CN113398067B - 一种四烯雌酮注射液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种四烯雌酮注射液及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种四烯雌酮注射液及其制备方法和应用，涉及养殖技术领域。每100mL四烯雌酮注射液包括以下成分：0.1～35g四烯雌酮、0.01～70mL聚乙二醇以及余量的醇类溶剂。本发明提供的四烯雌酮注射液能有效抑制母猪发情，使母猪的发情周期同步化，提升总产仔数和活产仔数，极大地提高了规模化养猪场的生产效率；且使用方便快捷，剂量更精准可控，不存在母猪因摄入剂量不足导致的卵泡囊肿的技术问题，单次注射即可有效抑制母猪发情6～12天，无需每天给药，显著降低了规模化养殖场的人工成本。

Description

一种四烯雌酮注射液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及养殖技术领域，具体而言，涉及一种四烯雌酮注射液及其制备方法和应用。
背景技术
四烯雌酮(Altrenogest)，CAS号：850-52-2，是一种人工合成的甾体类孕激素，其化学名为17α-烯丙基-17-羟基雌甾-4，9，11-三烯-3-酮。作用机理类似天然孕激素，主要通过抑制促性腺激素来调整母畜的发情周期(Sitrukware,R.，2004)，同时还具有较弱的雌激素、雄性激素以及促合成作用，无肾上腺激素和抗炎的作用(冯言言等，2020)。
四烯雌酮的口服制剂最早于1984年在法国获批上市，由英特威国际有限公司(INTERVET INTERNATIONAL B.V.，默沙东旗下动物保健公司，又称MSD Animal Health，简称“默沙东”)开发，1990年通过FDA的批准进入美国市场。主要用于马和猪的发情周期调控，母马一般需要连续饲喂15天，而母猪则需连续饲喂14或18天。母马在口服停药后的2～5天开始发情，8～15天大多数母马排卵，母猪在口服停药后的4～9天进入集中发情期(《Plumb's Veterinary Drug Handbook》(7th EDITION))。目前，四烯雌酮已经是欧美国家用于母猪同期发情调控不可或缺的产品，且尚无更好的替代品。
目前，国内外用于母猪繁殖调控的四烯雌酮制剂均为口服型制剂。比如中国专利CN105919932A、CN108042485A、CN109260208A以及美国专利US20170304260A1中均提及了口服液体剂型四烯雌酮制剂，而在中国专利CN108403667A、CN109464400A、CN112641737A、CN112137975A以及CN112587490A均提及了口服固体型四烯雌酮制剂。
市售的口服型四烯雌酮需要每天给药，连续给药14或18天，在使用过程中主要存在以下问题：
用药周期长，次数多，规模化养殖猪场频繁且大规模的给药操作导致人工成本增加；
由于口服型四烯雌酮适口性较差，且母猪对饲喂枪饲喂口服型四烯雌酮需要有熟悉和接受的过程，在刚开始给药的至少前3天需要用苹果汁来驯化母猪进食四烯雌酮溶液，这也增加了规模化养殖猪场现场操作人员的工作量；
口服型四烯雌酮一种给药方式是将药液洒在饲料上让母猪自由采食，这种粗犷式的给药方式经常由于喷洒不均匀或者药液飞溅导致母猪没有摄入足量的四烯雌酮而引发卵泡囊肿；
口服型四烯雌酮的另一种给药方式是将药液用饲喂枪直接投喂到母猪的口腔中，饲喂枪反复与不同的母猪口腔直接接触，这大大增加了母猪传染性疾病的传播风险。
口服型四烯雌酮的溶剂一般为大豆油或者其他油脂类溶剂，此类溶剂在低温下容易凝固，特别是在冬季的时候，药液粘稠度会大大增加甚至凝固，导致使用便利性大大下降。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种四烯雌酮注射液及其制备方法和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种四烯雌酮注射液，每100mL四烯雌酮注射液包括以下成分：0.1～35g四烯雌酮、0.01～70mL聚乙二醇以及余量的醇类溶剂。
