CN113354714A - 一种以NMDA和p55PIK为靶点的广谱抗炎多肽化合物、其制备方法及应用 - Google Patents

一种以NMDA和p55PIK为靶点的广谱抗炎多肽化合物、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

一种以NMDA和p55PIK为靶点的广谱抗炎多肽化合物、其制备方法及应用，其包括活性肽段，所述活性肽段的氨基酸序列为MMTYSTELIFYIEMDP或MMTYSTELIFYIEMDPG，还包括加载在活性肽段N端的跨膜结构或脂肪酸，所述脂肪酸为正癸酸、月桂酸或棕榈酸，具有该结构的多肽化合物为非甾体类抑制剂，以PI3K亚型成员p55PIK为靶点，能有效抑制炎症的发生，饱和脂肪酸连接至N端，能有效帮助活性区透过细胞膜，到达靶点部位，发挥功效，桥接聚乙二醇既能增强极性容易透膜又能增加水溶性，成药性强，C端结构可以增加制剂稳定性，具有良好的成药性。

Description

一种以NMDA和p55PIK为靶点的广谱抗炎多肽化合物、其制备 方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药中的多肽抑制剂领域，具体涉及一种以NMDA和p55PIK为靶点的广谱抗炎多肽化合物、其制备方法及应用。
背景技术
身体组织对各种内外原因引起的损伤进行防御和修复，引起炎症，其基本病理变化有变质、渗出和增生，其临床表现为红、肿、热、痛、功能障碍，其全身反应为发热、白细胞增多等。
炎症在生活中无处不在，影响到每个人，是人类健康的最大敌人。所以，炎症治疗是没有满足的巨大医疗需求，由于靶点的限制，甾体激素毒副作用无法消除，自发现以来没有更新换代药物出现，甾体激素抗炎药物急需替代。
目前报导的自身免疫性疾病和炎症疾病激酶抑制剂，主要针对靶点JAKs和TYK2，其中JAKs为非受体型酪氨酸蛋白激酶，相对分子量130000，靶点TYK2为非受体酪氨酸蛋白激酶2，由于安全性和治疗窗窄方面的问题，JAKs抑制剂的发展仍面临诸多挑战。
抑郁症是一种严重的精神障碍疾病，其发病机制复杂。近年来随着对抑郁症发病机制的深入研究，发现了一些基于非单胺递质的新型抗抑郁药物分子靶标，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-asparticacid，NMDA)受体拮抗剂氯胺酮可以迅速起效缓解抑郁症状，效果可以持续7天，能降低自杀风险，临床抗抑郁效果较好，但氯胺酮是一种毒品，成瘾性限制了它的发展。NMDA受体作为氯胺酮药效的靶点，引起广泛关注，可以大胆的预测，对其的调节可能迅速有效的缓解抑郁症状。
磷脂酰肌醇-3-激酶蛋白家族(PI3Ks)蛋白同免疫反应密切相关,其调节亚单位和催化亚单位的表达缺失或应用相应的PI3Ks抑制剂能够对免疫反应产生显著影响，其中，IA类PI3Ks调节亚单位能够通过其i-SH2结构域同相应的催化亚单位形成二聚体结构，进而调控催化亚单位的激酶活性。
目前，关于IA类PI3Ks亚单位对免疫反应尤其是炎症反应的调控作用存在较多争议，旨在明确IA类PI3Ks调节亚单位p55PIK对炎症反应的调控作用，初步探讨蛋白p55PIK对炎症反应的调控作用的机制。
p55PIK能够通过激活NFκB信号通路促进免疫细胞炎症因子转录和翻译，高表达p55PIK能够促进LPS诱导的炎症因子转录，翻译以及NFκB信号通路和PI3K/AKT通路激活；低表达p55PIK能够抑制LPS诱导的炎症因子转录翻译，以及减少NFκB信号通路和PI3K/AKT通路的激活。
蛋白p55PIK能够通过促进NFκB RelA转录活性，正向调控炎症反应，蛋白p55PIK与NFκB信号通路蛋白NFκB p65可能在免疫过程例如pV、PMA作用中相互结合。
穿膜融合多肽IP55能有效进入细胞，抑制肿瘤细胞细胞周期进程，抑制DNA合成，在单核巨噬细胞系采用穿膜融合多肽IP55预处理能够显著抑制LPS诱导的促炎因子TNF-α、IL-6以及IL-1β产生，在原代单核巨噬细胞采用穿膜融合多肽IP55预处理能够部分抑制LPS诱导的单核巨噬细胞THP1促炎因子TNF-α产生；在LPS诱导的小鼠急性肝损伤模型采用穿膜融合多肽IP55预处理能够部分抑制LPS诱导的肝脏细胞NFκB p65的核转位以及减少急性肝损伤造成的小鼠死亡。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种以NMDA和p55PIK为靶点的广谱抗炎多肽化合物、其制备方法及应用，其为非甾体类抑制剂，以NMDA和PI3K亚型成员p55PIK为双靶点，有效抑制炎症的发生。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种以NMDA和p55PIK为靶点的广谱抗炎多肽化合物，其包括活性肽段，所述活性肽段从N端到C端的氨基酸序列如下：
