KR20210145231A - 짧은 합성 펩티드 및 망막 변성 질환 및/또는 조직 손상 치료를 위한 용도 - Google Patents

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Abstract

망막 변성 질환 또는 조직 손상의 치료를 위한 합성 펩티드 및 이를 포함하는 조성물이 본원에 개시된다. 또한, 치료적 유효량의 본 발명의 합성 펩티드를 함유하는 조성물을 망막 변성 질환 또는 조직 손상의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 망막 변성 질환 또는 조직 손상을 치료하는 방법이 본원에 개시된다.

Description

짧은 합성 펩티드 및 망막 변성 질환 및/또는 조직 손상 치료를 위한 용도
1. 발명의 분야
본 개시내용은 신경 보호 작용 및/또는 조직 수복 및 재생 작용을 가짐으로써 망막 변성 질환 또는 조직 손상의 치료 또는 예방 분야에 유용한 짧은 합성 펩티드의 발견에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
망막 변성은 망막 또는 망막 색소 상피(RPE) 세포가 점진적이면서 결국에는 사멸됨으로써 초래되는 망막 퇴화이다. 동맥 또는 정맥 폐색, 당뇨병성 망막병증, 수정체후 섬유증식증/미숙아 망막병증 또는 질환(대개 유전성)을 포함해 망막 변성에는 몇 가지 이유가 있다. 이들은 시력 장애, 야맹증, 망막 박리, 광과민증, 터널 시야 및 주변 시야 상실에서 완전한 시야 상실과 같은 다양한 방식으로 나타날 수 있다. 망막 변성은 색소성 망막염(RP), 연령 관련 황반 변성(AMD), 당뇨병성 망막병증, 백내장, 급성 UV 망막병증 및 녹내장을 비롯한 다양한 형태의 망막 질환에서 발견된다.
연조직, 예를 들어 혈관, 피부 또는 근골격 조직에 대한 손상은 매우 흔하다. 연조직 상태는 예를 들어 피부 상태(예를 들면, 허혈성 상처, 당뇨병성 상처, 외상성 상처, 화상, 피부 궤양 및 수술 상처); 혈관 상태(예를 들면, 혈관 질환, 혈관 손상 및 부적절한 혈관 발달); 미용 상태(예를 들면, 수복, 확대 또는 미화와 관련된 것); 근육 질환(예를 들면, 염증성, 신경성 및 근육성 근육 질환, 및 근이영양증); 및 힘줄 및 인대와 같은 결합 조직의 상태를 포함할 수 있다. 또 다른 연조직 상태는 피부 노화 또는 스트레스 노출(예를 들면, UV 노출, 오염 등)으로, 이는 조직 수복 및 세포 재생을 느려지게 하는 원인이다. 피부 노화 과정은 주름 출현, 피부 색소 침착의 변화, 탄력과 조밀함 상실, 조직 이완과 같은 매우 뚜렷한 징후로 표시된다.
따라서, 관련 분야에서는 망막 변성 질환 및/또는 조직 수복 및 재생을 필요로 하는 상태를 치료 및/또는 예방하기 위한 개선된 의약 및/또는 방법이 요구된다.
발명의 요약
일반적으로, 본 개시내용은 망막 변성 질환 및/또는 조직 손상을 치료하기 위한 신규 화합물 및/또는 방법의 개발에 관한 것이다.
따라서, 본 개시내용의 제1 측면은 망막 변성 질환 또는 조직 손상을 치료할 수 있는 짧은 합성 펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 짧은 합성 펩티드는 X1X2X3X4EX5(서열 번호 1)로 제시되는 아미노산 서열로 이루어지며, 여기서,
X1은 세린(S) 또는 알라닌(A)이고;
X2는 류신(L), 알라닌(A) 또는 이소류신(I)이고;
X3은 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V) 또는 아스파라긴(N)이고;
X4는 알라닌(A), 글리신(G) 또는 글루탐산(E)이고;
X5는 글루타민(Q), 알라닌(A) 또는 아스파라긴(N)이고;
X2, X3, X4 및 X5는 독립적으로 L-형태이고, X1 및 E는 독립적으로 L- 또는 D-형태이며;
서열 번호 1이 SLGAEQ(서열 번호 9)의 서열을 가지면, 세린(S) 또는 글루탐산(E)은 D-형태이다.
선택적인 실시양태에 따르면, 합성 펩티드의 아미노산 서열의 N-말단은 아세틸화되고 아미노산 서열의 C-말단은 아미드화된다.
일부 실시양태에 따르면, X1은 세린(S)이고, X2는 류신(L)이고, X3은 글리신(G)이고, X4는 알라닌(A)이고, X5는 글루타민(Q)이고, 합성 펩티드는 SLGAEQ의 아미노산 서열(서열 번호 9, 이하 "6-mer")을 가진다.
다른 바람직한 실시양태에 따르면, 합성 펩티드는 서열 번호 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 또는 26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다. 일 예에서, X1은 알라닌(A)이고, X2는 류신(L)이고, X3은 글리신(G)이고, X4는 알라닌(A)이고, X5는 글루타민(Q)이고, 합성 펩티드는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Sa"). 다른 예에서, X1은 세린(S)이고, X2는 알라닌(A)이고, X3은 글리신(G)이고, X4는 알라닌(A)이고, X5는 글루타민(Q)이고, 합성 펩티드는 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer La"). 또 다른 예에서, X1은 세린(S)이고, X2는 류신(L)이고, X3 및 X4는 독립적으로 알라닌(A)이고, X5는 글루타민(Q)이고, 합성 펩티드는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Ga"). 또 다른 예에서, X1은 세린(S)이고, X2는 류신(L)이고, X3은 글리신(G)이고, X4는 글리신(G)이고, X5는 글루타민(Q)이고, 합성 펩티드는 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Ag"). 또 다른 예에서, X1은 세린(S)이고, X2는 류신(L)이고, X3은 글리신(G)이고, X4 및 X5는 독립적으로 알라닌(A)이고, 합성 펩티드는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Qa"). 추가 예에서, X1은 세린(S)이고, X2는 이소류신(I)이고, X3은 글리신(G)이고, X4는 알라닌(A)이고, X5는 글루타민(Q)이고, 합성 펩티드는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Li"). 다른 예에서, X1은 세린(S)이고, X2는 류신(L)이고, X3은 발린(V)이고, X4는 알라닌(A)이고, X5는 글루타민(Q)이고, 합성 펩티드는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Gv"). 또 다른 예에서, X1은 세린(S)이고, X2는 류신(L)이고, X3은 아스파라긴(N)이고, X4는 알라닌(A)이고, X5는 글루타민(Q)이고, 합성 펩티드는 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Gn"). 또 다른 예에서, X1은 세린(S)이고, X2는 류신(L)이고, X3은 글리신(G)이고, X4는 글루탐산(E)이고, X5는 글루타민(Q)이고, 합성 펩티드는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Ae"). 추가 예에서, X1은 세린(S)이고, X2는 류신(L)이고, X3은 글리신(G)이고, X4는 알라닌(A)이고, X5는 아스파라긴(N)이고, 합성 펩티드는 서열 번호 26의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Qn").
추가의 예에서, 6-mer의 X1 및 글루탐산(E)은 독립적으로 L- 또는 D-형태인 반면, 나머지 아미노산 잔기는 모두 L-형태이다. 일 예에서, 6-mer의 X1은 D-형태 알라닌이다(이하 "6-mer dS"). 추가 예에서, 6-mer의 글루타민(Q)은 D-형태이다(이하 "6-mer dE").
본 개시내용의 제2 측면은 망막 변성 질환 또는 조직 손상을 치료하기에 적합한 의약 및/또는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 의약 또는 조성물은 유효량의 상기 기재된 합성 펩티드, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
일부 바람직한 실시양태에 따르면, 합성 펩티드는 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는다(이하, 6-mer). 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 합성 펩티드는 서열 번호 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22 또는 26 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖는다. 일 예에서, 합성 펩티드는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Sa"). 다른 예에서, 합성 펩티드는 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer La"). 다른 예에서, 합성 펩티드는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Ga"). 다른 예에서, 합성 펩티드는 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Ag"). 추가의 예에서, 합성 펩티드는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Qa"). 추가 예에서, 합성 펩티드는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Li"). 다른 예에서, 합성 펩티드는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Gv"). 또 다른 예에서, 합성 펩티드는 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Gn"). 추가의 예에서, 합성 펩티드는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Ae"). 또 다른 예에서, 합성 펩티드는 서열 번호 26의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Qn").
일부 실시양태에서, 6-mer 합성 펩티드(서열 번호 9)는 적어도 하나의 D-형태 아미노산 잔기를 갖는다. 바람직하게는, 6-mer의 두 번째, 세 번째, 네 번째 및 여섯 번째 잔기는 독립적으로 L-형태인 반면, 첫 번째 및 다섯 번째 아미노산 잔기는 L- 또는 D-형태이다. 일 예에서, 6-mer의 첫 번째 잔기는 D-형태 알라닌이다(6-mer dS). 또 다른 예에서, 6-mer의 다섯 번째 잔기는 D-형태 글루탐산이다(6-mer dE).
본 발명의 의약 또는 조성물에 의해 치료가능한 망막 변성 질환은 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 황반 부종, 연령 관련 황반 변성(AMD), 색소성 망막염(RP), 백내장, 녹내장 또는 급성 UV 망막병증 중 어느 하나이다.
본 발명의 의약 또는 조성물에 의해 치료가능한 조직 손상은 안구건조질환(DED) 또는 망막 허혈/재관류 손상이다.
본 개시내용의 의약 또는 조성물은 혈관내 전달(예를 들어, 주사 또는 주입), 경구, 장, 직장, 폐(예를 들어, 흡입), 비강, 국소(경피, 협측 및 설하 포함), 방광내, 유리체내, 결막하, 복강내, 질, 뇌 전달(예를 들면, 뇌실내 및 뇌내), CNS 전달(예를 들면, 척수강내, 척수주위 및 척수내) 또는 비경구(예를 들면, 피하, 근육내, 정맥내 및 피내), 경점막 투여 또는 임플란트를 통한 투여, 또는 당업계에 공지된 다른 전달 경로를 통해 대상에게 투여될 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 제3 측면은 망막 변성 질환 또는 조직 손상을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 망막 변성 질환 또는 조직 손상과 관련된 증상을 개선 또는 완화하기 위해 상기 기재된 본 개시내용의 의약 또는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
모든 실시양태에서, 대상은 인간이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 합성 펩티드는 대상에게 0.001 내지 100 mg/Kg의 양으로 투여된다.
본 개시내용의 하나 이상의 실시양태의 세부사항이 아래에 수반되는 설명에서 기술된다. 본 개시내용의 다른 특징 및 이점은 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
특허 또는 출원 파일에는 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면이 포함된다. 컬러 도면(들)이 있는 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청시 필요한 수수료를 지불하면 청에서 제공할 것이다. 본 설명은 첨부 도면에 비추어 다음의 상세한 설명으로부터 더 잘 이해될 것이며, 여기서,
도 1. 글루타메이트 유도 Neuro-2a 세포 사멸에 대한 본 개시내용의 짧은 합성 펩티드의 효과 분석. 세포를 합성 펩티드로 4시간 동안 전처리하였다. 100 mM 글루타메이트에 6시간 노출 후 Neuro-2a 세포의 배지로의 LDH 방출 측정, 평균±SD로 표현됨(n=6). * P<0.05 versus 용매/글루타메이트 처리된 세포.
도 2. C2C12 세포에서 6-mer dS 유도된 서바이빈 발현은 STAT3 의존적 방식에 의한 것이었다. (A) 대표적인 면역블롯은 STAT3의 인산화에 대한 6-mer dS 또는 5-mer dS의 효과를 나타내었다. STAT3이 로딩 대조군으로 사용되었다. (B) 다양한 길이의 합성 펩티드 또는 STAT3 억제제에 의해 유도된 서바이빈 유전자의 발현에 대한 실시간 qPCR 분석. *P<0.002 versus 용매 처리 세포.
도 3. C2C12 세포에서 서바이빈 mRNA 유도에 대한 알라닌 스캐닝 접근법에 의해 생성된 6-mer 변이체의 효과. 세 가지 독립적인 분석이 수행되었으며 데이터는 평균±SD로 표현된다. *P<0.04 versus 용매 대조군.
도 4. C2C12 세포에서 서바이빈 mRNA 유도에 대한 D-형태 아미노산으로의 치환에 의해 생성된 6-mer 변이체의 효과. 세 가지 독립적인 분석이 수행되었으며 데이터는 평균±SD로 표현된다. *P<0.05 versus 용매 대조군.
도 5. C2C12 세포에서 서바이빈 mRNA 유도에 대한 아미노산 치환에 의해 생성된 6-mer 변이체의 효과. 세 가지 독립적인 분석이 수행되었으며 데이터는 평균±SD로 표현된다. *P<0.05 versus 용매 대조군.