第二方面，本发明实施例提供了一种四烯雌酮注射液的制备方法，其包括：将所述四烯雌酮注射液的成分按照配比混合。
第三方面，本发明实施例提供了一种猪的饲养方法，其包括采用如前述实施例所述的四烯雌酮注射液对母猪进行注射，使母猪的发情周期同步化。
第四方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的四烯雌酮注射液在制备用于诱导母猪同期发情或抑制母猪发情的药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种注射型的四烯雌酮，能够有效抑制母猪发情，使母猪的发情周期同步化，且能提升总产仔数和活产仔数，极大地提高了规模化养猪场的生产效率；
且本发明提供的四烯雌酮注射液使用更加的方便快捷，剂量更精准可控，不存在母猪因摄入剂量不足导致的卵泡囊肿的技术问题，单次注射即可有效抑制母猪发情6～12天，无需每天给药，显著降低了规模化养殖场的人工成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为试验例1中的不同聚乙二醇类型对母猪发情行为的影响；
图2为试验例2中不同聚乙二醇400含量对母猪发情行为的影响；
图3为试验例3中不同醇类溶剂对母猪发情行为的影响；
图4为试验例4中不同四烯雌酮浓度对母猪发情行为的影响；
图5为试验例5中不同给药途径对母猪发情行为的影响；
图6为试验例6中四烯雌酮标准曲线图；
图7为试验例6中母猪单剂量肌内注射四烯雌酮注射液(1.5mg/kg)后的平均血药浓度-时间曲线
Figure BDA0003168279940000041
图8为试验例7中不同给药次数和间隔对母猪发情行为的影响。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
首先，本发明实施例提供了一种四烯雌酮注射液，每100mL四烯雌酮注射液包括以下成分：0.1～35g四烯雌酮、0.01～70mL聚乙二醇以及余量的醇类溶剂。
经一系列创造性劳动，本发明提供了上述四烯雌酮注射液在-20±2℃的环境温度下为液态，其给药方式为肌内或皮下注射，在上述成分及其配比的限定下制备的四烯雌酮注射液能够有效抑制母猪发情，使母猪的发情周期同步化，且能提升总产仔数和活产仔数，极大地提高了规模化养猪场的生产效率。
相比于现有用于调控母猪发情的四烯雌酮而言，本发明提供的四烯雌酮注射液使用更加的方便快捷，每次给药更换针头，不存在增加母猪传染性疾病传播的风险，且剂量更精准可控，不存在母猪因摄入剂量不足导致的卵泡囊肿的技术问题，单次注射即可有效抑制母猪发情6～12天，无需每天给药，显著降低了规模化养殖场的人工成本。
在一些实施例中，每100mL四烯雌酮注射液中可包括0.1g、1g、2g、4g、5g、6g、8g、10g、12g、14g、16g、18g、20g、22g、24g、26g、28g、30g、32g、34g或35g四烯雌酮。
在一些实施例中，每100mL四烯雌酮注射液中可包括0.01mL、0.1mL、1mL、5mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、31.5mL、35mL、40mL、45mL、50mL、55mL、60mL、65mL或70mL聚乙二醇。
优选地，每100mL四烯雌酮注射液包括以下成分：1～30g四烯雌酮、0.1～65mL聚乙二醇以及余量的醇类溶剂。依照该配比制备的四烯雌酮注射液的效果更好，更长效。
更优选地，每100mL四烯雌酮注射液包括以下成分：5～15g四烯雌酮、5～30mL聚乙二醇以及余量的醇类溶剂。该配比能进一步提高四烯雌酮注射液的作用效果。
