JP2022530632A - 網膜変性疾患及び／又は組織傷害を処置するための短鎖合成ペプチド及びその使用 - Google Patents

Abstract

網膜変性疾患又は組織傷害の処置のための合成ペプチド及びそれを含む組成物がここに開示される。そのような処置を必要とする被検体に本開示の合成ペプチドの治療上有効量を含有する組成物を投与することによって網膜変性疾患又は組織傷害を処置する方法もここに開示される。【選択図】 図２

Description

本開示は、神経保護作用並びに／又は組織修復及び再生作用を有し、したがって網膜変性疾患又は組織傷害の処置又は予防の分野において有用となる短鎖合成ペプチドの発見に関する。

網膜変性は、網膜又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の進行性及び最終的な死によって引き起こされる網膜の悪化である。網膜変性には、動脈若しくは静脈の閉塞、糖尿病網膜症、後水晶体線維増殖症／未熟児網膜症又は（通常は遺伝性の）疾患を含むいくつかの理由がある。これらは、視力障害、夜盲症、網膜剥離、光感受性、トンネル視及び周辺視野の喪失から視野の完全喪失などの多数の異なる様式で存在し得る。網膜変性は、網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病網膜症、白内障、急性ＵＶ網膜症及び緑内障を含む、網膜疾患の多数の異なる形態で見られる。

軟部組織、例えば、血管、皮膚又は筋骨格組織への傷害は、非常に一般的なことである。軟部組織状態は、例えば、皮膚の状態（例えば、虚血性創傷、糖尿病性創傷、外傷性創傷、火傷、皮膚潰瘍及び外科的創傷）、血管状態（例えば、血管疾患、血管傷害及び血管発達不全）、美容状態（例えば、修復、増強又は美化を伴うもの）、筋疾患（例えば、炎症性、神経性及び筋形成性の筋疾患並びに筋ジストロフィー）並びに腱及び靱帯などの結合組織の状態を含み得る。他の軟部組織状態は、組織修復及び細胞再生の減速を引き起こす、皮膚の老化又はストレスへの曝露（例えば、ＵＶ曝露、汚染など）である。皮膚の老化プロセスは、非常に明確な兆候：しわの出現、皮膚の色素沈着の変化、弾力性及び緊密さの喪失、並びに組織の弛緩を特徴とする。

したがって、関連分野において、組織修復及び再生を必要とする網膜変性疾患及び／又は状態を処置及び／又は防止するための改善された薬物療法及び／又は方法のニーズが存在する。

概略として、本開示は、網膜変性疾患及び／又は組織傷害を処置するための新規な化合物及び／又は方法の開発に関する。

そこで、本開示の第１の態様は、網膜変性疾患又は組織傷害を処置することができる短鎖合成ペプチドを提供することを目的とする。短鎖合成ペプチドは、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＥＸ_５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：（配列番号）１）として記載されるアミノ酸配列からなり、
Ｘ_１は、セリン（Ｓ）又はアラニン（Ａ）であり、
Ｘ_２は、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）又はイソロイシン（Ｉ）であり、
Ｘ_３は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、
Ｘ_４は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
Ｘ_５は、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、
Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４及びＸ_５は独立してＬ体であり、Ｘ_１及びＥは独立してＬ体又はＤ体であり、
配列番号１がＳＬＧＡＥＱ（配列番号９）の配列を有する場合には、セリン（Ｓ）又はグルタミン酸（Ｅ）はＤ体である。

任意の実施形態によると、合成ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端がアセチル化され、アミノ酸配列のＣ末端がアミド化される。

ある実施形態によると、Ｘ_１はセリン（Ｓ）であり、Ｘ_２はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ_３はグリシン（Ｇ）であり、Ｘ_４はアラニン（Ａ）であり、Ｘ_５はグルタミン（Ｑ）であり、合成ペプチドはＳＬＧＡＥＱのアミノ酸配列（配列番号９、以下「６量体」）を有する。

他の好適な実施形態によると、合成ペプチドは、配列番号１２、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２又は２６のいずれかであるアミノ酸配列を有する。一実施例では、Ｘ_１はアラニン（Ａ）であり、Ｘ_２はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ_３はグリシン（Ｇ）であり、Ｘ_４はアラニン（Ａ）であり、Ｘ_５はグルタミン（Ｑ）であり、合成ペプチドは配列番号１２のアミノ酸配列（以下、「６量体Ｓａ」）を有する。他の実施例では、Ｘ_１はセリン（Ｓ）であり、Ｘ_２はアラニン（Ａ）であり、Ｘ_３はグリシン（Ｇ）であり、Ｘ_４はアラニン（Ａ）であり、Ｘ_５はグルタミン（Ｑ）であり、合成ペプチドは配列番号１３のアミノ酸配列（以下、「６量体Ｌａ」）を有する。さらに他の実施例では、Ｘ_１はセリン（Ｓ）であり、Ｘ_２はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ_３及びＸ_４は独立してアラニン（Ａ）であり、Ｘ_５はグルタミン（Ｑ）であり、合成ペプチドは配列番号１４のアミノ酸配列（以下、「６量体Ｇａ」）を有する。さらに他の実施例では、Ｘ_１はセリン（Ｓ）であり、Ｘ_２はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ_３はグリシン（Ｇ）であり、Ｘ_４はグリシン（Ｇ）であり、Ｘ_５はグルタミン（Ｑ）であり、合成ペプチドは配列番号１５のアミノ酸配列（以下、「６量体Ａｇ」）を有する。さらに他の実施例では、Ｘ_１はセリン（Ｓ）であり、Ｘ_２はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ_３はグリシン（Ｇ）であり、Ｘ_４及びＸ_５は独立してアラニン（Ａ）であり、合成ペプチドは配列番号１７のアミノ酸配列（以下、「６量体Ｑａ」）を有する。更なる実施例では、Ｘ_１はセリン（Ｓ）であり、Ｘ_２はイソロイシン（Ｉ）であり、Ｘ_３はグリシン（Ｇ）であり、Ｘ_４はアラニン（Ａ）であり、Ｘ_５はグルタミン（Ｑ）であり、合成ペプチドは配列番号１９のアミノ酸配列（以下、「６量体Ｌｉ」）を有する。他の実施例では、Ｘ_１はセリン（Ｓ）であり、Ｘ_２はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ_３はバリン（Ｖ）であり、Ｘ_４はアラニン（Ａ）であり、Ｘ_５はグルタミン（Ｑ）であり、合成ペプチドは配列番号２０のアミノ酸配列（以下、「６量体Ｇｖ」）を有する。さらに他の実施例では、Ｘ_１はセリン（Ｓ）であり、Ｘ_２はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ_３はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ_４はアラニン（Ａ）であり、Ｘ_５はグルタミン（Ｑ）であり、合成ペプチドは配列番号２１のアミノ酸配列（以下、「６量体Ｇｎ」）を有する。さらに他の実施例では、Ｘ_１はセリン（Ｓ）であり、Ｘ_２はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ_３はグリシン（Ｇ）であり、Ｘ_４はグルタミン酸（Ｅ）であり、Ｘ_５はグルタミン（Ｑ）であり、合成ペプチドは配列番号２２のアミノ酸配列（以下、「６量体Ａｅ」）を有する。更なる実施例では、Ｘ_１はセリン（Ｓ）であり、Ｘ_２はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ_３はグリシン（Ｇ）であり、Ｘ_４はアラニン（Ａ）であり、Ｘ_５はアスパラギン（Ｎ）であり、合成ペプチドは配列番号２６のアミノ酸配列（以下、「６量体Ｑｎ」）を有する。

