CN113388040A - 非洲猪瘟病毒嵌合蛋白、疫苗组合物、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种非洲猪瘟病毒嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含：(1)非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅰ；(2)非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅱ；(3)非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅲ；以及(4)非洲猪瘟病毒抗原性蛋白。本发明提供的嵌合蛋白首次利用非洲猪瘟病毒p72蛋白作为骨架，较好展示了非洲猪瘟病毒抗原性蛋白p54、p30、CD2v和p12的抗原性表位，免疫效果好，可产生显著的体液和细胞免疫。

Description

非洲猪瘟病毒嵌合蛋白、疫苗组合物、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒嵌合蛋白、含有该嵌合蛋白的疫苗组合物、制备方法及其应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种急性、烈性、高度接触性的传染病，其发病率高，死亡率可高达100％，我国将其列为一类动物疫病。该病最早在1921年于非洲的肯尼亚确认发生，2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行，2018年传入我国，带来巨大的直接和间接经济损失。该病被发现至今近百年，但目前全球尚无获批疫苗和特效药。
非洲猪瘟疫苗研发的难点在于病毒基因组大，蛋白多，结构复杂，难以大规模培养，传代易变异,病毒免疫逃逸机制不清，常规灭活疫苗及减毒活疫苗尚无实质性进展，且减毒活疫苗使用不当存在毒力返强及散毒的生物安全风险。
为此，本发明通过现代生物学方法，将病原的基因和蛋白进行分析，并对其免疫保护能力进行检验，进行蛋白工程疫苗的开发，有效解决目前各类疫苗免疫效果不理想的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供一种非洲猪瘟病毒嵌合蛋白，该非洲猪瘟病毒嵌合蛋白用于制备疫苗时，免疫效果良好，有效解决了现有技术中各类疫苗免疫效果不理想的问题。
本发明的一个方面在于提供一种非洲猪瘟病毒嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含：
(1)非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅰ，所述结构域Ⅰ氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅱ，所述结构域Ⅱ氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(3)非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅲ，所述结构域Ⅲ氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；以及
(4)非洲猪瘟病毒抗原性蛋白；
(5)非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅰ位于嵌合蛋白的N端，结构域Ⅲ位于嵌合蛋白的C端，结构域Ⅱ位于结构域Ⅰ与结构域Ⅲ之间，非洲猪瘟病毒抗原性蛋白位于非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅰ与结构域Ⅱ之间和/或结构域Ⅱ与结构域Ⅲ之间任意位置。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白包含的非洲猪瘟病毒抗原性蛋白为p54、p30、CD2v和p12蛋白片段至少一种。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述p54蛋白片段选自如SEQ ID NO.5、6、7、8、9、10、11、12所示任意一个或多个。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述p30蛋白片段选自如SEQ ID NO.13、14、15、16、17、18、19所示任意一个或多个。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述CD2v蛋白片段选自如SEQ ID NO.20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30所示任意一个或多个。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述p12蛋白片段选自如SEQ ID NO.31、32、33、34、35、36、37所示任意一个或多个。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白包含的非洲猪瘟病毒抗原性蛋白为p54+p30蛋白片段，所述p54+p30蛋白片段选自如SEQ ID NO.38、39、40所示任意一个或多个。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白包含的非洲猪瘟病毒抗原性蛋白为p54+CD2v蛋白片段，所述p54+CD2v蛋白片段选自如SEQ ID NO.41、42、43所示任意一个或多个。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白包含的非洲猪瘟病毒抗原性蛋白为p30+CD2v蛋白片段，所述p30+CD2v蛋白片段选自如SEQ ID NO.44、45、46所示任意一个或多个。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白包含的非洲猪瘟病毒抗原性蛋白为p30+p12蛋白片段，所述p30+p12蛋白片段选自如SEQ ID NO.47、48、49所示任意一个或多个。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白包含的非洲猪瘟病毒抗原性蛋白为CD2v+p12蛋白片段，所述CD2v+p12蛋白片段选自如SEQ ID NO.50、51、52所示任意一个或多个。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白包含的非洲猪瘟病毒抗原性蛋白为p54+p30+CD2v蛋白片段，所述p54+p30+CD2v蛋白片段选自如SEQ IDNO.53、54、55所示任意一个或多个。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白包含的非洲猪瘟病毒抗原性蛋白为p54+p30+CD2v+p12蛋白片段，所述p54+p30+CD2v+p12蛋白片段选自如SEQ ID NO.56、57、58所示任意一个或多个。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白还包含T细胞免疫激活表位，所述T细胞免疫激活表位包括但不限于霍乱类毒素T细胞表位和/或白喉毒素T细胞表位和/或破伤风类毒素T细胞表位和/或大肠杆菌不耐热肠毒素T细胞表位。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述白喉毒素T细胞表位选自如SEQ IDNO.59、60、61、62、63、64、65所示任意一个或多个。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述破伤风类毒素T细胞表位选自如SEQ IDNO.66、67、68、69、70、71、72、73、74、75所示任意一个或多个。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白还包括柔性连接肽，所述柔性连接肽的长度为4-10个氨基酸序列。柔性连接肽能够使嵌合蛋白具有更佳的亲和力，这主要是由于柔性连接肽增加了结构功能域之间的空间，消除或减少了相邻结构功能域之间的空间物理阻碍作用，增加所述嵌合蛋白各结构功能域的相对独立性，同时也增加所述嵌合蛋白各功能区的结构稳定及生物学功能。
作为本发明的一种实施方式，本发明选用的柔性连接肽为GGGS。
本发明的第二方面在于提供一种非洲猪瘟病毒嵌合蛋白的制备方法，所述方法包括：
(1)人工合成所述非洲猪瘟病毒嵌合蛋白基因，通过基因工程手段连接至克隆载体即嵌合蛋白的克隆载体；
(2)将构建的所述嵌合蛋白的克隆载体以及表达载体通过酶切，构建包含嵌合蛋白基因的表达载体即嵌合蛋白的表达载体；
(3)将所述嵌合蛋白的表达载体导入受体菌进行诱导表达，并对表达的嵌合蛋白进行鉴定以获得非洲猪瘟病毒嵌合蛋白。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白可通过原核表达系统来制备，也可通过真核表达系统或化学合成方法来制备。
本发明的第三方面在于提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白。
本发明的第四方面在于提供一种含有所述多核苷酸序列的表达载体。根据本领域常识，本领域技术人员可根据上述所公开的非洲猪瘟嵌合蛋白的氨基酸序列得到编码相应的氨基酸序列的核苷酸序列，进而获取所述多核苷酸。
本发明的第五方面在于提供一种非洲猪瘟病毒基因工程疫苗组合物，包括免疫量的所述非洲猪瘟病毒嵌合蛋白及药学上可接受的载体。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的非洲猪瘟病毒基因工程疫苗组合物中，所述非洲猪瘟病毒嵌合蛋白含量为100-300μg/ml。
非洲猪瘟病毒嵌合蛋白含量可选自100μg/ml、110μg/ml、120μg/ml、130μg/ml、140μg/ml、150μg/ml、160μg/ml、170μg/ml、180μg/ml、190μg/ml、200μg/ml、210μg/ml、220μg/ml、230μg/ml、240μg/ml、250μg/ml、260μg/ml、270μg/ml、280μg/ml、290μg/ml、300μg/ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的非洲猪瘟病毒基因工程疫苗组合物中，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)矿物油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100。
所述佐剂含量为5％-60％V/V，优选从30％-60％V/V，更优选50％V/V。
作为本发明的一种实施方式，所述的药学上可接受的载体包括药物、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。
为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
本发明的第六方面在于提供所述非洲猪瘟病毒基因工程疫苗组合物在制备预防非洲猪瘟的药物中的应用。
本发明具有以下突出优点：
本发明的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白首次利用非洲猪瘟病毒p72蛋白作为骨架，较好展示了p54、p30、CD2v和p12蛋白的抗原性表位，免疫效果好，可产生显著的体液和细胞免疫，有效解决了目前非洲猪瘟病毒疫苗面临的免疫原性差的问题；所述疫苗组合物可通过基因工程手段进行大量的表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产，无生物安全风险。
附图说明
图1为嵌合蛋白概要图，“Ⅰ”代表非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅰ，“Ⅱ”代表非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅱ，“Ⅲ”代表非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅲ，“Ag”代表非洲猪瘟病毒抗原性蛋白，“N”代表嵌合蛋白的氮端，“C”代表嵌合蛋白的碳端。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
定义
“抗原(Antigen)”是指能诱导机体发生免疫应答的物质，即能被T/B淋巴细胞表面的抗原受体(TCR/BCR)特异性识别与结合，活化T/B细胞，使之增殖分化，产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体)，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。