本文中的“聚乙二醇”可选自现有已知的聚乙二醇PEG，可通过现有的制备途径或购买获得；优选地，聚乙二醇为分子量小于700的PEG。
优选地，所述聚乙二醇包括聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚乙二醇500和聚乙二醇600中的至少一种。
优选地，所述聚乙二醇包括聚乙二醇400。当聚乙二醇中包括聚乙二醇400时，母猪同期发情的发情集中度较好。
本文中的“醇类溶剂”可选自现有已知的醇类溶剂。优选地，所述醇类溶剂包括乙醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、异丙醇、丙三醇、乙二醇、苯甲醇、苯乙醇、丙醇以及双丙甘醇中的至少一种。
优选地，所述醇类溶剂包括乙醇、丙三醇、异丙醇和1,2-丙二醇中的至少一种；
更优选地，所述醇类溶剂包括乙醇、丙三醇、异丙醇和1,2-丙二醇；乙醇、丙三醇、异丙醇和1,2-丙二醇的体积比为1：(0.1～1)：(0.1～1)：(1～20)。在一些实施例中，乙醇和1,2-丙二醇的体积比可以为1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14、1：15、1：16、1：17、1：18、1：19或1：20；乙醇与丙三醇的体积比可以为1：0.1、1：0.2、1：0.3、1：0.4、1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8、1：0.9或1：1；乙醇与异丙醇的体积比可以为1：0.1、1：0.2、1：0.3、1：0.4、1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8、1：0.9或1：1。
本发明实施例提供了一种四烯雌酮注射液的制备方法，其包括：将所述四烯雌酮注射液的成分按照配比混合。
本文中的“按照配比”指按照前述任意实施例所述的四烯雌酮注射液的成分配比。
优选地，当所述醇类溶剂包括乙醇、丙三醇、异丙醇和1,2-丙二醇时，所述制备方法包括：先将乙醇、丙三醇、异丙醇与聚乙二醇按比例混合，再将四烯雌酮按比例加入，混合后，再加入1,2-丙二醇混合，得到混合均匀的半成品溶液；将半成品溶液经有机系微孔滤膜过滤，灌封、盖塞和轧盖后，获得四烯雌酮注射液成品。
本发明实施例还提供了一种猪的饲养方法，其包括采用如前述任意实施例所述的四烯雌酮注射液对母猪进行注射，使母猪的发情周期同步化。
优选地，所述四烯雌酮注射液每次注射的剂量为0.1～5mg/kg。本发明提供的四烯雌酮注射液通过单次注射可有效抑制母猪发情最短6天最长12天；或可以多次注射来选自适宜的发情抑制周期满足实际生产需求，例如可以8或9天间隔注射，最后一次注射完毕后，母猪将在11～14天后集中发情。
优选地，所述母猪为经历过至少一次发情的母猪。
优选地，所述注射的方式为皮下注射或肌内注射。
此外，本发明还提供了如前述任意实施例所述的四烯雌酮注射液在制备用于诱导母猪同期发情或抑制母猪发情的药物中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1～17
实施例1～17提供了一种四烯雌酮注射液及其制备方法，四烯雌酮注射液的组分大致相同，区别在于各实施例采用的成分或其配比有所差异，具体可参照表1。
表1四烯雌酮注射液配方
Figure BDA0003168279940000071
实施例1～17的制备方法大致相同，具体可参照实施例1的制备方法。
实施例1的制备方法如下：
按照表1所示的配比取各组分，首先将聚乙二醇以及醇类溶剂(实施例1中为丙三醇、异丙醇以及乙醇)按比例加入配料罐，混合均匀后再按比例加入四烯雌酮；避光操作，以200rpm的搅拌速度搅拌25min，使物料完全溶解后，加入余量醇类溶剂(实施列1中为1,2-丙二醇)至100mL，继续以200rpm的速度搅拌25min，得到混合均匀的半成品溶液，备用；再依次用0.45μm和0.22μm的有机系微孔滤膜过滤，灌封、盖塞、轧盖，即得四烯雌酮注射液成品。