更なる実施例では、６量体のＸ_１及びグルタミン酸（Ｅ）が独立してＬ体又はＤ体であり、アミノ酸残基の残余が全てＬ体である。一実施例では、６量体のＸ_１はＤ体アラニンである（以下、「６量体ｄＳ」）。更なる実施例では、６量体のグルタミン（Ｑ）はＤ体である（以下、「６量体ｄＥ」）。

本開示の第２の態様は、網膜変性疾患又は組織傷害を処置するのに適した医薬品及び／又は組成物を提供することを目的とする。その医薬品又は組成物は、有効量の上述の合成ペプチド、及び薬学的に許容可能な担体を含む。

ある好適な実施形態によると、合成ペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列（以下、６量体）を有する。他の好適な実施形態によると、合成ペプチドは、配列番号１２、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２又は２６のいずれかであるアミノ酸配列を有する。一実施例では、合成ペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列（以下、「６量体Ｓａ」）を有する。他の実施例では、合成ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列（以下、「６量体Ｌａ」）を有する。他の実施例では、合成ペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列（以下、「６量体Ｇａ」）を有する。他の実施例では、合成ペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列（以下、「６量体Ａｇ」）を有する。更なる実施例では、合成ペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列（以下、「６量体Ｑａ」）を有する。更なる実施例では、合成ペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列（以下、「６量体Ｌｉ」）を有する。他の実施例では、合成ペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列（以下、「６量体Ｇｖ」）を有する。さらに他の実施例では、合成ペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列（以下、「６量体Ｇｎ」）を有する。更なる他の実施例では、合成ペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列（以下、「６量体Ａｅ」）を有する。また更なる実施例では、合成ペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列（以下、「６量体Ｑｎ」）を有する。

ある実施形態では、６量体合成ペプチド（配列番号９）は、少なくとも１つのＤ体アミノ酸残基を有する。好ましくは、６量体の第２、第３、第４及び第６の残基は独立してＬ体であり、第１及び第５のアミノ酸残基はＬ体又はＤ体である。一実施例では、６量体の第１の残基は、Ｄ体アラニン（６量体ｄＳ）である。他の実施例では、６量体の第５の残基は、Ｄ体グルタミン酸（６量体ｄＥ）である。

本医薬品又は組成物によって処置可能な網膜変性疾患は、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜色素変性症（ＲＰ）、白内障、緑内障又は急性ＵＶ網膜症のいずれかである。

本医薬品又は組成物によって処置可能な組織傷害は、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）又は網膜虚血／再灌流傷害である。

本開示の医薬品又は組成物は、血管内送達（例えば、注入又は点滴）、経口、経腸、経直腸、経肺（例えば、吸入）、経鼻、（経皮、口腔内及び舌下を含む）局所、膀胱内、硝子体内、結膜下、腹腔内、膣内、脳送達（例えば、脳室内及び脳内）、ＣＮＳ送達（例えば、くも膜下、脊椎周囲及び髄腔内）若しくは非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内及び皮内）、経粘膜投与若しくはインプラントを介した投与、又は当技術で周知の他の送達経路を介して被検体に投与され得る。

本開示の第３の態様は、結果として、網膜変性疾患又は組織傷害を患う被検体を処置する方法に向けられる。その方法は、網膜変性疾患又は組織傷害に関する症状を改善又は軽減するために上述の本開示の医薬品又は組成物を被検体に投与するステップを備える。

全ての実施形態において、被検体はヒトである。

好適な実施形態では、本開示の合成ペプチドは、０．００１～１００ｍｇ／Ｋｇの量で被検体に投与される。

以下に、本発明の１以上の実施形態の詳細を付随する説明において記載する。本発明の他の特徴及び有利な効果は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなる。

特許又は出願の提出は、カラーで制作された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を有する本特許又は特許出願の公報の複写は、請求及び必要な料金の支払いに応じて特許庁によって提供される。本記載は、添付図面を考慮して読まれる以下の詳細な説明からより深く理解される。

