CN113367066B - 一种桑树体外再生的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及一种桑树体外再生的方法，属于植物生物技术领域。本发明采用不含分生组织的带叶柄叶片作为外植体，外植体在从植株上取下之前，预先对幼苗进行高浓度的TDZ处理，这样缩短了从外植体获得不定芽的时间，增加了不定芽诱导率，并且可重复性高，适应性广，为其他再生困难的物种提供了思路。
Description
技术领域
本发明涉及一种桑树再生的方法，属于植物生物技术领域。
背景技术
植物再生特别是木本植物的再生是遗传操作的屏障。桑树为多年生木本植物，目前仅少数桑树品种报道了有再生的可能，但效率低、可重复性差。
王茜龄等对川桑的再生做了探索，用到的外植体是含有腋芽的茎段，诱导出了丛生芽，但含有腋芽的茎段已经包含分生组织，不属于去分化之后的再分化过程。也有其他的桑树再生的报道，比如印度学者用桑树品种K2的叶片作为外植体，成功诱导出了不定芽，但国内学者至今无法重复该实验。目前报道的植物再生多为直接从继代培养基中取下外植体，再通过不同激素的配比对取下的外植体进行再生尝试。国内的王彦文等学者也对中国的桑树品种进行了再生，其结果是再生效率低，并且可重复性差。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种桑树再生的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种桑树体外再生的方法，将长势良好的桑树幼苗在含有高浓度的细胞分裂素的培养基中进行预处理4-7周，取下带叶柄的完全展开的叶片，切掉叶尖部分的三分之一，将叶柄端插入含高浓度的细胞分裂素的培养基中进行不定芽的诱导，3-7周后，出现不定芽时，立即移入含有低浓度细胞分裂素的抽长培养基中进行芽抽长，获得桑树不定芽。
作为优选的技术方案之一，所述含有高浓度的细胞分裂素的培养基包括MS培养基、8.0mg/L TDZ、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH为5.8。
作为优选的技术方案之一，所述抽长培养基包括MS培养基、0.5-1mg/L 6-BA、30g/L蔗糖和5-8g/L琼脂，pH为5.6-5.8。
作为优选的技术方案之一，所述MS培养基为MS524培养基或MS525培养基。
本发明涉及到的桑树资源包括四倍体川桑(2n＝4x＝28)和YH(2n＝6x＝42)，其中四倍体川桑是由野生二倍体川桑(2n＝2x＝14)经过秋水仙素加倍获得，YH材料为云7(2n＝8x＝56)与华桑(2n＝4x＝28)杂交获得的种子，种子经过消毒后获得无菌苗。
本发明的有益效果在于：
本发明采用不含分生组织的外植体，在从植株上取下之前，预先对幼苗进行高浓度的TDZ处理，这样缩短了从外植体获得不定芽的时间，大大增加了诱导率以及出芽率，并且可重复性高，适应性广。为其他再生困难的物种提供了思路。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为四倍体川桑诱导不定芽，A为未经过TDZ处理的四倍体川桑幼苗上取下的叶片诱导出的不定芽，B为经过TDZ处理28天的四倍体川桑幼苗上取下的叶片诱导的不定芽，C为将诱导出的不定芽置于抽长培养基中的生长情况。黑色标尺表示0.5cm。
图2为YH诱导出的不定芽。A为从TDZ处理45天的幼苗取下的叶片诱导出的不定芽置于抽长培养基中后的生长情况，B为抽长后的不定芽。黑色标尺表示1.0cm。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
将长势良好的桑树幼苗(四倍体川桑和YH)在含有高浓度的TDZ培养基中进行预处理4-7周，叶片由淡黄变为绿色时，取下带叶柄的完全展开的叶片，在不切到腋芽的前提下，叶柄尽可能留长，切掉叶尖三分之一，将叶柄端插入含高浓度的TDZ培养基中，叶片的离轴面朝上贴紧培养基，进行不定芽的诱导，诱导条件为2000lx光照，每天16小时，3-7周后能够看到明显的不定芽，出现肉眼可见的不定芽时，立即移入含有低浓度细胞分裂素的抽长培养基中进行芽抽长，获得不定芽。
结果如图1中A、B、C所示，四倍体川桑材料在用没有经过TDZ预处理的幼苗上取下的外植体进行诱导作为对照组，可以看出对照获得的不定芽较少。
如图2中A、B所示，该方法在桑树材料YH中同样能够获得大量的不定芽。
经过统计，四倍体川桑和YH在用没有经过TDZ预处理的幼苗上取下的外植体进行诱导时的再生率分别为9.72％和23.67％，采用TDZ处理过的幼苗叶片进行诱导时，再生率分别提高到70.83％和77.33％。此外，没有经过处理的YH材料的叶片诱导出肉眼可见芽的时间为60天左右，经过TDZ处理后取下的叶片外植体诱导时间可缩短至28天左右。
所述含有高浓度的TDZ培养基组分包括MS524培养基、8.0mg/L TDZ、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH为5.8。
具体的配制方法为：量取800mL双蒸水，加入4.33g的MS524培养基和30g蔗糖，调pH至5.8后加入8g琼脂，随后将溶液补足1L。将该溶液倒入体积为2L的三角瓶，用滤膜封口后高压灭菌，灭菌条件为121℃，20min。高压灭菌后，培养基温度降至60℃左右时，加入8.0mg的TDZ，摇晃均匀后分装无菌平板中。
所述用于四倍体川桑材料的抽长培养基组分包括MS524、0.5mg/L 6-BA 、30g/L蔗糖和5g/L琼脂，pH为5.6。
具体配制方法为：量取800mL双蒸水，加入4.33g的MS524，0.5mg 6-BA和30g蔗糖，调pH至5.6后加入5g琼脂，随后将溶液补足1L。将该溶液倒入体积为2L的三角瓶，用滤膜封口后高压灭菌，同时将组培瓶用滤膜封口进行高压灭菌，灭菌条件为121℃，20min。高压灭菌后，将三角瓶中溶液摇晃均匀，分装到组培瓶中。
YH材料所用抽长培养基包括MS524培养基、0.5mg/L 6-BA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂，pH 5.7。配制方法同四倍体川桑抽长培养基。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (2)
1.一种桑树体外再生的方法，其特征在于，将长势良好的桑树幼苗在含有高浓度的细胞分裂素的培养基中进行预处理4-7周，取下带叶柄的完全展开的叶片，在不切到腋芽的前提下，叶柄尽可能留长，切掉叶尖部分的三分之一，将叶柄端插入含高浓度的细胞分裂素的培养基中进行不定芽的诱导，3-7周后，出现不定芽时，获得桑树不定芽；然后立即移入含有低浓度细胞分裂素的抽长培养基中进行芽抽长；
所述含有高浓度的细胞分裂素的培养基组成为MS培养基、8.0mg/L TDZ、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH为5.8；
所述抽长培养基组成为MS培养基、0.5-1mg/L6-BA、30g/L蔗糖和5-8g/L琼脂，pH为5.6-5.8。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MS培养基为MS524培养基或MS535培养基。
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| CN103283592B (zh) * | 2013-04-17 | 2014-11-12 | 华南农业大学 | 一种麻疯树叶柄外植体直接再生不定芽的方法 |
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