CN101809039A - 叶酸修饰的环糊精化合物、其制备方法、靶向性药物传递系统用的药物传递剂、药物组合物及造影剂 - Google Patents

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Abstract

构成环糊精的吡喃葡萄糖的6位的第一级羟基的两个或两个以上基团分别被具有叶酸的取代基置换而成的环糊精化合物。

Description

叶酸修饰的环糊精化合物、其制备方法、靶向性药物传递系统用的药物传递剂、药物组合物及造影剂
技术领域
本发明涉及一种叶酸修饰的环糊精化合物，其制备方法，以及药物传递剂，特别是，作为针对过度表达叶酸受体的癌细胞等目标的靶向性药物传递系统(TDDS)用的药物传递剂而使用的环糊精化合物(以下有些情形简称为“CD化合物”)，及其制备方法。具体来讲，本发明涉及一种构成环糊精的吡喃葡萄糖的6位的第一级羟基的两个或两个以上基团被叶酸所修饰的环糊精化合物，其制备方法，以及包括所述环糊精化合物，并且具有不构成抗原的隐蔽性、癌细胞识别性、优良的药物传递性的特性，应用在靶向系统中的药物传递剂，药物组合物以及造影剂。
背景技术
癌细胞靶向性药物传递系统(以下简称“癌细胞TDDS”)由具有目标的受体(目标部位)的配体(识别标记)、载体(例如，脂质体、环糊精)以及药物(阿霉素、紫杉酚、姜黄素等)构成。
一直以来，作为癌细胞的所述识别标记，作为实用化研究对象进行了将叶酸导入到脂质体、高分子微囊等的研究。
非专利文献1和2的总论中已揭示：作为一种维生素的叶酸与在癌细胞表面上过度表达的叶酸受容体蛋白质(以下简称“FBP”)将以1010M-1的缔合常数强有力地缔合。并且，在非专利文献2中记载有叶酸具有有效的炎症部位识别性能的事项。该文献中，作为目标的癌细胞种类包括：子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、脑癌、精巢癌、卵巢癌、骨髓癌等。被送达的药物除了抗癌药之外，还可以是蛋白毒素、造影剂、反义寡核苷酸、基因等。
非专利文献3中已揭示：对CD付与多个识别标记时，如果恰当地配置在特定的集中空间的话，与细胞表面的配体受容体蛋白质的多个结合位点之间同时引起多个相互作用。虽然其中每个相互作用是由氢键结合所引起的弱结合，但是，随着相互作用个数的增加，累积性的(指数函数关系)相互作用构成强有力的因素，以缔合常数考虑的话，相当于与1010M-1级别的抗原抗体反应相同级别的位置选择特异性引起强有力的相互作用，也就是，在此记载了所谓的糖簇效应。
根据非专利文献4、5、6中的意大利Padova大学的Caliceti团队的报告可知，虽然他们使用的利用叶酸的癌细胞靶向性药物传递系统(以下简称“癌细胞TDDS”)目前不具有有效的实用性，但是此报告中确有记载叶酸修饰的环糊精化合物。
特别是，在非专利文献4中，他们对β-环糊精进行甲苯磺酰化，并导入分子量为700(14聚物)的二氨基聚乙二醇化合物(以下简称“二氨基PEG化合物”)，并以琥珀酸酯化法使其与叶酸进行反应，从而得到叶酸修饰的环糊精化合物(以下简称“CD-PEG-FA”)。利用表面等离子共振(SPR)解析法对所述CD-PEG-FA与固定化FBP的相互作用进行评价。并且，经共焦点激光扫描显微镜确认，两个小时之后渗入到人类口腔内癌细胞(KB)。进而，作为新的制备方法，对β-CD导入5个六亚甲基二异氰酸酯，使所述二胺PEG化合物结合，获得对其中之一导入叶酸的化合物(以下简称“CD-(C6-PEG)5-FA”)。对该化合物进行了生物体内分解性、β-雌二醇、姜黄素等药物的溶解性等类似的评价。进而，在非专利文献6中评价了装载姜黄素的所述化合物对人类口腔内皮癌细胞(KB)与人类肺癌细胞(MCF)的靶向性能。
可是，这些文献中的叶酸1置换修饰环糊精CD-PEG-FA以及CD-(C6-PEG)5-FA虽然能识别KB癌细胞，但是渗入情况并不具有定向性和明确性，传递抗癌药的效果也不明确。其制备方法也不明确，上述化合物的缔合常数是呈现较弱的103M-1左右，其实用性较低。
在构成环糊精(CD)的吡喃葡萄糖的6位中存在第1级羟基，例如，构成环糊精(CD)的吡喃葡萄糖为6个时，CD中存在着6个第1级羟基。在非专利文献7中，本发明的发明人将CD中复数个存在着的所述第1级羟基分别置换为结合有糖链的糖链臂，由此制备CD化合物，这种CD化合物与医药或凝集素之间具有非常优异的缔合性能，也就是，具有所谓的双重识别能力。
非专利文献1：S.Wang，Philip S.Low，J.Control.Release，53，39-48(1998).
非专利文献2：Philip S.Low，Walter A.Henne，Derek D.Doorneweerd，Accounts Chem.Research，41，120-129(2008).
非专利文献3：Y.C.Lee and R.T.Acc.Chem.Res，1995，2
非专利文献4：P.Caliceti，S.Salmaso，A.Semenzato，T.Carofiglio，R.Fornasier，M.Fermeglia，M.Ferrone，S.Pricl，Bioconjuate Chem.，14，899-908(2003).
非专利文献5：S.Salmaso，A.Semenzato，P.Caliceti，J.Hoebeke，F.Sonvico，C.Dubernet，P.Couvreur，Bioconjugate Chem.，15，997-1004(2004).
非专利文献6：S.Salmaso，S.Sara，A.Semenzato，P.Caliceti，J.Drug Targeting，15(6)，379-390(2007).
非专利文献7：K.Hattori，A.Kenmoku，T.Mizuguchi，D.Ikeda，M.Mizuno，T.Inazu，J.Inclusion Phenom.Macrocyclic Chem.，56，9-16(2006).