蛋氨酸-蛋氨酸-苏氨酸-络氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-络氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-脯氨酰胺，缩写为MMTYSTELIFYIEMDP；
或蛋氨酸-蛋氨酸-苏氨酸-络氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-络氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-甘氨酰胺，缩写为MMTYSTELIFYIEMDPG。
进一步，所述广谱抗炎多肽化合物还包括加载在活性肽段N末端的跨膜结构或脂肪酸。
优选地，所述跨膜结构为YGRKKRRQRRR，所述脂肪酸为正癸酸、月桂酸或棕榈酸。
又，所述广谱抗炎多肽化合物的跨膜结构或脂肪酸与活性肽段N端氨基酸之间串联设置桥接段。
又，所述桥接段为PEG2、GGGG或PEG2-PEG2。
优选地，所述广谱抗炎多肽化合物具有如下结构：
YGRKKRRQRRRMMTYSTELIFYIEMDP-NH2；
CH3(CH2)8CO-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2；
CH3(CH2)8CO-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2；
CH3(CH2)8CO-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDPG-NH2；
CH3(CH2)8CO-PEG2-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2。
进一步，结构为CH3(CH2)8CO-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDPG-NH2的广谱抗炎多肽化合物分子量为2339.78g/mol，等电点为3.9。
本发明提供所述以NMDA和p55PIK为靶点的广谱抗炎多肽化合物在制备治疗炎症疾病药物中的应用。
进一步，所述炎症为心肌炎、类风关、帕金森、忧郁症、老年痴呆、红斑狼疮、脓毒症、眼底病、慢阻肺、新冠肺炎、哮喘、溃疡性肠炎、眼炎、干眼病、鼻炎、中耳炎、皮炎、溃疡糜烂、烧烫伤或糖尿病足。
本发明的广谱抗炎多肽化合物主要针对自身免疫性疾病和炎症疾病，对炎症引起的慢性病和机体免疫缺陷有良好的改善和治疗作用。
本发明中，脂肪酸-桥接段-活性肽段的结构中，采用脂肪酸作为透膜载体，桥接段增加化合物分子量和极性，延长半衰期，脂肪酸和桥接段透膜载体比较牢固；组合活性区可增加水溶性和稳定性、增强活性疗效，该结构中，十六肽活性肽段中的第14位为苏氨酸，十七肽的活性肽段C端为甘氨酸，增强抗炎肽的机体抗炎活性，激活机体免疫性疾病的疗效，实验证明对忧郁症和干眼症具有显著疗效，碳原子数在8-16的饱和脂肪酸能够有效转运活性区，桥接PEG2既能增强极性容易透膜又能增加水溶性，成药性强。
本发明中多肽化合物YGRKKRRQRRRMMTYSTELIFYIEMDP-NH2的结构为跨膜区+活性区，多肽化合物CH3(CH2)8CO-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2采用脂肪酸+活性区结构，具备抗炎功效，脂肪酸能够有效转运活性区；多肽化合物CH3(CH2)8CO-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2采用脂肪酸+PEG2+活性区结构，具备抗炎功效，脂肪酸能够有效转运活性区，桥接PEG2既能增强极性容易透膜又能增加水溶性，成药性强。
多肽化合物CH3(CH2)8CO-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDPG-NH2采用脂肪酸+PEG2+活性区结构，脂肪酸能够有效转运活性区，桥接PEG2和甘氨酸既能增强极性容易透膜又能增加水溶性，桥接PEG2还能增加分子量延长化合物的半衰期，具备良好的抗炎功效，溶液性制剂成药性强、稳定性好；多肽化合物CH3(CH2)8CO-PEG2-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2设计采用脂肪酸+PEG2+PEG2+活性区结构，脂肪酸能够有效转运活性区，桥接串联两个PEG2虽能增强极性和水溶性，具备良好的抗炎功效。
本发明提供所述广谱抗炎多肽化合物的制备方法，包括如下步骤：
1)树脂溶胀
替代度为0.45-0.6mmol/g的氨基树脂为起始树脂，与溶剂DMF进行溶胀，温度30～40℃，N2吹拂搅拌20-30min至树脂充分泡涨，除去多余的DMF，得到溶胀后的树脂；
2)偶联反应
