CN113391004B - 一种药物中遗传毒性杂质溴甲烷残留量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种药物中遗传毒性杂质溴甲烷残留量的测定方法，属于利用吸附作用、吸收作用、离子交换或类似现象来测试或分析材料化学或物理性质技术领域。以含溴甲烷的药物作为待测试样，将待测试样采用溶剂溶解，形成供试品溶液；采用顶空气相色谱‑氢火焰离子化检测法测定，溴甲烷浓度c与色谱图中溴甲烷峰面积A之间满足：A=190.18c‑0.7152。将本申请应用于克拉霉素等药物中遗传毒性杂质溴甲烷残留量的测定，平均回收率为95.7％，RSD为5.0％，该方法准确、灵敏、可靠，可用于克拉霉素原料药中基因毒性杂质溴甲烷残留量的测定。
Description
技术领域
本申请涉及一种药物(如：克拉霉素)中遗传毒性杂质溴甲烷残留量的测定方法，属于利用吸附作用、吸收作用、离子交换或类似现象来测试或分析材料化学或物理性质技术领域。
背景技术
克拉霉素是一种半合成的红霉素衍生物，在临床上具有重要价值，被认为是目前最安全有效的广谱抗生素之一。根据其合成工艺路线，在克拉霉素肟甲化物合成的过程中用到了溴甲烷。溴甲烷作为一种典型的卤代烷烃类化合物，在药物合成过程中常作为一种优良的甲基化试剂参与反应。但由于卤代烷烃具有遗传毒性杂质警示结构，因此有必要对克拉霉素中溴甲烷残留量进行控制。
王永春采用顶空气相色谱法结合微池电子捕获器(μ-ECD)检测法测定食品中溴甲烷，最低检测限可达0.01ppm；杨桂朋等采用吹扫-捕集-气相色谱配电导检测器(GC-ECD)法测定海水中氯甲烷与溴甲烷；翟自然等采用顶空气相色谱-氢火焰离子化检测(GC-FID)法测定合成富马酸贝达喹啉的起始物料中的基因毒性杂质1-氯丙烷和2-氯丙烷。而关于克拉霉素中溴甲烷的测定还未见报道。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种药物(如：克拉霉素)中遗传毒性杂质溴甲烷残留量的测定方法。
具体地，本申请是通过以下方案实现的：
一种药物中遗传毒性杂质溴甲烷残留量的测定方法，包括以下步骤：
(1)以含溴甲烷的药物作为待测试样，将待测试样采用溶剂溶解，形成供试品溶液；
(2)供试品溶液采用顶空气相色谱-氢火焰离子化检测法测定，其中，
顶空条件：平衡温度70～100℃，平衡时间5～30min，顶空瓶中液体体积1～5ml，
色谱条件：选择DB-WAX毛细管柱、Rtx-624毛细管柱、DB-1701毛细管柱中的任一种作为色谱柱，色谱柱程序升温如下：初始温度40℃，维持5分钟，再以20℃/分钟的速度升温至220℃，维持1分钟，GC运行时间15分钟，得色谱图；
(3)溴甲烷浓度c与色谱图中溴甲烷峰面积A之间满足：A＝190.18c-0.7152。
上述方法用于药物中遗传毒性杂质溴甲烷残留量的测定，具有准确、灵敏、可靠等优点，最低检测限可达到6.9ng/ml，相当于样品浓度0.07μg/g，平均回收率为95.7％，相对标准偏差RSD为5.0％。
进一步的，作为优选：
上述测定方法中，供试品溶液中，溴甲烷浓度c为0.023～0.375μg/ml。
上述测定方法中，所述供试品溶液包括空白供试品溶液和加标供试品溶液，所述空白供试品溶液由含溴甲烷药物溶解在溶剂中得到，加标供试品溶液由含溴甲烷药物与对照品溶液混合得到，对照品溶液是溴甲烷标准溶液加入溶剂稀释得到，对照品浓度为0.023-0.375μg/ml。
更优选的：
所述空白供试品溶液的质量浓度为0.1g/ml。
所述对照品溶液的浓度为0.023、0.050、0.100、0.150、0.250、0.375μg/ml中的任一种。
所述溴甲烷标准溶液浓度为100μg/mL，介质为甲醇。
上述测定方法的步骤(2)中，
顶空条件为：平衡温度80℃，平衡时间20min，定量环温度90℃，传输线温度100℃，进样量1.0mL；
