CN112245579A - 一种缓解肿瘤乏氧的光动力治疗剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种缓解肿瘤乏氧的光动力治疗剂及其制备方法和应用，属于医药技术领域。该光动力治疗剂为负载有O2的金属‑有机骨架纳米复合材料；所述金属‑有机骨架纳米复合材料为金属‑有机骨架纳米颗粒Zr‑TCPP(Fe)，在纳米颗粒Zr‑TCPP(Fe)的纳米骨架内修饰有全氟辛酸，同时在纳米颗粒Zr‑TCPP(Fe)的孔道内还吸附有葡萄糖氧化酶GOx。本发明采用向肿瘤组织递送O2同时设计能催化肿瘤内源性产生O2的药物递送体系可以显著改善乏氧环境，增强光动力治疗效果。此外，本发明的治疗剂合成步骤比较简单，且产率较高；由于合成方法简单，成本较低，因而适合大规模生产。

Description

一种缓解肿瘤乏氧的光动力治疗剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种缓解肿瘤乏氧的光动力治疗剂及其制备方法和应用。
背景技术
众所周知，恶性肿瘤严重危害人类生命健康，其中，实体肿瘤占临床恶性肿瘤85%以上，而乏氧是实体肿瘤的重要特征之一。由于肿瘤乏氧区的存在，降低了肿瘤对放疗、化疗的敏感性，导致肿瘤新生血管及乏氧诱导因子的形成，诱发肿瘤细胞的复发、侵袭和转移，成为肿瘤难以治愈的根本原因。肿瘤乏氧区的特征是氧气含量不足，而现有肿瘤治疗技术（放疗、光动力治疗）的治疗效果均强烈依赖肿瘤组织中的氧含量。因此，若能通过设计功能纳米材料，来增加肿瘤乏氧区的氧含量，将会显著增强放疗和光动力治疗（PDT）对乏氧肿瘤的治疗效果。因此，针对乏氧肿瘤的高效治疗是国际医学界公认的实现肿瘤彻底治愈必须克服的重要难题。
PDT是指光敏剂在接受一定波长的激光照射之后产生大量活性氧来实现对癌细胞的氧化损伤，凭借其可控性强、副作用低等优势被广泛应用到癌症治疗等领域。这种疗法依赖于局部的O2分子来产生高细胞毒性的1O2，但实体肿瘤缺氧微环境会影响光动力疗法的治疗效果。如果能在光动力治疗过程中增加O2浓度，将大大提高光动力治疗效果。
因此，向肿瘤组织递送O2或设计能内源性产生O2的药物递送体系可以显著改善乏氧环境，使肿瘤细胞恢复对药物的敏感性，提高肿瘤治疗效果，同时也可以增强光动力治疗效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种内源和外源双管齐下增氧且合成方法简单的缓解肿瘤乏氧的光动力治疗剂。
本发明的另一目的是提供上述光动力治疗剂的制备方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种缓解肿瘤乏氧的光动力治疗剂，所述光动力治疗剂为负载有O2的金属-有机骨架纳米复合材料；
所述金属-有机骨架纳米复合材料为金属-有机骨架纳米颗粒Zr-TCPP(Fe)，在纳米颗粒Zr-TCPP(Fe)的纳米骨架内修饰有全氟辛酸，同时在纳米颗粒Zr-TCPP(Fe)的孔道内还吸附有葡萄糖氧化酶GOx。
上述光动力治疗剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，采用高温溶剂热法制备卟啉酯；
步骤2，采用边酸化卟啉酯边嵌铁的方法得到嵌铁卟啉TCPP(Fe)；
步骤3，采用高温溶剂热法制备金属-有机骨架纳米颗粒Zr-TCPP(Fe)；
步骤4，采用一锅酯化的方法将全氟辛酸修饰到Zr-TCPP(Fe)的纳米骨架内；
