CN113384533A - 负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纳米材料的合成领域，更具体地合成了铁卟啉纳米材料，并利用丝素蛋白溶液绿色地制备了由丝素蛋白包裹的铁卟啉纳米材料。此外，利用丝素蛋白和铁卟啉的性质，上载了缺氧型治疗药物替拉扎明。具体包括以下步骤：（1）从家蚕蚕茧中提取再生丝素蛋白；（2）合成铁卟啉纳米材料，与丝素蛋白溶液作用后，合成丝素铁卟啉纳米材料；（3）通过上载替拉扎明，制备出负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料；（4）通过实验验证纳米材料的成功合成极其特性，探究该纳米材料产生不同种类ROS的能力，并且在此过程中氧气消耗的加剧，使得缺氧药物的疗效增加。本发明在生物医学领域及社会经济的其他领域都有着很大的应用潜力。

Description

负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料的制备
技术领域
本发明涉及纳米材料的合成领域，更具体地涉及具有化学治疗，光动力治疗和化学动力治疗的联合疗法的负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料的合成方法。
背景技术
蚕丝是人类最早利用的天然动物蛋白质之一，家蚕在我国已有数千年的养殖历史，蚕丝此类的天然纤维在纺织行业起到领头的作用。伴随着科学技术的发展，蚕丝的性能受到了科学家的广泛关注，特别是在蛋白质工程学模块。蚕丝作为高纯度结晶性蛋白质因其良好的生物相容性和透气透氧性等，在生物材料、精细化工等方面逐渐开始应用。
丝素蛋白（Fibroin）和丝胶蛋白（Sericin）是构成蚕丝的两种组件，丝素蛋白则是在丝胶蛋白的内部，占主要比重，约为整体重量的70%。丝素蛋白由3种主要成分组成，H链、L链和P25蛋白，H链和L链以二硫键相互结合，形成H链-L链亚单位，P25蛋白与H链-L链亚单位之间以非共价键的形式构成丝素蛋白复合体。丝素蛋白分子链主要包括18种氨基酸，其中甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、和丝氨酸（Ser）起主导作用，占整个成分的80%。由甘-丙-丝重复序列构成的多肽成为丝素蛋白结晶的主要成分。酪氨酸（Tyr）、缬氨酸（Val）、色氨酸（Trp）及其他氨基酸多出现在非结晶区。研究发现，以高浓度盐溶解、透析的方法获得的再生丝素蛋白最初以无规则卷曲结构为主，在外界因素如剪切力、温度等影响下逐渐向β-折叠结构转变，自组装成稳定结构。
近年来，金属有机骨架(MOFs)已被开发为治疗和显像剂的纳米载体。在研究充分的氧化石墨烯中，铁基氧化石墨烯因其无毒性质，被认为是在体内外生物应用中的理想物质。其中，铁卟啉MOFs具有独特的优势，可以作为光敏剂用于光动力治疗，并且其中的铁粒子能在肿瘤微环境中产生活性氧用于化学动力治疗。
替拉扎明（TPZ）是一种典型的缺氧药物。该药在有氧条件下仅具有极低的细胞毒性，但是在缺氧条件下的细胞毒性会提升约300倍。它的原理是根据在缺氧条件下的单电子还原反应，TPZ被还原为一种自由基中间体，并通过脱水反应进一步转化为具有高细胞毒性的苯并三嗪基（BTZ）。产生的BTZ可引起细胞中DNA的断裂，进而诱导细胞死亡。如果能够选择性地改善患者的肿瘤缺氧，就能最大程度的发挥药物的治疗效果。因此，借助光动力的氧气消耗和丝素蛋白的载药能力，能最大程度的发挥药物的治疗效果，该纳米材料是一种很有应用潜力的功能材料，具有进一步开发的价值。
发明内容
以丝素蛋白和铁卟啉为原料合成了一种负载替拉扎明的丝素铁卟啉多功能生物纳米材料，该材料具有良好的生物相容性，产生多种活性氧的同时可以改变肿瘤缺氧环境，从而引发药物治疗。而且该材料的制备过程非常简便，反应条件也特别温和。
本发明的技术方案具体如下：
负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料的制备，包含以下步骤：
（1）将蚕茧中的蚕蛹取出，其它部分切成蚕茧碎片；
（2）将蚕茧碎片加入到质量浓度为0.5%的碳酸钠溶液中，加热煮沸并持续30 min，得到黄色胶状的丝胶蛋白溶液和棉花状的膨松的丝素蛋白固体，利用二次水反复冲洗，将丝素蛋白固体表面的丝胶蛋白除去，于37 oC的鼓风干燥箱中干燥过夜，得到丝素蛋白；