对比例1
一种市售四烯雌酮内服溶液(孕力宝)，宁波三生生物科技股份有限公司。
试验例1：聚乙二醇类型对于四烯雌酮注射液的影响。
试验方案
本试验选取900头长×大二元后备母猪，日龄在220天以上，体重在130公斤以上，无明显外伤且至少经历过1次发情。将后备母猪随机分成6组，每组150头，按四烯雌酮含量计，以1.5mg/kg的剂量分别肌内注射不同组分的四烯雌酮注射液(实施例1～5，试验组)或生理盐水3ml(对照组)。从给药后的第2天开始到第20天，每天观察母猪发情迹象，每天上午和下午用公猪诱情各1次，根据“静立反应”进行发情鉴定。
结果
组方中不同聚乙二醇的类型对母猪发情行为的影响如表2和图1所示。数据显著性利用SPSS23软件进行分析，百分率数据使用χ2检验进行显著性统计，P<0.05表示差异显著。
表2组方中不同聚乙二醇类型对母猪发情行为的影响
Figure BDA0003168279940000081
Figure BDA0003168279940000091
备注：*：a、b、c不同字母标识的表示数据差异显著(P<0.05)，相同字母标识的表示数据差异不显著(P＞0.05)。
从表2与图1可知，对照组在D2时就有母猪发情，而A、B、C、D和E组则分别在D7、D8、D9、D10和D9出现母猪发情；在D2至D20的统计期内，所有试验组的发情率均比对照组高，且差异具有统计学意义(P<0.05)；就3天内集中发情率而言，B和C组的发情率均比其他组高，且差异具有统计学意义(P<0.05)；就4天内集中发情率而言，C组的发情率比其他组高，且差异具有统计学意义(P<0.05)；就5天内集中发情率而言，所有试验组的发情率均比对照组高，且差异具有统计学意义(P<0.05)；由此可知，本发明实施例1～5的四烯雌酮注射液可有效抑制母猪发情最短6天最长9天，且当组方中的聚乙二醇类型为聚乙二醇400时，母猪同期发情的发情集中度较好。
试验例2：聚乙二醇400含量对于四烯雌酮注射液效果的影响。
试验方案
本试验选取750头长×大二元后备母猪，日龄在220天以上，体重在130公斤以上，无明显外伤且至少经历过1次发情。将后备母猪随机分成5组，每组150头，按四烯雌酮含量计，以1.5mg/kg的剂量分别肌内注射不同组分的四烯雌酮注射液(实施例3、实施例6～9)。从给药后的第2天开始到第20天，每天观察母猪发情迹象，每天上午和下午用公猪诱情各1次，根据“静立反应”进行发情鉴定。
结果
组方中聚乙二醇400的不同添加量对母猪发情行为的影响如表3和图2所示。数据显著性利用SPSS23软件进行分析，百分率数据使用χ2检验进行显著性统计，P<0.05表示差异显著。
表3组方中不同聚乙二醇400含量对母猪发情行为的影响
Figure BDA0003168279940000101
Figure BDA0003168279940000111
备注：*：a、b、c不同字母标识的表示数据差异显著(P<0.05)，相同字母标识的表示数据差异不显著(P＞0.05)。
从表3与图2可知，C、F、G、H和I组分别在D9、D7、D9、D11和D12出现母猪发情；在D2至D20的统计期内，不管是3天内还是4天内或者5天内的集中发情率，C和H组均比其他组高，且差异具有统计学意义(P<0.05)，虽然C组和H组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)，但是从数值上来看，H组的集中发情率均优于C组。
由此可知，本发明实施例3以及实施例6～9的四烯雌酮注射液可有效抑制母猪发情最短6天最长11天，当每100ml注射液中聚乙二醇400的添加量为21.5ml时，母猪同期发情的发情集中度较好。
试验例3：醇类溶剂的含量对于四烯雌酮注射液效果的影响。
试验方案