本发明所用术语“疫苗”、“疫苗组合物”指含有非洲猪瘟病毒嵌合蛋白的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对非洲猪瘟的免疫反应。
术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。
术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除非洲猪瘟病毒嵌合蛋白之外的其它所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals Incorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squaleneoil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practicalapplication of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,NewYork,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccine design,the Subunit and adiuvant approach》(PlenumPress,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BF Goodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括矿物油、铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206或Gel佐剂中的一种或几种。
术语“预防”在涉及非洲猪瘟病毒感染时是指抑制非洲猪瘟病毒的复制、抑制非洲猪瘟病毒的传播或防止非洲猪瘟病毒在其宿主体内定居，以及减轻非洲猪瘟病毒感染的疾病或病症的症状。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1非洲猪瘟病毒p72全长及截短蛋白的表达
由苏州金唯智生物科技有限公司合成相应编码序列表SEQ ID NO.1所示p72蛋白氨基酸序列的核苷酸序列，并将合成的核苷酸克隆到pET28a载体上，命名为重组质粒pET28a-p72。
同样，将序列表SEQ ID NO.2所示非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅰ、序列表SEQ ID NO.3所示非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅱ、序列表SEQ ID NO.4所示非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅲ通过柔性连接肽连接，其中，非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅰ位于N端，结构域Ⅲ位于C端，结构域Ⅱ位于结构域Ⅰ与结构域Ⅲ之间，由苏州金唯智生物科技有限公司合成相应编码的核苷酸序列，并将合成的核苷酸克隆到pET28a载体上，命名为重组质粒pET28a-Δp72。
分别将上述重组质粒pET28a-p72、pET28a-Δp72转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，构建表达菌株1和表达菌株2，接种卡那霉素抗性的50ml LB液体培养基，37℃，230转/分振荡培养12小时后，转接入1L LB液体培养基中，37℃培养，制备发酵用种子液。
使用发酵罐为上海保兴生物公司50L发酵罐，配制30L培养基装入发酵罐，121℃灭菌30分钟。第二天将3L种子液接入发酵罐，培养菌液浓度达到OD600大约10左右时将培养温度降至25℃，加入IPTG至终浓度为0.5mM诱导培养12小时。发酵密度大约为40左右(OD600)停止培养，离心收集菌体。
重悬菌体，采用均质机以800bar压力破碎菌体4次。13500rpm，离心40min，留取上清，通过15％SDS-PAGE电泳检测。采用硫酸铵分级沉淀法进行蛋白粗纯，随后进行色谱纯化，纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳，显示目的蛋白均得到了纯化和富集。
实施例2非洲猪瘟病毒p72截短蛋白对免疫原性的影响
将实施例1制备得到的p72全长蛋白和p72截短蛋白加入到佐剂中，加的过程不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为含有p72全长蛋白或p72截短蛋白的疫苗组合物。适用于本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的佐剂。在本发明中，选用佐剂为双相佐剂(水包油包水乳剂)，例如可以是佐剂ISA206(法国赛比克公司)。制备的疫苗中各组分的具体配比见表1。
表1非洲猪瘟病毒p72全长及截短蛋白疫苗组合物成分配比
组分 疫苗1 疫苗2
p72蛋白(μg/ml) 200 0
Δp72蛋白(μg/ml) 0 200
双相佐剂(V/V％) 50％ 50％
取非洲猪瘟病毒抗原、抗体均为阴性的体重20kg左右的健康易感仔猪15头，随机分为3组，每组5头。第1组免疫疫苗1，第2组免疫疫苗2，第3组为空白对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射2ml，对照组免疫等量的PBS+佐剂。免疫两次，间隔14天。第1次免疫前及第2次免疫后14天采血。
用非洲猪瘟全病毒灭活抗原(购自欧洲联盟非洲猪瘟参考实验室(EUROPEANUNION REFERENCE LABORATORY FOR AFRICAN SWINE FEVER，URL-ASF))包被酶标板，4℃包被过夜；弃包被液，用磷酸盐缓冲液洗涤2次；加入5％牛血清白蛋白BSA于37℃封闭2小时；弃封闭液，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，拍干。
样品稀释液：磷酸盐缓冲液。
洗涤液：含0.05％V/V Tween-20的磷酸盐缓冲液。
二抗：酶标的羊抗猪二抗，使用时进行1:2000稀释。
显色液：包括A液和B液，其中，A液为TMB20mg加入10ml无水乙醇，用ddH2O定容至100ml，混匀后无菌分装；B液为柠檬酸2.1g、无水Na2HPO42.82g、0.75％的过氧化氢尿素0.64ml，用ddH2O定容至100ml，混匀后无菌分装。
终止液：2M H2SO4。
检测时在酶标反应孔中先加入50μl磷酸盐缓冲液，然后加入50μl待检血清，阴性、阳性对照，37℃温育30分钟，用洗涤液洗板三次，用磷酸盐缓冲液1:2000稀释羊抗猪酶标抗体，100μl/孔加入反应板，37℃温育30分钟，用洗涤液洗板三次，加入显色液A液、B液各50μl/孔，37℃显色10分钟，加终止液50μl/孔终止反应，用酶标仪读取吸光度OD450nm，根据判定结果进行判定。
判定标准：OD值≥0.19阳性，OD值＜0.19为阴性。
检测结果见表2。
表2非洲猪瘟病毒p72截短蛋白对免疫原性的影响检测结果
Figure BDA0002411388490000111
结果显示，非洲猪瘟病毒p72全长及截短蛋白抗体检测均为阳性，且抗体检测值无差异。说明本发明非洲猪瘟病毒p72蛋白截短后不影响其免疫原性，为p72蛋白作为骨架构建嵌合蛋白提供了可能。
实施例3非洲猪瘟病毒嵌合蛋白骨架及抗原性蛋白选择
发明人通过对非洲猪瘟病毒p72蛋白结构进行分析，创造性进行截短，依然保持了蛋白空间结构的相对稳定，且其免疫原性不受影响，为此，确定p72截短蛋白作为本发明嵌合蛋白的骨架。
同时，发明人经过大量的实验研究，结合非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白抗原表位分析，筛选到了如下序列，当嵌合蛋白包含非洲猪瘟病毒抗原性蛋白为p54、p30、CD2v和p12蛋白片段至少一种，即可产生更高的免疫原性反应：
p54蛋白片段选自如SEQ ID NO.5、6、7、8、9、10、11、12所示任意一个或多个；
p30蛋白片段选自如SEQ ID NO.13、14、15、16、17、18、19所示任意一个或多个；
CD2v蛋白片段选自如SEQ ID NO.20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30所示任意一个或多个；
p12蛋白片段选自如SEQ ID NO.31、32、33、34、35、36、37所示任意一个或多个。
实施例4非洲猪瘟病毒嵌合蛋白的表达1
参照实施例1方法，将实施例3中SEQ ID NO.7、13分别插入到非洲猪瘟病毒p72截短蛋白结构域Ⅰ和结构域Ⅱ、结构域Ⅱ和结构域Ⅲ之间，形成4个嵌合蛋白，即SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.7+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.7+SEQID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.13+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ IDNO.3+SEQ ID NO.13+SEQ ID NO.4。构建表达菌株3、表达菌株4、表达菌株5和表达菌株6。
分别发酵培养表达菌株3、4、5、6，收集并纯化蛋白。
实施例5不同插入位点对嵌合蛋白免疫原性的影响
将实施例4表达收集的4个蛋白参照实施例2方法加入佐剂制备疫苗组合物，各疫苗组合物的具体配比见表3。
表3非洲猪瘟病毒嵌合蛋白疫苗组合物成分配比
组分 疫苗3 疫苗4 疫苗5 疫苗6
表达菌株3蛋白(μg/ml) 200 0 0 0
表达菌株4蛋白(μg/ml) 0 200 0 0
表达菌株5蛋白(μg/ml) 0 0 200 0
表达菌株6蛋白(μg/ml) 0 0 0 200
双相佐剂(V/V％) 50％ 50％ 50％ 50％
取非洲猪瘟病毒抗原、抗体均为阴性的体重20kg左右的健康易感仔猪25头，随机分为5组，每组5头。第4组-第7组分别免疫疫苗3-疫苗6，第8组为空白对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射2ml，对照组免疫等量的PBS+佐剂。免疫两次，间隔14天。第1次免疫前及第2次免疫后14天采血。抗体检测结果见表4。
表4不同插入位点对嵌合蛋白免疫原性的影响检测结果
Figure BDA0002411388490000131
结果显示，4个非洲猪瘟病毒嵌合蛋白无论是作为骨架的p72截短蛋白还是插入的p54蛋白片段，以及整个嵌合蛋白均具有一定的免疫原性；嵌合蛋白的免疫原性更好；不同插入位置免疫原性无差异。表明，不同插入位点对非洲猪瘟病毒嵌合蛋白免疫原性没有影响；插入非洲猪瘟病毒抗原性蛋白后，作为骨架的p72截短蛋白免疫原性不受影响。
实施例6非洲猪瘟病毒嵌合蛋白的表达2
将实施例3中SEQ ID NO.9、16、22、23、32分别插入到非洲猪瘟病毒p72截短蛋白结构域Ⅰ和结构域Ⅱ之间，将SEQ ID NO.10、18、19、25、35分别插入到非洲猪瘟病毒p72截短蛋白结构域Ⅱ和结构域Ⅲ之间，形成10个嵌合蛋白，即SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.9+SEQ IDNO.3+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.16+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.22+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.23+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.32+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQID NO.3+SEQ ID NO.10+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.18+SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.19+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.25+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.35+SEQ ID NO.4。构建表达菌株7-16。
分别发酵培养表达菌株7-16，收集并纯化蛋白。
实施例7含有单个抗原性蛋白片段的嵌合蛋白的免疫原性试验
将实施例6表达收集10个蛋白参照实施例2方法加入佐剂制备疫苗组合物，各疫苗组合物的具体配比见表5、6。
表5含单个抗原性蛋白片段的嵌合蛋白疫苗组合物成分配比1