도 6. 4-HNE 유도 세포자멸사에 대한 ARPE-19 세포에 미치는 6-mer dS의 보호 효과. 세포에서 24시간 동안 혈청을 제거한 다음 추가 24시간 동안 25 μM 4-HNE에 노출시키기 전에 20 μM 6-mer dS 또는 용매로 전처리하였다. 세포자멸사는 TUNEL 염색(녹색 점)에 의해 결정되었고 Hoechst 33258(청색 점)으로 대조 염색되었다. (A) 세 가지 독립적인 실험의 대표적인 그래프가 도시된다. (B) TUNEL-양성 세포의 수를 조건당 2000개의 계수된 세포 집단으로 나누어 세포 사멸의 백분율을 정량화하였다. TUNEL, 말단 데옥시-뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 매개 dUTP 닉 말단 라벨링(nick end-labeling). aP<0.00003 versus 용매 처리 세포. bP<0.0006 versus 용매/4-HNE 처리 세포.
도 7. 6-mer 변이체 처리 없이 또는 처리하에 I/R 손상 후 20시간에 눈에서 TUNEL 염색된 래트 망막의 대표적인 이미지. 망막 섹션을 TUNEL(녹색) 및 Hoechst 33258(청색)으로 염색하였다. GCL, 신경절 세포층; INL, 내부 핵층; ONL, 외부 핵층.
도 8. 6-mer dS 처리 없이 또는 처리하에 I/R 손상 후 14일에 준비된 눈에서 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색된 래트 망막 섹션의 대표적인 사진. 대조군과 6-mer dS + I/R 그룹에서 GCL과 INL은 명확하고 잘 조직되었다. 원 배율×200.
도 9. I/R 손상 2주 후 비-허혈성(대조군) 및 허혈성 망막에서 미세아교세포 및 성상세포 면역염색 패턴의 대표적인 이미지. 망막 섹션을 Iba-1(녹색, 미세아교세포 마커), GFAP(녹색, 성상세포 마커) 및 Hoechst 33258(청색)으로 염색하였다. 대표적인 그래프는 세 가지 독립적인 실험으로부터의 것이며 400× 배율에서 얻었다.
도 10. I/R 손상 후 2주에 반대쪽 눈(샴(sham)) 및 허혈성 망막에서 변성된 모세혈관의 대표적인 이미지. 래트의 망막 미세혈관을 이소렉틴 GS-IB4(적색)로 염색하고 Hoechst 33258(청색, 혈관주위세포 핵 염색)으로 대조염색하였다. 화살표: 얇은 관이 있고 핵이 없는 변성 모세혈관. 실험은 세 가지 독립적인 실험에서 이루어졌다. 원 배율×400.
도 11. STZ 주사 후 2주에 비히클 또는 6-mer dS 점안제로 처리된 당뇨병 마우스에서 편평 장착된 망막의 대표적인 형광 이미지. 혈관 투과성을 FITC-BSA의 복강내 주사로 결정하였다. 화살표는 망막에 FITC-BSA가 축적된 혈관 출혈 병변을 가리킨다. 평균±SD로 표시되는 망막의 출혈 부위 수(그룹당 n=6). 원 배율×200. *P<0.007 versus 비히클/STZ 그룹.
도 12. STZ 주사 후 2주에 비히클 또는 6-mer dS 점안제로 처리된 당뇨병 마우스 및 샴 대조군의 망막에서 GFAP-양성 성상세포의 대표적인 형광 이미지. 세 가지 독립적인 실험에서 얻은 데이터(그룹당 n=6). 원 배율×400. *P<0.0002 versus 비히클/STZ 그룹.
도 13. 각막 상피 손상에 대한 6-mer 변이체 펩티드의 효과. C57BL6 마우스를 14일 동안 제어된 환경 챔버(CEC)에 수용하여 안구 표면 파괴를 유도한 다음(0일째), 추가 4일 동안(4일) 6-mer 변이체 펩티드 또는 비히클을 사용하여 건성안증을 치료하였다. (A) 0일 및 4일에 마우스의 대표적인 각막 플루오레세인 염색 이미지. (B) 플루오레세인 염색 정도에 따라 판단되는 각막 상피 손상 점수. 값은 각 그룹에서 평균±SD로 표현된다(n=10). *P<0.000001 versus 0일에 6-mer dS 그룹.
도 14. 토끼 각막 상피 세포에서 고삼투압 스트레스에 의해 유도된 염증유발성 유전자 발현에 대한 6-mer 변이체 펩티드의 효과. 세 가지 독립적인 분석을 수행하고 데이터는 평균±SD로 표현된다. *P<0.003 versus 용매 대조군.
발명의 설명
첨부된 도면과 관련하여 이하에 제공되는 상세한 설명은 본 실시예의 설명으로서 의도되며 본 실시예가 구성되거나 이용될 수 있는 유일한 형태를 나타내고자 하지 않는다. 설명은 실시예의 기능과, 실시예를 구성하고 조작하기 위한 일련의 단계를 설명한다. 그러나, 동일 또는 동등한 기능 및 순서가 상이한 실시예로 달성될 수도 있다.
1. 정의
편의상, 본 개시내용의 문맥에 사용된 특정 용어들을 여기에 모아놨다. 다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본원에 사용된 용어 "펩티드"는 아미노산 잔기의 중합체를 나타낸다. 본원에 사용된 용어 "합성 펩티드"는 자연 발생 단백질 분자 전체를 포함하지 않는 펩티드를 의미한다. 펩티드는 화학적 합성, 재조합 유전자 기술 또는 전 항원의 단편화 등과 같은 기술을 사용하여 인간이 개입하여 생산할 수 있다는 점에서 "합성"이다. 본 개시내용의 전반에 걸쳐, 펩티드 내 임의의 특정 아미노산 잔기의 위치는 펩티드의 N 말단으로부터 시작하여 번호가 매겨진다. 아미노산이 D- 또는 L-아미노산으로 지정되지 않은 경우, 아미노산은 L-아미노산이거나, 특정 이성질체를 필요로 하지 않는 한, D- 또는 L-아미노산일 수 있다. 또한, 폴리펩티드 아미노산 잔기에 대해 본원에서 사용된 표기법은 당업계에서 일반적으로 사용되는 약어들이다.
본원에 기술된 바와 같이, 아미노산 서열에서의 변화가 적어도 90%, 예컨대 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 75%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%를 유지한다면, 단백질/펩티드의 아미노산 서열에서 약간의 변화는 본 발명으로 개시되고 청구된 발명 개념(들)에 포함되는 것으로 고려된다. 본 발명의 합성 펩티드는 그의 생리학적 활성과 무관한 펩티드의 특징을 변경하도록 특이적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산은 본 연구에서 펩티드의 생리학적 활성 (즉, 혈관신생 관련 질환 및/또는 증상을 치료하는 그의 능력)에 영향을 미치지 않고 변경 및/또는 결실될 수 있다. 특히, 보존적 아미노산 치환이 고려된다. 보전적 치환은 아미노산 부류 내에서 그의 측쇄와 관련하여 일어나는 것이다. 유전적으로 인코딩된 아미노산은 일반적으로 다음 부류로 분류된다: (1) 산성 = 아스파테이트, 글루타메이트; (2) 염기성 = 리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성 = 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전 극성 = 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 보다 바람직한 부류는 다음과 같다: 세린 및 트레오닌은 지방족-하이드록시 부류이고; 아스파라긴 및 글루타민은 아미드-함유 부류이며; 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신은 지방족 부류이고; 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 방향족 부류이다. 예를 들어, 이소류신 또는 발린으로의 류신, 글루타메이트로의 아스파테이트, 세린으로의 트레오닌의 분리 치환, 또는 구조적으로 관련이 있는 아미노산으로의 임의의 아미노산의 유사한 치환은, 특히 이러한 치환이 골격 부위 내에 아미노산을 포함하지 않는 경우, 생성된 분자의 결합 또는 성질에 주요한 영향을 미치지 않는 것으로 예상하는 것이 마땅하다. 아미노산 변화가 기능성 펩티드로 이어지는지의 여부는 펩티드 유도체의 특이적 활성을 분석함으로써 용이하게 결정할 수 있다. 단백질/펩티드의 단편 또는 유사체는 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노- 및 카복시-말단은 기능성 도메인의 경계 부근에서 발생한다. 일 예에서, 본 발명의 합성 펩티드의 하나의 아미노산 잔기(예를 들어, 아스파테이트, 발린 또는 페닐알라닌)는 비극성 아미노산 잔기에 의해 (예를 들어, 알라닌에 의해) 보존적으로 치환된다. 다른 예에서, 본 발명의 합성 펩티드의 하나의 아미노산 잔기는 그의 D-형태 아미노산 잔기로 보존적으로 치환되고, 예를 들어 L-형태 세린(S) 및 L-형태 글루탐산(E)은 각각 상응하는 D-형태 잔기로 치환된다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 소정의 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것, 예를 들어, 신경보호 효과를 얻거나 조직 수복 또는 재생을 촉진하는 것을 의미하도록 의도된다. 그 효과는 질환 또는 그의 증세를 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적 및/또는 질환 또는 그 질환에 기인하는 부작용을 부분적 또는 완전히 치유한다는 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에서 사용된 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서 질환의 예방(예를 들어, 예방적), 치유 또는 완화 치료를 포함하며, 다음을 예로 들 수 있다: (1) 질환의 성향을 가지나 아직 이로 진단되지 않은 개체에서 질환 또는 증상(예를 들어, 망막 변성 또는 조직 손상)의 발생 예방 (예를 들어, 예방적), 치유 또는 완화 치료; (2) 질환의 억제(예를 들어, 그의 발생을 저지시킴으로써); 또는 (3) 질환 경감(예를 들어, 질환과 관련된 증세 감소).
용어 "투여된", "투여하는 것" 또는 "투여"는 제한없이 본 발명의 제제(예를 들어, 화합물 또는 조성물)의 정맥내, 근육내, 복강내, 동맥내, 두개내 또는 피하 투여를 포함하는 전달 방식을 지칭하도록 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 합성 펩티드 및/또는 그의 유사체는 각막 표면에 직접 적용을 위해 점안제로서 제형화된다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 합성 펩티드 및/또는 그의 유사체는 피부에 직접 도포를 위해 피부 연고 또는 로션으로서 제형화된다. 추가의 실시양태에서, 본 개시내용의 합성 펩티드 및/또는 그의 유사체는 정맥내 주사와 같이, 사용 전에 적절한 담체(예를 들어, 완충액)와 혼합하기 위한 분말로 제형화된다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 질환의 치료와 관련하여 원하는 결과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 그 투여량에서 효과적인 양을 지칭한다. 예를 들어, 망막 변성 질환의 치료에서, 망막 변성 질환의 임의의 증상을 감소, 예방, 지연 또는 억제 또는 정지시키는 제제(즉, 화합물, 합성 펩티드, 또는 치료 펩티드를 인코딩하는 핵산)가 효과적일 것이다. 유사하게, 조직 수복 또는 재생이 필요한 상태의 치료에서, 상태의 증상을 감소, 예방, 지연 또는 억제 또는 정지시키거나 조직 수복 또는 재생을 촉진하는 제제(즉, 화합물, 합성 펩티드, 또는 치료 펩티드를 인코딩하는 핵산)가 효과적일 것이다. 제제의 유효량은 질환 또는 상태를 치유하는 데 필요하지 않지만 질환 또는 상태의 발병을 지연, 장애 또는 예방하거나, 질환 또는 증상의 증세를 완화시키도록 질환 또는 증상에 대한 치료를 제공할 것이다. 유효량은 지정된 기간에 걸쳐 1회, 2회 또는 그 이상으로 투여될 수 있는 적합한 형태로 1, 2 또는 그 이상의 용량으로 분할될 수 있다.
용어 "대상" 또는 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 본 발명의 합성 펩티드 및/또는 방법에 의해 치료가능한, 인간 종을 포함한 포유동물을 의미하는 것으로 의도된다. "포유동물"이란 용어는 인간, 영장류, 가축 및 농장 동물, 예컨대 토끼, 돼지, 양 및 소; 뿐만 아니라 동물원, 스포츠 또는 애완 동물; 및 마우스 및 래트와 같은 설치류를 포함한 포유류의 모든 구성원을 의미한다. 또한 "대상" 또는 "환자"라는 용어는 특정 성별이 명시되지 않는 한 수컷 및 암컷 성별을 모두 의미한다. 따라서, "대상" 또는 "환자"라는 용어는 본 개시내용의 치료 방법으로부터 혜택을 받을 수 있는 임의의 포유동물을 포함한다. "대상" 또는 "환자"의 예로는 인간, 래트, 마우스, 기니피그, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말, 개, 고양이, 새 및 가금류가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 실시양태에서, 환자는 인간이다.
본 발명의 넓은 범위를 설명하는 수치 범위 및 파라미터가 근사값이긴 해도, 특정 실시예에 기재된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고되었다. 그러나, 모든 수치는 고유적으로 각각의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로 인해 필연적으로 발생하는 특정 오차를 포함한다. 또한, 본원에서 사용된 용어 "약"은 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 10%, 5%, 1% 또는 0.5% 이내를 의미한다. 대안적으로, 용어 "약"은 당업자가 고려할 때 평균의 허용가능한 표준 오차 이내를 의미한다. 작동/작업 실시예의 경우를 제외하고, 또는 달리 명시하지 않는 한, 본원에서 제시된 재료의 양, 지속 시간, 온도, 작동 조건, 양의 비율 등과 같은 모든 수치 범위, 양, 값 및 백분율은 모든 경우에 "약"이라는 용어로 수식된 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 달리 지시되지 않는 한, 본 개시내용 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터는 필요에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 최소한 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수의 수를 고려하고 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.
단수 형태 "a", "및", 그리고 "the"는 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함하도록 본원에서 사용된다.