采用Fmoc固相合成法，将由Fmoc基团保护的氨基酸与溶胀后的树脂在缩合剂、防消旋剂存在下进行偶联反应，脱除前一氨基酸上的Fmoc保护基后再进行后一个氨基酸的偶联反应，将氨基酸逐次偶联至树脂上；其中，由Fmoc基团保护的氨基酸按照所述活性肽段从C端至N端的偶联顺序依次为：Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(otbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Met-OH；
或Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(otbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Met-OH；
所述偶联反应中，缩合试剂为HBTU、HOBt和DIEA，偶联反应时间为1.5-2小时，偶联温度范围，激活温度范围13-17℃；
在树脂上完成16或17个氨基酸的偶联反应之后，再偶联由Fmoc保护的跨膜结构、桥接段和/或脂肪酸，反应产物经DMF、甲醇收缩后干燥，得到侧链带保护基团的全保护肽树脂；
3)裂解反应
将全保护树脂与裂解液在33-37℃下机械搅拌反应2.5-3.5小时后，滤除液体，在乙醚中进行沉降，洗涤、干燥，得到粗肽；其中，所述裂解液由TFA、三异丙基硅烷、纯水组成；
4)纯化、冻干
将步骤3)获得的粗肽溶解后通过高效液相色谱进行两次纯化，游离、冻干后获得所述的广谱抗炎多肽化合物，其中，第一次纯化的流动相为三氟乙酸体系，第二次纯化的流动相为醋酸体系。
优选地，步骤1)中，所述氨基树脂为Rink Amide MBHA Resin，所述树脂与溶胀溶剂的质量体积比为1：5-8。
又，步骤3)中，干燥时，干燥温度为20-30℃，维持压力在-0.09Mpa以下，干燥6h以上至恒重，即2小时内重量变化百分比小于1.0％。
本发明中，在粗肽的第一次纯化中，收集纯度大于95％以上，单杂小于3％的样品合并，去除与目的肽色谱性质差异较大杂质，以及残留在粗肽溶液样品中的溶剂，第二次纯化中，收集纯度大于98.5％以上，单杂小于0.5％的样品合并，28-32℃浓缩，去除多数与主峰色谱保留特性接近的杂质。
本发明的多肽化合物碳端为胺化结构，在固相合成时其起始树脂需选择氨基树脂，确定反应树脂后，进行树脂替代度的选择，替代度太高会增加反应杂质，反应不能充分进行，影响产物纯度，替代度太低会影响成本，替代度在0.45-0.6mmol/g时，粗肽纯度为78％，超出此范围，粗肽纯度在65％以下。
本发明中，保护氨基酸的反应当量太高会增加反应的杂质，以及增加生产成本，当量太低会影响反应的速率和反应不充分，将反应当量设为3.0eq时，合成收率较高。
本发明的多肽合成过程中，需要切掉保护基团和树脂，选用的裂解液为三氟乙酸TFA、三异丙基硅烷Tis和水体系，切割温度为33～37℃，裂解时间2.5小时，该裂解体系完整、配比适宜、极性良好、气味较小，稳定性好、脱除效果达60％，味道较小，收率高、纯度好。
裂解结束后，用乙醚或甲基叔丁基醚进行沉降，能够让多肽从裂解液里面析出来，尽可能洗去裂解过程中的一些裂解试剂和产生的杂质；甲基叔丁基醚沉降比例主要取决于裂解液的量，更好的让多肽从裂解液里面析出来，尽可能洗去裂解过程中的一些裂解试剂和产生的杂质。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的抗炎多肽属于双靶点原研创新药，是针对NMDA和PI3K亚型成员p55PIK的双靶点抑制剂，针对NMDA受体，特点是药物起效快、药效持续时间长；同时，该多肽化合物是首个针对PI3K调节亚基的PPI抑制剂，通过阻断p55PIK介导的信号通路抑制细胞增殖，降低NF-kB转录活性。
本发明的多肽化合物是新化合物实体，包括正癸酸-聚乙二醇-多肽活性区，多肽活性区以以NMDA和PI3K亚型成员p55PIK为靶点，有效抑制炎症的发生；饱和脂肪酸正癸酸、月桂酸或棕榈酸作为跨膜区侧链，连接至N端，能有效帮助活性区透过细胞膜，到达靶点部位，发挥功效，桥接聚乙二醇既能增强极性容易透膜又能增加水溶性，成药性强，C端桥接甘氨酸可以进一步增加制剂稳定性。
本发明采用多肽固相合成法制备多肽化合物，Fmoc基对酸很稳定，但能用哌啶很方便地脱去，这样在脱Fmoc时，对侧链保护基没有影响，肽链也不会被切割下来，完全达到交叉保护的目的，为优化工艺提供收率、减少杂质产生及增加成药性，优选反应条件和工艺参数设计科学合理。
附图说明
图1为本发明实施例4中的小鼠强迫游泳实验结果。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
材料、仪器型号来源：
间接检眼镜、iCare眼压计、KOWA手持裂隙灯(SL-17视频版)、光太Vitra 532nm激光仪、Heidelberg激光眼科诊断仪、台式裂隙灯显微镜系统等；分析仪器：Waters 2695检测器2996；分析色谱柱：Agilent C185um 300A。