组分 疫苗7 疫苗8 疫苗9 疫苗10 疫苗11
表达菌株7蛋白(μg/ml) 200 0 0 0 0
表达菌株8蛋白(μg/ml) 0 200 0 0 0
表达菌株9蛋白(μg/ml) 0 0 200 0 0
表达菌株10蛋白(μg/ml) 0 0 0 200 0
表达菌株11蛋白(μg/ml) 0 0 0 0 200
双相佐剂(V/V％) 50％ 50％ 50％ 50％ 50％
表6含单个抗原性蛋白片段的嵌合蛋白疫苗组合物成分配比2
组分 疫苗12 疫苗13 疫苗14 疫苗15 疫苗16
表达菌株12蛋白(μg/ml) 200 0 0 0 0
表达菌株13蛋白(μg/ml) 0 200 0 0 0
表达菌株14蛋白(μg/ml) 0 0 200 0 0
表达菌株15蛋白(μg/ml) 0 0 0 200 0
表达菌株16蛋白(μg/ml) 0 0 0 0 200
双相佐剂(V/V％) 50％ 50％ 50％ 50％ 50％
取非洲猪瘟病毒抗原、抗体均为阴性的体重20kg左右的健康易感仔猪55头，随机分为11组，每组5头。第9组-第18组分别免疫疫苗7-疫苗16，第19组为空白对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射2ml，对照组免疫等量的PBS+佐剂。免疫两次，间隔14天。第1次免疫前及第2次免疫后14天采血。抗体检测结果见表7。
表7含有单个抗原性蛋白片段的嵌合蛋白疫苗组合物免疫原性检测结果
Figure BDA0002411388490000151
Figure BDA0002411388490000161
结果显示，10个非洲猪瘟病毒嵌合蛋白均具有一定的免疫原性，抗体阳性；不同插入位置免疫原性无差异。
进一步，将实施例3中SEQ ID NO.5、6、8、12、14、20、21、29、30、31分别插入到非洲猪瘟病毒p72截短蛋白结构域Ⅰ和结构域Ⅱ之间，将SEQ ID NO.11、15、17、24、26、27、28、33、34、36、37分别插入到非洲猪瘟病毒p72截短蛋白结构域Ⅱ和结构域Ⅲ之间，形成21个嵌合蛋白，构建表达菌株表达蛋白，参照实施例2方法制备疫苗组合物。经猪体试验，二免后14天抗体检测结果均在0.622-0.664之间，结果显示为阳性。证明本发明选用的p54蛋白片段、p30蛋白片段、CD2v蛋白片段、p12蛋白片段作为嵌合蛋白的抗原性蛋白均具有一定的免疫活性，也进一步表明，不同插入位点对非洲猪瘟病毒嵌合蛋白免疫原性没有影响。
实施例8非洲猪瘟病毒嵌合蛋白的表达3
本实施例采用将本发明筛选的任意两个蛋白片段插入到非洲猪瘟病毒p72截短蛋白结构域Ⅱ和结构域Ⅲ之间，也可以插入到非洲猪瘟病毒p72截短蛋白结构域Ⅰ和结构域Ⅱ之间，也可以同时插入，不作具体限制，示意图见图1。参照实施例1方法，将实施例3中p54蛋白片段、p30蛋白片段、CD2v蛋白片段、p12蛋白片段选其二形成SEQ ID NO.38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52，分别插入到非洲猪瘟病毒p72截短蛋白结构域Ⅱ和结构域Ⅲ之间，形成15个嵌合蛋白，即SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.38+SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.39+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.40+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.41+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.42+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQID NO.43+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.44+SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.45+SEQID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.46+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.47+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQID NO.3+SEQ ID NO.48+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.49+SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.50+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.51+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.52+SEQ ID NO.4。构建表达菌株17-31。
分别发酵培养表达菌株17-31，收集并纯化蛋白。
实施例9含有两个抗原性蛋白片段的嵌合蛋白的免疫原性试验
将实施例8表达收集15个蛋白参照实施例2方法加入佐剂制备疫苗组合物，各疫苗组合物的具体配比见表8、9、10。
表8含两个抗原性蛋白片段的嵌合蛋白疫苗组合物成分配比1
组分 疫苗17 疫苗18 疫苗19 疫苗20 疫苗21
表达菌株17蛋白(μg/ml) 200 0 0 0 0
表达菌株18蛋白(μg/ml) 0 200 0 0 0
表达菌株19蛋白(μg/ml) 0 0 200 0 0
表达菌株20蛋白(μg/ml) 0 0 0 200 0
表达菌株21蛋白(μg/ml) 0 0 0 0 200
双相佐剂(V/V％) 50％ 50％ 50％ 50％ 50％
表9含两个抗原性蛋白片段的嵌合蛋白疫苗组合物成分配比2
Figure BDA0002411388490000171
Figure BDA0002411388490000181
表10含两个抗原性蛋白片段的嵌合蛋白疫苗组合物成分配比3
组分 疫苗27 疫苗28 疫苗29 疫苗30 疫苗31
表达菌株27蛋白(μg/ml) 200 0 0 0 0
表达菌株28蛋白(μg/ml) 0 200 0 0 0
表达菌株29蛋白(μg/ml) 0 0 200 0 0
表达菌株30蛋白(μg/ml) 0 0 0 200 0
表达菌株31蛋白(μg/ml) 0 0 0 0 200
双相佐剂(V/V％) 50％ 50％ 50％ 50％ 50％
取非洲猪瘟病毒抗原、抗体均为阴性的体重20kg左右的健康易感仔猪80头，随机分为16组，每组5头。第20组-第34组分别免疫疫苗17-疫苗31，第35组为空白对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射2ml，对照组免疫等量的PBS+佐剂。免疫两次，间隔14天。第1次免疫前及第2次免疫后14天采血。抗体检测结果见表11。
表11含有两个抗原性蛋白片段的嵌合蛋白疫苗组合物免疫原性检测结果
Figure BDA0002411388490000182
Figure BDA0002411388490000191
结果显示，15个非洲猪瘟病毒嵌合蛋白均具有较好的免疫原性，抗体阳性。表明，插入两个蛋白片段的嵌合蛋白具有比插入单个蛋白片段的嵌合蛋白更好的免疫原性。
实施例10非洲猪瘟病毒嵌合蛋白的表达4
参照实施例1方法，将实施例3中p54蛋白片段、p30蛋白片段、CD2v蛋白片段、p12蛋白片段选其三或四形成SEQ ID NO.53、54、55、56、57、58，分别插入到非洲猪瘟病毒p72截短蛋白结构域Ⅱ和结构域Ⅲ之间，形成6个嵌合蛋白，即SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ IDNO.53+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.54+SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.55+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ IDNO.56+SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.57+SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.58+SEQ ID NO.4。构建表达菌株32-37。
分别发酵培养表达菌株32-37，收集并纯化蛋白。
实施例11含有两个以上抗原性蛋白片段的嵌合蛋白的免疫原性试验
将实施例10表达收集6个蛋白参照实施例2方法加入佐剂制备疫苗组合物，各疫苗组合物的具体配比见表12。
表12含有两个以上抗原性蛋白片段的嵌合蛋白疫苗组合物成分配比
Figure BDA0002411388490000192
Figure BDA0002411388490000201
取非洲猪瘟病毒抗原、抗体均为阴性的体重20kg左右的健康易感仔猪35头，随机分为7组，每组5头。第36组-第41组分别免疫疫苗32-疫苗37，第42组为空白对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射2ml，对照组免疫等量的PBS+佐剂。免疫两次，间隔14天。第1次免疫前及第2次免疫后14天采血。抗体检测结果见表13。
表13含有两个以上抗原性蛋白片段的嵌合蛋白疫苗组合物免疫原性检测结果
组别 检测用包被原 一免前 二免后14天
36 全病毒灭活抗原 0.043 2.248
37 全病毒灭活抗原 0.048 2.282
38 全病毒灭活抗原 0.054 2.249
39 全病毒灭活抗原 0.046 2.243
40 全病毒灭活抗原 0.061 2.229
41 全病毒灭活抗原 0.056 2.284
42 全病毒灭活抗原 0.052 0.054
结果显示，6个非洲猪瘟病毒嵌合蛋白均具有较好的免疫原性，抗体阳性。表明，插入两个以上蛋白片段的嵌合蛋白较插入单个或两个蛋白片段具有更好的免疫原性。
实施例12非洲猪瘟病毒嵌合蛋白的表达5
参照实施例1方法，将实施例3中的p54蛋白片段、p30蛋白片段、CD2v蛋白片段、p12蛋白片段任意一个或多个连接T细胞免疫激活表位，包括但不限于霍乱类毒素T细胞表位和/或白喉毒素T细胞表位和/或破伤风类毒素T细胞表位和/或大肠杆菌不耐热肠毒素T细胞表位，再插入到非洲猪瘟病毒p72截短蛋白结构域Ⅱ和结构域Ⅲ之间，形成嵌合蛋白，本实施例以实施例3中p54蛋白片段、p30蛋白片段、CD2v蛋白片段、p12蛋白片段选其二或三形成SEQ ID NO.38、39、45、47、52、54连接白喉毒素T细胞表位SEQ ID NO.61或破伤风类毒素T细胞表位SEQ ID NO.70，分别插入到非洲猪瘟病毒p72截短蛋白结构域Ⅱ和结构域Ⅲ之间，形成12个嵌合蛋白，即SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.38+SEQ ID NO.4+SEQ IDNO.61、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.39+SEQ ID NO.4+SEQ ID NO.61、SEQ IDNO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.45+SEQ ID NO.4+SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.2+SEQ IDNO.3+SEQ ID NO.47+SEQ ID NO.4+SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ IDNO.52+SEQ ID NO.4+SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.54+SEQ IDNO.4+SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.38+SEQ ID NO.4+SEQ IDNO.70、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.39+SEQ ID NO.4+SEQ ID NO.70、SEQ IDNO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.45+SEQ ID NO.4+SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.2+SEQ IDNO.3+SEQ ID NO.47+SEQ ID NO.4+SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ IDNO.52+SEQ ID NO.4+SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.2+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.54+SEQ IDNO.4+SEQ ID NO.70，构建表达菌株38-49。