步骤5，将修饰有全氟辛酸的Zr-TCPP(Fe)分散在水中，再加入葡萄糖氧化酶GOx，经搅拌后得到金属-有机骨架纳米复合材料；
步骤6，将金属-有机骨架纳米复合材料分散在水中，在高压密封条件下通入氧气，得到所述光动力治疗剂。
进一步地，步骤1的过程为：将吡啶、对甲酰基苯甲酸甲酯和丙酸混合，混合物经加热反应，制得卟啉酯。
进一步地，步骤2的过程为：将卟啉酯、FeCl3·6H2O和N-N二甲基甲酰胺混合加热反应，反应物经酸化后制得嵌铁卟啉TCPP(Fe)。
进一步地，步骤3的过程为：将TCPP(Fe)、ZrOCl2·8H2O、苯甲酸和DMF，然后加入水，将混合物加热反应，制得金属-有机骨架纳米颗粒Zr-TCPP(Fe)。
进一步地，步骤4的过程为：将Zr-TCPP(Fe)、全氟辛酸加到DMF中，将混合液进行反应，制得修饰有全氟辛酸的Zr-TCPP(Fe)@F。
进一步地，步骤5的过程为：将修饰有全氟辛酸的Zr-TCPP(Fe)@F和GOx加到水中，将混合液常温搅拌，制得修饰GOx的Zr-TCPP(Fe)@F@GOx。
上述光动力治疗剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
有益效果：本发明通过将光敏剂卟啉(TCPP)作为MOFs材料的有机配体，以锆(Zr)作为金属源，且Zr上的八个末端-OH基团可用于全氟烷烃链的后修饰，构建得到可在660 nm激光响应的光动力治疗剂。本发明的治疗剂具有缓解肿瘤乏氧的特性，通过外界激光控制实现光动力治疗。采用上述光动力治疗剂治疗肿瘤是一种绿色的治疗方式，本发明采用向肿瘤组织递送O2同时设计能催化肿瘤内源性产生O2的药物递送体系可以显著改善乏氧环境，增强光动力治疗效果。此外，本发明的治疗剂合成步骤比较简单，且产率较高；进一步地，由于合成方法简单，成本较低，因而适合大规模生产。
附图说明
图1为实施例1中Zr-TCPP(Fe)纳米材料的SEM照片(a)、Zeta电位(b)、红外光谱(c)和紫外-可见-近红外光谱(d)。
图2为实施例1的Zr-TCPP(Fe)@全氟辛酸(F)+O2在水中溶解氧释放的测定(a)和其溶解氧释放量的统计(b)；Zr-TCPP(Fe)@F在水中溶解氧释放的测定(c)和其溶解氧释放量的统计(d)。
图3为实施例1的Zr-TCPP(Fe)在不同浓度H2O2(pH = 5)环境下溶解氧释放的测定(a)和其溶解氧释放量的统计(b)。
图4为实施例1的Zr-TCPP(Fe)@GOx在不同浓度GO环境中溶解氧释放的测定(a)和其溶解氧释放量的统计(b)。
图5为实施例1的Zr-TCPP(Fe)@GOx、Zr-TCPP(Fe)@F+O2和 Zr-TCPP@GOx在40µM GO环境中溶解氧释放的测定(a)和其溶解氧释放量的统计(b)。
图6为实施例1中不同浓度的Zr-TCPP、Zr-TCPP(Fe)和Zr-TCPP(Fe)@F的细胞毒性。
图7为实施例1中不同浓度的Zr-TCPP(Fe)、Zr-TCPP(Fe)-660nm、Zr-TCPP(Fe)@F+O2、Zr-TCPP(Fe)@F+O2-660nm、Zr-TCPP(Fe)@F@GOx+O2和Zr-TCPP(Fe)@F@GOx+O2-660nm的细胞活性。
具体实施方式
为详细说明本发明的结构特征、技术手段以及所实现的目的及效果，以下结合实施方式并配合附图进行详细说明。
本发明提供了一种缓解肿瘤乏氧的光动力治疗剂，包括具有梭形结构的Zr-TCPP(Fe)纳米颗粒和骨架内修饰的全氟辛酸以及为了催化细胞内葡萄糖产生H2O2所负载的GOx。