本试验选取600头长×大二元后备母猪，日龄在220天以上，体重在130公斤以上，无明显外伤且至少经历过1次发情。将后备母猪随机分成4组，每组150头，按四烯雌酮含量计，以1.5mg/kg的剂量分别肌内注射不同组分的四烯雌酮注射液(实施例8、实施例10～12)。从给药后的第2天开始到第20天，每天观察母猪发情迹象，每天上午和下午用公猪诱情各1次，根据“静立反应”进行发情鉴定。
结果
组方中不同醇类溶剂对母猪发情行为的影响如表4和图3所示。数据显著性利用SPSS23软件进行分析，百分率数据使用χ2检验进行显著性统计，P<0.05表示差异显著。
表4组方中不同醇类溶剂对母猪发情行为的影响
Figure BDA0003168279940000121
备注：*：a、b、c不同字母标识的表示数据差异显著(P<0.05)，相同字母标识的表示数据差异不显著(P＞0.05)。
从表4与图3可知，H、J、K和L组分别在D10、D12、D7和D12出现母猪发情；在D2至D20的统计期内，就3天内的集中发情率而言，L组比其他组高，且差异具有统计学意义(P<0.05)；就4天内的集中发情率而言，K组均比其他组低，且差异具有统计学意义(P<0.05)；就5天内的集中发情率而言，L组比J和K组高，且差异具有统计学意义(P<0.05)。
由此可知，本发明实施例8以及实施例10～12的四烯雌酮注射液可有效抑制母猪发情最短6天最长11天，当每100ml注射液中醇类溶剂添加量为5ml乙醇和余量的1,2-丙二醇时，母猪同期发情的发情集中度较好。
试验例4：四烯雌酮的浓度对于四烯雌酮注射液效果的影响。
试验方案
本试验选取600头长×大二元后备母猪，日龄在220天以上，体重在130公斤以上，无明显外伤且至少经历过1次发情。将后备母猪随机分成4组，每组150头，按四烯雌酮含量计，以1.5mg/kg的剂量分别肌内注射不同组分的四烯雌酮注射液(实施例12～15)。从给药后的第2天开始到第20天，每天观察母猪发情迹象，每天上午和下午用公猪诱情各1次，根据“静立反应”进行发情鉴定。
结果
组方中不同四烯雌酮浓度对母猪发情行为的影响如表5和图4所示。数据显著性利用SPSS23软件进行分析，百分率数据使用χ2检验进行显著性统计，P<0.05表示差异显著。
表5组方中不同四烯雌酮浓度对母猪发情行为的影响
Figure BDA0003168279940000131
Figure BDA0003168279940000141
备注：*：a、b、c不同字母标识的表示数据差异显著(P<0.05)，相同字母标识的表示数据差异不显著(P＞0.05)。
从表5与图4可知，L、M、N和O组分别在D12、D9、D9和D9出现母猪发情；在D2至D20的统计期内，就3天内和4天内的集中发情率而言，M组比其他组低，且差异具有统计学意义(P<0.05)，虽然L组、N组和O组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)，但是从数值上来看，N组的集中发情率要优于其他两组；就5天内的集中发情率而言，M组比其他组低，且差异具有统计学意义(P<0.05)。
由此可知，本发明实施例12～15的四烯雌酮注射液可有效抑制母猪发情最短6天最长11天，当每100ml注射液中的四烯雌酮添加量为10g时，母猪同期发情的发情集中度较好。
试验例5：验证四烯雌酮注射液给药途径对母猪发情抑制的影响。
本试验选取300头长×大二元后备母猪，日龄在220天以上，体重在130公斤以上，无明显外伤且至少经历过1次发情。将后备母猪随机分成2组，每组150头，按四烯雌酮含量计，以1.5mg/kg的剂量分别肌内或者皮下注射实施例14的四烯雌酮注射液。从给药后的第2天开始到第20天，每天观察母猪发情迹象，每天上午和下午用公猪诱情各1次，根据“静立反应”进行发情鉴定。
结果
不同给药途径对母猪发情行为的影响如表6和图5所示。数据显著性利用SPSS23软件进行分析，百分率数据使用χ2检验进行显著性统计，P<0.05表示差异显著。
表6不同给药途径对母猪发情行为的影响
