较，BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD组均有显著性降低(*P<0.05)，通过比较三组肿瘤抑制率也证明了BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD组明显增强了肿瘤抑制作用。5-FU和BBA/CM-β-CD、BBA/FA-PEG-CM-β-CD处理组仍有明显的抑制作用。这些结果表明，该传递系统BBA/FA-PEG-CM-β-CD对SW620异种移植瘤具有良好的抑制效果。
BBA/FA-PEG-CM-β-CD诱导肿瘤细胞坏死和凋亡:为进一步证实BBA/FA-PEG-CM-β-CD的抗肿瘤活性，采用免疫组化法对肿瘤组织进行了病理分析。如图16所示，在用5-FU、BBA和BBA/CM-β-CD、BBA/FA-PEG-CM-β-CD治疗的裸鼠肿瘤中，存在典型的坏死，例如核碎裂、收缩和溶解。与Saline对照组相比，BBA细胞群的平均坏死率约为20％，BBA/FA-PEG-CM-β-CD细胞群的平均坏死率为50％，5-FU组为50％，BBA/CM-β-CD组为30％，NaB组为10％，5-ASA组为15％。这一结果与上述抗肿瘤作用的结果一致，表明BBA/FA-PEG-CM-β-CD可引起肿瘤细胞坏死，导致肿瘤生长抑制。TUNEL分析显示，与Saline对照组相比，BBA、5-FU、BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD组的肿瘤组织观察到明显的细胞凋亡，BBA/FA-PEG-CM-β-CD组肿瘤中观察到更高水平的细胞凋亡。
为了研究BBA/FA-PEG-CM-β-CD是否能影响肿瘤细胞增殖，本实施例检测了ki-67、VEGFR的组织表达。与Saline组比较，NaB、5-ASA、5-FU、BBA、BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD治疗组的肿瘤组织显示Ki-67、VEGFR阳性细胞群显著减少(图16)。其中5-FU和BBA/FA-PEG-CM-β-CD治疗组阳性表达下降最为显著。说明5-FU和BBA/FA-PEG-CM-β-CD治疗组对肿瘤细胞增值抑制最为明显，药物治疗效果最强。
3、体内安全性研究
为测定体内潜在毒性，指导体内抗肿瘤疗效分析，本课题以昆明白小鼠为动物对象，考察BBA/FA-PEG-CM-β-CD口服剂型的急性毒性。适应性喂养小鼠5d，随机分为8组，每组5只，分别为：(a)Saline对照组，(b)NaB，(c)5-ASA，(d)FA-PEG-CM-β-CD，(e)BBA，(f)5-FU，(g)BBA/CM-β-CD，(h)BBA/FA-PEG-CM-β-CD。所有动物分别给予0.2mL以上不同剂型的单次口服灌胃，每天监测体重。试验过程中，每天观察所有动物的毒性和死亡率。记录饮食、尿液、粪便等常规变化。治疗后第15d，通过心脏采血收集各组小鼠的血液，1,000×g离心10min，收集血清，采用自动化生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)。
治疗后第15d处死小鼠。快速切除小鼠心、肝、肺、肾，生理盐水冲洗，10％福尔马林称重固定，苏木精、伊红染色(H&E)病理分析。内脏指数估计根据以下公式(7)为:
Organ Index(％)＝Organ Weight/Body Weight×100％……(7)
表7.小鼠存活率和体重变化情况
Figure BDA0003118593140000181
表8.不同制剂对小鼠脏器指数的影响
Figure BDA0003118593140000182
Figure BDA0003118593140000191
表9.不同剂型对小鼠血清生化指标的影响
Figure BDA0003118593140000192
本实施例检测了BBA/FA-PEG-CM-β-CD在正常昆明小白鼠的体内毒性。首先，经口服生理盐水、5-ASA、NaB、BBA、5-FU、BBA/CM-β-CD和BBA/FA-PEG-CM-β-CD，观察小鼠的体重变化。除5-FU治疗组外，其余7组治疗后均未见异常行为、中毒症状、体重下降及死亡，所有裸鼠的发色、饮食及活动均保持正常。如表7所示，与Saline组比较，5-FU治疗组平均体重下降4.46％，有显著性差异(*P<0.05)，BBA治疗组平均体重基本保持不变，其余6个处理组小鼠体重均有稳定增长趋势，治疗后第15d体重增幅约为2％-6％，除5-FU外，其余7个处理组小鼠体重差异不显著(*P>0.05)，表明，其余7个处理组对正常小鼠也没有毒性。