具体地，所述Zr-TCPP(Fe)纳米颗粒是直径约为100 nm的梭形结构。
上述光动力治疗剂的制备方法包括以下步骤：
步骤1，制备卟啉酯和四(4-羧基苯基)卟啉(H2TCPP)。
(1) 采用高温溶剂热法制备卟啉酯
将6g的吡啶、14g的对甲酰基苯甲酸甲酯、200 mL的丙酸加到500 mL的圆底烧瓶中，短暂超声处理后，将混合物在140 °C冷凝回流12h。冷却至室温后放入冰箱6h，通过抽滤收集产物，用乙醇边搅拌边抽滤收集产物，再加少量四氢呋喃(THF)抽滤洗涤。最后在60°C真空干燥12h得到卟啉酯。
(2) 酸化卟啉酯得到四(4-羧基苯基)卟啉
将2g合成的卟啉酯、60 mL的THF、60 mL的甲醇和配好的氢氧化钾(KOH)溶液(6.8g KOH加60mL的水)混合，将混合物在85 °C冷凝回流12h。冷却至室温后，用1M (mol/L)的HCl溶液调节产物的pH至6~7，然后用大量的水抽滤洗涤，最后在90°C真空干燥12h得到四(4-羧基苯基)卟啉(H2TCPP)。
步骤2，采用边酸化卟啉酯边嵌铁的方法制备嵌铁卟啉（TCPP(Fe)）。
将854mg的卟啉酯、3.46g的FeCl3·6H2O和100mL的N-N二甲基甲酰胺(DMF)加到250mL的圆底烧瓶中，超声分散后将混合液在160 °C冷凝回流6h。冷却至室温，用水抽滤洗涤，将所得固体溶解于三氯甲烷(CHCl3)中。然后用1M的HCl多次萃取，直至上清液澄清，每次萃取均保留下层溶剂，再用水萃取两次。将有机层液体倒入干燥烧杯内，加适量无水硫酸钠干燥约30分钟。用漏斗抽滤并用CHCl3洗涤，直至硫酸钠至白色。将抽滤后的液体转移至称重后的干燥圆底烧瓶内，用旋转蒸发仪在40°C旋蒸（去除溶剂CHCl3），旋蒸结束后称重并减去瓶重，得到产物的质量用于计算下一步所需KOH的量(比例为：0.75g产物/2.63gKOH)。下一步是酸解，向上步的烧瓶内加入50mL的THF和50mL甲醇，再加入配好的KOH（根据上一步计算得出），将混合液在85 °C冷凝回流12h。冷却后在45 °C旋蒸（去除THF和甲醇），得到的产物加水溶解，抽滤后保留滤液，用1M的HCl调节滤液pH至3。最后用水抽滤洗涤后放入90°C真空干燥箱中干燥12h得到产物嵌铁卟啉。
步骤3，采用高温溶剂热法制备Zr-TCPP(Fe)纳米颗粒。
将10mg的TCPP(Fe)、6.0 mg的ZrOCl2·8H2O、280 mg苯甲酸和10 mL的DMF加到50mL的圆底烧瓶中，超声分散，在圆底烧瓶中加入300 µL的水（最终含1.5% v/v的水）。短暂超声处理后，将混合物在90 °C加热5h。最后，通过离心收集产物，用DMF离心洗涤3次，再分散在1mL DMF中以进一步使用。
制备Zr-TCPP的方法同制备Zr-TCPP(Fe)的方法类似，仅把原料TCPP(Fe)改成H2TCPP即可。
所述ZrOCl2·8H2O和苯甲酸皆为常用的化学原料，可直接从试剂网上订购。
所述反应的最佳温度为90 °C，反应时间为5 h。得到的Zr-TCPP(Fe)纳米颗粒直径约为100 nm。
步骤4
(1) 一锅酯化的方法将全氟辛酸修饰到Zr-TCPP(Fe)骨架内。
称取10 mg的Zr-TCPP(Fe)、20mg全氟辛酸加入到10mL的DMF溶剂中，超声分散后，将上述得到溶液在60 °C油浴条件下密封磁力搅拌24 h。待反应结束后，自然冷却至室温，离心收集固体，在新鲜的热DMF中浸泡2 h，分别用DMF、丙酮和无水乙醇离心洗涤1次，得到的固体产物在120 °C的真空干燥箱干燥12 h。