本短鎖合成ペプチドの、グルタミン酸誘導性Ｎｅｕｒｏ－２ａ細胞死に対する効果の分析である。細胞を合成ペプチドで４時間、前処置した。１００ｍＭのグルタミン酸への６時間の曝露後のＮｅｕｒｏ－２ａ細胞の培地へのＬＤＨ放出の測定値を、平均±ＳＤ（ｎ＝６）として表す。溶媒／グルタミン酸処置細胞に対して^＊Ｐ＜０．０５である。 Ｃ２Ｃ１２細胞における６量体ｄＳ誘導性サバイビン発現は、ＳＴＡＴ３依存的であった。（Ａ）代表的な免疫ブロットは、６量体ｄＳ又は５量体ｄＳの、ＳＴＡＴ３のリン酸化に対する効果を示した。ＳＴＡＴ３をローディングコントロールとして用いた。（Ｂ）種々の長さの合成ペプチド又はＳＴＡＴ３阻害剤によって誘導されるサバイビン遺伝子発現のリアルタイムｑＰＣＲ分析である。溶媒処置細胞に対して^＊Ｐ＜０．００２である。 アラニンスキャニングアプローチによって作成された６量体変異体の、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるサバイビンｍＲＮＡ誘導に対する効果である。３つの独立したアッセイを行い、データを平均±Ｓ．Ｄ．として表す。溶媒コントロールに対して^＊Ｐ＜０．０４である。 Ｄ体アミノ酸による置換によって作成された６量体変異体の、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるサバイビンｍＲＮＡ誘導に対する効果である。３つの独立したアッセイを行い、データを平均±Ｓ．Ｄ．として表す。溶媒コントロールに対して^＊Ｐ＜０．０５である。 アミノ酸置換によって作成された６量体変異体の、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるサバイビンｍＲＮＡ誘導に対する効果である。３つの独立したアッセイを行い、データを平均±Ｓ．Ｄ．として表す。溶媒コントロールに対して^＊Ｐ＜０．０５である。 ６量体ｄＳの、ＡＲＰＥ－１９細胞に対する４－ＨＮＥ誘導性アポトーシスに対抗する保護効果である。細胞から血清が２４時間にわたって取り除かれ、そして２０μＭの６量体ｄＳ又は溶媒で前処置された後、２５μＭの４－ＨＮＥでさらに２４時間曝露された。アポトーシスを、ＴＵＮＥＬ染色（緑色の点）及びヘキスト３３２５８（青色の点）での対比染色によって決定した。（Ａ）３つの独立した実験による代表的なグラフを示す。（Ｂ）細胞死の割合を、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を条件ごとに２０００個のカウントされた細胞の母集団で除算することによって定量化した。ＴＵＮＥＬは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニックエンドラベリングである。溶媒処置細胞に対して^ａＰ＜０．００００３である。溶媒／４－ＨＮＥ処置細胞に対して^ｂＰ＜０．０００６である。 ６量体変異体の処置無し又は有りでのＩ／Ｒ傷害の２０時間後での眼球によるＴＵＮＥＬ染色されたラット網膜の代表的な画像である。網膜切片をＴＵＮＥＬ（緑）及びヘキスト３３２５８（青）で染色した。ＧＣＬは神経節細胞層であり、ＩＮＬは内顆粒層であり、ＯＮＬは外顆粒層である。 ６量体ｄＳの処置無し又は有りでのＩ／Ｒ傷害の１４日後に調製された眼球によるヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色されたラット網膜切片の代表的な写真である。コントロール群及び６量体ｄＳプラスＩ／Ｒ群では、ＧＣＬ及びＩＮＬは、鮮明で良好に組織化されていた。当初の倍率は、２００倍である。 Ｉ／Ｒ傷害の２週間後の非虚血性（コントロール）及び虚血性網膜における、ミクログリア及びアストロサイトの免疫染色パターンの代表的な画像である。網膜切片を、Ｉｂａ－１（緑、ミクログリアマーカー）、ＧＦＡＰ（緑、アストロサイトマーカー）及びヘキスト３３２５８（青）で染色した。代表的なグラフは、３つの独立した実験によるものであり、４００倍の倍率で得られた。 Ｉ／Ｒ傷害の２週間後での、対側眼（偽）及び虚血性網膜における変性毛細血管の代表的な画像である。ラット網膜微小血管系をイソレクチンＧＳ－ＩＢ４（赤）で染色し、ヘキスト３３２５８（青、周皮細胞核染色）で対比染色した。矢印は、細い管を有して核を有さない変性毛細血管である。実験は、３つの独立した実験によるものである。当初の倍率は、４００倍である。 ＳＴＺ注入後２週間目に、ビヒクル又は６量体ｄＳ点眼薬で処置された糖尿病マウスによるフラットマウントされた網膜の代表的な蛍光画像である。血管透過率を、ＦＩＴＣ－ＢＳＡの腹腔内注入によって決定した。矢印は、蓄積されたＦＩＴＣ－ＢＳＡを有する網膜での血管出血病変を指す。網膜の出血領域の数を、平均±ＳＤ（１群あたりｎ＝６）として表す。当初の倍率は、２００倍である。ビヒクル／ＳＴＺ群に対して^＊Ｐ＜０．００７である。 ＳＴＺ注入後２週間目に、ビヒクル又は６量体ｄＳ点眼薬で処置された偽コントロール及び糖尿病マウスによる網膜におけるＧＦＡＰ陽性アストロサイトの代表的な蛍光画像である。データは、３つの独立した実験によるものである（１群あたりｎ＝６）。当初の倍率は、４００倍である。ビヒクル／ＳＴＺ群に対して^＊Ｐ＜０．０００２である。 角膜上皮傷害に対する６量体変異体ペプチドの効果である。Ｃ５７ＢＬ６マウスを環境制御室（ＣＥＣ）に１４日間収容して眼表面破壊を誘導し（０日目）、そして、６量体変異体ペプチド又はビヒクルを用いたドライアイの処置をさらに４日間行った（４日目）。（Ａ）０日目及び４日目でのマウスによる、代表的な角膜のフルオレセイン染色された画像である。（Ｂ）フルオレセイン染色の程度によって判断される角膜上皮損傷のスコアである。値を、各群（ｎ＝１０）において平均±ＳＤとして表す。０日目での６量体ｄＳ群に対して^＊Ｐ＜０．０００００１である。 ウサギ角膜上皮細胞における高浸透圧ストレスによって誘導される炎症性遺伝子発現に対する６量体変異体ペプチドの効果である。３つの独立したアッセイを行い、データを平均±ＳＤとして表す。溶媒コントロールに対して^＊Ｐ＜０．００３である。