色谱条件：色谱柱为Rtx-624毛细管柱，氢火焰离子化检测的检测器温度为250℃，进样口温度为200℃，载气为高纯氮气，分流进样，分流比为5:1，流速为2.0mL/min，吹扫流量为3.0mL/min，
色谱柱程序升温条件：初始温度40℃，维持5分钟，再以20℃/分钟的速度升温至220℃，维持1分钟，GC运行时间15分钟。
上述测定方法中，溴甲烷浓度c的检测限为6.9ng/ml。
上述测定方法中，含溴甲烷药物为克拉霉素。
作为一个优选案例，上述测定方法还可以具体设置如下：采用Rtx-624毛细管柱和氢火焰离子化检测器，检测器温度为250℃，进样口温度200℃，载气为高纯氮气，分流进样，分流比为5:1，顶空平衡温度为80℃，平衡时间20min，定量环温度为100℃，传输线温度为110℃。结果表明，溴甲烷在0.023～0.375μg/ml浓度范围内线性关系良好，检测限为。
附图说明
图1为不同顶空平衡温度下供试品溶液的GC色谱图；
图2为DB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm，0.5μm)状态下对照品溶液的GC色谱图；
图3为DB-1701毛细管柱(30m×0.25mm，1.0μm)状态下对照品溶液的GC色谱图；
图4为Rtx-624毛细管柱(30m×0.32mm，1.8μm)状态下对照品溶液的GC色谱图；
图5为专属性溶液GC色谱图(A:空白溶剂，B:甲醇定位溶液，C溴甲烷对照品溶液)；
图6为灵敏度溶液典型GC色谱图(a:定量限溶液b:检测限溶液)；
图7为供试品(批号：11-096-200405)溶液典型GC色谱图。
具体实施方式
实施例1：试样的配制
试样包括如下五种：
(1)溴甲烷对照品储备液：精密量取溴甲烷对照品500μL，置20mL量瓶中，用DMF溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为2.5μg/mL的溴甲烷对照品储备液。
(2)对照品溶液：精密量取溴甲烷对照品储备液3.0mL，置50mL量瓶中，用DMF溶解并稀释至刻度，摇匀，取2.0ml置20ml顶空瓶中，压盖密封，即得质量浓度为0.15μg/mL的对照品溶液。
(3)供试品溶液：取克拉霉素原料药0.2g，置20mL顶空瓶中，加入2.0mL DMF，压盖密封，得质量浓度为0.1g/ml供试品溶液。
(4)空白溶液：精密量取DMF 2.0ml，置20ml顶空瓶中，压盖密封，即得空白溶液。
(5)甲醇定位溶液：精密量取甲醇1.0ml，置100ml量瓶中，加DMF稀释并定容至刻度，摇匀，取2.0ml置20ml顶空瓶中，压盖密封，即得甲醇定位溶液。
其中：
克拉霉素原料药，批号为11-096-200405、11-096-200406、11-096-200510，均由浙江某制药有限公司提供；溴甲烷标准溶液，农业部环境保护科研监测所，批号为202004，浓度为100μg/mL，介质为甲醇；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)与甲醇均为色谱级(默克公司)。
实施例2：实验条件的控制
1)检测器的选择
溴甲烷的沸点低，无紫外吸收，无法通过UV检测器在HPLC中检出，故选用GC法测定。
常用于检测卤代烷烃类的气相色谱检测器为电子捕获检测器(ECD)和质谱检测器(MS)。但ECD检测器具有放射源，对于仪器安装和操作环境有一定的要求。GC-MS联用仪成本较高，且在使用GC-MS测定小分子卤代烷烃时，易受到其他相同低分子碎片峰的干扰。
故：选择通用性更强、应用更广的氢火焰离子化检测器(FID)进行实验。
其余设备还包括：
7890B气相色谱仪和顶空进样器(美国Agilent公司)，Agilent Open LAB工作站；Mettle XPE 205电子天平(德国赛多利斯公司)。
2)顶空条件的选择