实施例1一种广谱抗炎多肽化合物Dec-MTG-17的制备方法
多肽序列：Dec-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDPG-NH2；
三字符号：
Dec-AEEA-Met-Met-Thr-Tyr-Ser-Thr-Glu-Leu-Ile-Phe-Tyr-Ile-Glu-Met-Asp-Pro-Gly-NH2；
中文序列：正癸酸-AEEA-蛋氨酸-蛋氨酸-苏氨酸-络氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-络氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-甘氨酰胺；
分子量：2339.78g/mol；
分子式：C108H167N19O32S3；
等电点：3.9；
PH＝7时的净电荷：-2.0；
平均亲水性：0.4；
亲水残基比例：24％；
结构式如下：
Figure BDA0003183780670000071
具体制备方法包括如下步骤：
1.树脂溶胀
称取取代度为0.5mmol/g的Rink Amide MBHA Resin 2.0g加入到100ml反应柱中，加入15mlDMF在温度30～40℃下溶涨，N2吹拂搅拌20-30min至树脂充分泡涨，溶胀结束后，抽去DMF，得到溶胀后的树脂。
2.偶联反应
采用Fmoc固相合成法，将由Fmoc基团保护的氨基酸与溶胀后的树脂在缩合剂、防消旋剂存在下进行偶联反应，将氨基酸逐次偶联至树脂上；
将偶联后的反应树脂加入15ml DBLK(25％PIP/DMF)试剂进行脱保护处理，脱除时间为20min，即脱除Fmoc基团，以便于与下一个氨基酸偶联生成肽键；脱保护反应结束后，分别用DMF×1、甲醇×2、DMF×4，共洗涤7次，每次用量15ml，每次2-3分钟，抽干产品，取少量树脂茚三酮检测显阳性。
将已溶解好的3倍量反应液(将Fmoc-Gly-OH、HOBt、HBTU置于50ml烧杯中，加入10ml DMF溶剂，冰浴、搅拌至全溶)加入树脂中，再补加5ml DMF溶剂，N2吹拂搅拌同时缓慢加入1.0ml DIPEA，温度控制在35±2℃并搅拌反应30min，抽干反应液，DMF洗涤3次，每次用量15ml,每次2-3分钟，取少量树脂茚三酮检测，显阴性，则反应完全，进入下一个循环。
在偶联反应中，脱除前一氨基酸上的Fmoc保护基后作为反应树脂再进行后一个氨基酸的偶联反应，其中，以氨基酸树脂的摩尔比为1eq，带Fomc保护基的氨基酸为3eq，缩合试剂为HBTU和DIEA，防消旋剂为HOBt，洗涤溶剂为DMF和甲醇，偶联反应时间为1.5-2小时，偶联温度范围，激活温度范围33-37℃；脱保护时，以25％PIP/DMF为脱保护剂，在所有的偶联反应中，投料比例保持一致，参见表1；
表1
原料/溶剂 投料量 允许范围 摩尔比 备注
反应树脂 1mmol 0.1mmol — 原料
25％PIP/DMF(V/V) 15ml ±2ml 3.0倍×1(V/V) 脱保护剂
DMF 75ml ±10ml 2.5倍×1(V/V) 洗涤溶剂
MeOH 30ml ±5ml 2.5倍×1(V/V) 洗涤溶剂
Fmoc-Gly-OH 0.9g ±10mg 3.0eq 原料
HOBt 4.06g ±5mg 3.0eq 防消旋剂
HBTU 1.149g ±10mg 3.0eq 缩合剂
DIPEA 1ml ±0.1mL 6.0eq 缩合试剂
DMF 15ml ±5mL 2.5倍×1(V/V) 反应溶剂
由Fmoc基团保护的氨基酸按照所述活性肽段从C端至N端的偶联顺序依次为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(otbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Met-OH。
在树脂上完成17个氨基酸的偶联反应之后，再偶联桥接段Fmoc-AEEA-OH、正癸酸Decanoic acid，反应产物分别用DMF×4、甲醇×2、每次用量15ml，每次2-3分钟，然后再用甲醇收缩两次，每次用量15ml，每次3-5分钟，抽干，减压干燥24h至恒重，得到全保护肽树脂，参见表2。
表2
原料/溶剂 投料量 允许范围 摩尔比 备注
偶联反应产物 1mol 0.1mmol — 原料
DMF 75ml ±10ml 2.5倍×1(V/V) 洗涤试剂
MeOH 30ml ±5ml 2.5倍×1(V/V) 试剂
3.裂解反应
在500ml的裂解烧瓶中加入约10g全保护肽树脂，加入已冰浴降温处理的裂解液(TFA、三异丙基硅烷、纯水的100ml混合液)让其在温度为35±2℃下机械搅拌反应3小时，滤出液体，缓慢的加入装有600ml无水乙醚的烧杯中，待其自然沉降，30分钟后去除上清液，将带有无水乙醚的粗肽进行过滤处理，倒出上清液，用无水乙醚洗粗肽，再次过滤，以此循环上述两步操作3～4次。