接下来，研究不同制剂对上述小鼠脏器指数的影响，以评估其体内毒性，结果见表8。结果显示，BBA和BBA/FA-PEG-CM-β-CD处理后的心、肝、肺、肾脏器指数与对照组相比均无显著变化(P>0.05)。但5-FU治疗后肝脏指数显著升高至8.34％±0.431％，与对照组(7.47％±1.362％，*P<0.05)比较，差异有统计学意义。而且，5-FU治疗后肾脏指数显著升高至3.06±0.268，与对照组(2.30±0.340，**P<0.01)比较，具有显著性差异。与5-FU比较，BBA/FA-PEG-CM-β-CD治疗下，对小鼠无毒性作用。上述结果表明，BBA和BBA/FA-PEG-CM-β-CD对小鼠无毒性作用。5-FU处理后肝脏和肾脏指标较对照组显著升高(P<0.05)，说明5-FU可能对小鼠具有毒性。
血清生化分析：除内脏指数外，我们还进行了血清生化分析，包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)，以评估BBA、BBA/FA-PEG-CM-β-CD对小鼠肝脏和肾脏的潜在毒性。如表9所示，除5-FU处理外，其他组处理后的血清生化分析指标都在正常范围内，且未观察到显著差异。经5-FU治疗后，AST、ALT均显著性高于对照组(P<0.05)，所有治疗组的肾功能指标尿素氮和肌酐数据均正常，与对照组相比无统计学差异(P>0.05)，表明所有制剂对治疗小鼠的肾功能均无明显毒性作用。
脏器H&E染色：如图17，给药后第15d收集的心脏、肝脏、肺和肾脏的组织学变化。首先，发现经各组处理的裸鼠肺脏出现肺脏组织间质内不等量炎性细胞浸润，考虑与肿瘤生长相关。5-ASA、NaB、FA-PEG-CM-β-CD、BBA/CM-β-CD处理组肺脏组织内不同程度出血，可能与解剖时操作不当有关，以上情况考虑与本试验处理无关。所有处理组的心脏、肝脏、肺脏和肾脏组织未见与本试验处理相关的病理损伤，进一步证明了BBA/FA-PEG-CM-β-CD的低毒性。
综上，本申请成功制备了一种新型药物BBA和新型靶向递药系统BBA/FA-PEG-CM-β-CD，其体内外实验结果显示：1)FA增强了BBA/CM-β-CD在SW620细胞中的摄取；2)各组制剂在相同条件下，BBA的体外抑瘤率明显强于5-ASA和NaB，可以实现5-ASA的抗炎作用和NaB的抗癌作用的联合，此外，对比BBA和BBA/CM-β-CD，BBA/FA-PEG-CM-β-CD的体外抑瘤率明显增强；3)对比原料药NaB，BBA明显延长了药物半衰期，目标递药系统BBA/FA-PEG-CM-β-CD具有一定的缓释作用，延长了给药系统的半衰期；5)BBA/FA-PEG-CM-β-CD具有明显的肿瘤靶向性，毒副作用也较小；6)相同浓度下，BBA的药效明显强于5-ASA和NaB，BBA/FA-PEG-CM-β-CD对结肠癌的药效学评价明显优于BBA。
总之，本课题成功制备了一种新型药物BBA，并构建一种新型靶向递药系统BBA/FA-PEG-CM-β-CD，其对结肠癌表现出较好的治疗效果，且其毒副作用明显降低。BBA/FA-PEG-CM-β-CD抑制组蛋白去乙酰化，诱导结肠癌细胞分化并抑制炎症优势使其有望成为有效的用于治疗结肠癌的靶向递药系统。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种药物，其特征在于：所述药物为2-丁酰氧基-5-丁酰胺基苯甲酸，化学结构式为：
Figure FDA0003118593130000011
2.一种FA介导的BBA/CM-β-CD靶向递药系统的构建方法，其特征在于：以功能性PEG作为连接臂，利用酰胺反应原理，将FA连接到CM-β-CD表面，再利用饱和水溶液法与BBA混合制备目标递药系统BBA/FA-PEG-CM-β-CD；BBA为权利要求1中所述的2-丁酰氧基-5-丁酰胺基苯甲酸。
3.根据权利要求1所述的一种FA介导的BBA/CM-β-CD靶向递药系统的构建方法，其特征在于，FA-PEG-CM-β-CD的制备方法包括：向CM-β-CD溶液中加入NHS，搅拌混合后加入EDC，混合均匀后，加入溶解后的FA-PEG-NH2，室温反应，冷冻干燥，得到FA-PEG-CM-β-CD。
4.根据权利要求3所述的一种FA介导的BBA/CM-β-CD靶向递药系统的构建方法，其特征在于，BBA/FA-PEG-CM-β-CD的制备方法包括：向溶液FA-PEG-CM-β-CD中加入BBA，加入甲醇溶解，除去甲醇后冷冻干燥，得到BBA/FA-PEG-CM-β-CD。
5.利用权利要求1-4任一所述的构建方法制备的结肠癌细胞靶向药物。
6.如权利要求5中所述的靶向药物在制备治疗结肠癌的试剂中的应用。
7.如权利要求1中所述的2-丁酰氧基-5-丁酰胺基苯甲酸在制备治疗结肠癌的试剂中的应用。
8.如权利要求1中所述的2-丁酰氧基-5-丁酰胺基苯甲酸的合成方法，将2-羟基-5-丁酰胺苯甲酸与丁酸酐混合溶解，滴加浓硫酸，于80～85℃之间搅拌反应；冷却结晶，真空干燥得到2-丁酰氧基-5-丁酰胺基苯甲酸。
9.根据权利要求8中所述的合成方法，其特征在于：2-羟基-5-丁酰胺苯甲酸的合成方法包括，向5-氨基水杨酸中加入饱和碳酸氢钠溶液，搅拌溶解；冰浴条件下向其中加入含有丁酰氯的丙酮溶液，室温反应；除去溶剂，剩余液体冷却后加盐酸酸化，溶液浑浊，抽滤，得到淡巧克力色沉淀即为2-羟基-5-丁酰胺苯甲酸。