(3) 采用常温搅拌的方法将GOx吸附到步骤2得到的纳米颗粒孔道内。
将4 mg的Zr-TCPP(Fe)@F分散在10mL水中，加入4 mg的GOx室温磁力搅拌过夜，离心收集并用水洗涤3次得到Zr-TCPP(Fe)@F@GOx，最后将产物分散在水中。
制备Zr-TCPP(Fe)@GOx的方法同制备Zr-TCPP(Fe)@F@GOx的方法类似，仅把反应物Zr-TCPP(Fe)@F改成Zr-TCPP(Fe)即可。
制备Zr-TCPP@GOx的方法同制备Zr-TCPP(Fe)@F@GOx的方法类似，仅把反应物Zr-TCPP(Fe)@F改成Zr-TCPP即可。
步骤5，用高压反应釜通O2使纳米复合材料载氧。
将Zr-TCPP(Fe)@F@GOx分散在水中，高压釜密封，磁力搅拌，加载O2气体，常温搅拌48 h后，得到产物Zr-TCPP(Fe)@F@GOx+O2离心并用水洗涤2次。
制备Zr-TCPP(Fe)@F+O2的方法同制备Zr-TCPP(Fe)@F@GOx+O2的方法类似，仅把反应物Zr-TCPP(Fe)@F@GOx改成Zr-TCPP(Fe)@F即可。
上述制备方法得到的光动力治疗剂，包括具有梭形结构的Zr-TCPP(Fe)纳米颗粒和骨架内修饰的全氟辛酸以及为了催化细胞内葡萄糖产生H2O2所负载的GOx。
所述Zr-TCPP(Fe)纳米颗粒是直径约为100 nm，且骨架内引入全氟辛酸和GOx功能化修饰。
本发明的光动力治疗剂具有缓解肿瘤乏氧的功能，本发明的Zr-TCPP(Fe)@F具有高氧溶解度适合用作氧传递载体缓解肿瘤乏氧。所述光动力治疗剂纳米材料含有光敏剂TCPP可在O2存在和660nm激光光照的条件下产生1O2，实现光动力治疗。GOx可以与细胞内的GO和O2反应生成H2O2和葡萄糖酸，增大细胞内H2O2的浓度，同时MOFs含有的Fe (Ⅲ)可以催化H2O2分解产生O2，通过内源性产氧增大细胞内O2浓度。同时可以切断癌细胞的营养来源，从而抑制癌细胞的增殖。因此，本发明的光动力治疗剂实现了缓解肿瘤乏氧以及控制1O2在细胞内的产生，同时实现肿瘤光动力治疗。
上述制备得到的缓解肿瘤乏氧光动力治疗剂能够作为治疗肿瘤的制剂的应用。
所述的治疗肿瘤的制剂为所述光动力治疗剂在所述的660nm激光光照下的光动力治疗。
可以理解的，所述光动力治疗能够抑制肿瘤细胞生长并杀死癌细胞，因此，本发明的光动力治疗剂是一种高效、低毒、绿色的肿瘤治疗方式。
本发明的肿瘤光动力治疗剂的制备方法，其合成原料价格低廉且制备工艺简单、易于大规模生产。此外，利用本发明制备方法得到的光动力治疗剂具有良好的单分散性和稳定性、良好的生物相容性以及高的O2气体负载量和具有光动力可控的1O2释放。
下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
（1）制备卟啉酯
将6g的吡啶、14g的对甲酰基苯甲酸甲酯、200 mL的丙酸加到500 mL的圆底烧瓶中，短暂超声处理后，将混合物在140 °C冷凝回流12h，冷却至室温后放入冰箱6h，通过抽滤收集产物，用乙醇离心洗涤产物，边搅拌边抽滤通过离心收集产物，再加少量四氢呋喃(THF)抽滤洗涤。最后在60°C真空干燥12h得到卟啉酯。
（2）制备四(4-羧基苯基)卟啉
将2g合成的卟啉酯、60 mL的THF、60 mL的甲醇和配好的氢氧化钾(KOH)溶液(6.8g KOH加60mL的水)，将混合物在85 °C冷凝回流12h。冷却至室温后，用1M (mol/L)的HCl溶液调节产物的pH至6~7，然后用大量水边抽滤洗涤，最后在90°C真空干燥12h得到四(4-羧基苯基)卟啉。