所得湿品进行真空干燥，控制干燥箱温度在25±5℃，维持压力在-0.09Mpa或以下，干燥12h(6h以上)至恒重(即2小时内重量变化百分比小于1.0％)。称重，得到Dec-MG-17粗肽2.27g(理论值)，放入合适容器中，贴上标签，在2～8℃下密封保存，取粗品进行质谱检测和纯度检测，具体投料配比参加表3。
表3Dec-MTG-17粗肽的制备投料配比表
原料/溶剂 投料量 允许范围 体积比 备注
全保护肽树脂 10g(理论) 0.1mmol — 中间体
TFA 95ml ±5ml 95 裂解试剂
三异丙基硅烷(Tis) 2.5ml ±0.5ml 2.5 裂解试剂
纯水 2.5ml ±0.5ml 2.5 裂解试剂
无水乙醚 2L ±100ml 沉降，洗涤试剂
4.纯化、冻干
将步骤3)获得的Dec-MG-17粗肽溶解后通过高效液相色谱进行两次纯化，游离、冻干后获得所述的广谱抗炎多肽化合物，其中，第一次纯化的流动相为三氟乙酸体系，第二次纯化的流动相为醋酸体系。
1)Dec-MTG-17粗品分析方法及仪器
分析方法：分析型高效液相色谱仪梯度洗脱分离
分析仪器：Waters 2695检测器2996
分析色谱柱：Agilent C185um 300A
2)分析条件：
流动相：A相：0.1％TFA+水；B相：0.1％ACN
检测波长：215nm；柱温：50℃；流速：1.0mL/min
Dec-MTG-17粗品溶解过滤：将2,27g Dec-MTG-17粗品用含5％的ACN水溶液进行溶解，溶解浓度约10mg/ml，溶解体积230ml搅拌30min至澄清，溶液呈淡黄色，无颗粒；用0.45um有机滤膜过滤，过滤结束后定量。
过滤目的：选择合适材质的0.45μm滤膜对Dec-MTG-17粗品进行过滤，除去不溶性物质。
3)一纯工艺开发
一纯目的：浓缩样品并去除与目的肽色谱性质差异较大杂质，以及残留在粗肽溶液样品中的溶剂。
色谱柱：5cm×250mm 1根，填料Daisogel-SP-120-50-ODS-AP；
操作：将粗品过滤液通过制备型HPLC的制备泵上样，每次抽取不超过3g的Dec-MTG-17多肽液体上样。
制备方法：制备型液相色谱仪梯度洗脱分离。
制备仪器：汉邦或是创新通恒制备型高效液相色谱仪
流动相：A相：0.1％TFA+H2O；B相：0.1％TFA+80％ACN+20％H2O；
检测波长：λ＝220nm；
柱温：室温；
梯度洗脱条件：梯度洗脱条件：A相：B相从50：50到40：60洗脱15min，从40：60到65：35洗脱50min，流量60ml/min。
收集纯度大于95％以上、单杂小于3％的样品合并，检测纯度，定含肽量。
4)二纯工艺开发
二纯目的：去除多数与主峰色谱保留特性接近的杂质。
色谱柱：选用1根5cm×250mm色谱柱，任意选一种填料YMC-SP-120-10-ODS-A、YMC-SP-120-10-ODS-AQ和Daisogel-SP-120-10-ODS-AP。
操作：将粗品过滤液通过制备型HPLC的制备泵上样，每次抽取不超过5g的Dec-MTG-17多肽液体上样。
制备方法：制备型液相色谱仪梯度洗脱分离。
制备仪器：汉邦或创新通恒制备型高效液相色谱仪
流动相：A相：0.1％HAc+H2O；B相：0.1％HAc+80％ACN+20％H2O；
检测波长：λ＝220nm；
柱温：室温；
梯度洗脱条件：A相：B相从45：55到40：60洗脱15min，从40：60到75：25洗脱50min，流量60ml/min。
收集纯度大于98.5％以上、单杂小于0.5％的样品合并，检测纯度，定含肽量。
利用0.055—0.065％醋酸为洗脱流动相，以50mM乙酸铵醋酸为离子转换流动相，调pH3.5，进行洗脱，将样品中的成盐离子置换为醋酸根离子，转换完成后进行冻干，获得Dec-MTG-17多肽化合物。
实施例2Dec-MTP-16多肽化合物的制备方法
多肽序列：Dec-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2
三字符号：
Dec-AEEA-Met-Met-Thr-Tyr-Ser-Thr-Glu-Leu-Ile-Phe-Tyr-Ile-Glu-Met-Asp-Pro-NH2
中文序列：正癸酸-AEEA-蛋氨酸-蛋氨酸-苏氨酸-络氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-络氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-脯氨酰胺分子量：2282.73g/mol；
分子式：C106H164N18O31S3；
等电点：3.9；
PH＝7时的净电荷：-2.0；
平均亲水性：0.4；
亲水残基比例：25％；
Dec-MTP-16多肽化合物的结构式如下：
Figure BDA0003183780670000111