本试验对顶空平衡温度、平衡时间及顶空瓶中液体体积进行了筛选。采用单因素变量法，分别考察平衡温度、平衡时间、液体体积三个参数下，对照品溶液中溴甲烷的峰面积变化及平行样间的RSD大小。
2.1顶空平衡温度的选择
取对照品溶液2.0ml置于顶空瓶中，考察70℃、80℃、90℃、100℃平衡温度，平衡20分钟的条件下，对照品溶液中溴甲烷峰的峰面积大小。
表1：顶空平衡温度考察结果表
| 平衡温度(℃) | 平均峰面积 | RSD(n＝3,％) |
| 70 | 36.4 | 1.4 |
| 80 | 44.7 | 0.8 |
| 90 | 56.5 | 0.7 |
| 100 | 70.2 | 1.8 |
结合表1和图1可以看出：随着顶空平衡温度的升高，对照品溶液中溴甲烷峰的峰面积呈明显增大趋势。但是，随着顶空平衡温度的升高，样品溶液在溴甲烷的出峰位置(RT4.1min)附近基线抬升，特别是在RT 3.6min处出现一色谱峰，且随着顶空平衡温度的升高峰面积逐渐增大，并伴有峰拖尾现象，从而影响溴甲烷的测定。故最终选择80℃的平衡温度进行实验。
2.2顶空平衡时间的选择
取对照品溶液2.0ml置于顶空瓶中，平衡温度80℃，平衡5、10、20、30min，考察不同平衡时间下对照品溶液中溴甲烷峰的峰面积大小。
表2：顶空平衡时间考察结果
| 平衡时间(min) | 平均峰面积 | RSD(n＝3,％) |
| 5 | 39.4 | 4.7 |
| 10 | 42.7 | 3.2 |
| 20 | 44.7 | 0.8 |
| 30 | 45.3 | 2.2 |
结果表明，随着顶空平衡温度的升高，对照品溶液中溴甲烷峰的峰面积稍有增大。从节约时间的角度考虑，宜选择较短的平衡时间，但顶空平衡时间过短，平行对照的相对平均偏差较大。因此，最终选择20min的平衡时间进行实验。
2.3顶空瓶中液体体积选择
分别取对照品溶液1.0、2.0、3.0、5.0ml置于顶空瓶中，平衡温度80℃，平衡20min，考察顶空瓶中不同液体体积对照品溶液中溴甲烷峰的峰面积大小。
表3：顶空瓶液体体积考察结果
| 液体体积(ml) | 平均峰面积 | RSD(n＝3,％) |
| 1 | 38.2 | 1.1 |
| 2 | 44.7 | 0.8 |
| 3 | 47.7 | 3.7 |
| 5 | 49.8 | 1.3 |
结果表明，随着顶空瓶中液体体积的增大，对照品溶液中溴甲烷峰的峰面积逐渐增大，且当液体体积达2ml以后，随着液体体积的增大，峰面积增大的趋势不够明显。从节约试剂的角度出发，最终选择2.0ml的液体体积进行实验。
综上：当平衡温度为80℃、平衡时间为20min、顶空瓶中液体体积为2ml时，测定实验效果最佳。并确定具体的顶空瓶参数为：平衡温度80℃，平衡时间20min，定量环温度90℃，传输线温度100℃，进样量1.0mL。
3)色谱条件的选择
(1)色谱柱的选择：
分别选用不同的色谱柱：DB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm，0.5μm)、Rtx-624毛细管柱(30m×0.32mm，1.8μm)及DB-1701毛细管柱(30m×0.25mm，1.0μm)，进行对照品溶液的分析。
结果发现：选用Rtx-624毛细管柱(30m×0.32mm，1.8μm)分析对照品溶液时，溴甲烷峰的峰形最好，且与相邻甲醇峰的分离度最高。
因此，选用Rtx-624毛细管柱(30m×0.32mm，1.8μm)进行实验。
(2)色谱分析实验的选择：由于对照品溶液中目标组分溴甲烷沸点低，同时还含有沸点较低的甲醇，为了使二者能很好的分离，初始柱温不宜过高。实验发现，初始柱温40℃保持5分钟的条件下，溴甲烷和甲醇可以在恒温的过程中即实现分离，而溶剂DMF沸点较高，故接着采用程序升温的方式使溶剂峰流出。