10.如权利要求1中所述的2-丁酰氧基-5-丁酰胺基苯甲酸的含量测定方法：采用高效液相色谱法测定BBA含量。色谱柱：Diamonsil C18柱；流动相：乙腈：0.1mol/L乙酸＝50:50；检测波长：240nm；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003012519A (ja) * 2001-07-05 2003-01-15 Mitsubishi Pharma Corp ウルソデオキシコール酸誘導体を有効成分とする大腸癌予防／治療剤
CN101182298A (zh) * 2007-12-04 2008-05-21 西安交通大学 化合物2-羟基-5-丁酰胺基苯甲酸及其用途
CN101238137A (zh) * 2005-05-27 2008-08-06 安泰碧治疗公司 4-或5-氨基水杨酸的衍生物
CN101809039A (zh) * 2007-09-28 2010-08-18 那诺蒂克株式会社 叶酸修饰的环糊精化合物、其制备方法、靶向性药物传递系统用的药物传递剂、药物组合物及造影剂
CN103351307A (zh) * 2013-06-09 2013-10-16 西安交通大学 2-(丁酰氧基)-5-氨基苯甲酸及其制备方法和应用
CN104826127A (zh) * 2015-04-25 2015-08-12 郑州大学 光热和光动联合抗肿瘤的以叶酸介导的金纳米星为载体的药物传递系统的制备方法及应用
CN106967717A (zh) * 2017-03-14 2017-07-21 西南医科大学 一种适配体介导腺病毒靶向给药系统及其构建方法
CN107233314A (zh) * 2017-05-08 2017-10-10 荆楚理工学院 一种具有双靶区同时递药效果的复合磷脂热敏脂质体及其制备方法和应用
CN109640965A (zh) * 2016-08-11 2019-04-16 塞尔利克斯生物私人有限公司 用于治疗肠易激综合征的组合物和方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003012519A (ja) * 2001-07-05 2003-01-15 Mitsubishi Pharma Corp ウルソデオキシコール酸誘導体を有効成分とする大腸癌予防／治療剤
CN101238137A (zh) * 2005-05-27 2008-08-06 安泰碧治疗公司 4-或5-氨基水杨酸的衍生物
CN101809039A (zh) * 2007-09-28 2010-08-18 那诺蒂克株式会社 叶酸修饰的环糊精化合物、其制备方法、靶向性药物传递系统用的药物传递剂、药物组合物及造影剂
CN101182298A (zh) * 2007-12-04 2008-05-21 西安交通大学 化合物2-羟基-5-丁酰胺基苯甲酸及其用途
CN103351307A (zh) * 2013-06-09 2013-10-16 西安交通大学 2-(丁酰氧基)-5-氨基苯甲酸及其制备方法和应用
CN104826127A (zh) * 2015-04-25 2015-08-12 郑州大学 光热和光动联合抗肿瘤的以叶酸介导的金纳米星为载体的药物传递系统的制备方法及应用
CN109640965A (zh) * 2016-08-11 2019-04-16 塞尔利克斯生物私人有限公司 用于治疗肠易激综合征的组合物和方法
CN106967717A (zh) * 2017-03-14 2017-07-21 西南医科大学 一种适配体介导腺病毒靶向给药系统及其构建方法
CN107233314A (zh) * 2017-05-08 2017-10-10 荆楚理工学院 一种具有双靶区同时递药效果的复合磷脂热敏脂质体及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PAOLO CALICETI等: "Synthesis and Physicochemical Characterization of Folate-Cyclodextrin Bioconjugate for Active Drug Delivery", 《BIOCONJUGATE CHEM》 *
STEFANO SALMASO等: "Specific Antitumor Targetable β-Cyclodextrin-Poly(ethyleneGlycol)-Folic Acid Drug Delivery Bioconjugate", 《BIOCONJUGATE CHEM》 *
刘涛等: "叶酸靶向载顺铂羧甲基-β-环糊精纳米复合物的制备及对鼻咽癌的体外抑制效应", 《中国细胞生物学学报》 *

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