添付図面との関連で以下に与えられる詳細な説明は、本実施例の説明としてのものであり、本実施例が構成又は利用され得る形態のみを示すものではない。その記載は、実施例の機能及び実施例を構成して動作させるためのステップの配列を説明する。ただし、同一又は同等の機能及び配列が、異なる実施例によっても実現され得る。

１．定義
便宜上、本開示の背景において採用される特定の用語をここにまとめる。特に断りがない限り、ここに使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。

ここで使用する用語「ペプチド」は、アミノ酸残基のポリマーを示す。ここで使用されるような用語「合成ペプチド」によって、天然に生じるタンパク質分子全体を含まないペプチドが意味される。ペプチドは、それが化学合成、遺伝子組換え技術又は抗原全体などの断片化などの技術を用いてヒトの介在によって生成され得る点において「合成」のものである。本開示全体を通じて、ペプチド内の任意の具体的なアミノ酸残基の位置は、ペプチドのＮ末端から開始して番号付けされる。アミノ酸がＤ－又はＬ－アミノ酸として指定されない場合、文脈が特定の異性体を要件としない限り、アミノ酸はＬ－アミノ酸であるか、あるいはＤ－又はＬ－アミノ酸のいずれかであり得る。また、ポリペプチドアミノ酸残基についてここで使用される表記は、本技術において一般的に使用されるそれらの略称である。

ここで記載するように、タンパク質／ペプチドのアミノ酸配列の軽微な変形は、そのアミノ酸配列の変形が少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７５％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％など、少なくとも９０％を維持することを条件として、現に開示され、特許請求される発明のコンセプトによって包含されるものとみなされる。本合成ペプチドは、その生理学的活性に関連しないペプチドの特徴を変更するように特異的に修飾され得る。例えば、あるアミノ酸は、この研究におけるペプチドの生理学的活性（すなわち、その血管新生関連の疾患及び／又は状態を処置する能力）に影響を与えることなく変更及び／又は削除可能である。特に、保存的なアミノ酸置換が考慮される。保存的な置換は、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内で起こるものである。遺伝子的にコードされたアミノ酸は、概略として以下のファミリーに分類される：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸、（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン、（３）疎水性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、及び（４）非電荷極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。より好適なファミリーとして、セリン及びスレオニンは脂肪族－水酸基ファミリーであり、アスパラギン及びグルタミンはアミド含有ファミリーであり、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンは脂肪族ファミリーであり、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは芳香族ファミリーである。例えば、イソロイシン又はバリンによるロイシンの単独置換、グルタミンによるアスパラギン酸の単独置換、セリンによるスレオニンの単独置換、又は構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の同様の置換は、特に、置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を関与させない場合に、結果として得られる分子の結合又は特性に大きく影響することはないと期待するのが合理的である。アミノ酸の変更が機能的ペプチドとなるか否かは、ペプチド誘導体の特異的活性をアッセイすることによって容易に判定可能である。タンパク質／ペプチドの断片又は類似体は、当業者によって容易に調製可能である。断片又は類似体の好適なアミノ－及びカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近にある。一実施例では、本合成ペプチドの１つのアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸、バリン又はフェニルアラニン）は、疎水性アミノ酸残基によって（例えば、アラニンによって）保存的に置換される。他の実施例では、本合成ペプチドの１つのアミノ酸残基はそのＤ体アミノ酸残基によって保存的に置換され、例えば、Ｌ体セリン（Ｓ）及びＬ体グルタミン酸（Ｅ）は対応するＤ体残基によってそれぞれ置換される。

ここで使用する用語「処置」は、所望の薬理学的及び／若しくは生理学的作用、例えば、神経保護作用を得ること、又は組織の修復若しくは再生を促進することを意味するものである。作用は、疾患若しくはその症状を完全に若しくは部分的に防止する観点では予防的であり、並びに／又は疾患及び／若しくはその疾患に起因する有害な作用の部分的若しくは完全な治癒の観点では治療的となり得る。ここで使用する「処置」は、哺乳類、特にヒトにおける疾患の防止的（例えば、予防的）、治癒的又は一時的緩和の処置を含み、（１）疾患に罹患しやすいが未だにそれを有しているとは診断されていない個人において疾患若しくは状態（例えば、網膜変性若しくは組織傷害）が発生することの防止的（例えば、予防的）、治癒的若しくは一時的緩和の処置、（２）疾患を（例えば、その進行を停止することによって）阻害すること、又は（３）疾患を軽減すること（例えば、その疾患に関連する症状を軽減すること）を含む。

用語「投与され」、「投与する」又は「投与」は、ここでは互換可能に使用されて、限定することなく、本発明の薬剤（例えば、化合物又は組成物）を静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、動脈内に、頭蓋内に又は皮下に投与することを含む送達のモードをいう。ある実施形態では、本開示の合成ペプチド及び／又はその類似体は、角膜面への直接の塗布のための点眼薬に調合される。他の実施形態では、本開示の合成ペプチド及び／又はその類似体は、皮膚への直接の塗布のための皮膚軟膏又はローションに調合される。更なる実施形態では、本開示の合成ペプチド及び／又はその類似体は、静脈注射などの使用前に適切な担体（例えば、緩衝液）と混合される粉体に調合される。