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有优异的目标缔合性能，或者，具有优异的药物包接能力的环糊精化合物，其制备方法，包括所述环糊精化合物的靶向性药物传递剂，药物组合物以及靶向性造影剂。特别是，本发明的目的在于提供一种与2个或2个以上叶酸和叶酸结合位点之间具有2个或2个以上的同时性相互作用的、对癌细胞的缔合性能优异的、具有优异的药物包接性能的环糊精化合物，其制备方法，包括所述环糊精化合物的靶向性药物传递剂，药物组合物以及靶向性造影剂。
根据本发明所述，提供了下述方案：
(1)构成环糊精的吡喃葡萄糖的6位的第一级羟基的两个或两个以上羟基分别被具有叶酸的取代基所置换而成的环糊精化合物，
(2)以下述通式1所表示的、被2个或2个以上叶酸修饰而成的(1)中所记载的环糊精化合物，
[化学式1]
通式1
Figure GPA00001075228300031
(在通式1中，m表示6～8的整数，m个的R1表示各自相互独立地具有下述通式2所表示的叶酸的取代基、羟基、具备糖基的取代基或者亲水性基团，并且，具有叶酸的所述取代基是所述环糊精化合物中的至少两个。所述环糊精化合物中的被置换的所述羟基之外的羟基，可以被具有糖基的取代基或者亲水性基团所置换。)
[化学式2]
通式2
Figure GPA00001075228300041
(在通式2中，※表示与构成环糊精的吡喃葡萄糖的6位碳原子之间的结合位置。并且，n表示0～3的整数，n为0时，羰基碳原子与氨基氮原子的结合部分表现为单结合。)
(3)被下述任一式所表示的(2)中所记载的环糊精化合物，
[化学式3]
Figure GPA00001075228300042
例示化合物1
[化学式4]
Figure GPA00001075228300051
Figure GPA00001075228300053
Figure GPA00001075228300054
(4)叶酸修饰的环糊精化合物的制备方法，缩合在构成环糊精的各个吡喃葡萄糖的6位的第一级羟基上具有氨基或者氨基-寡聚乙酰胺基的环糊精与叶酸，
(5)包括上述(1)～(3)的任一项所记载的环糊精化合物的靶向性药物传递剂，
(6)包括上述(1)～(3)的任一项所记载的环糊精化合物与药物，所述药物被所述环糊精化合物包接的靶向性药物组合物，以及
(7)包括上述(1)～(3)的任一项所记载的环糊精化合物与药物，所述药物被所述环糊精化合物包接的靶向性药物组合物。
接着，结合附图进一步详细说明本发明的上述以及其他特征的优点。
附图说明
图1：图1表示分别对所述例示化合物1等(作为比较例的比较化合物1、2，以及未修饰的β-CD)的FBP识别缔合的SPR测定结果。
图2：图2表示例示化合物1对于人类结肠癌细胞Caco-2以及小鼠肝脏正常细胞的缔合性的SPR测定结果。
图3：图3a是表示例示化合物1对于Caco-2肿瘤细胞的结合动力学行为的直线图。图3b是表示例示化合物1对于抗癌药DXR的结合动力学行为的直线图。
具体实施方式
首先，对本发明的环糊精化合物进行说明。
本发明的环糊精化合物是通过构成环糊精的吡喃葡萄糖的6位的第一级羟基的两个或两个以上羟基分别被具有叶酸的取代基置换而成。
作为本发明的环糊精化合物，优选的，由下述通式1所表示。
[化学式5]
通式1
在通式1中，m表示6～8的整数，m个的R1表示各自相互独立地具有下述通式2所表示的叶酸的取代基、羟基、具备糖基的取代基或者亲水性基团，并且，具有叶酸的所述取代基是所述环糊精化合物中的至少两个。
m为6时，构成α-环糊精，m为7时，构成β-环糊精，m为8时，构成γ-环糊精。m越大，环糊精的空洞直径就越大。在所述环糊精中，不能封入巨大分子、蛋白质，作为空洞的药物包接，优选的是疏水性的难溶性客体医药，另一方面，环糊精化合物比较小(1～5nm)，其小于脂质体或高分子胶束(100nm)，从细胞表面的渗透、组织内或者脑屏障中的移动较为容易。
如后所述，m是考虑需包接的药物的分子尺寸而定的，在此优选的，m为7。所述环糊精化合物中，具有叶酸的所述取代基个数为2个或2个以上，优选为m-1个以上，特别是优选为m个。
所述环糊精化合物中的被置换的所述羟基之外的羟基，可以被具有糖基的取代基或者亲水性基团所置换。
作为所述亲水性取代基，从本发明的环糊精化合物中付与亲水性的观点考虑，可以使用与羟基乙酸进行酯化反应而得的羟甲基羰基(-OCOCH2OH)，与葡糖酸进行酯化反应而得的葡糖酸酯基等。
[化学式6]
通式2
Figure GPA00001075228300071
在通式2中，※表示与构成环糊精的吡喃葡萄糖的6位碳原子之间的结合位置。并且，n表示0～3的整数，n为0时，羰基碳原子与氨基氮原子的结合部分表现为单结合。如后所述，优选的，n表示1或者2，更优选的，n表示2。
在通式2中，下列式所表示的是如后所述的来自作为间隔臂的氨基己酸的重复单元。
[化学式7]
Figure GPA00001075228300072
因此，在本发明的说明书中，有些情形将所述式所表示的部分仅仅标记为“cap”。从而，所述通式2可以表示为如下。
[化学式8]
通式2
Figure GPA00001075228300081
所述通式2中的※以及n的含义跟前述说明相同。
在本发明的说明书中，n为2时简称为cap2，n为1时简称为cap1。
另外，n为0时cap表示：将式中的羰基碳原子与氨基氮原子相结合的单结合。
这些作为间隔臂的、来自氨基己酸的重复单元，优选考虑下述观点1)和2)。
1)为获得所谓的“纳米簇效应”，即多个叶酸和多个叶酸受体(例如，癌细胞表层)之间的同时缔合，可提供适当的长度。
2)环戊烷部分具有疏水性，可以通过海葵效应增强药物的包接作用。
另外，对于叶酸受体的高级结构，从以叶酸为抑制剂的酶甘氨酸N-甲基转移酶的晶体结构解析中，其四聚体的副单元之间具有2个叶酸结合位点(参照以下报告：Z.Luka，S.Pakhomova，L.V.Loukachevitch，M.Egli，M.E.Newcomer，C.Wagner，J.Biol.Chem.，282，4069-4075(2007).)。从而，从生物学上的相同性因素可预测到，在癌细胞中的叶酸受体具有与糖簇效应相同的结构，可以想到多个叶酸在结合位点之间发挥多个同时性的相互作用。这种效果即是糖链的空间配置和受体的拓扑效果，也就是，类似于糖簇效应，可以简称为“纳米簇效应”。
并且，在多个臂被修饰的环糊精中，通过海葵效应(请参照：K.Hattori，A.Kenmoku，T.Mizuguchi，D.Ikeda，M.Mizuno，T.Inazu，J.Inclusion Phenom.Macrocyclic Chem.，56，9-16(2006).)的药物包接能力非常强烈，充分超过了作为目标值的106M-1，可以高效率地传递药物。
并且，在本发明所述的通式1所表示的环糊精化合物中，R1可以为具有下述通式3所表示的叶酸的取代基。如前所述，具有叶酸的所述取代基在所述环糊精化合物中至少有2个。
[化学式9]
通式3
Figure GPA00001075228300091
在通式3中，Y表示氧原子或者硫原子。※以及n的意义跟前述说明相同。
取代作为间隔臂的重复单元的氨基己酸，当Y为氧原子时，可以采用6-羟基己酸来制备，Y为硫原子时，可以使用巯基己酸来制备。
在本发明的说明书中，可以使用下述通式a表示所述通式1所表示的本发明的环糊精化合物。
[化学式10]
通式a
Figure GPA00001075228300092