分别发酵培养表达菌株38-49，收集并纯化蛋白。
实施例13含T细胞免疫激活表位的嵌合蛋白的免疫原性试验
将实施例12表达收集12个蛋白参照实施例2方法加入佐剂制备疫苗组合物，各疫苗组合物的具体配比见表14、15、16。
表14含有白喉毒素T细胞表位的嵌合蛋白疫苗组合物成分配比
组分 疫苗38 疫苗39 疫苗40 疫苗41 疫苗42 疫苗43
表达菌株38蛋白(μg/ml) 200 0 0 0 0 0
表达菌株39蛋白(μg/ml) 0 200 0 0 0 0
表达菌株40蛋白(μg/ml) 0 0 200 0 0 0
表达菌株41蛋白(μg/ml) 0 0 0 200 0 0
表达菌株42蛋白(μg/ml) 0 0 0 0 200 0
表达菌株43蛋白(μg/ml) 0 0 0 0 0 200
双相佐剂(V/V％) 50％ 50％ 50％ 50％ 50％ 50％
表15含有破伤风类毒素T细胞表位的嵌合蛋白疫苗组合物成分配比1
组分 疫苗44 疫苗45 疫苗46 疫苗47 疫苗48 疫苗49
表达菌株44蛋白(μg/ml) 100 0 0 0 0 0
表达菌株45蛋白(μg/ml) 0 100 0 0 0 0
表达菌株46蛋白(μg/ml) 0 0 100 0 0 0
表达菌株47蛋白(μg/ml) 0 0 0 100 0 0
表达菌株48蛋白(μg/ml) 0 0 0 0 100 0
表达菌株49蛋白(μg/ml) 0 0 0 0 0 100
双相佐剂(V/V％) 50％ 50％ 50％ 50％ 50％ 50％
表16含有破伤风类毒素T细胞表位的嵌合蛋白疫苗组合物成分配比2
Figure BDA0002411388490000221
Figure BDA0002411388490000231
取非洲猪瘟病毒抗原、抗体均为阴性的体重20kg左右的健康易感仔猪95头，随机分为19组，每组5头。第43组-第60组分别免疫疫苗38-疫苗55，第61组为空白对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射2ml，对照组免疫等量的PBS+佐剂。免疫两次，间隔14天。第1次免疫前及第2次免疫后14天采血。抗体检测结果见表17。
表17含T细胞免疫激活表位的嵌合蛋白的免疫原性检测结果
Figure BDA0002411388490000232
Figure BDA0002411388490000241
结果显示，12个含T细胞免疫激活表位的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白均具有较好的免疫原性，抗体阳性，与实施例9、实施例11验证未添加T细胞免疫激活表位的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白相比，免疫原性更好。表明，添加T细胞免疫激活表位有助于进一步增强免疫应答。
实施例14本发明非洲猪瘟病毒嵌合蛋白疫苗组合物对细胞免疫的影响
将实施例9收集的第20组、第21组、第27组、第29组、第34组，实施例11收集的第37组，实施例13收集的第49组-61组猪的外周血，分离外周血淋巴细胞，采用BiosourceEurope的Swine IFN Cytoset ELISPOT检测试剂盒进行检测，并计算斑点数。检测结果见表18。
表18非洲猪瘟病毒嵌合蛋白疫苗组合物细胞免疫检测结果
Figure BDA0002411388490000242
Figure BDA0002411388490000251
注：检测细胞数为106细胞。
结果显示，本发明添加T细胞免疫激活表位的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白疫苗组合物能较好的刺激细胞免疫的产生，显著高于未添加T细胞免疫激活表位的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白疫苗组合物。
表明，在本发明的嵌合蛋白的基础上添加T细胞免疫激活表位，有助于细胞免疫应答。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 普莱柯生物工程股份有限公司
<120> 非洲猪瘟病毒嵌合蛋白、疫苗组合物、制备方法及其应用
<160> 75
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 646
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p72蛋白
<400> 1
Met Ala Ser Gly Gly Ala Phe Cys Leu Ile Ala Asn Asp Gly Lys Ala
1 5 10 15
Asp Lys Ile Ile Leu Ala Gln Asp Leu Leu Asn Ser Arg Ile Ser Asn
20 25 30
Ile Lys Asn Val Asn Lys Ser Tyr Gly Lys Pro Asp Pro Glu Pro Thr
35 40 45
Leu Ser Gln Ile Glu Glu Thr His Leu Val His Phe Asn Ala His Phe
50 55 60
Lys Pro Tyr Val Pro Val Gly Phe Glu Tyr Asn Lys Val Arg Pro His
65 70 75 80
Thr Gly Thr Pro Thr Leu Gly Asn Lys Leu Thr Phe Gly Ile Pro Gln
85 90 95
Tyr Gly Asp Phe Phe His Asp Met Val Gly His His Ile Leu Gly Ala
100 105 110
Cys His Ser Ser Trp Gln Asp Ala Pro Ile Gln Gly Thr Ser Gln Met
115 120 125
Gly Ala His Gly Gln Leu Gln Thr Phe Pro Arg Asn Gly Tyr Asp Trp
130 135 140
Asp Asn Gln Thr Pro Leu Glu Gly Ala Val Tyr Thr Leu Val Asp Pro
145 150 155 160
Phe Gly Arg Pro Ile Val Pro Gly Thr Lys Asn Ala Tyr Arg Asn Leu
165 170 175
Val Tyr Tyr Cys Glu Tyr Pro Gly Glu Arg Leu Tyr Glu Asn Val Arg
180 185 190
Phe Asp Val Asn Gly Asn Ser Leu Asp Glu Tyr Ser Ser Asp Val Thr
195 200 205
Thr Leu Val Arg Lys Phe Cys Ile Pro Gly Asp Lys Met Thr Gly Tyr
210 215 220
Lys His Leu Val Gly Gln Glu Val Ser Val Glu Gly Thr Ser Gly Pro
225 230 235 240
Leu Leu Cys Asn Ile His Asp Leu His Lys Pro His Gln Ser Lys Pro
245 250 255
Ile Leu Thr Asp Glu Asn Asp Thr Gln Arg Thr Cys Ser His Thr Asn
260 265 270
Pro Lys Phe Leu Ser Gln His Phe Pro Glu Asn Ser His Asn Ile Gln
275 280 285
Thr Ala Gly Lys Gln Asp Ile Thr Pro Ile Thr Asp Ala Thr Tyr Leu
290 295 300
Asp Ile Arg Arg Asn Val His Tyr Ser Cys Asn Gly Pro Gln Thr Pro
305 310 315 320
Lys Tyr Tyr Gln Pro Pro Leu Ala Leu Trp Ile Lys Leu Arg Phe Trp
325 330 335
Phe Asn Glu Asn Val Asn Leu Ala Ile Pro Ser Val Ser Ile Pro Phe
340 345 350
Gly Glu Arg Phe Ile Thr Ile Lys Leu Ala Ser Gln Lys Asp Leu Val
355 360 365
Asn Glu Phe Pro Gly Leu Phe Val Arg Gln Ser Arg Phe Ile Ala Gly
370 375 380
Arg Pro Ser Arg Arg Asn Ile Arg Phe Lys Pro Trp Phe Ile Pro Gly
385 390 395 400
Val Ile Asn Glu Ile Ser Leu Thr Asn Asn Glu Leu Tyr Ile Asn Asn
405 410 415
Leu Phe Val Thr Pro Glu Ile His Asn Leu Phe Val Lys Arg Val Arg
420 425 430
Phe Ser Leu Ile Arg Val His Lys Thr Gln Val Thr His Thr Asn Asn
435 440 445
Asn His His Asp Glu Lys Leu Met Ser Ala Leu Lys Trp Pro Ile Glu
450 455 460
Tyr Met Phe Ile Gly Leu Lys Pro Thr Trp Asn Ile Ser Asp Gln Asn
465 470 475 480
Pro His Gln His Arg Asp Trp His Lys Phe Gly His Val Val Asn Ala
485 490 495
Ile Met Gln Pro Thr His His Ala Glu Ile Ser Phe Gln Asp Arg Asp
500 505 510
Thr Ala Leu Pro Asp Ala Cys Ser Ser Ile Ser Asp Ile Ser Pro Val
515 520 525
Thr Tyr Pro Ile Thr Leu Pro Ile Ile Lys Asn Ile Ser Val Thr Ala
530 535 540
His Gly Ile Asn Leu Ile Asp Lys Phe Pro Ser Lys Phe Cys Ser Ser
545 550 555 560
Tyr Ile Pro Phe His Tyr Gly Gly Asn Ala Ile Lys Thr Pro Asp Asp
565 570 575
Pro Gly Ala Met Met Ile Thr Phe Ala Leu Lys Pro Arg Glu Glu Tyr
580 585 590
Gln Pro Ser Gly His Ile Asn Val Ser Arg Ala Arg Glu Phe Tyr Ile
595 600 605
Ser Trp Asp Thr Asp Tyr Val Gly Ser Ile Thr Thr Ala Asp Leu Val
610 615 620
Val Ser Ala Ser Ala Ile Asn Phe Leu Leu Leu Gln Asn Gly Ser Ala
625 630 635 640
Val Leu Arg Tyr Ser Thr
645
<210> 2
<211> 42
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅰ
<400> 2
Phe Glu Tyr Asn Lys Val Arg Pro His Thr Gly Thr Pro Thr Leu Gly
1 5 10 15
Asn Lys Leu Thr Phe Gly Ile Pro Gln Tyr Gly Asp Phe Phe His Asp
20 25 30
Met Val Gly His His Ile Leu Gly Ala Cys
35 40
<210> 3
<211> 294
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅱ
<400> 3
Glu Asn Val Arg Phe Asp Val Asn Gly Asn Ser Leu Asp Glu Tyr Ser
1 5 10 15
Ser Asp Val Thr Thr Leu Val Arg Lys Phe Cys Ile Pro Gly Asp Lys