Figure BDA0003168279940000151
*：a、b不同字母标识的表示数据差异显著(P<0.05)，相同字母标识的表示数据差异不显著(P＞0.05)。
从表6与图5可知，肌内注射组和皮下注射组分别在D10和D13出现母猪发情；在D2至D20的统计期内，就3天内和4天内的集中发情率而言，肌内注射组均比皮下注射组高，且差异具有统计学意义(P<0.05)；就5天内的集中发情率而言，两组间的差异无统计学意义P>0.05)。由此可知，本发明实施例14的四烯雌酮注射液肌内和皮下注射分别可有效抑制母猪发情9天和12天，当采用肌内注射给药时，母猪同期发情的发情集中度较好。
试验例6：四烯雌酮注射液的药代动力学试验。
本试验的目的是研究四烯雌酮注射液单次注射后的药代动力学。
试验方案
本试验选取3头长×大二元后备母猪，日龄在220天以上，体重在130公斤以上，无明显外伤且至少经历过1次发情。以四烯雌酮含量计，按1.5mg/kg的剂量单次肌内注射实施例14的四烯雌酮注射液。给药前采空白血样，给药后10min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h和240h各采血5ml，4000转/min离心，取血浆至棕色EP管中，-20℃冻存待测。血浆中四烯雌酮的药物浓度采用高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定分析，分别记录四烯雌酮色谱峰面积，以标准曲线回归方程计算血浆中四烯雌酮浓度。计算实测血浆四烯雌酮各时间点血药浓度平均值和标准差并绘制药时曲线图，运用WinNonlin药物动力学分析软件，计算出有关药代动力学参数，求出关键药代动学力参数(AUC、tmax、Cmax等)。
结果
标准曲线的建立：取8份空白血浆，每份0.45mL，加入相应浓度标准工作液0.05mL，使血浆浓度分别为0、2、5、10、20、50、100、200ng/mL，加入0.5mL乙腈，涡旋30s，超声10min，以10000r/min离心10min，取上清液过0.22μm有机滤膜，供HPLC-MS/MS检测。结果见表7和图6。
表7四烯雌酮标准曲线
Figure BDA0003168279940000161
Figure BDA0003168279940000171
根据标准曲线，检测猪血浆中四烯雌酮的浓度，其检测结果见表8，药时曲线图见图7。
表8母猪单剂量肌内注射四烯雌酮注射液(1.5mg/kg)后的血药浓度
Figure BDA0003168279940000172
备注：ND，表示未检测出。
本次试验母猪单剂量肌内注射四烯雌酮内服溶液达峰时间约12h，达峰浓度Cmax70.349±8.690ng/mL，药时曲线下面积AUC0-t为3578.636±566.380h·ng/mL，AUC0-∞为3589.965±568.180h·ng/mL，半衰期t1/2为24.691±0.957h，血浆清除率CL为428.666±68.992mL/h，表观分布容积V为15175.455±1846.162mL，平均滞留时间MRT为40.572±1.547h，详见表9。
表9母猪单剂量肌内注射四烯雌酮注射液(1.5mg/kg)后的主要药代动力学参数
Figure BDA0003168279940000181
本次试验母猪单剂量肌内注射四烯雌酮注射液达峰时间约为12h，最高血药浓度为70.349±8.690ng/mL，半衰期为24.691±0.957h。上述结果表明，本发明四烯雌酮注射液肌内注射后释放平缓，血药浓度在较长的时间段内保持稳定释放的状态，在给药后的144h内能维持血药浓度在2ng/ml以上，具有缓释效果。
试验例7：四烯雌酮注射液给药次数对母猪发情抑制的影响。
试验方案