在通式a中，R1和m的意义跟前述说明相同，m个R1表示各自独立的所述通式2所示的具有叶酸的取代基、羟基、具有糖基的取代基或者亲水性基团，并且，具有叶酸的所述取代基是所述环糊精化合物中的至少两个。
优选的，本发明的环糊精(CD)化合物是下述通式b所示的化合物。
[化学式11]
通式b
Figure GPA00001075228300093
在所述通式b中，m、n的意义跟前述说明相同。p为2个或2个以上且m以下的数值，m-p个X表示各自独立的具有羟基、糖基的取代基或者亲水性基团。
所述具有糖基的取代基付与给本发明的环糊精(CD)化合物亲水性。
并且，作为所述取代基中的糖基优选为被特定目标疾病(肝癌、大肠癌、炎症等)的目标蛋白质特异性的识别基团，考虑到容易获得以及容易合成，优选为低聚糖(1～4个单糖)乃至糖链，更优选为单糖，也就是，与靶向性药物传递系统(TDDS)的目标疾病(肝癌、大肠癌、炎症等)相适应的半乳糖基、墨角藻糖基、葡糖基以及甘露糖基等。
作为所述具有糖基的取代基，可以为1-糖基-丙氧基巯基氨基，具有作为间隔臂的所述cap的、1-糖基-丙氧基巯基胺己酰氨基(以下有些情形简称为“1-糖基-丙氧基巯基胺-cap1基”)，1-糖基-丙氧基巯基胺己酰胺己酰胺基(以下有些情形简称为“1-糖基-丙氧基巯基胺-cap2基”)等。所述取代基中的葡糖基，优选为：α-D-半乳糖基、α-L-墨角藻糖基、α-D-甘露糖基或者α-D-葡糖基。
作为本发明的环糊精化合物的具体例，可以表示为下述例示化合物1～10，但是本发明并不局限于这些例示化合物。
[化学式12]
Figure GPA00001075228300101
[化学式13]
Figure GPA00001075228300111
p＝3例示化合物2
p＝1例示化合物5
Figure GPA00001075228300112
p＝2例示化合物3
p＝1例示化合物6
[化学式14]
[化学式15]
Figure GPA00001075228300122
Figure GPA00001075228300123
Figure GPA00001075228300124
接着说明作为本发明原料而使用的环糊精(CD)。
在本发明中，作为原料而使用的CD，只要具有环糊精的基本骨架，则对其无特别限定，可以使用α-CD、β-CD以及γ-CD。在此，这些CD构成具有不同的吡喃葡萄糖数量(α：6个；β：7个；γ：8个)的环，随着数值的不同，其洞的直径也不同。例如，α-CD具有苯环可以充分进入的大小，其可包接三氯乙烯，四氯乙烯等。并且，β-CD具有萘环可以充分进入的大小，γ-CD具有两个蒽环或者两个萘环可以充分进入的大小。从而，本技术领域的技术人员可以考虑待包接药物的分子大小而选择具有最恰当洞直径的CD。
接着说明本发明环糊精(CD)化合物的制备方法。
本发明的CD化合物的制备方法的特征为：缩合在构成环糊精的各个吡喃葡萄糖的6位的第一级羟基上具有氨基或者氨基-寡聚乙酰胺基的环糊精与叶酸。优选的，本发明的CD化合物的制备方法的特征为，针对叶酸和，具有官能团的CD或者构成CD环的各个吡喃葡萄糖的6位的全部第一级羟基上具有间隔臂(使CD环与叶酸的间具有适当距离的结构体)的CD，在凝聚剂存在或者不存在的环境下使其进行反应。
接着说明使用所述制备方法制备的具有所述官能团的环糊精(CD)。
本发明的具有官能团的CD，优选为，构成CD环的各个吡喃葡萄糖的6位的全部第一级羟基被置换成官能团。对CD导入所述官能团时，可以使用本技术领域的技术人员认为可行的任何方法。
对于在每个吡喃葡萄糖的6位的第一级羟基上具有官能团的CD，作为构成CD环的官能团，可以例举如下：氨基、醚基、硫醚基、羧基、叠氮基、p-甲苯磺酰基、环氧化基、不饱和基、巯基，乙酸基、苯氧基，以及诸如碘、溴及氯等的卤素基团等，在此，氨基具有与叶酸的明确反应性，因此优选使用氨基。
具体来讲，构成环糊精(CD)的各个吡喃葡萄糖的6位的全部第一级羟基置换为氨基的，七-6-氨基-β-环糊精(下述式1)(以下某些情形简称为“全氨基化CD”)，使用本技术领域的技术人员认为可行的任何方法，将各个吡喃葡萄糖的6位的全部第一级羟基氯化(称为“全氯化”)，全叠氮化之后再通过全氨基化而得到。
接着说明构成所述环糊精(CD)的各个吡喃葡萄糖的6位的全部第一级羟基具有间隔臂的CD。
所述具有间隔臂的CD可以通过以下方式构筑：对于在构成CD环的各个吡喃葡萄糖的6位的全部第一级羟基上具有官能团的CD，利用作为间隔臂的1或者2个或2个以上的(优选为1或者2)氨基己酸进行缩合反应。所述缩合反应可以表示成如下图示。
[化学式16]
Figure GPA00001075228300141
Figure GPA00001075228300142
具体来讲，优选的，在甲醇/水的混合溶液等的反应溶剂中，对于七-6-氨基-β-环糊精(所述式1)，在室温(20℃)下，对于氨基，受叔丁氧羰基(Boc)基保护的氨基己酸8～40当量进行2～150小时(最好是在反应迅速结束时间点起2～24小时)的缩合反应之后，进行任意的脱保护(脱Boc化)反应。凝聚剂的选择以及反应溶剂的选择均可以采用业界人士所认为的恰当方式，但是，作为凝聚剂优选为如后所述的4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-yl)-4-甲基吗啉氯化物，作为反应溶剂优选为存在三乙胺(TEA)或者N-甲基吗啉(NMM)等碱性化合物的甲醇/水的混合溶液。
通过重复执行N次所述缩合反应与脱保护反应，可以构建：对于在构成环糊精(CD)的各个吡喃葡萄糖的6位的全部第一级羟基上，具有n个作为间隔臂的氨基己酸的CD。如后所述，n优选为1或者2。
n＝1时，上述式2所表示的β-CD可以为“七-6-氨基-cap1-β-CD”，n＝2时，上述式3所表示的β-CD可以是“七-6-氨基-cap2-β-CD”。
可以使2个或2个以上叶酸与叶酸结合位点之间发挥2个或2个以上的同时性相互作用而调节所述间隔臂长度，由此可以调节本发明的环糊精化合物中的叶酸的空间配置。
在此，从2个或2个以上的叶酸与叶酸结合位点充分发挥2个或2个以上的同时性相互作用的长度以及结构的观点考虑，作为所述间隔臂优选的是，n为1或者2。所述间隔臂的末端具有用于缩合反应的官能团。
在本发明的制备方法中，将所述全氨基化CD(式1)，所述七-6-氨基-cap1-β-CD(式2)或者所述七-6-氨基-cap2-β-CD(式3)，所述叶酸一同通过缩合反应使其结合，从而可以制备目标CD化合物。
以所述七-6-氨基-cap2-β-CD(式3)为例，所述缩合反应可表示成如下图示。
[化学式17]
Figure GPA00001075228300151
Figure GPA00001075228300152
具体来讲，对于所述全氨基化环糊精(CD)(式1)，所述七-6-氨基-cap1-β-CD(式2)或者所述七-6-氨基-cap2-β-CD(式3)，将10～100当量的叶酸溶解于反应溶剂中，并且，在三乙胺(TEA)或者N-甲基吗啉(NMM)等碱性化合物的在存下，在室温(30℃)中，与4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-yl)-4-甲基吗啉氯化物(DMT-MM)等凝聚剂进行2～150小时的反应，在此优选为进行12～60小时的反应。
作为反应溶剂，对应于化合物的溶解性，可以使用二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、水、甲醇、异丙醇、t-丁醇、N-甲基吡咯烷酮(NMP)等。关于凝聚剂以及反应溶剂的选择，可以由本技术领域的技术人员适当选取。