（3）制备嵌铁卟啉 TCPP(Fe)
将854mg的卟啉酯、3.46g的FeCl3·6H2O和100mL的DMF加到250mL的圆底烧瓶中，超声分散后将混合液在160 °C冷凝回流6h。冷却至室温，用水抽滤洗涤，将所得固体溶解于三氯甲烷(CHCl3)中。然后用1M的HCl多次萃取，直至上清液澄清，每次萃取均保留下层溶剂，再用水萃取两次。将有机层液体倒入干燥烧杯内，加适量无水硫酸钠干燥约30分钟。用漏斗抽滤并用CHCl3洗涤，直至硫酸钠至白色。将抽滤后的液体转移至称重后的干燥圆底烧瓶内，用旋转蒸发仪在40°C旋蒸（去除溶剂CHCl3），旋蒸结束后称重并减去瓶重，得到产物的质量用于计算下一步所需KOH的量(比例为：0.75g产物/2.63gKOH)。下一步是酸解，向上步的烧瓶内加入50mL的THF和50mL甲醇，再加入配好的KOH（根据上一步计算得出），将混合液在85°C冷凝回流12h。冷却后在45 °C旋蒸（去除THF和甲醇），得到的产物加水溶解，抽滤后保留滤液，用1M的HCl调节滤液pH至3。最后用水抽滤洗涤后放入90°C真空干燥箱中干燥12h得到产物嵌铁卟啉。
（4）Zr-TCPP(Fe)纳米颗粒。
将10mg的TCPP(Fe)、6.0mg的ZrOCl2·8H2O、280mg苯甲酸和10mL的DMF加到50mL 的圆底烧瓶中，超声分散，在圆底烧瓶中加入300µL的水（最终含1.5% v/v的水）。短暂超声处理后，将混合物在90oC加热5h。最后，通过离心收集产物，用DMF离心洗涤3次，并再分散在1mL DMF中以进一步使用。
制备Zr-TCPP的方法同制备Zr-TCPP(Fe)的方法类似，仅把原料TCPP(Fe)改成H2TCPP即可。
（5）制备全氟辛酸修饰的Zr-TCPP(Fe)纳米颗粒Zr-TCPP(Fe)@F。
称取10mg的Zr-TCPP(Fe)、20mg全氟辛酸加入到10mL的DMF溶剂中，超声分散后，将上述得到溶液在60oC油浴条件下密封磁力搅拌24h。待反应结束后，自然冷却至室温，离心收集固体，在新鲜的热DMF中浸泡2h，分别加入DMF、丙酮和无水乙醇离心洗涤1次，得到的固体产物在120oC的真空干燥箱干燥12h。
（6）制备GOx孔道吸附的Zr-TCPP(Fe) @F@ GOx。
将所述4mg的Zr-TCPP(Fe)@F分散在10mL水中，加入4mg的GOx室温磁力搅拌过夜，离心收集并用水洗涤3次，最后产物分散在水中。
制备Zr-TCPP(Fe)@GOx的方法同制备Zr-TCPP(Fe)@F@GOx的方法类似，仅把反应物Zr-TCPP(Fe)@F改成Zr-TCPP(Fe)即可。
制备Zr-TCPP@GOx的方法同制备Zr-TCPP(Fe)@F@GOx的方法类似，仅把反应物Zr-TCPP(Fe)@F改成Zr-TCPP即可。
（7）制备载氧的光动力治疗剂Zr-TCPP(Fe)@F@GOx+O2。
将Zr-TCPP(Fe)@F@GOx分散在水中，高压釜密封，磁力搅拌，加载O2气体，常温搅拌48h后，产物离心并用水洗涤2次。
制备Zr-TCPP(Fe)@F+O2的方法同制备Zr-TCPP(Fe) @F@ GOx+O2的方法类似，仅把反应物Zr-TCPP(Fe)@F@GOx改成Zr-TCPP(Fe)@F即可。
性能测试：
1. Zr-TCPP(Fe)纳米颗粒的形貌测定