偶联反应中，由Fmoc基团保护的氨基酸按照所述活性肽段从C端至N端的偶联顺序依次为：Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(otbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Met-OH。
在树脂上完成16个氨基酸的偶联反应之后，再偶联桥接段Fmoc-AEEA-OH、正癸酸Decanoic acid。
其余操作参照实施例1的方法。
本实施例中，选择了不同条件进行偶联反应，具体反应条件及结果见表4-14。
1.不同树脂类型及替代度
表4不同类型树脂的实验结果
起始树脂 替代度 粗品收率％
Rink Amide MBHA Resin 0.45mmol/g 60％
Am Resin 0.45mmol/g 60％
表5不同类型树脂的实验结果
起始树脂 替代度 粗肽纯度％
Rink Amide MBHA Resin 0.3-0.45mmol/g(低) 60％
Rink Amide MBHA Resin 0.45-0.6mmol/g(中) 78％
Rink Amide MBHA Resin 0.6-0.85mmol/g(高) 65％
实验结果显示，选择替代度为0.45-0.6mmol/g的树脂时，收率较高。
2、保护氨基酸的不同反应当量
设置不同的反应当量进行偶联反应，具体参见表6。
表6不同保护氨基酸反应当量的实验结果
保护氨基酸反应当量 粗肽纯度％ 合成收率
2eq 66％ 50％
3eq 80％ 60％
4eq 70％ 55％
由表6可见，当量太高会增加反应的杂质，增加生产成本，当量太低会影响反应的速率和反应不充分。
3、不同缩合试剂对合成的影响
表7不同缩合试剂的实验结果
不同缩合试剂 粗肽纯度％ 合成收率
HOBt/DIC 70％ 56％
HBTU/HOBT/DIEA 76％ 60％
由表7可见，采用HBTU、HOBT和DIEA缩合试剂粗肽纯度和收率比较理想。
4、偶联时间的选择
进行偶联反应时间主要取决于合成规模，合成反应速率和随着时间推移产生的一些副反应三点考虑。
表8不同保护氨基酸反应当量的实验结果
偶联反应时间 粗肽纯度％ 合成收率
1h 65％ 50％
2h 80％ 60％
3h 68％ 55％
可见，根据Dec-MTP-16粗肽纯度和合成收率来看，该化合物偶联反应时间的最佳时间为2h。
5、偶联温度的选择
不同偶联反应温度的实验结果参见表9。
表9不同偶联反应温度的实验结果
偶联反应温度 粗肽纯度％ 合成收率％
25±2℃ 75％ 56％
35±2℃ 80％ 60％
由表9可见，根据Dec-MTP-16粗肽纯度和合成收率来看，反应温度35±2℃较为合适。
6、激活温度的选择
在上述反应条件确定的情况下，进行激活温度的选择实验，激活温度分别为0±2℃、15±2℃、30±2℃，参见表10。
表10不同激活温度的实验结果
激活温度 粗肽纯度％ 合成收率
0±2℃ 60％ 50％
15±2℃ 78％ 60％
30±2℃ 68％ 55％
根据Dec-MTP-16粗肽纯度和合成收率来判断最适的激活温度15±2℃。
7、裂解液配比选择
从多肽序列分析，需要切掉的保护基团有tbu和树脂，分别选用以下裂解液配比进行实验，实验结果参见表11：
1.TFA：TIS：苯甲醚＝95：3：2；
2.TFA：苯甲硫醚：苯甲醚＝95：1：4；
3.TFA：TIS：水＝95：2.5：2.5；
4.TFA：苯甲硫醚：苯甲醚＝95：3：2；
5.TFA：苯甲硫醚：苯甲醚：水＝95：1：3：1。
表11不同配比的裂解液对裂解效果的影响
Figure BDA0003183780670000141
由表11可见，结合Dec-MTP-16粗肽纯度及合成收率，TFA：Tis：水＝95％：2.5％：2.5％的组合裂解效果较好，且味道较小，对环境影响小。
8、不同裂解反应温度
表12裂解反应温度对裂解效果的影响
裂解反应温度(℃) 粗肽纯度(％) 合成收率(％)
20±2 65％ 50％
25±2 70％ 52％
30±2 75％ 55％
35±2 78％ 60％
40±2 70％ 54％
由表12可见，以Dec-MTP-16粗肽纯度及合成收率，合适的反应温度为35±2℃。
9、裂解反应时间选择
裂解反应时间主要取决于裂解树脂的量和裂解效果等，分别选用不同的裂解时间进行实验，参见表13。
表13裂解反应温度对裂解效果的影响
Figure BDA0003183780670000142
Figure BDA0003183780670000151
由表13可见，以Dec-MTP-16粗肽纯度及合成收率来看，合适的切割温度为2-3h。
10、甲基叔丁基醚沉降比例的选择
甲基叔丁基醚沉降比例主要取决于裂解液的量，更好的让多肽从裂解液里面析出来，尽可能洗去裂解过程中的一些裂解试剂和产生的杂质，分别选用不同的沉降液比例进行实验
表14沉降比例对实验的影响