2. 바람직한 실시예의 상세한 설명
본 개시내용은 적어도 부분적으로, 대상에서 망막 변성 질환 또는 조직 손상의 발병을 치료 및/또는 예방할 수 있는 짧은 합성 펩티드의 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명은 망막 변성 질환 또는 조직 손상의 치료 및/또는 예방을 위한, 새로 동정된 합성 펩티드를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다.
2.1 본 발명의 합성 펩티드
본 개시내용의 짧은 합성 펩티드는 X1X2X3X4EX5(서열 번호 1)로 제시된 아미노산 서열로 이루어지며, 여기서,
X1은 세린(S) 또는 알라닌(A)이고;
X2는 류신(L), 알라닌(A) 또는 이소류신(I)이고;
X3은 글리신(G), 알라닌(A) 또는 발린(V) 또는 아스파라긴(N)이고;
X4는 알라닌(A), 글리신(G) 또는 글루탐산(E)이고;
X5는 글루타민(Q), 알라닌(A) 또는 아스파라긴(N)이고;
X2, X3, X4 및 X5는 독립적으로 L-형태이고, X1 및 E는 독립적으로 L- 또는 D-형태이며;
서열 번호 1이 SLGAEQ(서열 번호 9)의 서열을 가지면, 세린(S) 또는 글루탐산(E)은 D-형태이다.
대안적으로 또는 선택적으로, 합성 펩티드의 아미노산 서열의 N-말단은 아세틸화되고 아미노산 서열의 C-말단은 아미드화된다.
바람직한 일 실시양태에 따르면, 본 개시내용의 합성 펩티드는 SLGAEQ의 아미노산 서열을 갖는다(서열 번호 9, 6-mer). 바람직하게는, 6-mer 합성 펩티드는 내부에 적어도 하나의 D-형태 아미노산 잔기를 포함하고, 따라서 그의 D-형태 유사체를 발생시킨다. 바람직한 일 실시양태에서, 6-mer 펩티드의 세린 잔기는 D-형태이다(6-mer dS). 또 다른 바람직한 실시양태에서, 6-mer 펩티드 내의 글루탐산 잔기는 D-형태이다(6-mer dE).
다른 실시양태에 따르면, 6-mer 합성 펩티드는 내부에 보존적 치환을 가질 수 있고, 이에 의해 서열 번호 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22 또는 26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 유사체를 생성할 수 있다.
본 발명의 합성 펩티드가 하기 표 1에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 합성 펩티드
펩티드명 아미노산 서열 서열 번호
6-mer NH2-Ser-Leu-Gly-Ala-Glu-Gln-COOH
SLGAEQ		 9
6-mer 유사체
6-mer Sa NH2- Ala-Leu-Gly-Ala-Glu-Gln-COOH
ALGAEQ		 12
6-mer La NH2-Ser-Ala-Gly-Ala-Glu-Gln-COOH
SAGAEQ		 13
6-mer Ga NH2-Ser-Leu-Ala-Ala-Glu-Gln-COOH
SLAAEQ		 14
6-mer Ag NH2-Ser-Leu-Gly-Gly-Glu-Gln-COOH
SLGGEQ		 15
6-mer Qa NH2- Ser-Leu-Gly-Ala-Glu-Ala-COOH
SLGAEA		 17
6-mer Li NH2-Ser-Ile-Gly-Ala-Glu-Gln-COOH
SIGAEQ		 19
6-mer Gv NH2-Ser-Leu-Val-Ala-Glu-Gln-COOH
SLVAEQ		 20
6-mer Gn NH2-Ser-Leu-Asn-Ala-Glu-Gln-COOH
SLNAEQ		 21
6-mer Ae NH2-Ser-Leu-Gly-Glu-Glu-Gle-COOH
SLGEEQ		 22
6-mer Qn NH2-Ser-Leu-Gly-Ala-Glu-Asn-COOH
SLGAEN		 26
6-mer D 형태 유사체
6-mer dS NH2-(D-Ser)-Leu-Gly-Ala-Glu-Gln-COOH
SLGAEQ		 9
6-mer dE NH2-Ser-Leu-Gly-Ala-(D-Glu)-Gln-COOH
SLGAEQ		 9
임의의 서열에서 굵은 글씨는 특정 아미노산이 D-형태임을 나타낸다.
바람직한 실시양태에 따르면, 6-mer(서열 번호 9)의 여섯 번째 아미노산 잔기(즉, 글루타민(Q))가 존재해야 하며, 그렇지 않으면 합성 펩티드는 그의 신경보호 활성을 잃을 것이다. 일 실시양태에서, 6-mer로부터 여섯 번째 아미노산 잔기(Q)가 결실되고 5-mer가 임의의 유의한 신경보호 활성이 결여된 5-mer 합성 펩티드(서열 번호 10)가 생성된다.
다른 실시양태에 따르면, 6-mer(서열 번호 9)의 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째 및 여섯 번째 아미노산 잔기는 다른 보존적 아미노산 잔기로 독립적으로 치환될 수 있다. 일 실시양태에서, 6-mer의 첫 번째 잔기(즉, 세린(S))가 알라닌(A)으로 치환되어 서열 번호 12의 아미노산 서열의 합성 펩티드가 생성된다(이하 "6-mer Sa"). 다른 실시양태에서, 6-mer의 두 번째 잔기(즉, 류신(L))가 알라닌(A)으로 치환되어 서열 번호 13의 아미노산 서열의 합성 펩티드가 생성된다(이하 ""6-mer La"). 대안적으로, 6-mer의 류신(L) 잔기가 이소류신(I)으로 치환되어 서열 번호 19의 아미노산 서열의 합성 펩티드가 생성된다(이하 "6-mer Li"). 또 다른 실시양태에서, 6-mer의 세 번째 잔기(즉, 글리신(G))가 알라닌(A)으로 치환되어 서열 번호 14의 아미노산 서열의 합성 펩티드가 생성된다(이하 " 6-mer Ga"). 대안적으로, 6-mer의 글리신(G) 잔기가 발린(V)으로 치환되어 서열 번호 20의 아미노산 서열의 합성 펩티드가 생성된다(이하 "6-mer Gv"). 또 다른 실시양태에서, 6-mer의 네 번째 잔기(즉, 알라닌(A))가 글리신(G)으로 치환되어 서열 번호 15의 아미노산 서열의 합성 펩티드가 생성된다(이하 " 6-mer Ag"). 대안적으로, 6-mer의 알라닌(A) 잔기가 글루탐산(E)으로 치환되고, 합성 펩티드는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Ae"). 추가 실시양태에서, 6-mer의 6번째 잔기(즉, 글루타민(Q))가 알라닌(A)으로 치환되어 서열 번호 17의 아미노산 서열의 합성 펩티드가 생성된다(이하 " 6-mer Qa"). 대안적으로, 6-mer의 글루타민(Q) 잔기가 아스파라긴(N)으로 치환되고, 합성 펩티드는 서열 번호 26의 아미노산 서열을 갖는다(이하 "6-mer Qn").
추가 실시양태에 따르면, 적어도 하나의 D-형태 아미노산 잔기가 6-mer 합성 펩티드에 포함되고, 특히, 6-mer의 위치 2, 3, 4 및 6에 있는 각각의 아미노산 잔기는 L-형태로 남아 있어야 하는 반면, 6-mer의 첫 번째 및 다섯 번째 위치는 L- 또는 D-형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 6-mer의 위치 1 및 5에 있는 아미노산 잔기는 독립적으로 D-형태로 존재하고, 따라서 상기 표 1에 기재된 바와 같이 6-mer의 D-형태 유사체를 생성한다.
본 발명의 합성 펩티드는 당업계의 임의의 표준 펩티드 합성 프로토콜에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 합성 펩티드는 제조사의 프로토콜에 따라 고상 펩티드 합성기(ABI433A 펩티드 합성기, Applied Biosystems Inc., Life Technologies Corp., Foster City, CA, USA)를 사용하여 합성할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 합성 펩티드는 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터에서 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 핵산을 클로닝할 수 있으며, 여기에서 핵산은 숙주 세포에서 본 펩티드를 발현하기에 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 이어, 적합한 숙주 세포에 벡터를 도입하여 펩티드를 발현시킬 수 있다. 발현된 재조합 폴리펩티드는 황산암모늄 침전 및 분별 컬럼 크로마토그래피와 같은 방법에 의해 숙주 세포로부터 정제할 수 있다. 이와 같이 제조된 펩티드는 하기 실시예에 기재된 방법에 따라 그의 활성에 대해 시험될 수 있다.
상기 언급된 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 중합, 생분해성 마이크로입자 또는 마이크로캡슐 전달 장치를 사용함으로써 전달할 수 있다. 숙주에서 핵산의 흡수를 달성하기 위한 다른 방법은 표준 방법으로 제조된 리포좀을 사용하는 것이다. 폴리뉴클레오티드는 단독으로 이들 전달 비히클에 도입되거나 조직 특이적 항체와 함께 도입될 수 있다. 대안적으로, 정전기적 또는 공유 결합력에 의해 폴리-L-리신에 부착된 플라스미드 또는 다른 벡터로 구성된 분자 접합체를 제조할 수 있다. 대안적으로, 당업계에 공지된 조직 특이적 전사 조절 요소의 사용에 의해서 조직 특이적 표적화를 달성할 수 있다. 근육내, 피내 또는 피하 부위로의 "네이키드(naked) DNA"의 전달(즉, 전달 비히클 없이)이 생체 내 발현을 달성하기 위한 또 다른 수단이다.
본 발명의 합성 펩티드는 그의 N-말단 또는 C-말단에서 변형될 수 있다. N-말단 변형의 예는 N-당화, N-알킬화 및 N-아세틸화 아미노산을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 말단 변형은 페길화를 포함할 수 있다. C-말단 변형의 일례는 C-말단 아미드화 아미노산이다. 대안적으로, 하나 이상의 펩티드 결합이 비-펩티딜 연결로 대체될 수 있고, 개별 아미노산 잔기는 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 제제로 처리되어 변형될 수 있다.
다양한 작용기가 또한 화학적 변형이 일어나기 쉬운 합성 펩티드의 다양한 지점에서 첨가될 수 있다. 작용기는 펩티드의 말단에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용기는 합성 펩티드의 안정성, 효능 또는 선택성 개선; 세포막 및/또는 조직 배리어를 통한 합성 펩티드의 침투 개선; 조직 국재화 개선; 독성 또는 제거율 감소; 및 세포 펌프에 의한 추출 저항성 향상 등과 같이, 하나 이상의 특성에 대한 펩티드의 활성을 개선시킨다. 적합한 작용기의 비제한적인 예로는, 예를 들어 펩티드의 친수성을 감소시키고 친유성을 증가시킴으로써 그에 부착된 펩티드가 세포로 운반되는 것을 촉진시키는 것이 있으며, 이들 작용기는 임의로 및 바람직하게는 세포 내부에서 가수분해에 의해 또는 효소적으로 생체 내에서 절단될 수 있다. 하이드록시 보호기는 에스테르, 카보네이트 및 카바메이트 보호기를 포함한다. 아민 보호기는 알콕시 및 아릴옥시 카보닐기를 포함한다. 카복실산 보호기는 지방족, 벤질 및 아릴 에스테르를 포함한다.
펩티드 모방(peptidomimetic) 유기 부위"가 임의로 보존 및 비보존적 치환 모두로서 본 발명의 합성 펩티드의 아미노산 잔기를 대체할 수 있다. 펩티드 모방 유기 부위는 임의로 및 바람직하게는 치환된 아미노산과 유사한 입체, 전자 또는 배열 특성을 갖고, 이러한 펩티드 모방체는 필수 위치에서 아미노산을 치환하는데 사용되며 보존적 치환으로 간주된다. 펩티드 모방체는 임의로 효소 또는 다른 분해 과정에 의한 펩티드의 분해를 억제하는데 사용될 수 있다. 펩티드 모방체는 임의로 및 바람직하게는 유기 합성 기술에 의해 제조될 수 있다. 적합한 펩티드 모방체의 비제한적 예로서는 아미드 결합, 3-아미노-2-프로페니돈-6-카복실산, 하이드록실-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-카복실레이트, 1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-카복실레이트, 및 히스티딘 이소퀴놀론 카복실산을 들 수 있다.
합성 펩티드의 임의의 부분은 작용기 첨가에 의한 것과 같이 화학적으로 임의로 변형될 수 있다. 변형은 임의로 본 발명의 펩티드의 합성 중에 수행될 수 있다. 변형의 비제한적인 예시적 유형은 카복시메틸화, 아실화, 인산화, 당화 또는 지방 아실화를 포함한다. 에테르 결합이 세린 또는 트레오닌 하이드록실을 당의 하이드록실에 결합시키기 위해 임의로 사용될 수 있다. 아미드 결합이 글루타메이트 또는 아스파테이트 카복시기를 당의 아미노기에 결합시키기 위해 임의로 사용될 수 있다. 아세탈 및 케탈 결합이 또한 아미노산과 탄수화물 사이에 형성될 수 있다.
2.2 망막 변성 질환 및/또는 조직 수복 또는 재생이 필요한 상태의 치료를 위한 조성물
본 발명의 합성 펩티드는 망막 변성 질환 및/또는 조직 수복 또는 재생이 필요한 조직 손상으로 고통받는 대상을 치료하는데 적합하다. 따라서, 본 개시내용의 추가의 측면은 본 발명의 합성 펩티드를 포함하는, 망막 변성 질환 및/또는 조직 손상 치료용 의약을 제공하는 것이다.