图1是实施例1制备的Zr-TCPP(Fe)纳米颗粒的SEM(a)、Zeta电位(b)、紫外-可见-近红外光谱(c)和红外光谱(d)。结果表明，图示(a)中能够观察到合成的Zr-TCPP(Fe)纳米颗粒直径为100±1nm，且分散均匀。图示(b)可以看出制备的Zr-TCPP(Fe)@F（MOF@PHF）及载氧后的材料（MOF@PHF+O2）比Zr-TCPP(Fe) 纳米颗粒的Zeta电位有提升且电位数值较大，说明其稳定性更好。图示(c)可以看出制备的Zr-TCPP(Fe)纳米颗粒在近紫外区区具有非常好的光吸收，可作为近紫外区响应的光动力治疗剂。图示(d)可以看出制备的TCPP(Fe)在1483 cm-1处出现C-H弯曲振动，在1000cm-1处出现Fe-N带，说明Fe成功嵌入到TCPP中。
2.测定Zr-TCPP(Fe)@F+O2和Zr-TCPP(Fe)@F在水中溶解氧的释放
将实施例1制备的Zr-TCPP(Fe)@F+O2和Zr-TCPP(Fe)@F配成浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL的水溶液，分别加入40mL的去离子水，用溶解氧测定仪每隔30秒记录溶液溶解氧浓度的变化，绘制成曲线，从而测定不同浓度下的溶解氧释放的差异。从图2(a)、(c)中可以看出随着Zr-TCPP(Fe)@F+O2的浓度增加，其溶解氧释放量也逐渐增加，而相同条件下Zr-TCPP(Fe)@F在水中溶解氧释放量基本不变。从图2(b)、(d)中可以清楚地看出相同条件下Zr-TCPP(Fe)@F+O2在水中溶解氧释放量要明显高于在Zr-TCPP(Fe)@F的环境下。
3. 测定Zr-TCPP(Fe)在不同浓度H2O2(pH = 5)环境下溶解氧释放
将实施例1制备的4mg/mL的Zr-TCPP(Fe)水溶液，分别加入40mL 的配成浓度分别为100、200、400、600µM的H2O2 (pH = 5)PBS溶液，用溶解氧测定仪每隔30秒记录溶液溶解氧浓度的变化，绘制成曲线，从而测定不同浓度H2O2下的溶解氧释放的差异。从图3(a)、(b)中可以看出相同条件下随着H2O2浓度的增加，Zr-TCPP(Fe)溶解氧释放量逐渐增加。
4. 测定Zr-TCPP(Fe)@GOx在不同浓度GO环境中溶解氧释放
将实施例1制备的4mg/mL 的Zr-TCPP(Fe)@GOx 水溶液，分别加入40mL 的配成浓度分别为0、50、20、40µM的GO(pH = 7.4)PBS溶液，用溶解氧测定仪每隔30秒记录溶液溶解氧浓度的变化，绘制成曲线，从而测定不同浓度GO下的溶解氧释放。从图4(a)、(b)中可以看出相同条件下随着GO浓度的增加，Zr-TCPP(Fe)@GOx溶解氧释放量逐渐增加。
5.测定Zr-TCPP(Fe)@Gox、Zr-TCPP(Fe)@F+O2和 Zr-TCPP@GOx在40µM GO环境中溶解氧释放
将实施例1制备的4mg/mL的Zr-TCPP(Fe)@Gox、 Zr-TCPP(Fe)@F+O2和Zr-TCPP@GOx 水溶液，分别加入40mL的40µM的GO(pH = 7.4)PBS溶液，用溶解氧测定仪每隔30秒记录溶液溶解氧浓度的变化，绘制成曲线，从而测定同一浓度的不同材料在40µM的GO环境下的溶解氧释放的差异。从图5(a)、(b)中可以看出相同条件下Zr-TCPP(Fe)@Gox溶解氧释放量最大。
6. 不同浓度的Zr-TCPP、Zr-TCPP(Fe)和Zr-TCPP(Fe)@F的细胞毒性（660nm 代表激光照射组）。