（3）将步骤（2）所得到的丝素蛋白浸没于氯化钙、乙醇和水的混合溶液中，并置于90 oC水浴锅中持续加热2 h，随后用抽滤装置将得到的丝素蛋白溶液中的杂质去除，并在截留量为3500 kDa的透析袋中流水透析三天，去除体系中的钙离子和乙醇，最终获得澄清的丝素蛋白溶液，保存在4oC的冰箱中备用；
（4）将六水合氯化铁和中-四（4-羧基苯基）卟吩溶于N,N-二甲基甲酰胺中，并加入一定量的冰乙酸搅拌2 h，再次加入一定体积的N,N-二甲基甲酰胺，所获得的溶液置于80oC的烘箱反应24 h后离心分离，并使用N,N-二甲基甲酰胺、甲醇和二次水洗涤数次沉淀后得到铁卟啉，保存在4oC的冰箱中备用，所有反应均为暗反应；
（5）将步骤（4）中得到的铁卟啉分散于水相后加入EDC/NHS，并在室温下避光搅拌30 min，随后加入丝素蛋白溶液继续室温避光搅拌24 h，离心洗涤后获得丝素铁卟啉纳米材料，并保存于4oC冰箱；
（6）将步骤（5）得到的丝素铁卟啉纳米材料和替拉扎明分别分散于水相中，再加入到反应器皿室温避光搅拌24 h，离心洗涤后获得负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料。
进一步的，所述步骤（3）中氯化钙、乙醇和水的摩尔比为1:2:8。
进一步的，所述步骤（4）中六水合氯化铁与中-四（4-羧基苯基）卟吩的质量比为2:5，冰乙酸的质量分数为37%。
进一步的，所述步骤（5）中EDC/NHS质量比为4:3，加入的铁卟啉和丝素蛋白质量比为1:2。
进一步的，所述步骤（6）中丝素铁卟啉纳米材料和替拉扎明质量比为20:3。
本发明主要优点有：
产物生物安全性及生物相容性高，制备形成的纳米颗粒均一稳定。所形成的纳米材料具有产生不同种类活性氧的能力，药物递送能力以及肿瘤治疗能力，有很强的应用价值。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为本发明实施例1中负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料的透射扫描电镜图。
图2为本发明实施例1中负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料的热场发射扫描电镜图。
图3为本发明实施例1中负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料在不同溶液下的动态光散射水合粒径分布图（7天）。
图4为本发明实施例1中负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料的X射线光电子能谱图
图5为本发明实施例1中负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料的电子自旋共振测定活性氧的(a)形成和(b)种类图。
图6为本发明实施例1中负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料以不同浓度与不同细胞孵育24 h后的生物相容性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 制备负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料
（1）将蚕茧中的蚕蛹取出，其它部分切成1平方厘米左右的蚕茧碎片；将1 g左右的蚕茧碎片加入到质量浓度为0.5%的碳酸钠溶液中，并加热煮沸持续30 min，得到黄色胶状的丝胶蛋白溶液和棉花状的膨松固体（丝素蛋白），利用二次水反复冲洗，将丝素蛋白表面的丝胶蛋白除去，于37℃的鼓风干燥箱中干燥过夜
（2）将步骤（1）所得到的丝素蛋白浸没于氯化钙、乙醇和水（摩尔比为1：2：8）的混合溶液中，并置于90℃水浴锅中持续加热2 h，随后用抽滤装置将得到的丝素蛋白溶液中的杂质去除，并在截留量为3500 kDa的透析袋中流水透析三天，去除体系中的钙离子和乙醇，最终获得澄清的丝素蛋白溶液，保存在4℃的冰箱中备用；