일 실시양태에서, 의약은 망막 변성 질환, 특히 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 연령 관련 황반 변성(AMD), 색소성 망막염(RP), 녹내장, 또는 급성 UV 망막병증의 치료를 위한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 의약은 조직 손상, 특히 안구건조질환(DED) 또는 망막 허혈/재관류(I/R) 손상의 치료를 위한 것이다.
의약은 적당량의 본 발명의 합성 펩티드를 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하여 제조된다. 특정 실시양태에서, 합성 펩티드는 6-mer, 6-mer Sa, 6-mer La, 6-mer Ga, 6-mer Ag, 6-mer Qa, 6-mer Li, 6-mer Gv, 6-mer Gn, 6-mer Ae, 6-mer Qn, 6-mer dS, 6-mer dE 및 이들의 조합을 포함하나 이들에 제한되지 않는 상술된 바와 같은 펩티드 군으로부터 선택된다.
의약 또는 조성물에 존재하는 펩티드의 양은 사용되는 펩티드에 따라 달라질 것이다. 펩티드는 전형적으로 약 0.001 중량% 내지 약 10 중량%, 예컨대 0.001, 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2., 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.9, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9 및 10.0 중량%의 양, 특히 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%, 예컨대 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2., 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.9, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 및 5.0 중량%의 양으로 조성물에 존재할 것이다.
합성 펩티드와 함께 사용하기 위한 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 관련 분야에 잘 알려져 있으며, 비독성 불활성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화제 또는 제형 보조제를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 전형적인 약학적으로 허용가능한 담체는 물 또는 생리 식염수이다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당류; 옥수수 전분과 같은 전분류; 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 셀룰로스 및 그 유도체; 분말화 트래거칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아 버터 및 좌제 왁스와 같은 부형제; 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; 한천; 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄과 같은 완충제; 알긴산; 및 비독성 윤활유(예컨대, 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트), 착색제, 방출제, 향미제, 방부제 및 항산화제와 같은 다른 제제를 들 수 있지만 이들로만 제한되는 것은 아니다. 조성물은 그 안에 항생제 또는 항진균제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 의약 또는 조성물의 적합한 투여 경로는 혈관내 전달(예를 들어, 주사 또는 주입), 경구, 장내, 직장, 폐(예를 들어, 흡입), 비강, 국소(경피, 협측 및 설하 포함) 방광내, 유리체내, 복강내, 질내, 뇌 전달(예를 들어, 뇌실내 및 뇌내), CNS 전달(예를 들어, 척추강내, 척수주변 및 척수내) 또는 비경구(예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 및 피내), 경점막 투여 또는 임플란트를 통한 투여, 또는 당업계에 공지된 다른 전달 경로이다.
경구 투여에 적합한 약학 조성물은 환제, 정제, 로젠지 또는 경질 또는 연질 캡슐과 같은 개별 투여 단위로서, 또는 분산성 분말 또는 과립으로, 또는 용액 또는 현탁액, 예를 들어 수성 또는 유성 현탁액, 에멀젼, 시럽, 엘릭서 또는 장용 제형으로서 제형화될 수 있다. 바람직한 일례에서, 약학 조성물은 점안제이다. 조성물은 밀봉 바이알 또는 앰풀과 같은 단일 용량 또는 다중 용량 용기에 제공될 수 있으며, 사용 전에 무균 액체 담체(예를 들면, 물 또는 염수)의 첨가를 필요로 하는 동결 건조 상태로 저장될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 약학 조성물은 본 발명의 합성 펩티드를 물, 링거액, 염수, 1,3-부탄디올, 알콜 등과 같은 무균 용매와 혼합 또는 분산시킴으로써 수성 또는 비수성 멸균 주사제로 제형화될 수 있다. 대안적으로, 고정유, 지방산 또는 합성 모노- 또는 디글리세리드가 용매로서 사용될 수 있다. 조성물은 필터를 통해 여과함으로써 멸균될 수 있다.
국소 또는 경피 적용을 위해, 약학 조성물은 일반적으로 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 패치 또는 스프레이로 제형화된다. 안과 제형, 점이제 및 점안제가 또한 본 발명의 범위 내에서 고려된다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 조성물은 눈에 국소 투여된다. 다른 실시양태에 따라, 약학 조성물은 피부 사용을 위한 연고이다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 본 발명의 합성 펩티드 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg(예를 들어, 0.01 내지 50 mg/kg), 예컨대 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 또는 1,000 μg/kg; 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 mg/kg이 환자에게 투여된다. 전형적인 일일 또는 주간 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg 또는 그 이상, 예컨대 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 mg/kg의 범위일 수 있다. 상기 임의의 국소 투여 목적을 위해 이용되는 용량은 일반적으로 하루에 1 내지 수 회, 예를 들어 4회, 6회, 8회 또는 그 이상의 횟수로 투여될 것이다.
폐 투여에 적합한 약학 조성물은 계량 용량의 가압 에어로졸, 네뷸라이저 또는 흡입기에 의해 생성될 수 있는 미세 더스트 또는 미스트로서 제형화된다.
본 발명에 의해 제공되는 약학 조성물은 바람직하게는 키트의 형태로 제공된다. 본 발명에서, "키트"는 운반, 저장 및 그의 동시 또는 연속 투여를 허용하도록 본 발명에 의해 제공되는 합성 펩티드(들) 및/또는 포장된 조성물을 형성하는 추가적인 치료 화합물을 함유하는 제품으로서 이해된다. 따라서, 본 발명의 키트는 각각 본 발명의 합성 펩티드를 함유하고 단일 용량 또는 다중 용량으로 제조될 수 있는 하나 이상의 밀봉 앰풀을 함유할 수 있다. 키트는 추가로 식염수, 링거액, 덱스트로스 및 염화나트륨과 같은 수성 매질; 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필에틸렌 글리콜과 같은 수용성 매질; 및 필요에 따라 수불용성 비히클과 같이 합성 펩티드를 용해시키기에 적합한 비히클을 함유할 수 있다. 키트에 존재할 수 있는 다른 성분은 본 발명의 조성물을 결정된 한계 내에서 유지시키는 것을 허용하는 패키지이다. 이러한 패키지를 제조하는데 적합한 재료는 유리, 플라스틱(폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트 등), 병, 바이알, 종이, 샤세 등을 포함한다.
본 발명의 키트는 키트에 존재하는 상이한 제형을 동시에, 연속적으로 또는 별도로 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 키트는 상이한 성분의 동시, 연속 또는 개별 투여를 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 상기 설명서는 인쇄물의 형태 또는 전자 저장 매체(자기 디스크, 테이프 등), 광학 매체(CD-ROM, DVD) 등과 같이 대상이 읽을 수 있도록 설명서를 저장할 수 있는 전자적 지원 형태일 수 있다. 매체는 추가적으로 또는 대안적으로 상기 설명서를 제공하는 인터넷 웹페이지를 포함할 수 있다.
2.3 망막 변성 질환 및/또는 조직 수복 또는 재생이 필요한 상태의 치료 방법
상술한 바와 같이, 본 발명에 기술된 발견은 망막 변성 질환 및/또는 조직 손상의 예방 및/또는 치료에 유용하다.
따라서, 본 발명은 X1X2X3X4EX5(서열 번호 1)으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 상술된 의약 또는 조성물을 망막 변성 질환 및/또는 조직 손상의 예방과 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 망막 변성 질환 및/또는 조직 손상을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것으로서, 여기에서,
X1은 세린(S) 또는 알라닌(A)이고;
X2는 류신(L), 알라닌(A) 또는 이소류신(I)이고;
X3은 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V) 또는 아스파라긴(N)이고;
X4는 알라닌(A), 글리신(G) 또는 글루탐산(E)이고;
X5는 글루타민(Q), 알라닌(A) 또는 아스파라긴(N)이고;
X2, X3, X4 및 X5는 독립적으로 L-형태이고, X1 및 E는 독립적으로 L- 또는 D-형태이며;
서열 번호 1이 SLGAEQ(서열 번호 9)의 서열을 가지면, 세린(S) 또는 글루탐산(E)은 D-형태이다.
대안적으로 또는 선택적으로, 합성 펩티드의 아미노산 서열의 N-말단은 아세틸화되고 아미노산 서열의 C-말단은 아미드화된다.
대상에게 투여된 경우 의약 및/또는 조성물은 망막 변성 질환 및/또는 조직 수복 또는 재생을 필요로 하는 상태와 관련된 증상을 개선 또는 완화시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 합성 펩티드는 6-mer Sa, 6-mer La, 6-mer Ga, 6-mer Ag, 6-mer Qa, 6-mer Li, 6-mer Gv, 6-mer Gn, 6-mer Ae, 6-mer Qn, 6-mer dS, 6-mer dE 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 상기 기재된 펩티드의 군으로부터 선택된다.
일 실시양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 의약 또는 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 망막 변성 질환, 특히 당뇨병성 망막증, 연령 관련 황반 변성(AMD), 색소성 망막염(RP), 녹내장 또는 급성 UV 망막병증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 의약 또는 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 조직 수복 또는 재생이 필요한 조직 손상, 특히 안구건조질환(DED), 골관절염, 급성 건 파열, 피부 상처, 피부 노화, 주름, 탈모증, 또는 망막 허혈/재관류(I/R) 손상을 치료하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 본 개시내용의 의약 또는 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
모든 실시양태에서, 치료에 적합한 대상은 인간이다.
본 발명은 이제 제한이 아니라 설명의 목적으로 제공되는 하기 실시예를 참조하여 보다 구체적으로 설명될 것이다.
실시예
재료 및 방법
재료
둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 및 소태아혈청(FBS)은 Invitrogen(Carlsbad, CA)에서 구입하였다. Phospho-Stat3(Tyr705) 및 STAT3 항체는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA)에서 구입하였다. STAT3 펩티드 억제제(no. 573096) 및 STAT3 Inhibitor V(no. 573099)는 Calbiochem(La Jolla, CA)에서 구입하였다. 글루타메이트, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 스트렙토조토신(STZ; S0130), 플루오레세인 이소티오시아네이트-소혈청 알부민(FITC-BSA) 및 모든 화학 물질은 모두 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)의 제품이다. 짧은 합성 펩티드는 GenScript(Piscataway, NJ)에 의해 합성되었으며, 각 펩티드는 안정성을 위해 NH2-말단에서 아세틸화 및 COOH-말단에서 아미드화에 의해 변형되었고, 이후 질량 분석법을 사용하여 특성화되었다(>95% 순도).
세포 배양
C2C12 마우스 근모세포 세포주 및 Neuro-2a 마우스 신경모세포 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection)(Manassas, VA)에서 입수하였다. 세포를 DMEM-고 글루코스 배지에서 유지하였다. 인간 망막 색소 상피 세포주인 ARPE-19 세포를 DMEM/F12(둘베코 변형 이글 배지와 햄 F12(Ham's F12)의 1:1 혼합물)에서 배양하였다. 모든 배지에는 5% CO2 분위기의 존재하에 37℃에서 10% FBS, 4 mM 1-글루타민, 1 mM 피루베이트 및 100 U/ml 페니실린-100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충되었다.
Neuro-2a 세포 사멸 평가
Neuro-2a 세포를 24시간 동안 48-웰 배양 플레이트에 시딩(1.5×105 세포/웰)한 다음, 4시간 동안 더 20 μM의 본 발명의 펩티드 (0.5 ml 배지에서 6-mer 7 μg)를 함유하는 신선한 2% FBS-DMEM 배지 0.5 ml에서 배양하였다. 이어, 100 mM 글루타메이트(1M 스톡 및 용매로서 PBS로부터)를 추가 6시간 동안 세포에 첨가하였다. 글루타메이트 유도 세포 사멸을 손상된 세포에 의해 배양 배지로 방출된 락테이트 탈수소효소(LDH) 활성을 측정하여 정량적으로 평가하였다. LDH 활성은 사용 설명서에 따라 PicoProbe™ LDH-Cytotoxicity Fluorometric Assay Kit(Catalog # K314-500; BioVision)를 사용하여 측정하였다. LDH 활성은 형광 산물(Ex/Em = 535/587 nm)을 측정함으로써 자동화된 마이크로플레이트 판독기(UVmax; Molecular Devices, San Francisco, CA)를 사용하여 추정되었다.
웨스턴 블롯 분석
세포 용해, 분획화 및 SDS-PAGE를 이전에 기술된 절차(Yang YC et al., BMC Cancer 2007;7:216)에 따라 수행하였다. 이 연구에 사용된 항체는 Phospho-Stat3 및 STAT3(1:1000배 희석)에 대한 것이다. 적절한 IgG-HRP 이차 항체(Santa Cruz Biotechnology) 및 ECL 시약(Amersham Biosciences)을 사용하여 관심 단백질을 검출하였다.