通过使用噻唑蓝(MTT)测定法测定Hela 细胞的细胞生存力。将细胞以104个/孔的密度接种到96孔细胞培养板中，并在5% CO2下于37 °C孵育12h。然后，将加药组以每孔50μL的Zr-TCPP、Zr-TCPP(Fe)和Zr-TCPP(Fe)@F分散在DMEM中，其浓度不同（5、10、20、40、80和160µg/mL）被添加到每个孔。将细胞在5% CO2下于37 °C再孵育24h。孵育后，去除旧培养基，并用PBS洗涤细胞孔以去除未摄取的颗粒，然后添加100µL新鲜培养基。然后向每个孔中加入10µL过滤灭菌的MTT试剂（PBS中5 mg/mL），并将板在37°C下孵育。再孵育4h后，除去培养基，并通过添加DMSO溶解沉淀的甲瓒晶体。使用酶标仪在450nm处测量每个孔中溶解的甲瓒晶体的吸收值。以未加药处理的细胞作为对照组，其细胞活性记为100%，计算出各浓度下的细胞存活率。所有样品均一式三份制备。
通过图6的细胞毒性的结果可以看出，以上三种材料有良好的生物相容性。
7. 不同浓度Zr-TCPP(Fe)、Zr-TCPP(Fe)-660nm 、Zr-TCPP(Fe)@F+O2 、Zr-TCPP(Fe)@F+O2-660nm 、Zr-TCPP(Fe)@F@GOx+O2和Zr-TCPP(Fe)@F@GOx+O2-660nm的细胞活性。
通过使用MTT 测定法测定Hela 细胞的细胞生存力。将细胞以104个/孔的密度接种到96孔细胞培养板中，并在5% CO2下于37 °C孵育12h。然后，将加药组以每孔50μL的Zr-TCPP(Fe)、Zr-TCPP(Fe)-660nm 、Zr-TCPP(Fe)@F+O2 、Zr-TCPP(Fe)@F+O2-660nm 、Zr-TCPP(Fe)@F@GOx+O2和Zr-TCPP(Fe)@F@GOx+O2-660nm分散在DMEM中，其浓度不同（5、10、20、40、80和160µg/mL）被添加到每个孔。加药后在5% CO2下于37 °C再孵育4h，随后用660nm激光器（1.0 W / cm-2）把每个加药的细胞孔各照射10min。将细胞在5% CO2下于37 °C再孵育24h。孵育后，去除旧培养基，并用PBS洗涤细胞孔以去除未摄取的颗粒，然后添加100µL新鲜培养基。然后向每个孔中加入10µL过滤灭菌的MTT试剂（PBS中5 mg/mL），并将板在37゜C下孵育。再孵育4h后，除去培养基，并通过添加DMSO溶解沉淀的甲瓒晶体。使用酶标仪在450nm处测量每个孔中溶解的甲瓒晶体的吸收值。以未加药处理的细胞作为对照组，其细胞活性记为100%，计算出各浓度下的细胞存活率。所有样品均一式三份制备。
通过图7的细胞毒性的结果可以看出，Zr-TCPP(Fe)和其激光对照组的细胞活性均在95%以上；Zr-TCPP(Fe)@F+O2和其激光对照组的细胞活性均低于Zr-TCPP(Fe)和其激光对照组的细胞活性，这是因为Zr-TCPP(Fe)@F+O2引入了一个能固定氧气的组分并从用材料载氧运输到肿瘤细胞内，从而缓解肿瘤乏氧使其活性降低，Zr-TCPP(Fe)@F+O2比其激光对照组的细胞活性稍高是因为在激光条件下产生了1O2可以使细胞活性降低；Zr-TCPP(Fe)@F@GOx+O2和其激光对照组的细胞活性均低于Zr-TCPP(Fe)@F+O2和其激光对照组的细胞活性，这是因为Zr-TCPP(Fe)@F@GOx+O2引入的GOx可以催化细胞内的葡萄糖产生过氧化氢(H2O2)，而H2O2又可以和材料中的Fe(Ⅲ)反应产生O2，增大细胞内氧气浓度，通过外加载氧和细胞内产氧双管齐下的方式缓解肿瘤乏氧并有利于光动力治疗的协同作用使细胞活性大大降低，Zr-TCPP(Fe)@F@GOx+O2比其激光对照组的细胞活性高是因为在激光条件下产生了1O2使细胞活性降低。