20 25 30
Met Thr Gly Tyr Lys His Leu Val Gly Gln Glu Val Ser Val Glu Gly
35 40 45
Thr Ser Gly Pro Leu Leu Cys Asn Ile His Asp Leu His Lys Pro His
50 55 60
Gln Ser Lys Pro Ile Leu Thr Asp Glu Asn Asp Thr Gln Arg Thr Cys
65 70 75 80
Ser His Thr Asn Pro Lys Phe Leu Ser Gln His Phe Pro Glu Asn Ser
85 90 95
His Asn Ile Gln Thr Ala Gly Lys Gln Asp Ile Thr Pro Ile Thr Asp
100 105 110
Ala Thr Tyr Leu Asp Ile Arg Arg Asn Val His Tyr Ser Cys Asn Gly
115 120 125
Pro Gln Thr Pro Lys Tyr Tyr Gln Pro Pro Leu Ala Leu Trp Ile Lys
130 135 140
Leu Arg Phe Trp Phe Asn Glu Asn Val Asn Leu Ala Ile Pro Ser Val
145 150 155 160
Ser Ile Pro Phe Gly Glu Arg Phe Ile Thr Ile Lys Leu Ala Ser Gln
165 170 175
Lys Asp Leu Val Asn Glu Phe Pro Gly Leu Phe Val Arg Gln Ser Arg
180 185 190
Phe Ile Ala Gly Arg Pro Ser Arg Arg Asn Ile Arg Phe Lys Pro Trp
195 200 205
Phe Ile Pro Gly Val Ile Asn Glu Ile Ser Leu Thr Asn Asn Glu Leu
210 215 220
Tyr Ile Asn Asn Leu Phe Val Thr Pro Glu Ile His Asn Leu Phe Val
225 230 235 240
Lys Arg Val Arg Phe Ser Leu Ile Arg Val His Lys Thr Gln Val Thr
245 250 255
His Thr Asn Asn Asn His His Asp Glu Lys Leu Met Ser Ala Leu Lys
260 265 270
Trp Pro Ile Glu Tyr Met Phe Ile Gly Leu Lys Pro Thr Trp Asn Ile
275 280 285
Ser Asp Gln Asn Pro His
290
<210> 4
<211> 94
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅲ
<400> 4
Pro Ile Ile Lys Asn Ile Ser Val Thr Ala His Gly Ile Asn Leu Ile
1 5 10 15
Asp Lys Phe Pro Ser Lys Phe Cys Ser Ser Tyr Ile Pro Phe His Tyr
20 25 30
Gly Gly Asn Ala Ile Lys Thr Pro Asp Asp Pro Gly Ala Met Met Ile
35 40 45
Thr Phe Ala Leu Lys Pro Arg Glu Glu Tyr Gln Pro Ser Gly His Ile
50 55 60
Asn Val Ser Arg Ala Arg Glu Phe Tyr Ile Ser Trp Asp Thr Asp Tyr
65 70 75 80
Val Gly Ser Ile Thr Thr Ala Asp Leu Val Val Ser Ala Ser
85 90
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54蛋白
<400> 5
Tyr Pro Arg His
1
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54蛋白
<400> 6
Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe
1 5
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54蛋白
<400> 7
Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser
1 5 10 15
Phe Phe Ser Thr
20
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54蛋白
<400> 8
Lys Lys Lys Ala Ala Ala Ile Glu Glu
1 5
<210> 9
<211> 52
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54蛋白
<400> 9
Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ser Val Gly Lys Pro Val Thr
20 25 30
Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala Thr Asn Lys Pro Val Thr Asp
35 40 45
Asn Pro Val Thr
50
<210> 10
<211> 21
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54蛋白
<400> 10
Ala Thr Thr Ala Ser Val Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr
1 5 10 15
Asn Arg Pro Ala Thr
20
<210> 11
<211> 33
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54蛋白
<400> 11
Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala His
1 5 10 15
Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser Gln
20 25 30
Thr
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54蛋白
<400> 12
Thr Tyr Thr His Lys Asp
1 5
<210> 13
<211> 50
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p30蛋白
<400> 13
Asp Ile Val Lys Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu
1 5 10 15
His Gln Ala Gln Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu
20 25 30
Glu Glu Thr Glu Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn
35 40 45
Asp Asn
50
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p30蛋白
<400> 14
Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln Glu
1 5 10
<210> 15
<211> 24
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p30蛋白
<400> 15
Glu Thr Glu Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp
1 5 10 15
Asn Glu Thr Asn Glu Cys Thr Ser
20
<210> 16
<211> 24
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p30蛋白
<400> 16
Glu Thr Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu
1 5 10 15
Pro Ser Ser Glu Val Pro Lys Asp
20
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p30蛋白
<400> 17
Glu Gln Glu Pro Ser Ser Glu Val Pro Lys Asp
1 5 10
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p30蛋白
<400> 18
Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe
1 5
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p30蛋白
<400> 19
Thr Pro Leu Lys Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg
1 5 10
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒CD2v蛋白
<400> 20
Ile Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly
1 5 10
<210> 21
<211> 3
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒CD2v蛋白
<400> 21
Val Phe Asp
1
<210> 22
<211> 96
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒CD2v蛋白
<400> 22
Ser Ile Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser
1 5 10 15
Asn Ile Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe
20 25 30
Phe Asn Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn
35 40 45
Phe Cys Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn
50 55 60
Asn Cys Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr
65 70 75 80
Tyr Gln Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu
85 90 95
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒CD2v蛋白
<400> 23
Pro Ala Thr Pro Pro Asn Ile Thr Tyr
1 5
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒CD2v蛋白
<400> 24
Lys Asn Asn Gly Thr Asn
1 5
<210> 25
<211> 42
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒CD2v蛋白
<400> 25
Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ile Asn Asp
1 5 10 15
Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr Asn Trp Asn
20 25 30
Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr
35 40
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒CD2v蛋白
<400> 26
Asn Asn Ser Asn Ile
1 5
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒CD2v蛋白
<400> 27
Ile Ser Thr Ser Asn Glu
1 5
<210> 28
<211> 46
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒CD2v蛋白
<400> 28
Lys His Val Glu Glu Ile Glu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Asn Glu Glu
1 5 10 15
Glu Gln Cys Gln His Asp Asp Thr Thr Ser Ile His Glu Pro Ser Pro
20 25 30
Arg Glu Pro Leu Leu Pro Lys Pro Tyr Ser Arg Tyr Gln Tyr
35 40 45
<210> 29
<211> 49
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒CD2v蛋白
<400> 29
Met Arg Pro Ser Thr Gln Pro Leu Asn Pro Phe Pro Leu Pro Lys Pro
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Lys Pro Cys Pro Pro Pro Lys Pro Cys Pro Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Cys Pro Ser Ala Glu Ser Tyr Ser Pro Pro Lys Pro Leu Pro
35 40 45
Ser
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒CD2v蛋白
<400> 30
Ile Pro Pro Leu Ser Thr
1 5
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p12蛋白
<400> 31
Ala Leu Asp Gly Ser Ser
1 5
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p12蛋白
<400> 32
Ser Ser Gly Gly Gly Ser Asn
1 5
<210> 33
<211> 6
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p12蛋白
<400> 33
Arg Gln Gln Lys Lys Cys
1 5
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p12蛋白
<400> 34
Lys Cys Ser Lys Ala Glu
1 5
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p12蛋白
<400> 35
Glu Cys Thr Cys Asn Asn
1 5
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p12蛋白
<400> 36
Gly Ser Cys Ser Leu
1 5
<210> 37
<211> 4
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p12蛋白
<400> 37
Leu Lys Thr Ser
1
<210> 38
<211> 49
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54、p30蛋白
<400> 38
Ala Thr Thr Ala Ser Val Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr
1 5 10 15
Asn Arg Pro Ala Thr Gly Gly Gly Ser Glu Thr Asn Glu Cys Thr Ser
20 25 30
Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser Ser Glu Val Pro Lys
35 40 45
Asp
<210> 39
<211> 36
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54、p30蛋白
<400> 39
Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser
1 5 10 15
Phe Phe Ser Thr Gly Gly Gly Ser Thr Pro Leu Lys Glu Glu Glu Lys
20 25 30
Glu Val Val Arg
35
<210> 40
<211> 87
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54、p30蛋白
<400> 40
Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala His
1 5 10 15
Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser Gln
20 25 30
Thr Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Lys Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly
35 40 45
Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu
50 55 60
His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn
65 70 75 80
Ile His Glu Lys Asn Asp Asn
85
<210> 41
<211> 152
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54、CD2v蛋白
<400> 41
Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ser Val Gly Lys Pro Val Thr
20 25 30
Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala Thr Asn Lys Pro Val Thr Asp
35 40 45
Asn Pro Val Thr Gly Gly Gly Ser Ser Ile Asp Tyr Trp Val Ser Phe
50 55 60
Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn Ile Thr Asn Asp Asn Asn Asp
65 70 75 80
Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe Asn Asn Ser Phe Asn Thr Leu
85 90 95
Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe Cys Glu Cys Ser Asn Tyr Ser
100 105 110
Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn Cys Ser Leu Thr Ile Phe Pro
115 120 125
His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr Gln Val Val Trp Asn Gln Ile
130 135 140
Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu
145 150
<210> 42
<211> 79
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54、CD2v蛋白
<400> 42
Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala His
1 5 10 15
Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser Gln
20 25 30
Thr Gly Gly Gly Ser Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr
35 40 45
Leu Asn Ile Asn Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu
50 55 60
Glu Tyr Asn Trp Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr
65 70 75
<210> 43
<211> 102
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54、CD2v蛋白
<400> 43
Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ser Val Gly Lys Pro Val Thr
20 25 30
Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala Thr Asn Lys Pro Val Thr Asp
35 40 45
Asn Pro Val Thr Gly Gly Gly Ser Lys His Val Glu Glu Ile Glu Ser
50 55 60
Pro Pro Pro Glu Ser Asn Glu Glu Glu Gln Cys Gln His Asp Asp Thr
65 70 75 80
Thr Ser Ile His Glu Pro Ser Pro Arg Glu Pro Leu Leu Pro Lys Pro
85 90 95
Tyr Ser Arg Tyr Gln Tyr
100
<210> 44
<211> 77
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p30、CD2v蛋白
<400> 44
Glu Thr Glu Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp
1 5 10 15
Asn Glu Thr Asn Glu Cys Thr Ser Gly Gly Gly Ser Met Arg Pro Ser
20 25 30
Thr Gln Pro Leu Asn Pro Phe Pro Leu Pro Lys Pro Cys Pro Pro Pro
35 40 45
Lys Pro Cys Pro Pro Pro Lys Pro Cys Pro Pro Pro Lys Pro Cys Pro
50 55 60
Ser Ala Glu Ser Tyr Ser Pro Pro Lys Pro Leu Pro Ser
65 70 75
<210> 45
<211> 150
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p30、CD2v蛋白
<400> 45
Asp Ile Val Lys Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu
1 5 10 15
His Gln Ala Gln Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu
20 25 30
Glu Glu Thr Glu Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn
35 40 45
Asp Asn Gly Gly Gly Ser Ser Ile Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys
50 55 60
Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn Ile Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn
65 70 75 80
Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe Asn Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr
85 90 95
Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe Cys Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser
100 105 110
Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn Cys Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn
115 120 125
Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr Gln Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn
130 135 140
Tyr Thr Ile Lys Leu Leu
145 150
<210> 46
<211> 58
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p30、CD2v蛋白
<400> 46
Thr Pro Leu Lys Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ile Asn Asp
20 25 30
Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr Asn Trp Asn
35 40 45
Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr
50 55
<210> 47
<211> 21
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p30、p12蛋白
<400> 47
Glu Gln Glu Pro Ser Ser Glu Val Pro Lys Asp Gly Gly Gly Ser Ala
1 5 10 15
Leu Asp Gly Ser Ser
20
<210> 48
<211> 19
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p30、p12蛋白
<400> 48
Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe Gly Gly Gly Ser Ser Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Asn
<210> 49
<211> 34
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p30、p12蛋白
<400> 49
Glu Thr Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu
1 5 10 15
Pro Ser Ser Glu Val Pro Lys Asp Gly Gly Gly Ser Arg Gln Gln Lys
20 25 30
Lys Cys
<210> 50
<211> 106
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒CD2v、p12蛋白
<400> 50
Ser Ile Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser
1 5 10 15
Asn Ile Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe
20 25 30
Phe Asn Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn
35 40 45
Phe Cys Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn
50 55 60
Asn Cys Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr
65 70 75 80
Tyr Gln Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Lys Cys Ser Lys Ala Glu
100 105
<210> 51
<211> 52
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒CD2v、p12蛋白
<400> 51
Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ile Asn Asp
1 5 10 15
Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr Asn Trp Asn
20 25 30
Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr Gly Gly Gly Ser Glu Cys
35 40 45
Thr Cys Asn Asn
50
<210> 52
<211> 55
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒CD2v、p12蛋白
<400> 52
Lys His Val Glu Glu Ile Glu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Asn Glu Glu
1 5 10 15
Glu Gln Cys Gln His Asp Asp Thr Thr Ser Ile His Glu Pro Ser Pro
20 25 30
Arg Glu Pro Leu Leu Pro Lys Pro Tyr Ser Arg Tyr Gln Tyr Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Ser Cys Ser Leu
50 55
<210> 53
<211> 175
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54、p30、CD2v蛋白
<400> 53
Ala Thr Thr Ala Ser Val Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr
1 5 10 15
Asn Arg Pro Ala Thr Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Lys Ser Ala Arg
20 25 30
Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln Glu Glu Trp
35 40 45
Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu Ser Ser Ala
50 55 60
Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Gly Gly Gly Ser Ser
65 70 75 80
Ile Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn
85 90 95
Ile Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe
100 105 110
Asn Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe
115 120 125
Cys Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn
130 135 140
Cys Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr
145 150 155 160
Gln Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu
165 170 175
<210> 54
<211> 82
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54、p30、CD2v蛋白
<400> 54
Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser
1 5 10 15
Phe Phe Ser Thr Gly Gly Gly Ser Thr Pro Leu Lys Glu Glu Glu Lys
20 25 30
Glu Val Val Arg Gly Gly Gly Ser Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr
35 40 45
Asn Ile Tyr Leu Asn Ile Asn Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu
50 55 60
Ser Ile Leu Glu Tyr Asn Trp Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr
65 70 75 80
Ala Thr
<210> 55
<211> 136
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54、p30、CD2v蛋白
<400> 55
Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser
1 5 10 15
Phe Phe Ser Thr Gly Gly Gly Ser Thr Pro Leu Lys Glu Glu Glu Lys
20 25 30
Glu Val Val Arg Gly Gly Gly Ser Ser Ile Asp Tyr Trp Val Ser Phe
35 40 45
Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn Ile Thr Asn Asp Asn Asn Asp
50 55 60
Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe Asn Asn Ser Phe Asn Thr Leu
65 70 75 80
Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe Cys Glu Cys Ser Asn Tyr Ser
85 90 95
Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn Cys Ser Leu Thr Ile Phe Pro
100 105 110
His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr Gln Val Val Trp Asn Gln Ile
115 120 125
Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu
130 135
<210> 56
<211> 182
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54、p30、CD2v、p12蛋白
<400> 56
Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser
1 5 10 15
Phe Phe Ser Thr Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Lys Ser Ala Arg Ile
20 25 30
Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln Glu Glu Trp Asn
35 40 45
Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu Ser Ser Ala Ser
50 55 60
Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Gly Gly Gly Ser Ser Ile
65 70 75 80
Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn Ile
85 90 95
Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe Asn
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe Cys
115 120 125
Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn Cys