정량적 실시간 PCR
TRIzol(Invitrogen)을 사용하여 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. oligo(dT) 프라이머와 역전사효소(Superscript III; Invitrogen)를 사용하여 50℃에서 50분 동안 전체 RNA 1 μg으로 cDNA 합성을 수행하였다. 간단히 설명하면, 다음 사이클링 조건으로 DNA Master SYBR Green I 키트(Roche)를 사용하여 LightCycler(Roche, Mannheim, Germany)에서 cDNA의 정량화를 수행하였다: 95℃에서 10분 동안 초기 변성, 이어 95℃에서 10초, 60℃에서 10초 및 72℃에서 10초로 40 사이클, 및 72℃에서 5분 종료 배양. 데이터를 ΔΔCt로 계산하였다. 그런 다음 발현을 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH)의 발현에 대해 정규화하였다. PCR 프라이머는 마우스 서바이빈 센스, 5'-TGCCACGATGGTGATGAAAC-3' (서열 번호 27), 안티센스, 5'-TGACGGGTAGTCTTTGCAGT-3' (서열 번호 28) (등록 번호: NM_001012273.1; PCR 산물: 136 bp); 마우스 GAPDH 센스, 5'-AACGGATTTGGCCGTATTGG-3' (서열 번호 29), 안티센스, 5'-CATTCTCGGCCTTGACTGTG-3' (서열 번호 30) (NM_001289726.1; 149 bp)이다. 토끼 염증성 유전자 발현 분석을 위한 PCR 프라이머는 토끼 TNF-α센스, 5'-CCTGTGCCTCCCTTCACTTA-3' (서열 번호 31), 안티센스, 5'-CCCTTAGGGAGCAGAGGTTC-3' (서열 번호 32) (등록 번호: NM_001082263.1); 토끼 IL-1β 센스, 5'-CCTGTTCTTTGAGGCCGATG-3' (서열 번호 33), 안티센스, 5'-GCCGGAAGCTCTTGTTGTAG-3' (서열 번호 34) (NM_001082201.1); 토끼 GAPDH 센스, 5'-AGGTCATCCACGACCACTTC-3' (서열 번호 35), 안티센스, 5'-GTGAGTTTCCCGTTCAGCTC-3' (서열 번호 36) (등록 번호:NM_001082253.1)이다. PCR 산물 및 GAPDH(글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소) 대조군 mRNA의 사이클 역치(Ct) 값을 사용하여 mRNA의 상대적인 양을 계산하였다.
동물 연구
모든 실험은 맥케이 기념 병원 심의위원회(Mackay Memorial Hospital Review Board(대만))에서 승인을 받았다. 동물 조사 및 안과 수술은 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 시력 및 안과 연구 협회 선언에 따라 수행되었다. 모든 수술은 무균 조건에서 수행되었다.
망막 허혈-재관류(I/R) 동물 모델
실험 절차는 맥케이 기념 병원 심의위원회(대만)에서 승인을 받았다. 모든 수술은 무균 조건에서 수행되었다. 성체 10주령 수컷 스프래그-돌리(Sprague-Dawley) 래트(초기 체중 = 312±11 g)를 자일라진(10 mg/kg)을 복강내 주사하여 마취시켰다. 펩티드를 0.85% 생리 식염수에 1 mM로 용해시키고 I/R 유도 전에 마이크로 주사기로 31-Gneedle을 통해 100 μL 펩티드를 결막하 주사하여 전달하였다. 일반 식염수를 비히클 대조군으로 사용하였다. 4시간 동안 펩티드 또는 비히클 주사 후 래트 I/R을 수행하였다. 0.5% 트로피카미드 및 0.5% 페닐에프린으로 동공을 확장시켰다. 히팅 블랭킷을 사용하여 체온을 37℃로 유지시켰다. 동공 확장 후, 생리 식염수 저장소에 연결된 27 게이지 바늘로 오른쪽 눈의 전방에 캐뉼러를 삽입하였다. 눈 위 150 cm에 저장소를 유지하여 안압(IOP)을 110 mmHg까지 올리고, 홍채의 백색화와 망막의 적색 반사 소실의 관찰로 망막 허혈을 확인하였다. 90분의 허혈 후, 캐뉼러화 바늘을 빼내고 안압을 정상 압력으로 되돌려 망막 동맥으로부터 혈액 공급을 회복하고 재관류 손상을 유도하였다. 적색 반사의 복귀로 재관류가 분명하였다. 0.4% 옥시부프로카인 염산염 1 내지 2 방울을 사용하여 각막 진통을 이루고, 절차 전후에 오플록사신 안과용 젤(0.3%)을 눈에 국소 도포하였다. 모든 실험에서 오른쪽 눈만 사용하였다. 동물 내 대조군으로 왼쪽 눈에 샴 절차를 수행하였다.
I/R-유도 망막 손상의 조직학적 평가
I/R 손상 후 14일에 과량의 펜토바비탈(체중 kg당 100 mg 정맥내)을 사용하여 래트(각 그룹에서 n=6)를 안락사시키고, 안구를 실크 봉합사로 각막의 12시 위치에 표시한 후, 적출하여 4℃에서 24시간 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)에 고정하였다. 고정 후, 전안부를 제거하고 시신경유두를 포함하는 후안구를 등급 에탄올 시리즈로 탈수하고 파라핀에 포매하였다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 위해, 마이크로톰을 사용하여 시신경 유두부를 통해 수직 경선을 따라 5 μm 두께의 섹션을 채취하고 200×에서 aCCD 카메라가 장착된 광학 현미경(Leica, Heidelberg, Germany)으로 관찰하였다. 망막의 I/R 손상 정도를 정량화하기 위해, 전체 중심 망막 두께(OT, GCL에서 ONL 사이), 내부 핵층(INL) 및 외부 핵층(ONL)을 측정하였다. 신경절 세포층(GCL)에서의 세포수를 선형 세포 밀도(200 μm당 세포)를 사용하여 계산하였다. 눈당 3개의 섹션을 평균화하고 6개 눈의 평균을 각 그룹의 대표값으로기록하였다.
I/R-손상 망막의 TUNEL 염색
20시간 동안 I/R 후, 래트(각 그룹에서 n=6)를 펜토바비탈 과다 투여로 안락사시켰다. 적출된 안구를 4℃에서 24시간 동안 4% PFA에 고정시켰다. 고정된 망막 조직을 파라핀에 포매하였다. 망막 세포의 세포자멸사를 확인하기 위해, 시신경 유두를 통해 5 μm 두께의 섹션을 절단하여 탈파라핀화한 후, 재수화하고, 20 μg/mL 프로테이나제 K와 10분 동안 배양한 다음, 말단 데녹시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TdT)-매개 dUTP 닉-말단 라벨링(TUNEL) 기반 키트(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 세포자멸사 세포의 면역 형광 염색을 수행하였다. Hoechst 33258로 7분 동안 대조염색하여 핵 위치를 확인하였다. CCD(charge-coupled device) 카메라(Zeiss AxioCam HRm, Zeiss)가 장착된 에피형광 현미경(epifluorescence microscope)(Zeiss Axioplan 2 이미징; Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 섹션을 관찰하고(×400, 6개 필드/샘플), Axiovert 소프트웨어(Zeiss AxioVision Release 4.8.2, Zeiss)를 사용하여 정량화를 수행하였다. 눈당 3개의 섹션을 평균화하고 6개 눈의 평균을 각 그룹의 대표값으로 기록하였다.
면역형광 염색
탈파라핀화된 망막 섹션을 비특이적 염색을 차단하기 위해 실온에서 20분 동안 0.5% TritonX-100(PBST)을 함유하는 PBS 중 10% 염소 혈청 및 5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단하였다. 37℃에서 3시간 동안 신경교섬유질 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein)(GFAP)(1:100 희석) 또는 Iba-1(1:100 희석)에 대한 일차 항체를 사용하여 염색을 수행하였다. 이어서 슬라이드를 적절한 형광 표지된 이차 항체(1:500 희석)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, Hoechst 33258로 6분 동안 대조염색하였다. 그런 다음, 슬라이드를 PBST로 3회 헹구고 FluorSave™ 시약(Calbiochem)을 장착하고 에피형광 현미경(Zeiss Axioplan 2 이미징; Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다. 눈당 3개의 섹션을 평균화하고 6개 눈의 평균을 각 그룹의 대표값으로 기록하였다.
망막 혈관계 준비 및 분석
I/R 손상 후 14일에 과량의 펜토바비탈을 사용하여 래트(각 그룹에서 n=6)를 안락사시키고, 안구를 4℃에서 밤새 4% PFA로 고정시켰다. 망막을 분리하여 PBST를 5분 동안 투과시킨 다음, 밤새 물로 세척하고 유리 슬라이드에 놓고 37℃에서 30분 동안 2.5% 트립신(50 μl, Invitrogen, Carlsbad, CA)과 함께 인큐베이션하고 가끔 부드럽게 흔들어 주었다. 비혈관 세포를 혈관계에서 브러시로 부드럽게 제거하고 PBS로 세척하였다. 이어, 섹션을 37℃에서 1시간 동안 이소렉틴 GS-IB4(Alexa Fluor 568 접합체, 1:200 희석, Thermo Fisher Scientific)로 염색한 다음, Hoechst 33258로 10분 동안 대조염색하고 PBST로 헹구고 FluorSave™ 시약을 장착한 뒤, 200×에서 에피형광 현미경으로 가시화하였다. 길이를 따라 어디에도 혈관주위세포가 없는 작은 혈관 튜브로 변성 모세혈관을 식별하고 망막 면적의 평방 밀리미터당으로 보고하였다. 눈당 10개의 섹션을 평균화하고 6개 눈의 평균값을 각 그룹의 대표값으로 기록하였다.
당뇨병 마우스의 망막에서 혈관 이상 측정
1일 및 3일에 스트렙토조토신(STZ; 200 mg/kg 체중)을 복강내 주사하여 당뇨병 마우스를 만들었다. STZ는 0.1M 시트레이트 완충액(pH 4.5)에서 새로 제조하였다. 주사 후, 갑작스러운 저혈당 쇼크를 방지하기 위해 마우스에 10% 수크로스를 밤새 공급하였다. 1주(7일) 후, 비공복 혈당 수치가 >500 mg/dl인 마우스를 당뇨병으로 정의하고 실험에 사용하였다. 균형 염 용액(BSS)을 펩티드 비히클(Alcon, Novartis)로 사용하였다. 6-mer 유사체(BSS에 200 μM로 용해) 점안제를 하루에 세 번 눈에 국소 투여하였다. 2주(14일) 후, 마우스에 100 mg/kg의 FITC-BSA를 추가 30분 동안 복강내 주사하여 망막의 혈관 병변(출혈 영역)을 결정하였다. 이어서, 동물을 CO2 흡입에 의해 안락사시키고, 눈을 적출하여 4℃에서 밤새 4% PFA로 고정한 뒤, 유리 슬라이드에 평평하게 장착하여 광학 섹션을 얻었다. 망막의 혈관 병변을 200×에서 에피형광 현미경으로 평평한 마운트의 모든 4개의 망막 사분면에서 점수를 매겼다. 중앙 및 주변 망막 모두의 각 사분면에서 3개의 현미경 필드를 샘플링하고 데이터를 평균 병변수/망막로 표시하였다.
건성안 동물 모델
동물
C57BL/6 마우스(7-8 주령, 각각 체중 약 18 내지 25 g)가 본 모델 시스템에 사용되었다. 모든 마우스는 맥케이 기념 병원 심의위원회(대만)에서 승인된 절차에 따라 동물 시설에서 유지되었다. 모든 동물 실험 절차는 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO 선언에 따라 수행되었다.
건성안 유도
Barabino 등(IVOS (2005) 46(8), 2766-2771)에 의해 이전에 기재된 절차에 따라 14일 동안 제어된 환경 챔버(CEC)에 마우스를 두어 건성안을 유도하였다. CEC에 배치된 마우스를 상대 습도(RH) 25% 미만, 온도 20-22 ℃, 기류 약 15 L/분으로 유지시킨 조건에 하루 12시간씩 노출시켰다. 대조군 마우스는 정상 환경(RH > 50%, 기류 없음, 온도 20-22 ℃)에서 동일한 기간 동안 유지시켰다.
처리
일반적인 인공 눈물 제형인, 균형 염 용액(BSS)에 용해된 1% 카복시메틸셀룰로스(CMC)를 펩티드 비히클로서 사용하였다. 펩티드(100 μM, 한쪽 눈 치료에 사용되는 10 μl 점안제 중 약 0.7 μg 펩티드) 또는 1% CMC 비히클을 1일 3회 눈에 국소 투여하였다. 본 발명의 합성 펩티드가 건성안증에 치료 효과를 발휘할 수 있는지의 여부를 시험하기 위해 마우스를 CEC에 14일 동안 국소 치료 없이 수용한 후 본 펩티드로 4일 동안 처리하였다.
각막 플루오레세인 염색
졸레틸(6 mg/kg) 및 자일라진(3 mg/kg)의 혼합물을 복강내 주사하여 동물을 마취시켰다. 국소 플루오레세인(Fluor-I-Strip, Ayerst Laboratories, Philadelphia, PA)으로 염색하여 각막 상피 손상을 결정하였다. 각막 플루오레세인 염색을 코발트 블루광 아래 슬릿 램프 생체현미경으로 검사하고 디지털 카메라로 촬영하였다. 각막의 염료 염색을 다음과 같이 블라인드 방식으로 점수를 매겼다: 구두점 염색이 없는 경우 0점; 각막의 1/3 미만이 염색된 경우 1점; 2/3 이하가 염색된 경우 2점; 3분의 2 이상이 염색되면 3점(Horwath-Winter J 2013).