所述缩合反应中所使用的凝聚剂可以使用：4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-yl)-4-甲基吗啉氯化物(以下简称“DMT-MM”)，二环己基碳二亚胺(以下简称“DCC”)，水溶性碳化二亚胺(以下简称“WSC”)等本技术领域的任何凝聚剂。本技术领域的技术人员根据所选择的官能团或者反应溶剂的种类，可以选择恰当的凝聚剂。例如，在所述缩合反应中，环糊精上的官能团为氨基时，也就是，与叶酸的羧基进行反应时，作为凝聚剂使用所述DMT-MM为佳。
DMT-MM与碳氢酸反应生成酯，然后与胺反应形成酰胺键。该反应在乙醇、甲醇、异丙醇、水等各种溶剂中进行，且值得注意的是，有报告称进行了定量性反应(例如M.Kunishima，C.Kawachi，J.Morita，K.Terao，F.Iwasaki，S.Tani，Tetrahedron，55，13159-13170(1999))。
例如，作为脱盐酸剂可以使用具有与叶酸相同摩尔当量的N-甲基吗啉(NMM)或者三乙胺，作为凝聚剂可以使用具有相同或者5倍摩尔当量的DMT-MM。
利用丙酮再沉淀处理方式对生成物进行未反应物去除处理之后，通过凝胶过滤色谱法(GPC)对生成物进行精炼、离析为好。
作为使用在GPC中的凝胶可以选用Bio gel、Sephadex、TOSO-PW gel(这些是商品名)，但是，从分离精炼能力的角度考虑，优选使用Bio gel(例如，P4、P6)。
作为溶出溶液可以使用水、氨液等，但是，考虑到与未反应叶酸等杂质之间的分离能力，优选使用水。
可以使用本技术领域的技术人员认为合适的任意方法对制备得到的环糊精化合物结构进行确认。
接着说明本发明的靶向性药物传递剂以及靶向性药物组合物。
本发明的靶向性药物传递剂包括所述环糊精化合物，特别是，本发明的靶向性药物传递剂包括基于由2个或2个以上叶酸引起的纳米簇效应的所述环糊精化合物，其应用于癌细胞、炎症等的靶向性药物传递系统(TDDS)。并且，本发明的靶向性药物组合物包括所述环糊精化合物与药物。优选的，本发明的靶向性药物组合物包括与药物同等摩尔当量的环糊精化合物为好。
本发明的靶向性药物传递剂以及靶向性药物组合物可以包括所述环糊精化合物之中的一种或者两种以上。作为环糊精化合物与药物共存方式，可以考虑使药物内包(包接)在环糊精化合物中。
在此，所谓靶向性药物传递系统(TDDS)是指，通过对药物的投入形态(剂形，添加剂等)进行研究，从而精密控制药物在体内的动态，由此使药物选择性并且局部性地送达到目标细胞。根据本发明所述，对于发现叶酸受体的目标细胞或者目标组织，可以更加选择性地送达目标药物。特别是，根据本发明所述，对于过度表达叶酸受体的目标细胞或者目标组织，可以进一步选择性地送达目标药物。可以适用本发明的目标包括：癌、自身免疫疾病、炎症性疾病等疾病的疾病组织以及疾病部位。
可以适用本发明的癌症包括：上皮性恶性肿瘤，脊髓为主的造血器官恶性肿瘤等，特别是，卵巢癌(非粘液性卵巢癌等)、子宫癌、子宫内膜癌、乳癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌(睾丸绒毛上皮癌等)、脑癌(室管膜瘤等)、咽喉癌、肺癌、肺腺癌、肾癌(肾细胞癌等)、肝癌、大肠癌(结肠癌等)、胸膜间皮瘤、肉瘤、慢性以及急性骨髓性白血病、肺转移性肿瘤等各种转移性癌症。
可以适用本发明的自身免疫疾病以及/或者炎症性疾病包括：风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、动脉粥样硬化症、多发性硬化症、克罗恩氏病、银屑病、溃疡性结肠炎、肺纤维症、移植物抗宿主疾病等。
本发明的靶向性药物组合物对于疾病组织以及疾病部位，可以应用于发现叶酸的疾病的治疗上，最好是过度表达叶酸的疾病的治疗上。在本说明书中，所谓“治疗”是指：对于有可能遭受疾病或者已遭受疾病的哺乳动物，不仅包括治愈或者改善该疾病，还包括阻止或者缓和该疾病恶化，也就是，不仅包括治疗相关处置，还包括预防相关处置。并且，作为适用本发明的药物可以根据具体疾病适当选取使用。作为所述药物除了包括抗癌药(包括抗癌剂、癌转移抑制剂)之外，还会包括蛋白毒素、造影剂、反义寡核苷酸、基因等。
本发明的靶向性药物组合物可以为液体药剂以及固体药剂。具体来讲，作为靶向性药物组合物的液体药剂可以为注射剂，特别是皮下、肌内、关节内、静脉内用注射剂。作为液体药剂时，在靶向性药物组合物中，除药物以及CD化合物之外，根据需求还可以添加任意的pH调整剂、缓冲剂、稳定剂、增溶剂等。并且，作为靶向性药物组合物的固体药剂可以为药片、散药、颗粒剂、胶囊剂、浓缩溶剂等的口服性固体药剂或者喷雾剂、栓剂、注射剂、外用剂、点滴剂等非口服用固体药剂。做成固体药剂时，在靶向性药物组合物中，除了药物以及所述CD化合物之外，根据需求还可以添加任意的赋形剂、结合剂、溶解剂、润滑剂、着色剂、佐剂等，进而，根据需求还可以任意实施多种包衣，例如，糖衣、凝胶包衣以及类似的可被应用的包衣。
本发明的靶向性药物组合物可以投入到可能遭受或者已遭受上述疾病的哺乳动物(优选为人类)。根据投入对象的年龄、体重、疾病种类、症状程度、药物种类的不同而其投入量也显著不同，但是，通常对于成年人而言，1日内可分一次或多次投入约1mg～100mg的药物。
本发明的靶向性药物传递剂为所述具有糖基的取代基中所述糖基为半乳糖基的环糊精(CD)化合物时，肝实质细胞表面可以成为合适的目标，可以应用到肝癌疾病上。
并且，所述糖基为墨角藻糖基的CD化合物时，大肠表面细胞可以成为合适的目标，可以应用到大肠癌疾病上。具有所述糖基的取代基中的所述糖基为甘露糖基或者葡糖基的CD化合物时，可以通过导入巨噬细胞的方式应用到癌症疾病上。
接着说明具有所述糖基的取代基的构建。
具有所述糖基的取代基，以配糖物为半乳糖苷为例，按照下述反应式进行构建。
[化学式18]
Figure GPA00001075228300181
具有所述糖基的取代基在酸催化剂的存在下，通过丙烯醇的糖乃至糖链的丙氧基化，使用碳个数为2～7的巯基脂肪酸进行光加成反应的方式进行构建。作为所述巯基脂肪酸，优选使用3-巯基己酸，4-巯基丁酸。
具体来讲，使用丙烯醇溶解糖乃至糖链，添加酸催化剂并在温度为97℃的氮气流回流中合成烯丙基配糖物。在所获得的烯丙基配糖物和3-巯基己酸等巯基脂肪酸进行光加成反应，从而构建为糖隔臂单元。
所述烯丙基配糖物与巯基脂肪酸的反应是在氮气、氩等惰性气体氛围中照射紫外线的方式进行。
在此使用200nm～400nm范围内的紫外线，优选使用340nm～380nm。照射时间为1～20小时，优选为3～7小时。在此，可以根据反应状态，反应装置的不同，进行适当改变。作为反应溶剂使用DMF、甲醇、水等。
对其生成物，使用根据Sephadex G10的GPC方式进行精炼。
接着说明药物以及目标蛋白质之间的缔合评价。
作为包接在CD中的药物，可以举例抗癌医药品——阿霉素(DXR)。
本发明的靶向性药物组合物为，将以包接缔合在CD空洞部分中的药物做成标识化合物，由此可以做到靶向性造影剂。具体来讲，所述被包接缔合的标识化合物做成L-[3-18F]-α-甲基酪氨酸(18F-FMT)，由此可以做到使用在PET(正电子发射型断层显像)中的靶向性造影剂。
并且，所述被包接缔合的标识化合物做成荧光色素化合物(例如，荧光素)，由此可以做到使用在荧光/内视镜中的靶向性造影剂。
进而，所述被包接缔合的标识化合物做成钆(Gd)化合物(例如，钆螯合芳香族化合物)，由此可以做到使用在核磁共振成像技术(MRI)中的靶向性造影剂。