130 135 140
Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr Gln
145 150 155 160
Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Lys Thr Ser
180
<210> 57
<211> 106
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54、p30、CD2v、p12蛋白
<400> 57
Ala Thr Thr Ala Ser Val Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr
1 5 10 15
Asn Arg Pro Ala Thr Gly Gly Gly Ser Glu Thr Asn Glu Cys Thr Ser
20 25 30
Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser Ser Glu Val Pro Lys
35 40 45
Asp Gly Gly Gly Ser Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr
50 55 60
Leu Asn Ile Asn Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu
65 70 75 80
Glu Tyr Asn Trp Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Asn
100 105
<210> 58
<211> 128
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒p54、p30、CD2v、p12蛋白
<400> 58
Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ser Val Gly Lys Pro Val Thr
20 25 30
Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala Thr Asn Lys Pro Val Thr Asp
35 40 45
Asn Pro Val Thr Gly Gly Gly Ser Thr Pro Leu Lys Glu Glu Glu Lys
50 55 60
Glu Val Val Arg Gly Gly Gly Ser Lys His Val Glu Glu Ile Glu Ser
65 70 75 80
Pro Pro Pro Glu Ser Asn Glu Glu Glu Gln Cys Gln His Asp Asp Thr
85 90 95
Thr Ser Ile His Glu Pro Ser Pro Arg Glu Pro Leu Leu Pro Lys Pro
100 105 110
Tyr Ser Arg Tyr Gln Tyr Gly Gly Gly Ser Lys Cys Ser Lys Ala Glu
115 120 125
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> 白喉毒素
<400> 59
Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro
1 5 10 15
<210> 60
<211> 19
<212> PRT
<213> 白喉毒素
<400> 60
Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala
1 5 10 15
Gln Val Ile
<210> 61
<211> 20
<212> PRT
<213> 白喉毒素
<400> 61
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
1 5 10 15
Ser Leu Met Val
20
<210> 62
<211> 20
<212> PRT
<213> 白喉毒素
<400> 62
Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu
1 5 10 15
Val Gly Glu Leu
20
<210> 63
<211> 20
<212> PRT
<213> 白喉毒素
<400> 63
Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn
1 5 10 15
Leu Phe Gln Val
20
<210> 64
<211> 20
<212> PRT
<213> 白喉毒素
<400> 64
Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ala
20
<210> 65
<211> 20
<212> PRT
<213> 白喉毒素
<400> 65
Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser
1 5 10 15
Lys Thr His Ile
20
<210> 66
<211> 14
<212> PRT
<213> 破伤风类毒素
<400> 66
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Phe Glu
1 5 10
<210> 67
<211> 14
<212> PRT
<213> 破伤风类毒素
<400> 67
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu
1 5 10
<210> 68
<211> 15
<212> PRT
<213> 破伤风类毒素
<400> 68
Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile
1 5 10 15
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 破伤风类毒素
<400> 69
Val Asn Asn Glu Ser Ser Glu
1 5
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> 破伤风类毒素
<400> 70
Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn Glu Ser Ser
1 5 10 15
Glu
<210> 71
<211> 6
<212> PRT
<213> 破伤风类毒素
<400> 71
Pro Asn Arg Asp Ile Leu
1 5
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 破伤风类毒素
<400> 72
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
1 5
<210> 73
<211> 6
<212> PRT
<213> 破伤风类毒素
<400> 73
Ser Tyr Phe Pro Ser Val
1 5
<210> 74
<211> 20
<212> PRT
<213> 破伤风类毒素
<400> 74
Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile Tyr Ser Tyr
1 5 10 15
Phe Pro Ser Val
20
<210> 75
<211> 20
<212> PRT
<213> 破伤风类毒素
<400> 75
Ile Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro
1 5 10 15
Ala Leu Asn Ile
20

Claims (13)

1.一种非洲猪瘟病毒嵌合蛋白，其特征在于，所述嵌合蛋白包含：
1)非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅰ，所述结构域Ⅰ氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
2)非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅱ，所述结构域Ⅱ氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
3)非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅲ，所述结构域Ⅲ氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；以及
4)非洲猪瘟病毒抗原性蛋白；
5)非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅰ位于嵌合蛋白的N端，结构域Ⅲ位于嵌合蛋白的C端，结构域Ⅱ位于结构域Ⅰ与结构域Ⅲ之间，非洲猪瘟病毒抗原性蛋白位于非洲猪瘟病毒p72结构域Ⅰ与结构域Ⅱ之间和/或结构域Ⅱ与结构域Ⅲ之间任意位置。
2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒抗原性蛋白为p54、p30、CD2v和p12蛋白至少一种片段；
3.根据权利要求2所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白，其特征在于，所述p54蛋白片段选自如SEQ ID NO.5、6、7、8、9、10、11、12所示任意一个或多个；
所述p30蛋白片段选自如SEQ ID NO.13、14、15、16、17、19所示任意一个或多个；
所述CD2v蛋白片段选自如SEQ ID NO.20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30所示任意一个或多个；
所述p12蛋白片段选自如SEQ ID NO.31、32、33、34、35、36、37所示任意一个或多个。
4.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒嵌合蛋白还包含T细胞免疫激活表位，所述T细胞免疫激活表位包括但不限于霍乱类毒素T细胞表位和/或白喉毒素T细胞表位和/或破伤风类毒素T细胞表位和/或大肠杆菌不耐热肠毒素T细胞表位。
5.根据权利要求4所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白，其特征在于，所述白喉毒素T细胞表位选自如SEQ ID NO.59、60、61、62、63、64、65所示任意一个或多个；
所述破伤风类毒素T细胞表位选自如SEQ ID NO.66、67、68、69、70、71、72、73、74、75所示任意一个或多个。
6.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒嵌合蛋白还包括柔性连接肽，所述柔性连接肽的长度为4-10个氨基酸序列；优选地，所述柔性连接肽为GGGS。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
1)人工合成所述非洲猪瘟病毒嵌合蛋白基因，通过基因工程手段连接至克隆载体即嵌合蛋白的克隆载体；
2)将构建的所述嵌合蛋白的克隆载体以及表达载体通过酶切，构建包含嵌合蛋白基因的表达载体即嵌合蛋白的表达载体；
3)将所述嵌合蛋白的表达载体导入受体菌进行诱导表达，并对表达的嵌合蛋白进行鉴定以获得非洲猪瘟病毒嵌合蛋白。
8.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1-6任一项所述的非洲猪瘟病毒嵌合蛋白。
9.一种表达载体，所述表达载体含有权利要求8所述多核苷酸序列。
10.一种非洲猪瘟病毒疫苗组合物，包括免疫量的权利要求1-6任一项所述非洲猪瘟病毒嵌合蛋白及药学上可接受的载体。
11.根据权利要求10所述的非洲猪瘟病毒疫苗组合物，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒嵌合蛋白含量为100-300μg/ml；优选地，所述非洲猪瘟病毒嵌合蛋白含量为200μg/ml。
12.根据权利要求10所述的非洲猪瘟病毒疫苗组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)矿物油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为QuilA、QS-21、GPI-0100；
所述佐剂含量为5％-60％V/V，优选从30％-60％V/V，更优选50％V/V。
13.根据权利要求10-12任一项所述的的非洲猪瘟病毒疫苗组合物在制备预防非洲猪瘟的药物中的应用。
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