ここで使用される用語「有効量」は、疾患の処置に関して所望の結果を達成するのに必要な期間にわたる用量での有効量のことである。例えば、網膜変性疾患の処置では、網膜変性疾患のいずれかの症状を軽減させ、予防し、遅延させ、抑制し又は停止させる薬剤（すなわち、治療用ペプチドをコードする化合物、合成ペプチド又は核酸）が有効となる。同様に、組織の修復又は再生を必要とする状態の処置では、状態のいずれかの症状を軽減させ、予防し、遅延させ、抑制し、若しくは停止させ、又は組織の修復若しくは再生を促進する薬剤（すなわち、治療用ペプチドをコードする化合物、合成ペプチド又は核酸）が有効となる。薬剤の有効量は、疾患又は状態を治癒することは要件とされないが、疾患若しくは状態の発症が遅延、阻害若しくは予防され、又は疾患若しくは状態の症状が改善されるように、疾患又は状態に対する処置を与えることになる。有効量は、指定期間全体を通じて１回、２回又はそれ以上の回数で投与される適切な形態で１、２又はそれ以上の用量に分割され得る。

用語「被検体」又は「患者」は、ここでは互換可能に使用され、本発明の合成ペプチド及び／又は方法によって処置可能なヒト種を含む哺乳類を意味するものとする。用語「哺乳類」は、ヒト、霊長類、ウサギ、ブタ、ヒツジ及びウシのような飼育動物及び家畜、その他動物園、競技用又はペット用動物並びにマウス及びラットのような齧歯類を含む哺乳網の全てのメンバーのことである。また、用語「被検体」又は「患者」は、ある性別が具体的に示されない限り雄及び雌の両性別をいうものとする。したがって、用語「被検体」又は「患者」は、本開示の処置方法から利益を得ることができる任意の哺乳類を含む。「被検体」又は「患者」の例は、これに限定されないが、ヒト、ラット、マウス、モルモット、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ及び家禽を含む。例示的実施形態では、患者はヒトである。

発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは概数であるものの、具体的な実施例で説明される数値は可能な限り厳密に報告される。ただし、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的にもたらされる所定の誤差を本来的に含む。また、ここで使用されるように、用語「約」は、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％内を一般に意味する。あるいは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合の平均の許容標準誤差内を意味する。有効な／効果的な実施例以外においても、明示の断りがない限り、ここに開示されるその材料の量、継続時間、温度、動作条件、量の比率などに対するものなどの数値範囲、量、値及び割合の全ては、いずれの場合においても用語「約」によって変更されるものとして理解されるべきである。したがって、逆のことが示されない限り、本開示及び添付の特許請求の範囲で説明される数値パラメータは、所望のように変化し得る概数である。少なくとも、各数値パラメータは、報告される有効数字の数を考慮してかつ通常の四捨五入手段を適用して少なくとも解釈されるべきである。

単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、そうでないことを文脈が明示しない限り、ここでは複数の参照を含むものとして使用される。

２．好適な実施形態の詳細な説明
本開示は、少なくともある程度、被検体が網膜変性疾患又は組織傷害を発症するのを処置及び／又は予防可能な短鎖合成ペプチドの発見に基づく。したがって、本発明は、網膜変性疾患又は組織傷害の処置及び／又は予防に対する、新規に同定された合成ペプチドを備える方法及び組成物を提供する。

２．１ 本合成ペプチド
本開示の短鎖合成ペプチドは、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＥＸ_５（配列番号１）として記載されるアミノ酸配列からなり、
Ｘ_１はセリン（Ｓ）又はアラニン（Ａ）であり、
Ｘ_２はロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）又はイソロイシン（Ｉ）であり、
Ｘ_３は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、
Ｘ_４はアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
Ｘ_５は、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、
Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４及びＸ_５は独立してＬ体である一方で、Ｘ_１及びＥは独立してＬ体又はＤ体であり、
配列番号１がＳＬＧＡＥＱ（配列番号９）の配列を有する場合、セリン（Ｓ）又はグルタミン酸（Ｅ）はＤ体である。

代替的に又は任意に、合成ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端はアセチル化され、アミノ酸配列のＣ末端はアミド化される。

好適な一実施形態によれば、本開示の合成ペプチドは、ＳＬＧＡＥＱ（配列番号９、６量体）のアミノ酸配列を有する。好ましくは、６量体合成ペプチドは、その中に少なくとも１つのＤ体アミノ酸残基を含み、それにより、そのＤ体類似体をもたらす。好適な一実施形態では、６量体ペプチドのセリン残基は、Ｄ体（６量体ｄＳ）である。他の好適な実施形態では、６量体ペプチドのグルタミン酸残基は、Ｄ体（６量体ｄＥ）である。

他の実施形態によれば、６量体合成ペプチドは、その中に保存的置換を有し、それにより、配列番号１２、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２又は２６のいずれかであるアミノ酸配列を有する類似体をもたらし得る。

本合成ペプチドを以下の表１に詳細に示す。

表１ 本合成ペプチド

いずれの配列中の太字も、特定のアミノ酸がＤ体であることを示す。

好適な実施形態によれば、６量体（配列番号９）の第６のアミノ酸残基（すなわち、グルタミン（Ｑ））は存在しなければならず、そうでなければ合成ペプチドはその神経保護活性を喪失する。一実施形態では、６量体による第６のアミノ酸残基（Ｑ）を削除した５量体合成ペプチド（配列番号１０）を生成し、５量体はいずれの有意な神経保護活性も欠乏している。