进而，所述包接缔合的标识化合物做成钡化合物，或者碘乃至碘化合物(例如，1，3，5-三碘苯)，由此可以做到使用在X射线电脑断层扫描法(X射线CT)的靶向性造影剂。
评价所述环糊精(CD)化合物的双重识别能力的方法是：使用通过表面基因共鸣法获得的、所述CD化合物对于药物的包接缔合常数以及对于所述CD化合物的目标蛋白质的识别缔合常数构成的二维图示进行。
在此，所谓[双重识别]是指，本发明的CD化合物，一方面其糖链部分与目标蛋白质缔合，另一方面其CD空洞部分与药物包接缔合的现象。
作为目标蛋白质可以例举存在于癌细胞表面等的受体蛋白质等。
使用固化DXR等药物，或者叶酸受体蛋白(FBP)等目标蛋白质的表面等离子共振(SPR)光学生物传感器来求得各个缔合常数，并通过二维图示扫描适合做成所述靶向性药物传递剂的CD化合物。
作为评价所述双重识别能力的方法，经过动物实验或临床实验来分别求得医药品及其对应细胞表面的受体蛋白之间的缔合常数，将各个对数标示在横轴、纵轴而评价双重识别，越靠近右上则说明该靶向性药物传递系统(TDDS)用的药物传递剂具有更好的药剂包接能力以及目标蛋白质之间的缔合能力。
接着说明表面等离子共振(SPR)光学生物传感器的原理。
使用SPR光学生物传感器(例如，IAsys)的表面等离子共振(SPR)法可以测定生物体高分子的分子之间相互作用。
利用SPR法可以测定本发明的CD化合物的、对于目标蛋白质的缔合以及药物包接缔合。
具体来讲，将配体(例如，叶酸结合蛋白质)固定在比色杯上，溶解在缓冲溶液中的对象物质(例如，本发明的环糊精(CD)化合物)注入到所述比色杯中。其次，测定以完全反射角以下的入射角向棱镜发射激光时所生成的、损耗波与表面基因组波引起表面等离子共振(SPR)时的入射角。产生SPR的入射角根据600nm的损耗域内的质量而变化。可以观测其变化量，此时的变化量简称为响应(R)。该入射角与所缔合的分子的质量成比例。也就是，可以从这些质量变化观测到缔合分离相互作用。
本发明的环糊精化合物，一方面其可以通过本身具有的环糊精空洞部分与药物进行包接缔合，另一方面，发挥作为识别标记的叶酸的空间性集中配置的所述纳米簇效应，其具有优异的对于癌细胞等目标的受体等的叶酸结合位点之间的缔合性。
本发明的环糊精化合物虽然根据侧链的长度而不同，但是，大概为10nm以下，大部分为5nm以下，也就是，比较小，其具有优异的细胞膜透过性，具有稳定的环糊精，另一方面，该环糊精通过配糖物结合的加水分解而具有自然分解性，其具有优异的生物体内的安全性。
本发明的环糊精化合物，将其分子内的羟基被半乳糖基、墨角藻糖基等具有糖基的各种取代基所取代，由此，可以进一步具有目标器官/细胞特异性(癌细胞、肝脏、大肠、巨噬细胞等)。
通过本发明的环糊精化合物的制备方法，可以不通过复杂工程而简单获得所述具有优异特性的环糊精化合物。
本发明的靶向性药物传递剂，其主要由作为糖的环糊精构成，因此，其抗原性较低，还具有隐蔽性。在此，所谓的隐蔽性是指，不遭受来自γ-球蛋白抗体的生物体防御为目标的免疫攻击，不发挥抗原性而在生物体内移动。
由于本发明的靶向性药物组合物由于包括所述环糊精化合物，因此，可以使用在抗癌药物中的癌细胞目标载体或者炎症部位目标载体，癌组织的造影剂的目标，基因等的传递等领域。具体来讲，适合于应用在对于癌、肝癌、大肠癌等疾病的靶向性药物传递系统(TDDS)，对于癌组织等的靶向性造影剂。
实施例
接着，对于本发明的实施例进行进一步说明，但是需要注意的是，本发明并不局限于这些内容。
参考例1：七-6-氨基-β-CD(所述式1)的制备
(1)七-6-氯-β-CD的制备
在双口烧瓶中放入3.0274g的β-环糊精(CD)，利用乙醇进行4次共沸并使其脱水之后，进行20小时的真空干燥(40℃)。真空干燥之后，对烧瓶进行氮气置换之后取出而获得2.75g(2.42×10-3mol)的β-CD。对此，放入23ml的预先利用CaH2进行脱水的二甲基甲酰胺(DMF)并使其溶解，并放置在氮气气流中。进而，缓慢滴入2.9ml(37×10-3mol)的甲烷磺酰氯。其次，在80℃的油槽温度下进行4小时30分钟的反应。冷却到室温之后，为了停止反应，放入5ml的乙醇并进行30分钟的搅拌，利用大约12ml的甲醇钠28％甲醇溶液进行中和(pH 7～8)，并进行16小时20分钟。
利用蒸发装置对其进行干燥固化，移到瓷漏斗中利用甲醇以及水清洗生成物。进行24小时20分钟的真空干燥(40℃)之后，获得2.5886g的产量，其收获率为85％。通过色谱法(TLC)以及激光电离飞行时间质谱分析仪(MALDI-TOF MS)进行确认。TLC使用丁醇∶乙醇∶水＝5∶4∶3的展开溶剂1，并作为显色试剂使用茴香醛，其Rf值为0.83。
(2)七-6-氯-β-CD的制备
在圆底烧瓶中，利用二甲基乙酰胺∶水＝60ml∶8ml溶解1.2630g(9.9930×10-4mol)的七-6-氯-β-CD，并添加1.4232g(218.9×10-4mol)的叠氮化钠。在110℃的油槽温度下进行24小时的反应之后，反应溶液的温度降低到室温为止搅拌1小时。利用移液管将其溶液滴入到约700ml的水中，使其生成物沉淀化，去除作为杂质的滤液。将过滤物转移到瓷漏斗中，利用水对其进行清洗。进行13个小时的真空干燥(40℃)之后，获得1.1562g的产量，其收获率为88％。通过色谱法(TLC)以及激光电离飞行时间质谱分析仪(MALDI-TOF MS)进行确认。TLC使用丁醇∶乙醇∶水＝5∶4∶3的展开溶剂1，并作为显色试剂使用茴香醛，其Rf值为0.77。
(3)七-6-氨基-β-CD(所述式1)的制备
在圆底烧瓶中，利用73ml的DMAc溶解1.0015g(7.6446×10-4mol)的七-6-氯-β-CD、3.1962g(121.86×10-4mol)的三苯基膦，在室温中进行1小时反应之后，添加30ml(4000×10-4mol)的25％氨水搅拌22小时30分钟。反应之后，利用蒸发装置对其进行浓缩，添加500ml的乙醇对生成物进行沉淀化，去除作为杂质的滤液。将过滤物移到瓷漏斗中，利用乙醇对其进行清洗。进行19小时50分钟的真空干燥(40℃)之后，获得0.8321g的产量，其收获率为96％。通过色谱法(TLC)以及激光电离飞行时间质谱分析仪(MALDI-TOF MS)进行确认。TLC使用丁醇∶乙醇∶水＝5∶4∶3的展开溶剂1，并作为显色试剂使用茴香醛以及茚三酮。
参考例2：七-6-氨基-cap1-β-CD(所述式2)的制备
由于在七-6-氨基-β-CD(所述式1)(1.71g)中导入氨基己酸，使用氨基被Boc基保护的氨基己酸(10当量，3.51g)，在甲醇/水的混合溶液(1∶1v/v，20ml∶20ml)中，添加N-甲基吗啉(NMM)(10当量，1.67ml)之后，一次性添加凝聚剂(DMT-MM)(10当量，4.2g)，在室温中进行48小时的反应。反应之后，利用蒸发装置对其进行浓缩，利用纯水对生成物实施再沉淀。去除滤液之后，溶解在甲醇中，将过滤物干燥固化而获得七-6-Boc-氨基-cap1-β-CD。
在七-6-Boc-氨基-cap1-β-CD中添加大约4ml的4M-HCl/二氧杂环乙烷溶液，在冰冷环境中搅拌3小时，进行脱Boc化，获得七-6-Boc-氨基-cap1-β-CD(所述式2)。获得2.17g的产量，其收获率为74.6％。使用MALDI-TOF MS进行生成物的确认。
MALDI-TOF MS：计算值1920.55[M]+，1943.54[M+Na]+，1959.65[M+K]+；实测值m/z 1919.50，1956.81。
参考例3：七-6-氨基-cap2-β-CD(所述式3)的制备