本发明提供的光动力治疗剂通过以Zr-TCPP(Fe)为载体并在其表面修饰全氟辛酸和GOx，并通过高压负载O2气体。首先所述的敏剂Zr-TCPP(Fe)是采用高温溶剂热的方法制备的，其具有单分散性和尺寸分布均一。其次通过一锅酯化的方法，将全氟辛酸修饰到Zr-TCPP(Fe) 表面，增加了其稳定性，以及可以作为固定O2气体的载体。再进一步表面修饰GOx，最终实现了缓解肿瘤乏氧的效果。再次，利用GOx对细胞内GO催化产生H2O2，增大细胞内H2O2 的浓度，同时MOFs含有的Fe (Ⅲ)可以催化H2O2分解产生O2，通过内源性产氧增大细胞内O2浓度。因此本发明的光动力治疗剂可在O2存在和660nm激光光照下的条件产生1O2，实现光动力治疗。

Claims (8)

1.一种缓解肿瘤乏氧的光动力治疗剂，其特征在于：所述光动力治疗剂为负载有O2的金属-有机骨架纳米复合材料；
所述金属-有机骨架纳米复合材料为金属-有机骨架纳米颗粒Zr-TCPP(Fe)，在纳米颗粒Zr-TCPP(Fe)的纳米骨架内修饰有全氟辛酸，同时在纳米颗粒Zr-TCPP(Fe)的孔道内还吸附有葡萄糖氧化酶GOx。
2.权利要求1所述的光动力治疗剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，采用高温溶剂热法制备卟啉酯；
步骤2，采用边酸化卟啉酯边嵌铁的方法得到嵌铁卟啉TCPP(Fe)；
步骤3，采用高温溶剂热法制备金属-有机骨架纳米颗粒Zr-TCPP(Fe)；
步骤4，采用一锅酯化的方法将全氟辛酸修饰到Zr-TCPP(Fe)的纳米骨架内；
步骤5，将修饰有全氟辛酸的Zr-TCPP(Fe)分散在水中，再加入葡萄糖氧化酶GOx，经搅拌后得到金属-有机骨架纳米复合材料；
步骤6，将金属-有机骨架纳米复合材料分散在水中，在高压密封条件下通入氧气，得到所述光动力治疗剂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1的过程为：将吡啶、对甲酰基苯甲酸甲酯和丙酸混合，混合物经加热反应，制得卟啉酯。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2的过程为：将卟啉酯、FeCl3·6H2O和N-N二甲基甲酰胺混合加热反应，反应物经酸化后制得嵌铁卟啉TCPP(Fe)。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤3的过程为：将TCPP(Fe)、ZrOCl2·8H2O、苯甲酸和DMF，然后加入水，将混合物加热反应，制得金属-有机骨架纳米颗粒Zr-TCPP(Fe)。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤4的过程为：将Zr-TCPP(Fe)、全氟辛酸加到DMF中，将混合液进行反应，制得修饰有全氟辛酸的Zr-TCPP(Fe)@F。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤5的过程为：将修饰有全氟辛酸的Zr-TCPP(Fe)@F和GOx加到水中，将混合液常温搅拌，制得修饰GOx的Zr-TCPP(Fe)@F@GOx。
8.权利要求1所述的光动力治疗剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
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