他の実施形態によれば、６量体（配列番号９）の第１、第２、第３、第４及び第６のアミノ酸残基は、独立して他の保存的アミノ酸残基で置換され得る。一実施形態では、６量体の第１の残基（すなわち、セリン（Ｓ））をアラニン（Ａ）によって置換し、それにより配列番号１２のアミノ酸配列の合成ペプチド（以下、「６量体Ｓａ」）をもたらす。他の実施形態では、６量体の第２の残基（すなわち、ロイシン（Ｌ））をアラニン（Ａ）によって置換し、それにより配列番号１３のアミノ酸配列の合成ペプチド（以下、「６量体Ｌａ」）をもたらす。代替的に、６量体のロイシン（Ｌ）残基をイソロイシン（Ｉ）によって置換し、それにより配列番号１９のアミノ酸配列の合成ペプチド（以下、「６量体Ｌｉ」）をもたらす。さらに他の実施形態では、６量体の第３の残基（すなわち、グリシン（Ｇ））をアラニン（Ａ）によって置換し、それにより配列番号１４のアミノ酸配列の合成ペプチド（以下、「６量体Ｇａ」）をもたらす。代替的に、６量体のグリシン（Ｇ）残基をバリン（Ｖ）によって置換し、それにより配列番号２０のアミノ酸配列の合成ペプチド（以下、「６量体Ｇｖ」）をもたらす。さらに他の実施形態では、６量体の第４の残基（すなわち、アラニン（Ａ））をグリシン（Ｇ）によって置換し、それにより配列番号１５のアミノ酸配列の合成ペプチド（以下、「６量体Ａｇ」）をもたらす。代替的に、６量体のアラニン（Ａ）残基をグルタミン酸（Ｅ）によって置換し、合成ペプチドは配列番号２２のアミノ酸配列（以下、「６量体Ａｅ」）を有する。更なる実施形態では、６量体の第６の残基（すなわち、グルタミン（Ｑ））をアラニン（Ａ）によって置換し、それにより配列番号１７のアミノ酸配列の合成ペプチド（以下、「６量体Ｑａ」）をもたらす。代替的に、６量体のグルタミン（Ｑ）残基をアスパラギン（Ｎ）によって置換し、合成ペプチドは配列番号２６のアミノ酸配列を有する（以下、「６量体Ｑｎ」）。

更なる実施形態によれば、少なくとも１つのＤ体アミノ酸残基が６量体合成ペプチドに含まれ、特に、６量体の２、３、４及び６位でのアミノ酸残基の各々がＬ体のままでなくてはならないが、６量体の第１及び第５位はＬ体であってもよいし、Ｄ体であってもよい。ある実施形態では、６量体の１及び５位でのアミノ酸残基は独立してＤ体であり、したがって上記の表１に示すように６量体のＤ体類似体をもたらす。

本合成ペプチドは、当技術で任意の標準的なペプチド合成プロトコルに従って合成され得る。例えば、本合成ペプチドは、製造者のプロトコルに従って、固相ペプチドシンセサイザー（ＡＢＩ４３３Ａペプチドシンセサイザー、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ、フォスターシティー、カリフォルニア州、米国）の使用によって合成され得る。

代替的に、本合成ペプチドは、組換え技術を用いて調製され得る。例えば、本ペプチドをコードする核酸は発現ベクターにクローニング可能であり、核酸は宿主細胞において本ペプチドを発現するのに適した調節配列に動作可能に連結される。そして、ベクターは、適切な宿主細胞に導入されてペプチドを発現することができる。発現された組換えポリペプチドを、硫酸アンモニウム沈殿及び分画カラムクロマトグラフィーなどの方法によって宿主細胞から精製することができる。このように調製されたペプチドを、以下の実施例に示す方法に従って、その活性について試験することができる。

上記の核酸又はポリヌクレオチドを、当技術で周知のポリマー、生分解性微粒子又はマイクロカプセル送達デバイスの使用によって送達することができる。宿主での核酸の取り込みを達成するための他の様式は、標準的な方法によって調製されたリポソームの使用である。ポリヌクレオチドは、これらの送達ビヒクルに単独で組み込まれ、又は組織特異的な抗体とともに組み込まれ得る。代替的に、ポリ－Ｌ－リジンを付着したプラスミド又は他のベクターから構成される分子複合体は、静電気又は共有結合力によって調製することができる。代替的に、組織特異的標的化は、当技術で周知の組織特異的転写調節要素の使用によって達成され得る。筋肉内、皮内又は皮下部位への「裸のＤＮＡ」の送達（すなわち、送達ビヒクル無し）は、ｉｎ ｖｉｖｏ発現を達成する他の手段である。

本合成ペプチドは、そのＮ末端又はＣ末端で修飾され得る。Ｎ末端修飾の例は、これに限定されないが、Ｎ－糖化、Ｎ－アルキル化及びＮ－アセチル化アミノ酸を含む。末端修飾は、ＰＥＧ化を含み得る。Ｃ末端修飾の例は、Ｃ末端アミド化アミノ酸である。代替的に、１以上のペプチド結合は非ペプチジル結合で置換されてもよく、個々のアミノ酸部分は選択された側鎖又は末端残基と反応可能な薬剤での処置を介して修飾されてもよい。

種々の官能基は、化学修飾の影響を受けやすい合成ペプチドの種々の点に付加もされ得る。官能基は、ペプチドの末端に付加され得る。ある実施形態では、官能基は、合成ペプチドの安定性、有効性又は選択性の改善、細胞膜及び／又は組織バリアを横断する合成ペプチドの浸透の改善、組織局在の改善、毒性又はクリアランスの低減、並びに細胞ポンプ等による排出抵抗の改善などの、１以上の特性に関してペプチドの活性を改善する。適切な官能基の非限定的な例は、例えば、ペプチドの親水性の低減及び親油性の増加によって、そこに付着したペプチドの細胞への輸送を促進するものであり、これらの官能基は、任意に及び好適にはｉｎ ｖｉｖｏで、細胞内で加水分解又は酵素的に切断され得る。ヒドロキシ保護基は、エステル、カーボネート及びカルバメート保護基を含む。アミン保護基は、アルコキシ及びアリールオキシカルボニル基を含む。カルボン酸保護基は、脂肪族、ベンジル及びアリールエステルを含む。