각막 상피 세포 배양 및 처리
변연 줄기 상피 세포(LSEC)를 6개월령 뉴질랜드 흰 토끼에서 단리하고 DMEM/F-12 기초 배지 기반 세포 현탁액 배양에 의해 14일 동안 연속적으로 배양하여 이전에 기술된 바와 같이(Ho et al., Stem Cells. 2013;31:1775) 각막 유사 상피 세포 분화를 달성하였다. LSEC(6웰 플레이트의 웰당 2×105 세포)를 20 μM 6-mer 변이체 펩티드와 혼합된 2% FBS 함유 기초 배지로 6시간 동안 처리한 다음, 90 mM NaCl로 직접 처리하여 세포가 고삼투압(HOP)을 겪게 하였다. 3시간 후, 정량적 실시간 PCR을 사용하여 HOP-유도 종양 괴사 인자(TNF)-α 및 인터루킨-1 베타(IL-1β) 발현을 추정하였다. DMEM/F-12 기초 배지(309 mOsm)에서 배양된 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
통계
결과를 세 가지 독립적인 실험에서 얻었다. 모든 수치는 평균±SD로 표현되었다. 만-휘트니(Mann-Whitney) 검정을 사용하여 두 그룹의 비교를 수행하였다. P<0.05를 유의미한 것으로 간주하였다.
실시예 1 신경보호 펩티드의 확인 및 특성화
1.1 신경보호 펩티드 확인
본 실시예에서는, 표 2에 열거된 일련의 짧은 합성 펩티드를 합성하고, "재료 및 방법" 섹션에 기재된 절차에 따라 Neuor-2a 신경모세포에서 글루타메이트 유도 세포 사멸에 의해 신경보호 효과를 평가하였다. 또한, 각 합성 펩티드(서열 번호 2 내지 11)의 첫 번째 아미노산 잔기(즉, 세린)는 프로테아제 저항성을 증가시키기 위한 D-형태였다.
간단히 설명하면, 세포를 4시간 동안 지정 펩티드(즉, 서열 번호 2 내지 11 중 임의의 것)로 전처리한 다음, 100 mM 글루타메이트로 6시간 동안 처리하였다. 세포 사멸을 상업용 LDH(락테이트 탈수소효소) 세포독성 분석 키트로 검출하였다. 결과가 도 1에 도시되어 있다.
하기 짧은 합성 펩티드
펩티드명 아미노산 서열 서열 번호
13-mer-dS NH2-(D-Ser)-Leu-Gly-Ala-Glu-Gln-Arg-Thr-Glu-Ser-Ile-Ile-His-COOH SLGAEQRTESIIH 2
12-mer-dS NH2-(D-Ser)-Leu-Gly-Ala-Glu-Gln-Arg-Thr-Glu-Ser-Ile-Ile-COOH SLGAEQRTESII 3
11-mer-dS NH2-(D-Ser)-Leu-Gly-Ala-Glu-Gln-Arg-Thr-Glu-Ser-Ile-COOH SLGAEQRTESI 4
10-mer-dS NH2-(D-Ser)-Leu-Gly-Ala-Glu-Gln-Arg-Thr-Glu-Ser-COOH
SLGAEQRTES		 5
9-mer-dS NH2-(D-Ser)-Leu-Gly-Ala-Glu-Gln-Arg-Thr-Glu-COOH
SLGAEQRTE		 6
8-mer-dS NH2-(D-Ser)-Leu-Gly-Ala-Glu-Gln-Arg-Thr-COOH
SLGAEQRT		 7
7-mer-dS NH2-(D-Ser)-Leu-Gly-Ala-Glu-Gln-Arg-COOH
SLGAEQR		 8
6-mer-dS NH2-(D-Ser)-Leu-Gly-Ala-Glu-Gln-COOH
SLGAEQ		 9
5-mer-dS NH2-(D-Ser)-Leu-Gly-Ala-Glu-COOH
SLGAE		 10
4-mer-dS NH2-(D-Ser)-Leu-Gly-Ala-COOH
SLGA		 11
임의의 서열에서 굵은 글씨는 특정 아미노산이 D-형태임을 나타낸다.
도 1에 도시된 바와 같이, 글루타메이트는 경시 세포 사멸을 야기하였다(7.6±0.8%; 글루타메이트가 첨가된 펩티드 용매 DMSO가 양성 대조군으로 사용됨). 흥미롭게도, 6-mer-dS 펩티드(SLGAEQ; 서열 번호 9)만이 Neuro-2a 세포에 대한 보호 효과를 나타낸 반면, 6개 초과 아미노산 잔기를 갖는 펩티드(즉, 13-mer dS 내지 7-mer dS(서열 번호 2 내지 8)뿐 아니라 6개 미만의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드(즉, 5-mer dS 또는 4-mer dS(서열 번호 10 또는 11))는 어떠한 세포 보호 효과도 나타내지 않았다(1.5±0.5% versus 8.2±0.6% - 11.4±0.3%).
결과는 6-mer dS(SLGAEQ; 서열 번호 9)에서 6번째 아미노산 잔기(Gln; Q)가 6-mer의 신경보호 활성을 보존하는 중요한 잔기임을 암시한다. 결과는 또한 아르기닌(R) 잔기(7-mer dS(서열 번호 8)의 마지막 아미노산)가 6-mer의 생체 기능에 대한 억제 역할을 할 수 있음을 시사한다.
1.2 6-mer dS 펩티드의 특성화
1.2.1 6-mer dS 펩티드는 STAT3 의존적 방식으로 서바이빈 발현을 유도한다
서바이빈은 허혈 동안 신경 세포 생존에 중요한 STAT3(신호 전달물질 및 전사 활성제)의 전사 표적이다. 따라서, 본 실시예에서는 STAT3 신호전달이 6-mer dS의 신경보호 효과에 역할을 하는지의 여부를 조사하였다. 결과는 도 2에 도시되어 있다.
웨스턴 블롯 분석은 6-mer dS에 의해 자극된 C2C12 근모세포가 자극 후 5 내지 20분의 기간에 발생하는 STAT3 인산화를 유도하는 것으로 나타내었다. 대조적으로, 5-mer dS는 그러한 효과를 갖지 않았다(도 2, 패널 A).
또한, 6-mer dS로 3시간 동안 자극 후, C2C12 세포에서 서바이빈 mRNA의 수준은 용매-처리된 세포의 수준과 비교하여 2.6배까지 유의하게 증가하였다(도 2, 패널 B). 다른 펩티드(즉, 서열 번호 2 내지 8 또는 10 내지 11 중 임의의 것)로 처리된 C2C12 세포는 그러한 유도를 초래하지 않았다.
STAT3pep 및 STAT3 억제제 V를 포함한 공지된 약리학적 억제제를 또한 사용하여 서바이빈 유도의 분자 메카니즘을 조사하였다. 실시간 qPCR 분석은 6-mer dS에 의해 유도된 서바이빈 mRNA 발현이 STAT3 억제제(즉, STAT3pep 또는 STAT3 억제제 V)로 전처리된 세포에서 2.6배에서 1.3배로 억제되었음을 보여주었다(도 2, 패널 B)
종합하면, 본 실시예에서의 발견은 6-mer dS 펩티드가 STAT3 신호전달 경로의 활성화를 통해 서바이빈 발현을 유도함으로써 신경보호 효과를 발휘함을 제시한다.
1.2.2 글루탐산 잔기는 6-mer dS 펩티드에 의해 유도되는 서바이빈 발현에 중요하다
6-mer dS 펩티드에서 중요한 잔기를 추가로 조사하기 위해, 알라닌 스캐닝 및 아미노산 치환을 각각 사용하여 6-mer dS 펩티드에서 잔기가 알라닌 또는 그의 D-형태 아미노산으로 체계적으로 치환되거나, 또는 돌연변이된 6-mer 변이체를 생성하였다; 이렇게 생성된 6-mer 변이체는 표 3 내지 4에 나열되어 있다.
알라닌 스캐닝 접근법에 의해 생성된 6-mer 변이체
펩티드명 아미노산 서열 서열 번호
6-mer Sa NH2- Ala-Leu-Gly-Ala-Glu-Gln-COOH
ALGAEQ		 12
6-mer La NH2-Ser-Ala-Gly-Ala-Glu-Gln-COOH
SAGAEQ		 13
6-mer Ga NH2-Ser-Leu-Ala-Ala-Glu-Gln-COOH
SLAAEQ		 14
6-mer Ag NH2-Ser-Leu-Gly-Gly-Glu-Gln-COOH
SLGGEQ		 15
6-mer Ea NH2-Ser-Leu-Gly-Ala-Ala-Gln-COOH
SLGAAQ		 16
6-mer Qa NH2-Ser-Leu-Gly-Ala-Glu-Ala-COOH
SLGAEA		 17
D-형태 아미노산으로의 치환에 의해 생성된 6-mer 변이체
펩티드명 아미노산 서열 서열 번호
6-mer dS NH2-(D-Ser)-Leu-Gly-Ala-Glu-Gln-COOH
SLGAEQ		 9
6-mer dL NH2-Ser-(D-Leu)-Gly-Ala-Glu-Gln-COOH
SLGAEQ		 9
6-mer dA NH2-Ser-Leu-Gly-(D-Ala)-Glu-Gln-COOH
SLGAEQ		 9
6-mer dE NH2-Ser-Leu-Gly-Ala-(D-Glu)-Gln-COOH
SLGAEQ		 9
6-mer dQ NH2-Ser-Leu-Gly-Ala-Glu-(D-Gln)-COOH
SLGAEQ 		9
임의의 서열에서 굵은 글씨는 특정 아미노산이 D-형태임을 나타낸다.
돌연변이에 의해 생성된 6-mer 변이체
펩티드명 아미노산 서열 서열 번호
6-mer St NH2-The-Leu-Gly-Ala-Glu-Gln-COOH
TLGAEQ		 18
6-mer Li NH2-Ser-Ile-Gly-Ala-Glu-Gln-COOH
SIGAEQ		 19
6-mer Gv NH2-Ser-Leu-Val-Ala-Glu-Gln-COOH
SLVAEQ		 20
6-mer Gn NH2-Ser-Leu-Asn-Ala-Glu-Gln-COOH
SLNAEQ		 21
6-mer Ae NH2-Ser-Leu-Gly-Glu-Glu-Gln-COOH
SLGEEQ		 22
6-mer Ai NH2-Ser-Leu-Gly-Ile-Glu-Gln-COOH
SLGIEQ		 23
6-mer As NH2-Ser-Leu-Gly-Ser-Glu-Gln-COOH
SLGSEQ		 24
6-mer Ed NH2-Ser-Leu-Gly-Ala-Asp-Gln-COOH
SLGADQ		 25
6-mer Qn NH2-Ser-Leu-Gly-Ala-Glu-Asn-COOH
SLGAEN		 26
실시예 1.2.1의 접근법과 유사하게, C2C12 세포에서 서바이빈 mRNA의 발현 수준을 표 3 내지 5에서 6-mer 변이체의 기능에 대한 지표로 사용하였다. 간단히 설명하면, 저혈청 배지에서 C2C12 세포를 6시간 동안 20 μM 6-mer 변이체로 처리하였다. 실시간 qPCR 분석은 6-mer Sa(1.7-배), 6-mer La(1.5-배), 6-mer Ga(1.6-배), 6-mer Ag(1.5-배) 및 6-mer Qa(1.6-배)가 서바이빈 유도 관점에서 6-mer dS 활성을 부분적으로 유지할 수 있었음을 나타낸다(*P<0.004 versus 용매 대조군; 도 3). 결과는 또한 글루탐산(E) 잔기의 알라닌 치환이 6-mer 활성을 심각하게 손상시킬 것임을 보여주었다.
비천연 아미노산(D-형태 아미노산)으로의 치환에 의해 생성된 6-mer 변이체의 기능과 관련하여, 실시간 qPCR 분석은 D-형태 잔기로 세린(S)의 치환이 용매 대조군과 비교하여 서바이빈 mRNA의 수준을 증가시키고(도 4, dS vs 용매), 따라서 6-mer dS는 양성 대조군으로 작용한 반면, 류신(L), 알라닌(A) 또는 글루타민(Q)의 그의 상응하는 D-형태 잔기로의 치환은 서바이빈 유전자 유도 활성을 상당히 방해할 것임을 보여주었다(도 4, dL, dA 또는 dQ vs 6-mer dS). 글루탐산(E)의 그의 D-형태 잔기로의 치환은 서바이빈 mRNA 수준에서 중간 정도의 유도로 이어졌고(도 4, dE vs 6-mer dS), 이 수준은 용매 대조군의 수준보다 여전히 상당히 높은 것이다.
아미노산은 일반적으로 측쇄(즉, R기)의 특성에 따라 분류되기 때문에, 6-mer의 아미노산 잔기를 R기에서 유사한 특성을 나타내는 다른 잔기로 치환하여 돌연변이를 생성하였다(표 5 참조). 도 5의 실시간 qPCR 분석은 류신(L)을 이소류신(I)으로(6-mer Li), 글리신(G)을 아스파라긴(N)으로(6-mer Gn), 글리신(G)을 발린(V)으로(6-mer Gv), 알라닌(A)을 글루탐산(E)으로(6-mer Ae) 또는 글루타민(Q)을 아스파라긴(N)으로(6-mer Qn)으로 치환하는 것이 독립적으로 용매 대조군과 비교하여 2.1-, 1.5-, 2.3-, 1.5- 및 2.1배로 서바이빈 mRNA를 유도할 수 있음을 보여준다(도 5, *P<0.05). 대조적으로, 세린(S)을 트레오닌(T)으로(6-mer St), 알라닌(A)을 이소류신(I)으로(6-mer Ai), 알라닌(A)을 세린으로(6-mer As), 또는 글루탐산(E)을 아스파르트산(D)으로(6-mer Ed) 치환하는 것은 서바이빈 mRNA 유도를 심각하게 손상시켰다(즉, 기본 수준과 같거나 그보다 아래).