沉降液比例 粗肽纯度％ 合成收率％
1：3 65％ 50％
1：6 70％ 55％
1：10 76％ 60％
由表14可见，以Dec-MTP-16粗肽纯度及合成收率看，合适的甲基叔丁基醚沉降液体积比例为甲基叔丁基醚：裂解液＝1：10。
实施例3干眼症动物模型的药效评价
1、给药技术及眼组织取材
眼局部给药：结膜囊滴眼；玻璃体腔注射；前房注射；球后注射；视网膜下注射眼组织取材：角膜、房水、结膜、虹膜、晶状体、视网膜
2、眼科药效学动物模型
1)莨菪碱诱导的干眼症(C57小鼠或SD大鼠)；前房注射粘弹剂诱导的急性青光眼(新西兰兔)；
角膜内皮损伤模型(新西兰兔)；激光光凝诱导的脉络膜新生血管(NHP)
2)高氧诱导的视网膜新生血管(C57乳鼠)；STZ诱导的糖尿病视网膜病变(BN大鼠)；视神经损伤模型(SD大鼠)；苯扎溴铵诱导的干眼症(SD大鼠)
3)升高眼内压诱导的缺血再灌注(SD大鼠)；碱烧伤诱导的角膜新生血管(新西兰兔)；角膜缝线法诱导角膜新生血管(新西兰兔)；MNU/碘酸钠诱导的视网膜变性(C57小鼠)
4)去卵巢诱导干眼症(NHP)；组胺诱导过敏性结膜炎(豚鼠)；激光小梁网诱导慢性高眼压模型(NHP)；
5)亚硒酸钠注射诱导白内障；眼部疼痛、近视、弱视及眼部炎症模型
3、体内药效学评价指标
泪液分泌量：测量棉线变色长度(mm)；
角膜损伤评分：根据角膜荧光素钠染色面积评分；
4、具体过程：
根据《干眼临床诊断专家共识》(2013年)和《干眼症动物模型制备规范》(草案，2018年)中关于干眼症的临床指标，依此考察药物的治疗效果。
本模型采用皮下注射东莨菪碱配合干燥环境建立干眼小鼠模型，其原理是东莨菪碱可以抑制泪腺上分布的M3胆碱能受体，从而抑制小鼠泪液分泌。同时，长期处于干燥环境可以刺激眼表感觉神经末梢，引起神经源性炎症，进而加重眼表损害。该模型用来评价泪液分泌量(Schirmer I)、泪膜破裂时间(BUT)和角膜银光素染色(FLS)等干眼症重要的临床指标。
动物：C57BL/6J小鼠，实验分组及周期参见表15，其中，生理盐水模型组是干眼症模型的动物+生理盐水，作为阴性对照，生理盐水对照组是正常组+生理盐水，受试模型组中采用实施例1中的多肽化合物。
表15
Figure BDA0003183780670000161
实验周期：30天
观测指标：红肿程度、畏光程度。
泪膜破裂时间检测(BUT)：分别检测给药后第7、14天泪膜破裂程度。
泪液分泌量(Schirmer I实验)：在给药前和给药后第3、7、11、14天分别测量泪液检测滤纸泪液的浸入长度。
角膜损伤评分：在给药前和给药后的第3、7、11、14天进行荧光素钠染色评分。
如果药物对上述临床检查指标改善明显，则进行以下病理检测：
做组织切片，观察药物对造模后小鼠的角膜和结膜组织的影响。
实验结束后，去结膜上皮组织和泪腺，分析MHC-II蛋白、TNF-α、IL-1β及IL-6mRNA等相关炎症因子的变化。
结论：本发明的多肽化合物有明显改善疗效，经切片和炎症因子分析，有显著性差异。
经对实验动物C57小鼠、SD大鼠或新西兰兔进行药效模型试验，治疗干眼症、近视眼或角结膜眼等有改善疗效。
实施例4本发明的多肽化合物在抑郁模型中的药效评价
通过抑郁症常用的分析指标，即强迫游泳，初步评价多肽药物的抗抑郁效果。本发明先利用正常动物，考察给药一周后的抗抑郁药效。
动物及实验方案：
C57BL/6小鼠，正常动物急性给药，以强迫游泳(FST)为抗抑郁样行为考察指标，受试化合物口服给药，受试化合物为本发明实施例2中的多肽化合物Dec-MTP-16；艾司氯胺酮(Esketamine)作为阳性药物，腹腔给药，设空白对照；单次给药后24h测FST，受试药物以三种不同剂量经口灌胃给药，FST测试，统计小鼠的静止不动时间(Immobility time)，检测指标：在单次给药后的1h测强迫游泳，考察是否有快速抗抑郁的效果，参见表16、表17和图1，其中，表17中的Dec-MTP-16为按照剂量10mg/kg腹腔注射给药的结果。
表16
Figure BDA0003183780670000171
表17强迫游泳实验中小鼠的不动时间(单位为秒)
Figure BDA0003183780670000172
Figure BDA0003183780670000181
由表17和图1可见，强迫游泳实验中，静止不动时间按平均值计算，空白对照为144.09秒，用多肽化合物Dec-MTP-16为117.07秒，平均静止不动时间缩短27.02秒，有显著性差异，证明本发明的多肽化合物有抗抑郁功效，仅次于阳性对照品盐酸艾司氯胺酮的疗效，相对于现有多肽化合物成药性好，在治疗忧郁症方面有替代艾司氯胺酮的前景。

Claims (10)

1.一种以NMDA和p55PIK为靶点的广谱抗炎多肽化合物，其包括活性肽段，所述活性肽段从N端到C端的氨基酸序列如下：