本试验选取450头长×大二元后备母猪，日龄在220天以上，体重在130公斤以上，无明显外伤且至少经历过1次发情。将后备母猪随机分成3组，每组150头，按四烯雌酮含量计，以1.5mg/kg的剂量分别肌内注射实施例14的四烯雌酮注射液。第I组只注射1次(第1天)，第II组在第1次注射(第1天)给药后的第8天注射第2次，第III组在第1次注射(第1天)给药后的第9天注射第2次。从第1次给药后的第7天开始到第25天，每天观察母猪发情迹象，每天上午和下午用公猪诱情各1次，根据“静立反应”进行发情鉴定。
结果
不同给药次数和间隔对母猪发情行为的影响如表10和图8所示。数据显著性利用SPSS23软件进行分析，百分率数据使用χ2检验进行显著性统计，P<0.05表示差异显著。
表10不同给药次数和间隔对母猪发情行为的影响
Figure BDA0003168279940000191
备注：*：a、b不同字母标识的表示数据差异显著(P<0.05)，相同字母标识的表示数据差异不显著(P＞0.05)。
从表10与图8可知，I、II和III组分别在D9、D16和D18出现母猪发情；在D7至D25的统计期内，就3天内的集中发情率而言，各组间的差异没有统计学意义(P>0.05)；就4天内的集中发情率而言，各组间的差异没有统计学意义(P>0.05)，但是从数值上来看，II组要优于其他两组；就5天内的集中发情率而言，II组比第I组高，且差异具有统计学意义(P<0.05)，III组与I组的差异虽然没有统计学意义(P>0.05)，但是从数值上来看，III组要优于I组。由此可知，本发明实施例14的四烯雌酮注射液单次可有效抑制母猪发情8天，以8天的间隔连续注射2次可有效抑制母猪发情15天，以9天的间隔连续注射2次可有效抑制母猪发情17天，当以8天的间隔连续注射2次时，母猪同期发情的发情集中度较好。
试验例8：四烯雌酮注射液对母猪繁育性能的影响。
试验方案
本试验选取450头长×大二元后备母猪，日龄在220天以上，体重在130公斤以上，无明显外伤且至少经历过1次发情。将后备母猪随机分成5组，每组150头，按四烯雌酮含量计，以1.5mg/kg的剂量分别肌内注射不同组方的四烯雌酮注射液(实施例14，注射试验组)或用对比例1的四烯雌酮口服液以20mg/头份的剂量连续饲喂14天(口服试验组)或肌内注射生理盐水3ml(对照组)，在第1次注射(第1天)后的第8天进行第2次注射。注射试验组和口服试验组从第1次给药后的第14天开始到第25天，对照组从第1次给药后的第3天开始到第25天，每天观察母猪发情迹象，每天上午和下午用公猪诱情各1次，根据“静立反应”进行发情鉴定。如有静立反应则间隔8-12小时进行一次输精操作，再间隔8-12小时再进行第二次输精，如无静立反应则次日继续进行公猪诱情。期间记录配种母猪的头数，并在第二次配种后28-35天B超检查受孕母猪的头数，另外再记录分娩母猪的头数，分娩母猪的窝健仔数和窝产仔数。试验过程中记录注射部位的不良反应。
结果
四烯雌酮注射液对母猪繁育性能的影响如表11所示。数据显著性利用SPSS23软件进行分析，百分率数据使用χ2检验进行显著性统计，P<0.05表示差异显著。
表11四烯雌酮注射液对母猪繁育性能的影响
Figure BDA0003168279940000211
备注：*：a、b不同字母标识的表示数据差异显著(P<0.05)，相同字母标识的表示数据差异不显著(P＞0.05)；
其中：配种率＝配种头数/试验头数*100％；
受胎率＝B超确认的受孕头数/配种头数*100％；
分娩率＝分娩头数/B超确认的受孕头数*100％；
繁殖效率＝(分娩头数/配种头数)×100×窝均总仔数。
从表11可知，注射试验组和口服试验组对比，配种率、受胎率、分娩率、窝均健仔数以及窝均总仔数的差异均没有统计学意义(P>0.05)，而对照组与试验组(注射试验组和口服试验组)对比，除受胎率和分娩率之外，配种率、窝均健仔数以及窝均总仔数的差异均有统计学意义(P<0.05)，且试验组的繁殖效率均高于对照组。由此可知，本发明实施例14的四烯雌酮注射液与四烯雌酮口服液一样均可有效提高后备母猪的繁育性能。试验过程中注射部位均未观察到任何不良反应。