종합적으로, 결과는 6-mer dS(서열 번호 9)의 6개 잔기 중 5개가 아미노산 치환을 허용할 수 있는 반면, 글루탐산 잔기(E)는 6-mer 펩티드의 신경보호 활성에 중요함을 제시한다.
실시예 2 6-mer dS, 6-mer Sa, 6-mer Li, 6-mer Gv, 및 6-mer Qn은 망막 허혈/재관류 손상으로부터 망막을 보호한다
망막 혈관 폐쇄, 급성 녹내장, 당뇨병성 망막병증, 연령 관련 황반 변성(AMD), 망막 박리 및 미숙아 망막병증과 같은 많은 안과 질환은 환자의 실명으로 이어지는 망막 허혈/재관류(I/R) 손상과 관련될 수 있다. 일반적으로, 망막 허혈은 모세혈관 막힘으로 인해 망막 영역에서 에너지 고갈이 초래되고 후속 자연 재관류는 강한 산화 스트레스를 유발할 수 있다. I/R 손상 후 몇 시간 내에 염증 및 세포사가 발생한다. 결국, 이러한 병리학적 반응은 시신경 및 망막 모세혈관 변성으로 이어질 것이다.
본 실시예에서는, "재료 및 방법" 섹션에 기재된 I/R 손상의 래트 모델을 사용하여 신경 망막 세포 및 망막 모세혈관 시스템에 대한 6-mer 변이체 펩티드의 신경보호 효과를 조사하였다. 간단히 설명하면, 6-mer 변이체 펩티드(1 mM, 120 μl)를 I/R 유도 전에 4시간 동안 스프래그-돌리 래트의 결막하 공간에 주입하였다. 그런 다음, 눈의 안압(IOP)을 90분 동안 110 mmHg로 증가시킨 다음 20시간 동안 재관류하여 래트 망막에 I/R 손상을 유도하였다. 그 후, TUNEL 염색을 이용하여 망막 세포의 세포자멸사 수준을 평가하였다. 또한, I/R 손상 14일 후 H&E 염색으로 망막 형태를 분석하였다. 그 결과를 도 6 내지 10 및 표 6 내지 9에 요약하였다.
ARPE-19 세포의 4-하이드록시-2-노네날(4-HNE) 유도 세포자멸사에 대한 6-mer dS 또는 6-mer dE의 보호 효과를 도시하는 도 6을 참조한다. 4-하이드록시-2-노네날(4-HNE)은 지질 산화의 산물로서, 다양한 세포 표적, 특히 단백질이 산화환원 신호 전달에 관여하는 부가물을 형성할 수 있는 가장 강력한 반응성 알데히드 중 하나로 간주된다. 특히, 4-HNE는 ATPase 활성을 손상시키고, 산소 소비를 방해하고, 결국 조기 세포자멸사를 유발함으로써 미토콘드리아에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 6-mer dS는 4-HNE 유도 세포자멸사를 억제할 수 있으며, 6-mer dS는 6-mer보다 더 효과적인 것으로 밝혀졌다(도 6, 패널 B).
6-mer 펩티드(6-mer dS 또는 6-mer St)로 처리되거나 처리없이 I/R 손상 후 눈에서 촬영한 망막 이미지가 도 7에 제공된다. 비히클로 처리된 샴 그룹의 눈에서, 망막 세포 핵은 TUNEL 염색에 대해 음성이었고; 풍부한 녹색 형광 망막 세포 핵이 비히클 + I/R 그룹에서 내부 핵층(INL), 외부 핵층(ONL) 및 신경절 세포층(GCL) 내에서 발견되었다. 대조적으로, 6-mer dS로 처리된 눈에서는 래트 망막의 TUNEL 염색에 의해 더 적은 수의 녹색 형광 핵만이 확인되었으며, 반면, 6-mer St는 그러한 효과가 없었다(즉, I/R 유도 망막 세포 세포자멸사 차단). 특히, 표 6에 요약된 바와 같이, I/R 전에 6-mer Sa, 6-mer Li, 6-mer Gv 또는 6-mer Qn 펩티드의 결막하 주사는 또한 I/R에 의해 유도된 망막 세포자멸사를 감소시켰다.
래트 눈에서 I/R 손상 후 20시간에 망막에서 TUNEL-양성 세포수의 정량적 분석
망막에서 TUNEL 양성 세포수 (/200 μm)
비히클 + I/R 27.2 ± 2.7
6-mer dS + I/R 7.8 ± 1.5*
6-mer Sa + I/R 12.6 ± 1.1*
6-mer Li + I/R 9.8 ± 1.4*
6-mer Gv + I/R 10.4 ± 1.4*
6-mer Qn + I/R 12.5 ± 0.89*
6-mer St + I/R 21.8 ± 1.8
데이터는 평균±표준 편차로 표현된다(n = 그룹당 눈 6개).
*P<0.0001 versus 비히클+I/R.
이제 6-mer dS로 처리되거나 처리없이 I/R 손상 후 눈에서 채취한 H&E 염색된 망막 섹션의 사진인 도 8을 참조한다. 14일 동안 I/R 손상 후, H&E 염색된 망막 단면은 샴 대조군에 비해 감소된 망막 두께(비히클 I/R 그룹)를 나타내었다. 또한, I/R 손상 눈에 6-mer dS의 단일 결막하 주사는 전체 망막 두께를 샴 대조군과 유사한 수준으로 개선하였으며, 이는 6-mer dS 처리가 I/R-유도 망막 변성을 효과적으로 예방할 수 있음을 시사한다. 통계적으로, 6-mer dS + I/R 그룹의 망막 전체, INL 및 ONL 두께는 비히클 + I/R 그룹의 것보다 유의하게 더 컸고 대조군과 비슷하였다(P>0.05)(표 7). 결과는 6-mer dS가 초기 단계(20시간)에 I/R에 의해 유도된 망막 세포자멸사를 방지하는 능력이 있어 I/R 손상 후 14일 동안 전체 망막 두께를 유지하는 능력이 있음을 추가로 입증한다. 이러한 결과는 또한 6-mer 변이체가 망막 변성을 완화하는 신경 보호 효과가 있음을 제시한다.
I/R 손상 후 14일에 H&E 염색에 의한 망막 위축의 조직학적 검사
총 두께(GCL에서 INL까지; μm) P 값
대조군(무손상) 326.2±9.4
비히클 + I/R 260.8±7.1* *P = 0.006 versus 대조군
6-mer dS + I/R 308.9±11.2# #P = 0.01 versus 비히클 + I/R
INL 두께 (μm) P 값
대조군 (무손상) 70.7±2.4
비히클 + I/R 51.6±0.8* *P = 0.0003 versus 대조군
6-mer dS + I/R 71.3±7.5# #P = 0.04 versus 비히클 + I/R
ONL 두께 (μm)
대조군 (무손상) 139.8±4.2 P 값
비히클 + I/R 125.8±4.5* *P = 0.04 versus 대조군
6-mer dS + I/R 133.4±7.7# #P = 0.04 versus 비히클 + I/R
데이터는 평균±표준 편차로 표현된다(n = 그룹당 6).
염증은 추가 망막 세포 사멸을 초래하고, 차례로 혈액-망막 장벽(BRB) 파괴로 이어지는, 지연기 동안 I/R 손상의 일반적인 특징이다. 망막 염증은 당뇨병성 망막병증 및 녹내장과 같은 여러 망막 질환과 관련이 있다. 미세아교세포와 성상세포는 시각 시스템(망막, 시신경 및 뇌의 시각 중심)의 상주 면역 세포이며 주요 효과기 세포로서 염증 스트레스에 반응한다.
도 9에 도시된 바와 같이, I/R 손상 후 14일에 망막 염증의 면역형광 염색은 비히클로 처리된 I/R 손상 눈에서 대조군과 비교하여 Iba-1-양성 미세아교세포 및 GFAP-양성 성상세포의 상당한 활성화가 관찰된 반면, 6-mer dS로 처리된 눈에서는 Iba-1-양성 미세아교세포 및 GFAP-양성 성상세포의 활성화가 덜 두드러지는 것을 확인시켰다. 또한, 2개의 염증 이펙터는 GCL에 매우 근접하고 모든 그룹의 내부 망막 경계를 따라 위치하는 것으로 밝혀졌다. 평균적으로, 6-mer dS + I/R 그룹에 비해 비히클 + I/R 그룹에서 상당히 더 많은 수의 미세아교세포 및 성상세포가 관찰되었다(표 8). 종합적으로, 6-mer dS는 I/R에 의해 자극된 망막의 미세아교세포 및 성상세포의 병리학적 활성화를 효과적으로 억제할 수 있다.
I/R 손상 후 14일에 면역형광 염색에 의한 망막 미세아교세포/성상세포 분석
Iba-1-양성 미세아교세포 (/400× 필드) P 값
대조군 (무손상) 3.3±1.2
비히클 + I/R 24.7±1.6* *P = 0.0000002 versus 대조군
6-mer dS + I/R 5.8±1.0# #P = 0.0000004 versus 비히클 + I/R
GFAP-양성 성상세포 (/400Х 필드) P 값
대조군 (무손상) 6.9±2.0
비히클 + I/R 28.6±2.2* *P = 0.000007 versus 대조군
6-mer dS + I/R 10.3±1.8# #P = 0.000004 versus 비히클 + I/R
데이터는 평균±표준 편차로 표현된다(n = 그룹당 6).
망막 I/R 손상 모델에서, 망막 내피 세포 및 혈관주위세포의 사멸은 무세포 모세혈관으로 이어진다. 6-mer dS 처리가 I/R 손상 후 망막 혈관계를 효과적으로 보호할 수 있는지의 여부를 확인하기 위해, 전체 마운트 망막을 이소렉틴 GS-IB4(내피 세포에 결합하는 형광 표지된 이소렉틴) 및 Hoechst 33258(표시된 세포 핵용 형광 염료)으로 염색하였다. 샴 테스트를 통해 반대쪽 눈에서 얻은 대조군 망막과 비교하여 비히클 처리된 I/R 손상 눈의 망막에서 무세포 모세혈관 수의 증가가 발견되었다(도 10). 변성 모세혈관의 수는 6-mer dS 처리에 의해 감소되었다. 무세포 모세혈관의 정량이 표 9에 요약되어 있다. 또한, 비히클 또는 6-mer dS를 사용한 반대쪽 눈의 샴 테스트 성능은 망막 혈관계에 세포독성 효과가 없었다. 종합적으로, 6-mer dS 펩티드는 망막 미세혈관에 대한 I/R 유도 손상으로부터 보호가 가능하다.
허혈 후 14일에 I/R-손상 망막에서 무세포 모세혈관의 수
무세포 모세혈관의 수 (/mm 2 ) P 값
샴 N.D.
비히클 + I/R 7.2±0.9
6-mer dS + I/R 2.3±0.7# #P = 0.0001 versus 비히클 + I/R
데이터는 평균±표준 편차로 표현된다(n = 그룹당 6).
간단히 설명하면, I/R 동물 모델 연구의 결과는 6-mer dS, 6-mer Sa, 6-mer Li, 6-mer Gv, 및 6-mer Qn을 포함하는 6-mer 변이체가 독립적으로 I/R 유도 신경 및 혈관 손상 뿐만 아니라 망막 염증에 대해 망막을 보호할 수 있음을 확인시켰다. 또한, 동물 연구는 6-mer 변이체의 결막하 주사가 I/R 유도 망막 손상을 치료하기 위한 잠재적인 치료 옵션으로 작용할 수 있음을 제시한다.
실시예 3 6-mer dS는 당뇨병 마우스에서 망막 혈관계를 보호한다
I/R-유도 망막에서 변성 모세혈관의 현미경적 외관은 당뇨병성 망막병증에서 발견되는 무세포 모세혈관의 현미경적 외관과 유사하다. 당뇨병성 망막병증에 대한 6-mer dS의 가능한 유익한 효과를 평가하기 위해, 6-mer dS 또는 비히클 점안제를 STZ 유도 당뇨병 마우스의 눈에 14일 동안 하루에 3번 국소 처리하였다. FITC-BSA(플루오레세인 이소티오시아네이트-소혈청 알부민)의 혈관외 유출을 검출하여 망막 혈관 이상을 조사하였다. 현미경 이미지는 비히클 처리된 당뇨병 마우스의 망막에서 여러 출혈 영역을 나타내었지만(도 11), 6-mer dS 점안제로 처리된 눈은 혈관 병변의 수가 감소하였다(2.8±0.6, 6-mer dS versus 8.2±1.5, 비히클 대조군).