「ペプチド模倣有機部分」は、保存的及び非保存的置換の双方として、本合成ペプチドのアミノ酸残基と任意に置換され得る。ペプチド模倣有機部分は置換されたアミノ酸と同様の立体的、電子的又は配置特性を任意に及び好適に有し、そのようなペプチド模倣物は必須位置のアミノ酸を置換するように使用され、保存的置換とみなされる。ペプチド模倣物は、酵素的又は他の分解プロセスによるペプチドの分解を阻害するように任意に使用され得る。ペプチド模倣物は、任意に及び好適には、有機合成技術によって生成され得る。適切なペプチド模倣物の非限定的な例は、アミド結合の同配体、３－アミノ－２－プロペニドン－６－カルボン酸、ヒドロキシル－１，２，３，４－テトラヒドロ－イソキノリン－３－カルボキシレート、１，２，３，４－テトラヒドロ－イソキノリン－３－カルボキシレート及びヒスチジンイソキノロンカルボン酸を含む。

合成ペプチドの任意の部分は、官能基の付加などによって、任意に化学的に修飾され得る。修飾は、本ペプチドの合成中に任意に行われ得る。非限定的な例示的な修飾の種類は、カルボキシメチル化、アシル化、リン酸化、グリコシル化又は脂肪酸アシル化を含む。エーテル結合は、セリン又はスレオニンのヒドロキシルを糖のヒドロキシルに結合するのに任意に使用され得る。アミド結合は、グルタミン酸又はアスパラギン酸のカルボキシ基を糖のアミノ基に結合するのに任意に使用され得る。アセタール及びケタール結合も、アミノ酸と炭水化物の間に任意に形成され得る。

２．２ 網膜変性疾患及び／又は組織修復若しくは再生を必要とする状態の処置のための組成物
本合成ペプチドは、網膜変性疾患及び／又は組織修復若しくは再生を必要とする組織傷害を患う被検体を処置するのに適している。したがって、本開示の更なる態様は、網膜変性疾患及び／又は組織傷害を処置するための本合成ペプチドを含む医薬品を提供することである。

一実施形態では、医薬品は、網膜変性疾患、特に、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜色素変性症（ＲＰ）、緑内障又は急性ＵＶ網膜症の処置のためのものである。

他の実施形態では、医薬品は、組織傷害、特に、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）又は網膜虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害の処置のためのものである。

医薬品を、適切な量の本合成ペプチドを薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤とともに組成物に混合することによって製造する。特定の実施形態では、合成ペプチドを、６量体、６量体Ｓａ、６量体Ｌａ、６量体Ｇａ、６量体Ａｇ、６量体Ｑａ、６量体Ｌｉ、６量体Ｇｖ、６量体Ｇｎ、６量体Ａｅ、６量体Ｑｎ、６量体ｄＳ、６量体ｄＥ及びそれらの組合せを含むがこれに限定されない、上述のペプチドの群から選択する。

医薬品又は組成物中に存在するペプチドの量は、使用されるペプチドに依存する。ペプチドは、通常は、０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．９、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９及び１０．０重量％などの、約０．００１重量％から約１０重量％の量で、特に、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．９、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９及び５．０重量％などの約０．０１重量％から約５重量％の量で組成物中に存在する。

合成ペプチドとともに使用する薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、関連技術で周知であり、非毒性の不活性固体、半固体若しくは液体充填剤、希釈剤、封入剤又は製剤補助剤を含むが、これに限定されない。標準的な薬学的に許容可能な担体は、水又は生理食塩水である。薬学的に許容可能な担体の例は、非毒性の潤滑剤（例えば、ラウリル硫酸及びステアリン酸マグネシウム）、着色剤、放出剤、着香料、防腐剤及び酸化防止剤などの他の薬剤と同様に、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖、コーンスターチのようなデンプン、セルロース並びにカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのその誘導体、粉末トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、カカオバター及び坐剤ワックスなどの賦形剤、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油などの油、プロピレングリコールのようなグリコール、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル、アガー、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、アルギン酸を含むがこれに限定されない。組成物は、その中に抗生物質又は抗真菌の薬剤をさらに含み得る。

本発明の医薬品又は組成物の適切な投与経路は、血管内送達（例えば、注入又は点滴）、経口、経腸、経直腸、経肺（例えば、吸入）、経鼻、（経皮、口腔内及び舌下を含む）局所、膀胱内、硝子体内、腹腔内、膣内、脳送達（例えば、脳室内及び脳内）、ＣＮＳ送達（例えば、くも膜下、脊椎周囲及び髄腔内）若しくは非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内及び皮内）、経粘膜投与若しくはインプラントを介した投与、又は当技術で周知の他の送達経路である。

経口投与に適した薬学的組成物は、ピル、タブレット、甘味入りの錠剤又は硬質若しくは軟質カプセルなど、分散性の粉末若しくは顆粒など、又は溶液若しくは懸濁液、例えば、水性若しくは油性の懸濁液、乳濁液、シロップ、エリキシル剤若しくは経腸栄養製剤などの、個別の投与単位に処方され得る。好適な一実施例では、薬学的組成物は、点眼薬である。組成物は、封止されたバイアル又はアンプルなどの単回投与又は複数回投与の容器で提示されてもよく、使用前に滅菌液体担体（例えば、水又は生理食塩水）の添加を必要とする凍結乾燥状態で保存されてもよい。

非経口投与に適した薬学的組成物は、本合成ペプチドを水、リンゲル液、生理食塩水、１，３－ブタンジオール、アルコールなどの滅菌溶媒に混合又は分散させることにより、水性又は非水性滅菌注射に処方され得る。あるいは、固定油、脂肪酸又は合成モノグリセリド若しくはジグリセリドが溶媒として用いられてもよい。組成物は、フィルターを通して濾過することによって滅菌され得る。