色谱柱程序升温如下：初始温度40℃，维持5分钟，再以20℃/分钟的速度升温至220℃，维持1分钟，GC运行时间15分钟。
气相色谱采用高纯氮气作为载气，流速为2.0mL/min，分流比为5:1，吹扫流量为3.0mL/min，进样口温度为200℃，FID检测器温度为250℃。
实施例3：专属性试验
取实施例1制备的对照品溶液、空白溶液和甲醇定位溶液，按实施例2确定的优选顶空条件、色谱条件进样测定，记录色谱图，结果见图5。
溴甲烷的保留时间约为4.10分钟，空白溶剂在溴甲烷出峰附近无干扰峰出现，且甲醇峰与溴甲烷峰间的分离度满足要求，专属性良好。
实施例4：线性试验
精密量取实施例1所制备溴甲烷对照品储备液适量，加溶剂DMF稀释，得到浓度分别为0.023、0.050、0.100、0.150、0.250、0.375μg/ml的系列对照品溶液，各取2.0ml，置20ml顶空瓶中，压盖密封。按实施例2给出的优选顶空条件和色谱条件进样测定，记录色谱图。
以上述溶液的质量浓度c为横坐标，峰面积A为纵坐标绘制标准曲线，得线性方程为：A＝190.18c-0.7152(R2＝0.9991)，表明溴甲烷在0.023～0.375μg/ml质量浓度范围内线性关系良好。
实施例5：精密度试验
精密量取实施例1制备的对照品溶液2ml，置20ml顶空瓶中，压盖密封，平行配制6份，按实施例2给出的优选顶空条件和色谱条件进样测定，记录色谱图。
结果：平行6份对照品溶液中溴甲烷峰面积的RSD为1.5％(n＝6)，表明仪器的精密度良好。
实施例6：检测限和定量限
取实施例4中质量浓度为0.023μg/ml的系列对照品溶液2.0ml，置于20ml顶空瓶中，压盖密封，按实施例2给出的优选顶空条件和色谱条件进样测定，记录色谱图。
测得定量限浓度为0.023μg/ml，相当于样品浓度0.07ppm，信噪比(S/N)为11.8～16.4，其峰面积的RSD(n＝6)为5.0％。取定量限溶液3.0ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，取2.0ml置20ml顶空瓶中，压盖密封，按实施例2给出的优选顶空条件及色谱条件进样测定，记录色谱图。测得检测限浓度为0.0069μg/ml，相当于样品浓度0.2ppm，信噪比(S/N)为5.3～5.9。
结果表明：本申请测定方法的检测灵敏度可以满足要求，可以对溴甲烷准确地定量。灵敏度溶液典型色谱图见下图6。
实施例7：准确度试验
精密称取克拉霉素样品(批号:11-096-200405)0.2g，置20mL顶空瓶中，分别加入实施例4中质量浓度为0.10、0.15、0.25μg/ml的系列对照品溶液2.0mL，压盖密封，作为低(60％)、中(100％)、高(160％)3个浓度组加标供试品溶液，每组平行制备3份。
另取本品(批号:11-096-200405)约0.2g，置20mL顶空瓶中，加入溶剂2.0ml，压盖密封，作为空白供试品溶液。
取空白供试品溶液、各浓度加标供试品溶液，按实施例2中给出的优选顶空条件及色谱条件进样测定，记录色谱图。取溴甲烷峰面积，按外标法计算各供试品溶液中溴甲烷的含量，减去样品中的本底含量，与加入量相比后得出回收率，结果：溴甲烷的平均回收率为95.7％(RSD＝5.0％，n＝9)。
实施例8：重复性及稳定性试验
精密称取克拉霉素样品(批号:11-096-200405)0.2g，置20ml顶空瓶中，加入实施例1中制备的对照品溶液2.0ml，压盖密封，平行配制6份，按实施例2给出的优选顶空条件及色谱条件，进样测定，记录色谱图。结果显示：溴甲烷的峰面积的RSD为2.0％(n＝6)，表明测定方法的重复性良好。
取上述溶液及实施例1中制备的对照品溶液于室温放置0、8、24h时，分别按实施例2给出的优选顶空条件及色谱条件，进样测定，记录色谱图。分析结果表明：24h内，100％限度浓度加标供试品溶液和对照品溶液中溴甲烷含量的RSD(n＝6)分别为4.1％和2.6％，可以满足较长时间内的样品测定要求。