上述结果表明，本发明的四烯雌酮注射液可安全、有效地提升后备母猪的繁育性能。
试验例9：四烯雌酮注射液与四烯雌酮口服液低温环境下性状变化对比试验。
试验方案
取实施例1～17的四烯雌酮注射液以及对比例1的四烯雌酮口服的药液各25ml，分别倒入50ml不同的烧杯并用封口膜封口。首先将装有药液的烧杯置于25±2℃环境下5小时后，撕开封口膜，用玻璃棒测试药液性状并记录。将装有药液的烧杯再次封口，置于-20±2℃环境下5小时后，撕开封口膜，用玻璃棒测试药液性状，记录药液性状的变化。药液用玻璃棒搅拌时棒体可借助重力自然插入药液且无晶体析出则性状为液态，药液用玻璃棒搅拌时棒体无法借助重力自然插入药液或有晶体析出则性状为固态。
结果
不同环境温度对四烯雌酮注射液和四烯雌酮口服液药液性状的影响如表12所示。
表12不同环境温度对四烯雌酮注射液和四烯雌酮口服液药液性状的影响
Figure BDA0003168279940000221
从表12可知，市售四烯雌酮口服液在低温环境下药液发生显著的变化由液态变为固态，而本发明的四烯雌酮注射液在低温环境下依然能保持常温状态下的性状。因此本发明的四烯雌酮注射液在寒冷地区使用时，可保持药液不凝固，使用便利性大大增强。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种四烯雌酮注射液，其特征在于，每100mL四烯雌酮注射液包括以下成分：0.1~35g四烯雌酮、0.01~70mL聚乙二醇以及余量的醇类溶剂；所述醇类溶剂包括乙醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、异丙醇、丙三醇、乙二醇、苯甲醇、苯乙醇、丙醇以及双丙甘醇中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的四烯雌酮注射液，其特征在于，每100mL四烯雌酮注射液包括以下成分：1~30g四烯雌酮、0.1~65mL聚乙二醇及余量的醇类溶剂。
3.根据权利要求2所述的四烯雌酮注射液，其特征在于，每100mL四烯雌酮注射液包括以下成分：5~15g四烯雌酮、5~30mL聚乙二醇以及余量的醇类溶剂。
4.根据权利要求1所述的四烯雌酮注射液，其特征在于，所述聚乙二醇包括聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚乙二醇500和聚乙二醇600中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的四烯雌酮注射液，其特征在于，所述聚乙二醇包括聚乙二醇400。
6.根据权利要求1所述的四烯雌酮注射液，其特征在于，所述醇类溶剂包括乙醇、丙三醇、异丙醇和1,2-丙二醇中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的四烯雌酮注射液，其特征在于，所述醇类溶剂包括乙醇、丙三醇、异丙醇和1,2-丙二醇，乙醇、丙三醇、异丙醇和1,2-丙二醇的体积比为1：（0.1~1）：（0.1~1）：（1~20）。
8.如权利要求1~7任一项所述的四烯雌酮注射液的制备方法，其特征在于，其包括：将所述四烯雌酮注射液的成分按照配比例混合。
9.如权利要求1~7任一项所述的四烯雌酮注射液在制备用于母猪发情周期同步化的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述四烯雌酮注射液每次注射的剂量为0.1~5mg/kg。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述四烯雌酮注射液的注射方式为肌内注射或皮下注射。
12.如权利要求1~7任一项所述的四烯雌酮注射液在制备用于诱导母猪同期发情或抑制母猪发情的药物中的应用。
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