为了在所述七-6-氨基-cap1-β-CD(1.0g)中进一步导入氨基己酸，使用氨基受Boc基保护的氨基己酸(20当量，2.4g)，在甲醇溶液(100ml)中添加NMM(20当量，1.15ml)之后，一次性添加DMT-MM(20当量，2.88g)，并在室温中进行48小时的反应。反应之后，利用蒸发装置对其进行浓缩，利用纯水对生成物实施再沉淀。去除滤液之后，溶解在甲醇中，将过滤物干燥固化而获得七-6-Boc-氨基-cap2-β-CD。
在七-6-Boc-氨基-cap2-β-CD中添加大约4ml的4M-HCl/二氧杂环乙烷溶液，在冰冷环境中搅拌3小时，进行脱Boc化，获得七-6-Boc-氨基-cap2-β-CD(所述式3)。获得1.46g的产量，其收获率为103.4％。使用MALDI-TOF MS进行生成物的确认。
MALDI-TOF MS：计算值2712.3[M]+，2735.29[M+Na]+，2751.4[M+K]+；实测值m/z2711.45，2732.78，2748.80。
实施例1：例示化合物1以及7～10的制备
在100ml的反应容器中放入53.3mg(2×10-5mol)的七-6-Boc-氨基-cap2-β-CD(所述式3)，276.9mg(60×10-5mol)的叶酸，并在100℃温度中利用20ml的DMSO进行溶解。接着，添加NMM 66μl(60×10-5mol)，DMT-MM(60×10-5mol)，甲醇20ml，在30℃的油槽温度下搅拌45小时。
(a)反应结束之后，丙酮再经沉淀、吸滤后，在圆底烧瓶中，利用1M氨水对过滤物进行溶出，并进行冷冻干燥。精炼是通过Bio-Gel-P6的GPC来进行。GPC柱条件如下：
Figure GPA00001075228300231
4cm×92cm，溶出速度0.25ml/分钟，样品浓度294mg/4ml(氨水)Bio-Gel-P6处理之后，获得55.5mg的产量，收获率为49.8％的生成物。
所述(a)的分离精炼之后，对生成物进行NMR测定的结果为，δ值(ppm)的8.66～8.69、7.61～7.70、6.60～6.71的各个多原子信号由例示化合物1的叶酸部分信号与作为微量杂质的未反应叶酸信号构成，那些各个信号的积分值进行平均的取代度为6.4，在其中共存这微量的从例示化合物1游离出来的化合物(叶酸6取代环糊精化合物)。在此，通过下述(b)所示的分离精炼工程对例示化合物1进行精炼、离析。
(b)反应结束之后，丙酮再经沉淀、吸滤后，在旋转减压蒸发器中，去除挥发性成分，进行干燥固化。过滤物100mg分散于水中，加热到50～60℃，施加超声波进行溶解。利用膜滤器(0.45μ聚丙烯过滤器，Whatman plc.制)过滤不溶物之后，通过Bio-Gel-P4凝胶(Bio-Rad Laboratories公司制)的GPC填充到
Figure GPA00001075228300232
4cm×60cm的玻璃柱中，在2.0ml/分钟的流速、17大气压加压下进行。作为溶出液使用水，利用分部收集器对目标化合物进行分流收集，利用蒸发装置进行干燥固化之后，利用少量水进行溶解，冷冻干燥之后获得例示化合物1为18.3mg，收获率为44.4％。
并且，同时获得例示化合物7～10，对其进行分别单离。
确认例示化合物1以及7～10时，利用TLC(Rf值0.48；展开溶剂1-丁醇∶乙醇∶水∶25％氨水＝5∶4∶3∶5，显色试剂：茴香醛以及碘)，MALDI-TOF MS(M＝C259H350O77N70；[M+H]+：计算值5676.98，实测值5674.10；[M+Na]+：计算值5698.96，实测值5697.97；[M+K]+：计算值5715.07，实测值5716.21)，1H NMR以及1H-1H COSY进行NMR峰值的归属。1H NMR(500MHz，DMSO-D2O)δ(ppm)：1.24(28H，s)1.40(28H，s)1.49(28H，s)1.93～1.97(14H，m)2.06(28H，s)2.26～2.28(14H，t)3.03(28H，s)4.20(7H，t)4.53(14H，s)4.86(7H，s)6.60～6.71(14H，m)7.61～7.70(14H，m)8.66～8.69(7H，m)。利用常用融点测量装置进行测量之后发现在188～189℃温度下被分解。
例示化合物7计算值：5812.12[M+Na]+；实测值：5812.03[M+Na]+
例示化合物8计算值：5585.81[M+Na]+；实测值：5586.03[M+Na]+
例示化合物9计算值：5275.58[M+Na]+；实测值：5275.40[M+Na]+
例示化合物10计算值：5065.37[M+K]+；实测值：5065.27[M+K]+
实施例2：例示化合物2以及6的制备
(1)1-D-半乳糖基-丙氧基的制备
在双口烧瓶中放入5.0138g的半乳糖，利用乙醇进行4次共沸并使其脱水，真空干燥之后，对烧瓶进行氮气置换后取出，放入50ml的丙烯醇进行溶解，并置于氮气气流中。在此，作为酸催化剂添加1.5091g的Dowex 50W-X8，加热并进行2小时的回流。其次，通过吸滤方式去除Dowex 50W-X8，移到双口烧瓶进行浓缩干燥固化。冷冻干燥固化之后，获得产量为6.22g、总收获率为101％的生成物。
(2)1-α-D-半乳糖基-丙氧基巯基羧酸(所述式4)的制备
在双口烧瓶中，将6.22g的1-D-半乳糖基-丙氧基溶解于25ml的甲醇并置于氩气流之下。其次，添加2.7ml的3-巯基己酸，停止氩气流并盖上盖子，搅拌的同时照射5个小时的紫外线。
浓缩干燥固化，冷冻干燥固化之后，在Sephadex G-10的GPC中对其进行精炼。获得7.06g的产量，其收获率为77％。
计算值：349.35[M+Na]+、365.46[M+K]+；实测值：350.04，365.9
(3)例示化合物2以及5的制备
利用1.0ml的甲醇和1.0ml的DMSO(1∶1)溶解4.5mg的通过参考例1制备的所述七-6-氨基-β-CD和1.8mg的叶酸(对于所述七-6-氨基-β-CD相当于1当量)，并添加作为凝聚剂的DMT-MM(对于七-6-氨基-β-CD相当于1当量)，在室温中搅拌30分钟，使其进行反应。其次，利用0.5ml的甲醇溶解39.6mg的D-半乳糖基-丙氧基巯基羧酸(对于七-6-氨基-β-CD相当于1当量)，并添加作为凝聚剂的DMT-MM(对于七-6-氨基-β-CD相当于30当量)，在室温中搅拌13天，使其进行反应。使用总计34.7mg的DMT-MM。
利用MALDI-TOF MS对生成物进行确认之后，利用巴斯德吸管将其生成物一点点添加在10倍容量的丙酮中，并析出生成物和未反应叶酸。对此进行吸滤之后，在析出物质之中，可以溶解于水的成分流入圆底烧瓶，使其冷冻干燥，获得例示化合物2以及5的混合物质，其产量为10.5mg，其收获率为76％。
例示化合物2(C147H208O71N28S4)计算值：3670.73[M+K]+；实测值：3671.04[M+K]+
例示化合物5(C133H214O75N14S6)计算值：3440.66[M+K]+；实测值：3432.68[M+K]+
如前所述，利用上述质谱等，以完全不同的分子峰值进行检测，并且，其分子量之差导致在GPC中的溶出时间不同，由此，通过Bio-Gel-P4的GPC，利用通常方法对例示化合物2以及5进行分离或精炼。
实施例3：例示化合物3以及6的制备
(1)1-L-墨角藻糖基-丙氧基巯基羧酸的制备
在实施例2中，与所述1-D-半乳糖基-丙氧基巯基羧酸(所述式4)的制备相同的顺序制备1-L-墨角藻糖基-丙氧基巯基羧酸。
计算值：333.35[M+Na]+、349.46[M+K]+；实测值：334.09[M+Na]+、350.08[M+K]+