（3）将2 ml浓度为2 mg·mL-1六水合氯化铁和2 ml浓度为5 mg·mL-1中-四（4-羧基苯基）卟吩溶于N,N-二甲基甲酰胺，并加入0.4 mL 质量分数为37%的冰乙酸后搅拌2 h，再加入10 mL N,N-二甲基甲酰胺，所获得的溶液置于80oC的烘箱反应24 h，并使用N,N-二甲基甲酰胺、甲醇和二次水洗涤数次沉淀后得到铁卟啉，保存在4℃的冰箱中备用，所有反应均为暗反应；
（4）将得到的铁卟啉(5 mL, 2 mg·mL-1)分散于水相，然后加入总体积为1 mL的EDC(4 mg·mL-1)/NHS(3 mg mL-1)后在室温下避光搅拌30 min。随后加入丝素蛋白溶液(5mL, 4 mg·mL-1)继续室温避光搅拌24 h，离心洗涤后获得丝素铁卟啉纳米材料，并保存于4oC冰箱；
（5）将得到的丝素铁卟啉纳米材料(5 mL, 4 mg·mL-1)和替拉扎明 (2 mL, 1.5mg·mL-1)分别分散于水相中，再加入到反应器皿室温避光搅拌24 h，离心洗涤后获得负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料。。
图1和图2为负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料的透射电镜图和热场发射图，可以看出终产物纳米粒子的平均长度在210 nm左右，宽度为84 nm左右。图3的纳米粒子在不同溶液环境下的水合粒径图可以看出该纳米粒子的粒径稳定性较好。图4的光电子能谱图证明了材料的成功合成。图5(a)和(b)的电子自旋共振图谱可以看出成功产生了不同种类的活性氧。图6的细胞实验表明在正常细胞中纳米粒子的生物相容性较好。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料的制备，其特征在于，包含以下步骤：
（1）将蚕茧中的蚕蛹取出，其它部分切成蚕茧碎片；
（2）将蚕茧碎片加入到质量浓度为0.5%的碳酸钠溶液中，加热煮沸并持续30 min，得到黄色胶状的丝胶蛋白溶液和棉花状的膨松的丝素蛋白固体，利用二次水反复冲洗，将丝素蛋白固体表面的丝胶蛋白除去，于37 oC的鼓风干燥箱中干燥过夜，得到丝素蛋白；
（3）将步骤（2）所得到的丝素蛋白浸没于氯化钙、乙醇和水的混合溶液中，并置于90 oC水浴锅中持续加热2 h，随后用抽滤装置将得到的丝素蛋白溶液中的杂质去除，并在截留量为3500 kDa的透析袋中流水透析三天，去除体系中的钙离子和乙醇，最终获得澄清的丝素蛋白溶液，保存在4oC的冰箱中备用；
（4）将六水合氯化铁和中-四（4-羧基苯基）卟吩溶于N,N-二甲基甲酰胺中，并加入一定量的冰乙酸搅拌2 h，再次加入一定体积的N,N-二甲基甲酰胺，所获得的溶液置于80oC的烘箱反应24 h后离心分离，并使用N,N-二甲基甲酰胺、甲醇和二次水洗涤数次沉淀后得到铁卟啉，保存在4oC的冰箱中备用，所有反应均为暗反应；
（5）将步骤（4）中得到的铁卟啉分散于水相后加入EDC/NHS，并在室温下避光搅拌30min，随后加入丝素蛋白溶液继续室温避光搅拌24 h，离心洗涤后获得丝素铁卟啉纳米材料，并保存于4oC冰箱；
（6）将步骤（5）得到的丝素铁卟啉纳米材料和替拉扎明分别分散于水相中，再加入到反应器皿室温避光搅拌24 h，离心洗涤后获得负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料。
2.根据权利要求1所述的负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料的制备，其特征在于：所述步骤（3）中氯化钙、乙醇和水的摩尔比为1:2:8。
3.根据权利要求1所述的负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料的制备，其特征在于：所述步骤（4）中六水合氯化铁与中-四（4-羧基苯基）卟吩的质量比为2:5，冰乙酸的质量分数为37%。
4.根据权利要求1所述的负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料的制备，其特征在于：所述步骤（5）中EDC/NHS质量比为4:3，加入的铁卟啉和丝素蛋白质量比为1:2。
5.根据权利要求1所述的负载替拉扎明的丝素铁卟啉纳米材料的制备，其特征在于：所述步骤（6）中丝素铁卟啉纳米材料和替拉扎明质量比为20:3。
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