망막에서, 내피 세포, 혈관주위세포 및 성상세포가 공동으로 작용하여 망막내 모세혈관 네트워크 내에 혈액-망막 장벽을 형성하였다. 성상세포는 당뇨병 마우스에서 염증 반응을 증폭시키는 데 참여하고, 이는 차례로 망막에서 혈관 누출에 기여한다. 도 12를 참조하면, STZ 주사 후 14일에 망막의 GFAP 면역형광 염색이 비히클/STZ 그룹에서 (대조군과 비교하여) GFAP-양성 성상세포의 유의한 활성화가 발견된 반면, 6-mer dS/STZ 그룹에서는 덜 두드러졌으며(수/400× 필드: 24.3±2.7 versus 11.0±1.4), 이는 6-mer dS가 당뇨병 마우스의 망막에서 성상세포의 병리학적 활성화를 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다.
비-증식성 당뇨병성 망막병증(NPDR)에 대한 충족되지 않은 치료 요구가 여전히 존재하며, 이는 환자가 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR) 및/또는 당뇨병성 황반 부종(DME)으로 진행되는 것을 예방하는 데 중요하다. 6-mer dS 점안제는 당뇨병성 망막병증의 초기 단계에서 망막 염증과 혈관 이상을 예방하는데 효과적이며 새로운 치료제의 임상 개발 진행을 가능하게 할 수 있다.
실시예 4 6-mer dS는 각막 상처 치유를 촉진한다
중증 안구건조질환(DED)은 일반적으로 손상된 각막 상피를 동반한다. 본 실시예에서는, "재료 및 방법" 섹션에 설명된 절차에 따라 확립된 뮤린 건성안 모델을 사용하여 손상된 각막에 대한 6-mer 변이체 펩티드의 치료 효능을 평가하였다.
간단히 설명하면, 마우스를 14일 동안 제어된 환경 챔버(CEC)에 수용하여(0일로 설정됨) 각막 표면 파괴를 유도하였다. 각막 플루오레세인 염색을 사용하여 각막 표면 손상을 추정하고 염색 점수가 2인 동물(마우스를 CEC에 14일 동안 유지한 후)을 펩티드 처리하였다. DED 치료를 위한 6-mer 변이체 펩티드 제형은 방법 부분에 설명되어 있다. 4일 동안 6-mer dS로 처리한 후, 결과는 0일의 염색 점수와 비교하여 각막 플루오레세인 염색에서 유의한 감소를 나타내었다(점수: 1.4±0.2 versus 3±0; 도 13). 4일 동안 비히클, 6-mer dA 또는 6-mer St를 사용한 처리는 치료 효과가 없었다.
건조 스트레스-유도된 건성안 동물에서 안구 표면 손상이 염증에 의해 유도 및/또는 촉진된다는 것은 잘 알려져 있다. 염증유발성 매개체 중에서, IL-1β 및 TNF-α의 억제가 동물의 건성안 개선에 도움이 된다고 보고되었다. 또한, 상승된 눈물 삼투압이 염증 및 안구 표면 손상을 유발하는 건성안의 핵심 메커니즘으로 생각된다.
6-mer 변이체가 각막 상피 세포에서 염증유발성 유전자 발현에 대한 고삼투압 스트레스의 효과를 억제하는 능력을 갖는지의 여부를 조사하기 위해, 토끼 각막 상피 세포를 분리하고 배양물에서 확장시킨 다음, 고삼투압 배지(463 mOsM, 90 mM NaCl 첨가)에서 세포를 배양하기 전에 6-mer 변이체 펩티드(20 μM)로 6시간 동안 처리하였다. 기초 배지(309 mOsm)에서 배양된 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
세포를 고삼투압 배지에서 3시간 동안 배양한 후, TNF-α 및 IL-1β 유전자 발현을 포함하는 염증유발성 매개체의 mRNA 수준을 실시간 qPCR에 의해 결정하였다. 그 결과, TNF-α 및 IL-1β mRNA는 기초 배지(용매 단독)에서 배양된 세포와 비교하여 각각 12.8배 및 4.5배 유의하게 상향 조절되는 것으로 나타났다(도 14). 그러나, 6-mer dS, 6-mer Sa 또는 6-mer Gv로 6시간 동안 전처리한 세포는 용매 처리 세포와 비교하여 TNF-α 및 IL-1β의 mRNA 발현을 각각 분명히 억제하였다.
염증은 건성안 발달의 주요 요인이다. 결과로부터 6-mer dS, 6-mer Sa 및 6-mer Gv가 실제로 항염증제로 사용될 수 있으며 개선된 각막 상처 치유로 이어질 수 있음이 확인되었다.
종합하면, 앞서 언급된 작업 실시예에 제시된 결과는 본 개시내용의 짧은 합성 펩티드가 신경보호 기능을 갖고, 신경 변성 질환(예를 들어, 망막 변성 질환), 및 조직 수복 및 재생(예를 들어, 망막 허혈/재관류 손상, 상처 치유, 건성안 증후군 등)과 관련된 질환 또는 상태의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있음을 보여준다.
상기 실시양태들의 설명은 단지 예시로서 주어진 것이며, 당업자에 의해 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 상기 명세서, 실시예 및 데이터는 본 발명의 예시적인 실시양태들의 구조 및 사용에 대한 완전한 설명을 제공한다. 본 발명의 다양한 실시양태가 특정 정도로, 또는 하나 이상의 개별 실시양태를 참조하여 상술되었지만, 당업자는 본 발명의 취지 또는 범위로부터 벗어남이 없이 개시된 실시양태에 많은 변경을 가할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> TSAO Yeou-Ping HO Tsung-Chuan <120> SHORT SYNTHETIC PEPTIDE AND THEIR USES FOR TREATING RETINAL DEGENERATIVE DISEASES AND/OR TISSUE INJURIES <130> P4002-PCT <160> 26 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa is Ser or Ala <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa is Leu, Ala or Ile <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa is Gly, Ala, Val or Asn <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa is Ala, Gly or Glu <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa is Gln, Ala or Asn <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa 1 5 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;13-mer-dS <400> 2 Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;12-mer-dS <400> 3 Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;11-mer-dS <400> 4 Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;10-mer-dS <400> 5 Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;9-mer-dS <400> 6 Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;8-mer-dS <400> 7 Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;7-mer-dS <400> 8 Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;6-mer-dS <400> 9 Ser Leu Gly Ala Glu Gln 1 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;5-mer-dS <400> 10 Ser Leu Gly Ala Glu 1 5 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;4-mer-dS <400> 11 Ser Leu Gly Ala 1 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;6-mer Sa <400> 12 Ala Leu Gly Ala Glu Gln 1 5 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;6-mer La <400> 13 Ser Ala Gly Ala Glu Gln 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;6-mer Ga <400> 14 Ser Leu Ala Ala Glu Gln 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;6-mer Ag <400> 15 Ser Leu Gly Gly Glu Gln 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;6-mer Ea <400> 16 Ser Leu Gly Ala Ala Gln 1 5 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;6-mer Qa <400> 17 Ser Leu Gly Ala Glu Ala 1 5 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;6-mer St <400> 18 Thr Leu Gly Ala Glu Gln 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;6-mer Li <400> 19 Ser Ile Gly Ala Glu Gln 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;6-mer Gv <400> 20 Ser Leu Val Ala Glu Gln 1 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;6-mer Gn <400> 21 Ser Leu Asn Ala Glu Gln 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;6-mer Ae <400> 22 Ser Leu Gly Glu Glu Gln 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;6-mer Ai <400> 23 Ser Leu Gly Ile Glu Gln 1 5 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;6-mer As <400> 24 Ser Leu Gly Ser Glu Gln 1 5 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;6-mer Ed <400> 25 Ser Leu Gly Ala Asp Gln 1 5 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic;6-mer Qn <400> 26 Ser Leu Gly Ala Glu Asn 1 5

Claims (22)

  1. X1X2X3X4EX5(서열 번호 1)로 제시된 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드로서, 여기서,
    X1은 세린(S) 또는 알라닌(A)이고;
    X2는 류신(L), 알라닌(A) 또는 이소류신(I)이고;
    X3은 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V) 또는 아스파라긴(N)이고;
    X4는 알라닌(A), 글리신(G) 또는 글루탐산(E)이고;
    X5는 글루타민(Q), 알라닌(A) 또는 아스파라긴(N)이고;
    X2, X3, X4 및 X5는 독립적으로 L-형태이고, X1 및 E는 독립적으로 L- 또는 D-형태이며;
    서열 번호 1이 SLGAEQ(서열 번호 9)의 서열을 가지면, 세린(S) 또는 글루탐산(E)은 D-형태인,
    합성 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 아미노산 서열의 N-말단이 아세틸화되고 아미노산 서열의 C-말단은 아미드화된, 합성 펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 서열 번호 9, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 또는 26의 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드.
  4. 제1항의 합성 펩티드, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 합성 펩티드가 서열 번호 9, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 또는 26의 아미노산 서열을 갖는, 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체는 액체, 겔, 크림 및 연고로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
  7. X1X2X3X4EX5(서열 번호 1)로 제시된 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드의 유효량을 망막 변성 질환 또는 조직 손상을 앓고 있는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상을 치료하는 방법으로서, 여기서,
    X1은 세린(S) 또는 알라닌(A)이고;
    X2는 류신(L), 알라닌(A) 또는 이소류신(I)이고;
    X3은 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V) 또는 아스파라긴(N)이고;
    X4는 알라닌(A), 글리신(G) 또는 글루탐산(E)이고;
    X5는 글루타민(Q), 알라닌(A) 또는 아스파라긴(N)이고;
    X2, X3, X4 및 X5는 독립적으로 L-형태이고, X1 및 E는 독립적으로 L- 또는 D-형태이며;
    서열 번호 1이 SLGAEQ(서열 번호 9)의 서열을 가지면, 세린(S) 또는 글루탐산(E)은 D-형태인,
    방법.
  8. 제7항에 있어서, 아미노산 서열의 N-말단이 아세틸화되고 아미노산 서열의 C-말단은 아미드화된, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 합성 펩티드는 서열 번호 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 또는 26의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  10. 제7항에 있어서, 망막 변성 질환은 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 연령 관련 황반 변성(AMD), 색소성 망막염(RP), 녹내장 또는 급성 UV 망막병증 중 임의의 것인, 방법.
  11. 제7항에 있어서, 조직 손상은 안구건조 질환(DED) 또는 망막 허혈/재관류 손상인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 대상은 인간인 방법.
  13. 망막 변성 질환 또는 조직 손상 치료용 의약의 제조를 위한, X1X2X3X4EX5(서열 번호 1)로 제시된 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드의 용도로서, 여기서,
    X1은 세린(S) 또는 알라닌(A)이고;
    X2는 류신(L), 알라닌(A) 또는 이소류신(I)이고;
    X3은 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V) 또는 아스파라긴(N)이고;
    X4는 알라닌(A), 글리신(G) 또는 글루탐산(E)이고;
    X5는 글루타민(Q), 알라닌(A) 또는 아스파라긴(N)이고;
    X2, X3, X4 및 X5는 독립적으로 L-형태이고, X1 및 E는 독립적으로 L- 또는 D-형태이며;
    서열 번호 1이 SLGAEQ(서열 번호 9)의 서열을 가지면, 세린(S) 또는 글루탐산(E)은 D-형태인,
    용도.
  14. 제13항에 있어서, 아미노산 서열의 N-말단이 아세틸화되고 아미노산 서열의 C-말단은 아미드화된, 용도.
  15. 제13항에 있어서, 합성 펩티드는 서열 번호 9, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 또는 26의 아미노산 서열을 갖는, 용도.
  16. 제13항에 있어서, 망막 변성 질환은 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 연령 관련 황반 변성(AMD), 색소성 망막염(RP), 녹내장 또는 급성 UV 망막병증 중 임의의 것인, 용도.
  17. 제13항에 있어서, 조직 손상은 안구건조 질환(DED) 또는 망막 허혈/재관류 손상인, 용도.
  18. 망막 변성 질환 또는 조직 손상 치료용 의약으로서의 사용을 위한, X1X2X3X4EX5(서열 번호 1)로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드로서, 여기서,
    X1은 세린(S) 또는 알라닌(A)이고;
    X2는 류신(L), 알라닌(A) 또는 이소류신(I)이고;
    X3은 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V) 또는 아스파라긴(N)이고;
    X4는 알라닌(A), 글리신(G) 또는 글루탐산(E)이고;
    X5는 글루타민(Q), 알라닌(A) 또는 아스파라긴(N)이고;
    X2, X3, X4 및 X5는 독립적으로 L-형태이고, X1 및 E는 독립적으로 L- 또는 D-형태이며;
    서열 번호 1이 SLGAEQ(서열 번호 9)의 서열을 가지면, 세린(S) 또는 글루탐산(E)은 D-형태인,
    합성 펩티드.
  19. 제18항에 있어서, 아미노산 서열의 N-말단이 아세틸화되고 아미노산 서열의 C-말단은 아미드화된, 사용을 위한 합성 펩티드.
  20. 제18항에 있어서, 서열 번호 9, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 또는 26의 아미노산 서열을 갖는 사용을 위한 합성 펩티드.
  21. 제18항에 있어서, 망막 변성 질환은 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 연령 관련 황반 변성(AMD), 색소성 망막염(RP), 녹내장 또는 급성 UV 망막병증 중 임의의 것인, 사용을 위한 합성 펩티드.
  22. 제18항에 있어서, 조직 손상은 안구건조 질환(DED) 또는 망막 허혈/재관류 손상인, 사용을 위한 합성 펩티드.
KR1020217035146A 2019-08-27 2019-08-27 짧은 합성 펩티드 및 망막 변성 질환 및/또는 조직 손상 치료를 위한 용도 KR20210145231A (ko)

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