(2)例示化合物3以及6的制备
接着，在100ml的容器中，放入118.8mg(3.82×10-4mol)的所述1-L-墨角藻糖基-丙氧基巯基羧酸，157.5mg(3.56×10-4mol)的叶酸，溶解于6ml的DMSO中，并且，添加参考例1中所制备的13.6mg(1.20×10-5mol)的所述七-6-氨基-β-CD，201.3mg的DMT-MM，12ml的甲醇，并搅拌13天。其次，进行丙酮再沉淀，并通过吸滤方式去除1-L-墨角藻糖基-丙氧基巯基羧酸，叶酸，DMT-MM，可以溶解于水的成分移到圆底烧瓶(将玻璃过滤器内的残留物移到圆底烧瓶时使用超纯水)，并进行浓缩干燥固化。获得产量为11.1mg，收获率为26.8％的例示化合物3以及6的混合物。
例示化合物3(C140H211O68N21S5)计算值：3475.70[M+K]+；实测值：3478.85[M+K]+
例示化合物6(C133H214O69N14S6)计算值：3344.66[M+K]+；实测值：3347.65[M+K]+
如前所述，利用上述质谱等，以完全不同的分子峰值进行检测，并且，其分子量之差导致在GPC中的溶出时间不同，由此，通过Bio-Gel-P4的GPC，利用通常方法对例示化合物3以及6进行分离或精炼。
[化学式19]
实施例4：例示化合物4的制备
将通过现有方法(例如，Aoki，R.Arai，K.Hattori，J.Inclusion Phenom.，50，115-120(2004))合成的单一-6-氨基-β-CD(式5；0.17g)，叶酸(0.07g)，二环己基碳二亚胺(DCC；0.03g)溶解于5mL的DMSO，10μL的呲啶中，并在室温(24℃)中搅拌24小时。反应之后，利用蒸发装置对其进行浓缩，利用Sephadex G-10柱(3cm×20cm)进行凝胶过滤操作。利用蒸发装置对分离取得的溶液进行浓缩干燥固化，利用少量水溶解之后进行冷冻干燥，获得例示化合物4。其产量为0.11g，其收获率为45％。
1H NMR(500MHz，D2O)δ(ppm)：1.80～2.32(4H，m)，4.95～5.00(7H，d)，6.72～6.76(2H，d)，7.53～7.57(2H，d)，MALDI-TOF MS(C61H89O39N8)计算值：1558.39[M+H]+；实测值：1559.13[M+H]+
实施例5：对于例示化合物1等的叶酸结合蛋白质(FBP)的缔合评价
<FBP的固定化>
使用在固定化的试剂通过下述方式获得。
·1mM BS3溶液：将2.9mg的双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸盐(BS3)溶解于5ml的10mM磷酸缓冲溶液(pH7.2)而得。
·FBP固定化溶液：将1mg的FBP(SIGMA公司制)溶解于1ml的10mM磷酸缓冲溶液(pH7.2)而得。
利用所述IAsys(表面等离子共振(SPR)装置)，通过下述(1)～(8)操作对FBP进行固定化。
(1)在SPR光学生物传感器反应杯表面上的氨基硅烷基团上，作为与凝集素蛋白质的氨基进行反应的衔接物，注入所述1mM BS3溶液并使其预先进行反应，响应平衡为止放置15分钟左右。
(2)在所述反应杯中注入10mM磷酸缓冲溶液(pH7.2)，并使其响应平衡为止等待。
(3)使响应尽量少变化为止，多次(例如，4次)重复所述(1)，(2)操作。
(4)为了使得惰性化、阻塞未反应的氨基硅烷，将乙酐-醋酸溶液(混合体积比1∶1)注入到反应杯中。
(5)注入10mM磷酸缓冲溶液(pH7.2)进行清洗之后，注入10mM磷酸缓冲溶液(pH7.2)进行溶剂置换。
(6)注入所述FBP固定化溶液，进行反应，使其平衡为止，放置。
(7)注入10mM磷酸缓冲溶液(pH7.2)使其稳定为止，备用。
(8)考虑到反应杯上的后台影响，为了使得惰性化、阻塞未反应的BS3末端的琥珀酸酰胺酯基，注入1M乙醇胺溶液，并放置5分钟左右。
关于FBP的固定化，由于注入(6)时被测定的FBP的响应(R)的变化量为1081.4arcsec，因此，识别为R＝600arc sec时在1ng/mm2中，每1nm2存在1个氨基硅烷基团，因此，以1.80ng/mm2进行固定化。
<对于FBP的所述例示化合物1等的缔合评价>
在固定化FBP的反应杯中，注入200μl的溶解于10mM磷酸缓冲溶液(pH7.3；含有0.85％NaCl)的所述例示化合物1(1.0×10-6M)，由此得到图1所示的饱和曲线(测定温度25.0℃)。通过实施例2获得的由例示化合物2以及5构成的混合物，通过实施例3获得的由例示化合物3以及6构成的混合物，作为比较例的比较化合物1、2，未修饰的β-CD，均以1.0×10-6M的浓度，如同例示化合物1的方法进行SPR测定，并评价了对于FBP的缔合性。
[化学式20]
Figure GPA00001075228300271
Figure GPA00001075228300272
图1表示所述例示化合物1(图中1)、由例示化合物2以及5构成的所述混合物(图中2)、由例示化合物3以及6构成的所述混合物(图中3)、作为比较例子的比较化合物1(图中4)、比较化合物2(图中5)、以及未修饰的β-CD(图中6)对于上述物质的FBP识别缔合的SPR测定结果示意图。
响应的变化量与所缔合的化合物质量呈比例，响应越大则缔合常数越大，认为具有优异的缔合性。
如图1所示，不具备作为识别标记的叶酸的比较化合物1、2，未修饰的β-CD完全没有表现缔合性。另一方面，由例示化合物2以及5构成的所述混合物，由例示化合物3以及6构成的所述混合物均显示对于FBP的缔合性。进而，具有7个叶酸基团的所述例示化合物1基于所述纳米簇效应，其缔合性能最好。缔合常数为5.1×109M-1。
另外，对于例示化合物4也进行了同样的SPR测定，其结果为，其缔合性能不如具有7个叶酸基团的所述例示化合物1。缔合常数的概算值为7.8×105M-1。
实施例6例示化合物1对于Caco-2肿瘤细胞以及小鼠肝脏正常细胞的缔合比较评价
例示化合物1通过如同上述方法对于引起人类结肠癌的细胞的Caco-2细胞以及作为其比较目标细胞的小鼠肝脏正常细胞进行SPR测定，由此比较评价了识别相互作用。
试验6-1.对Caco-2肿瘤细胞的SPR测定
取代FBP固定化溶液而作为Caco-2细胞固定溶液使用Caco-2细胞的适量浓度液体(磷酸缓冲溶液(pH7.3)+0.85％NaCl)(CORNING公司制)之外，其他部分与实施例10的<FBP的固定化>操作相同，由此进行了Caco-2细胞的固定化。进而，对Caco-2细胞进行固定化之后的反应杯中，注入200μl的、溶解于磷酸缓冲溶液(pH7.3)+0.85％NaCl的、所述例示化合物1(1.0×10-10M)，并进行SPR测定。
试验6-2.对小鼠肝脏正常细胞的SPR测定
取代FBP固定化溶液而作为小鼠肝脏正常细胞固定溶液使用小鼠肝脏正常细胞的适量浓度液体(生理食盐水)(COSMO BIO co.，ltd.(RKL)公司制)之外，其他部分与实施例5的<FBP的固定化>操作相同，由此进行了小鼠肝脏正常细胞的固定化。进而，对小鼠肝脏正常细胞进行固定化之后的反应杯中，注入200μl的、溶解于生理食盐水(含有1mM CaCl2NaCl)的、所述例示化合物1(1.0×10-10M)，并进行SPR测定。
图2表示通过试验6-1以及6-2获得的结果。图2表示例示化合物1分别对于Caco-2肿瘤细胞(图中7)以及小鼠肝脏正常细胞(图中8)的缔合性的SPR测定结果。