实施例9：应用试验
根据人用药品注册技术要求国际协调会(International Conference onHarmonization，ICH)M7指南规定，克拉霉素中遗传毒性类杂质的毒理学关注阈值(threshold of toxicological concern，TTC)为每天1.5μg。克拉霉素在治疗使用时，每日最大剂量为1g，按此计算得溴甲烷的限度应不得超过1.5μg/g，即1.5ppm。本实施例采用顶空气相色谱-氢火焰离子化检测(GC-FID)法测定克拉霉素原料药中溴甲烷的残留量。
取实施例1制备的供试品溶液，按实施例2给出的优选顶空条件及色谱条件，进样测定，记录色谱图。结果三批样品(批号：11-096-200405，11-096-200406，11-096-200510)中均未检出溴甲烷，表明供试品溶液中溴甲烷浓度均小于检测限浓度0.0069μg/ml，即供试品中溴甲烷残量均小于0.07ppm，供试品溶液典型的GC图如下图7所示。
上述实施例采用GC-FID法测定了克拉霉素原料药中的遗传毒性杂质溴甲烷，该测定方法操作简单、重复性好、准确度高，最低检测限可达0.07μg/g，可满足高剂量药物克拉霉素中该类遗传毒性杂质的测定，以保障人体的用药安全。同时，将本申请建立的方法应用于其他药物，可以得到近似的结果，说明上述测定方法也适用于其他药物中该类基因毒性杂质的测定。
Claims (7)
1.一种药物中遗传毒性杂质溴甲烷残留量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以含溴甲烷的药物作为待测试样，将待测试样采用溶剂溶解，形成供试品溶液，供试品溶液中，溴甲烷浓度c为0.023 ~0.375 μg/ml；
其中，所述供试品溶液包括空白供试品溶液和加标供试品溶液，空白供试品溶液由含溴甲烷药物溶解在溶剂中得到，加标供试品溶液由含溴甲烷药物与对照品溶液混合得到，对照品溶液是溴甲烷标准溶液加入溶剂稀释得到，对照品浓度为0.023-0.375μg/ml，
（2）供试品溶液采用顶空气相色谱-氢火焰离子化检测法测定，其中，
顶空条件：平衡温度80℃，平衡时间20 min，定量环温度90℃，传输线温度100℃，顶空瓶中液体体积1~5ml，
色谱条件：选择Rtx-624毛细管柱作为色谱柱，氢火焰离子化检测的检测器温度为250℃，进样口温度为200℃，载气为高纯氮气，分流进样，分流比为5:1，
色谱柱程序升温如下：初始温度40℃，维持5分钟，再以20℃/分钟的速度升温至220℃，维持1分钟，GC运行时间15分钟，得色谱图，
（3）溴甲烷浓度c与色谱图中溴甲烷峰面积A之间满足：A=190.18c-0.7152。
2.根据权利要求1所述的一种药物中遗传毒性杂质溴甲烷残留量的测定方法，其特征在于：空白供试品溶液的质量浓度为0.1g/ml。
3.根据权利要求1所述的一种药物中遗传毒性杂质溴甲烷残留量的测定方法，其特征在于：对照品溶液的浓度为0.023、0.050、0.100、0.150、0.250、0.375μg/ml中的任一种。
4.根据权利要求1所述的一种药物中遗传毒性杂质溴甲烷残留量的测定方法，其特征在于：溴甲烷标准溶液浓度为100 μg/mL，介质为甲醇。
5.根据权利要求1所述的一种药物中遗传毒性杂质溴甲烷残留量的测定方法，其特征在于：顶空条件中，进样量1.0 mL；色谱条件中，流速为2.0 mL/min，吹扫流量为3.0 mL/min。
6.根据权利要求1所述的一种药物中遗传毒性杂质溴甲烷残留量的测定方法，其特征在于：溴甲烷的检测限浓度c为6.9 ng/ml。
7.根据权利要求1-6任一项所述的一种药物中遗传毒性杂质溴甲烷残留量的测定方法，其特征在于：含溴甲烷药物为克拉霉素。
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