蛋氨酸-蛋氨酸-苏氨酸-络氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-络氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-脯氨酰胺，缩写为MMTYSTELIFYIEMDP；
或蛋氨酸-蛋氨酸-苏氨酸-络氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-络氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-甘氨酰胺，缩写为MMTYSTELIFYIEMDPG。
2.根据权利要求1所述的广谱抗炎多肽化合物，其特征在于，所述广谱抗炎多肽化合物还包括加载在活性肽段N端的跨膜结构或脂肪酸。
3.根据权利要求2所述的广谱抗炎多肽化合物，其特征在于，所述跨膜结构为YGRKKRRQRRR，所述脂肪酸为正癸酸、月桂酸或棕榈酸。
4.根据权利要求1所述的广谱抗炎多肽化合物，其特征在于，所述广谱抗炎多肽化合物的跨膜结构或脂肪酸与活性肽段N端氨基酸之间串联设置桥接段。
5.根据权利要求4所述的广谱抗炎多肽化合物，其特征在于，所述桥接段为PEG2、GGGG或PEG2-PEG2。
6.根据权利要求1所述的广谱抗炎多肽化合物，其特征在于，所述广谱抗炎多肽化合物为具有如下氨基酸序列的化合物：
YGRKKRRQRRRMMTYSTELIFYIEMDP-NH2、
CH3(CH2)8CO-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2、
CH3(CH2)8CO-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2、
CH3(CH2)8CO-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDPG-NH2或
CH3(CH2)8CO-PEG2-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2。
7.根据权利要求6所述的广谱抗炎多肽化合物，其特征在于，结构为CH3(CH2)8CO-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDPG-NH2的广谱抗炎多肽化合物，分子量为2339.78g/mol，等电点为3.9。
8.如权利要求1-7任一项所述以NMDA和p55PIK为靶点的广谱抗炎多肽化合物在制备治疗炎症疾病药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述炎症为心肌炎、类风关、帕金森、忧郁症、老年痴呆、红斑狼疮、脓毒症、眼底病、慢阻肺、新冠肺炎、哮喘、溃疡性肠炎、眼炎、干眼病、鼻炎、中耳炎、皮炎、溃疡糜烂、烧烫伤或糖尿病足。
10.如权利要求1-7任一项所述广谱抗炎多肽化合物的制备方法，包括以下步骤：
1)树脂溶胀
替代度为0.45-0.6mmol/g的氨基树脂为起始树脂，与溶剂DMF进行溶胀，温度30～40℃，N2吹拂搅拌20-30min至树脂充分泡涨，除去多余的DMF，得到溶胀后的树脂；
2)偶联反应
采用Fmoc固相合成法，将由Fmoc基团保护的氨基酸与溶胀后的树脂在缩合剂、防消旋剂存在下进行偶联反应，脱除前一氨基酸上的Fmoc保护基后再进行后一个氨基酸的偶联反应，将氨基酸逐次偶联至树脂上；其中，由Fmoc基团保护的氨基酸按照所述活性肽段从C端至N端的偶联顺序依次为：Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(otbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Met-OH；
或Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(otbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Met-OH；
所述偶联反应中，缩合试剂为HBTU、HOBt和DIEA，偶联反应时间为1.5-2小时，偶联温度范围，激活温度范围13-17℃；
在树脂上完成16或17个氨基酸的偶联反应之后，再偶联由Fmoc保护的跨膜结构、桥接段和/或脂肪酸，反应产物经DMF、甲醇收缩后干燥，得到侧链带保护基团的全保护肽树脂；
3)裂解反应
将全保护树脂与裂解液在33-37℃下机械搅拌反应2.5-3.5小时后，滤除液体，在乙醚中进行沉降，洗涤、干燥，得到粗肽；
其中，所述裂解液由TFA、三异丙基硅烷、纯水组成；
4)纯化、冻干
将步骤3)获得的粗肽溶解后通过高效液相色谱进行两次纯化，游离、冻干后获得所述的广谱抗炎多肽化合物，其中，第一次纯化的流动相为三氟乙酸体系，第二次纯化的流动相为醋酸体系。
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