如上所述，响应越大则缔合常数越大并具有优异的缔合性能，如图2所示，例示化合物1几乎不与小鼠肝脏正常细胞缔合，但是，与Caco-2肿瘤细胞强有力的缔合，也就是，对于癌细胞具有特殊的识别缔合性能。
实施例7：例示化合物1对于Caco-2肿瘤细胞以及抗癌药DXR的缔合比较评价
使用引起人类结肠癌的细胞的Caco-2细胞，并评价了识别相互作用。
试验7-1.对Caco-2肿瘤细胞的识别缔合测定
取代FBP固定化溶液而作为Caco-2肿瘤细胞固定溶液使用Caco-2细胞的适量浓度液体(磷酸缓冲溶液(pH7.3)+0.85％NaCl)之外，其他部分与实施例5的<FBP的固定化>操作相同，由此进行了Caco-2肿瘤细胞的固定化，进而，由于通过直线图示方法求得对于FBP的缔合常数，因此，将包含改变成多个浓度的所述例示化合物1的溶液注入到对Caco-2肿瘤细胞进行固定化了的反应杯中，并进行SPR测定。
图3a是表示对于Caco-2肿瘤细胞的结合动力学行为的直线图。
如图3a所示，与Caco-2肿瘤细胞的缔合测定结果，例示化合物1的缔合常数为5.1×109M-1。
作为特异性反应的典型例的抗原抗体反应的缔合常数为1010M-1左右，考虑到例示化合物1对于Caco-2细胞具有相同水准的缔合常数，因此，可以认为例示化合物1对于癌细胞具有充分的特异性识别缔合性能。并且，该缔合性能的强度受所述纳米簇的影响。
试验7-2.药物DXR的包接性能的测定
作为药物使用制癌抗生物质-阿霉素(以下简称“DXR”)，使用相同于试验例1的方法评价本发明的CD化合物的包接性能。
1)DXR的固定化
对于DXR的光学生物传感器反应杯的固定化操作是，除了溶解药物的缓冲溶液的pH不同之外，其他操作方法相同于上述FBP的固定化。
(1)在反应杯表面上的氨基硅烷基团上，作为与DXR的氨基进行反应的衔接物，注入1mM BS3溶液/10mM磷酸缓冲溶液，并在pH6.5环境中使其进行反应。光学生物传感器的响应相对稳定为止多次重复此操作，并通过添加乙酐-醋酸溶液(混合体积比1∶1)，使得惰性化、阻塞未反应的氨基硅烷基团。
阻塞之后，置换为pH5.3的10mM-磷酸缓冲溶液，添加DXR溶液(2mg DXR/10mM-磷酸缓冲溶液，pH5.3)，使其反应。其次，考虑到反应杯上的后台影响，使用1M乙醇胺溶液在pH8.5环境下进行琥珀酸酰胺酯基的阻塞操作。
关于DXR的固定化，由于DXR的响应的变化量为186.1arc sec，因此，识别为R＝600arc sec时在1ng/mm2中，每1nm2存在1个氨基硅烷基团，因此，以0.31ng/mm2进行固定化。
2)测定
使用DXR固定化反应杯，如同试验1，测定了所述例示化合物1与DXR之间的结合动力学行为。图2b表示通过上述方式获得的结果。图2b表示对于DXR的结合动力学行为的直线图。
如图3b的直线图所示，例示化合物1对于DXR的包接缔合常数为3.5×107M-1。作为环糊精的包接作用，只要缔合常数达到106M-1，则识别为具有作为药物传递剂的充分强有力的包接能力，但是，在此超过此缔合常数。本发明人认为，由于叶酸部分具有疏水性，因此与DXR包接时，海葵效应(请参照：K.Hattori，A.Kenmoku，T.Mizuguchi，D.Ikeda，M.Mizuno，T.Inazu，J.Inclusion Phenom.Macrocyclic Chem.，56，9-16(2006).)起强有力的作用所引起的。
另外，如同例示化合物1的方法，对于例示化合物4也测定了同样的对于抗癌医药DXR的缔合常数，其结果，所述例示化合物4对于DXR的缔合常数为1.72×105M-1，这一数字不如具有7个叶酸基团的所述例示化合物1。
构成环糊精的吡喃葡萄糖之中的1个3位羟基被叶酸取代的下述比较化合物3，对于此例示化合物3也进行对于Caco-2肿瘤细胞以及DXR的缔合试验。与例示化合物1以及4的结果一同列在下述表1中。
[化学式21]
比较化合物3：
Figure GPA00001075228300301
[表1]
 化合物   受体   缔合常数Ka(M-1)   药物  缔合常数Ka(M-1)
 例示化合物1   Caco-2   5.1×109   DXR  3.5×107
 例示化合物4   FBP   7.8×105(概算值)   DXR  1.7×105
 例示化合物3   Caco-2   1.8×104   DXR  2.5×103
如表1所示，具有7个叶酸基团的所述例示化合物1与，基于所述纳米簇效应而仅具有一个叶酸基团的例示化合物4和比较化合物3相比，所述例示化合物1显示大约104倍的受体缔合性能。另一方面，具有7个叶酸基团的所述例示化合物1与，基于所述海葵效应而仅具有一个叶酸基团的例示化合物4和比较化合物3相比，所述例示化合物1显示102倍以上的DXR包接性能。
从以上结果可知，本发明的环糊精化合物对于癌细胞以及药物显示优异的双重识别性能，因此，可以作为对癌细胞的靶向性药物传递系统(TDDS)中的载体使用。
产业上的可利用性
本发明的环糊精化合物，可以使用在抗癌药物中的癌细胞目标载体或者炎症部位目标载体，癌组织的造影剂的目标，基因等的传递等领域。
本发明的靶向性药物传递系统以及靶向性药物组合物，可以使用于对癌、肝癌、大肠癌等疾病的靶向性药物传递系统(TDDS)，还可以作为对癌、肝癌、大肠癌等疾病的靶向性造影剂而使用。
在此我们结合实施例说明了本发明，但是，只要我们没有特意指定的话，不能限定本发明的说明中的细节部分，这一点并非违反权利要求范围所示的发明精神与范围，应该认为可以做宽广范围的解释。
本申请主张2007年9月28日在日本提出的专利申请号为2007-256527的发明专利申请的优先权，上述发明专利申请被引入本说明书中作为参考。

Claims (7)

1.一种环糊精化合物，其特征在于：构成环糊精的吡喃葡萄糖的6位的第一级羟基的两个或两个以上基团分别被具有叶酸的取代基置换而成。
2.根据权利要求1所述的环糊精化合物，其特征在于：其可以表示为下述通式1，其被2个或2个以上的叶酸修饰而成；
[化学式1]
通式1
在通式1中，m表示6～8的整数，m个的R1表示各自相互独立地具有下述通式2所表示的叶酸的取代基、羟基、具备糖基的取代基或者亲水性基团，并且，具有叶酸的所述取代基是所述环糊精化合物中的至少两个；
[化学式2]
通式2
Figure FPA00001075228200012
在通式2中，※表示与构成环糊精的吡喃葡萄糖的6位碳原子之间的结合位置。并且，n表示0～3的整数，n为0时，羰基碳原子与氨基氮原子的结合部分表现为单结合。
3.根据权利要求2所述的环糊精化合物，其特征在于：被下述任一式所表示：
[化学式3]
Figure FPA00001075228200021
例示化合物1
[化学式4]
Figure FPA00001075228200023
Figure FPA00001075228200031
Figure FPA00001075228200032
4.一种叶酸修饰的环糊精化合物的制备方法，其特征在于：缩合在构成环糊精的各个吡喃葡萄糖的6位的第一级羟基上具有氨基或者氨基-寡聚乙酰胺基的环糊精与叶酸。
5.一种靶向性药物传递剂，其特征在于：包括权利要求1～3的任一项所述的环糊精化合物。
6.一种靶向性药物组合物，其特征在于：包括权利要求1～3的任一项所述的环糊精化合物与药物，所述药物被所述环糊精化合物包接。
7.一种靶向性造影剂，其特征在于：包括权利要求1～3的任一项所述的环糊精化合物与药物，所述造影剂被所述环糊精化合物包接。
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