局所又は経皮適用に対して、薬学的組成物は、一般に、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、パッチ又はスプレーに処方される。眼科用製剤、点耳薬及び点眼薬もまた、本発明の範囲内で考慮される。ある実施形態によれば、発明の組成物は、眼に局所的に投与される。他の実施形態によれば、薬学的組成物は、皮膚に使用する軟膏である。疾患の種類及び重症度に応じて、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０若しくは１，０００μｇ／ｋｇ、又は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９若しくは１００ｍｇ／ｋｇなどの、約１μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０１～５０ｍｇ／ｋｇ）の本合成ペプチドが患者に投与される。標準的な１日又は週１回の投与量は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０ｍｇ／Ｋｇなどの、約０．０１ｍｇ／Ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲となり得る。局所投与の上記の目的のいずれかに利用される投与は、一般に、１日あたり１～数回、例えば、４、６、８又はそれ以上の回数で投与される。

経肺投与に適した薬学的組成物は、定量加圧エアロゾル、ネブライザー又は吸入器を用いて生成され得る細塵又はミストとして処方される。

発明によって提供される薬学的組成物は、好ましくは、キットの形態で提示される。本発明では、「キット」は、その輸送、保存及び同時又は連続投与を可能とするようにパッケージングされた組成物を形成する、本発明によって提供される合成ペプチド及び／又は追加の治療用化合物を含む製品として理解される。したがって、発明のキットは、単回投与又は複数回投与として調製可能な、発明の合成ペプチドをそれぞれ含む１以上の封止アンプルを含み得る。キットは、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース及び塩化ナトリウムなどの水性媒体、アルコール、ポリエチレングリコール、プロピルエチレングリコールなどの水溶性媒体、並びに必要に応じて水不溶性ビヒクルなどの、合成ペプチドを可溶化するのに適したビヒクルを追加的に含み得る。キットに存在し得る他の成分は、発明の組成物を決定された制限内で維持することを可能とするパッケージである。そのようなパッケージを調製するのに適した材料は、ガラス、プラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなど）、ボトル、バイアル、紙、小袋などを含む。

発明のキットは、キットに存在する異なる製剤の同時、連続又は別個の投与についての説明書を追加的に含み得る。したがって、発明のキットは、異なる成分の同時、連続又は別個の投与についての説明書をさらに備え得る。上記説明書は、印刷物の形態で、又は電子記憶媒体（磁気ディスク、テープなど）、光学媒体（ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ）などの、それが被検体によって読み取られ得るように説明書を記憶可能な電子支援の形態であり得る。媒体は、上記の説明書を提供するインターネットウェブページを追加的に又は代替的に含み得る。

２．３ 網膜変性疾患及び／又は組織修復若しくは再生を必要とする状態の処置のための方法
上述のように、本発明中で説明される発見は、網膜変性疾患及び／又は組織傷害の防止及び／又は処置に有用である。

したがって、本発明は、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＥＸ_５（配列番号１）として記載されるアミノ酸配列からなる合成ペプチドであって、
Ｘ_１はセリン（Ｓ）又はアラニン（Ａ）であり、
Ｘ_２はロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）又はイソロイシン（Ｉ）であり、
Ｘ_３は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、
Ｘ_４はアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
Ｘ_５は、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、
Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４及びＸ_５は独立してＬ体であり、Ｘ_１及びＥは独立してＬ体又はＤ体であり、
配列番号１がＳＬＧＡＥＱ（配列番号９）の配列を有する場合、セリン（Ｓ）又はグルタミン酸（Ｅ）はＤ体である、合成ペプチドと、
薬学的に許容可能な担体とを備える、上記の医薬品又は組成物を、それを必要とする被検体に投与するステップを備える、網膜変性疾患及び／又は組織傷害の防止及び／又は処置のための方法に関する。

代替的に又は任意に、合成ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端はアセチル化され、アミノ酸配列のＣ末端はアミド化される。

被検体に投与された場合の医薬品及び／又は組成物は、網膜変性疾患及び／又は組織修復若しくは再生を必要とする状態に関連する症状を改善又は緩和可能である。

特定の実施形態では、合成ペプチドは、６量体Ｓａ、６量体Ｌａ、６量体Ｇａ、６量体Ａｇ、６量体Ｑａ、６量体Ｌｉ、６量体Ｇｖ、６量体Ｇｎ、６量体Ａｅ、６量体Ｑｎ、６量体ｄＳ、６量体ｄＥ及びそれらの組合せを含むがこれらに限定されない上記のペプチドの群から選択される。

一実施形態によれば、本発明は、本発明の医薬品又は組成物を、それを必要とする被検体に投与するステップを備える、網膜変性疾患、特に、糖尿病網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜色素変性症（ＲＰ）、緑内障又は急性ＵＶ網膜症を処置するための方法に関する。

他の実施形態によれば、本発明は、本発明の医薬品又は組成物を、それを必要とする被検体に投与するステップを備える、組織修復又は再生を必要とする組織傷害、特に、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）、骨関節炎、急性腱断裂、皮膚創傷、皮膚老化、しわ、脱毛症又は網膜虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害を処置するための方法に関する。

方法は、本発明の医薬品又は組成物を、それを必要とする被検体に投与するステップを含む。

全ての実施形態では、処置に適した被検体は、ヒトである。

ここで、本発明を、限定ではなく実証の目的のために提供される以下の実施形態を参照してより具体的に説明する。

材料及び方法
材料
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ）及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カールスバッド、カリフォルニア州）から購入した。Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）及びＳＴＡＴ３抗体を、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（ダンバーズ、マサチューセッツ州）から購入した。ＳＴＡＴ３ペプチド阻害剤（Ｎｏ．５７３０９６）及びＳＴＡＴ３阻害剤Ｖ（Ｎｏ．５７３０９９）を、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（ラホーヤ、カリフォルニア州）から購入した。グルタミン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ、Ｓ０１３０）、フルオレセインイソチオシアネート－ウシ血清アルブミン（ＦＩＴＣ－ＢＳＡ）及び全ての化学物質は、全てＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社（セントルイス、ミズーリ州）によるものであった。短鎖合成ペプチドをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）によって合成し、各ペプチドを安定性のためにＮＨ_２末端でのアセチル化及びＣＯＯＨ末端でのアミド化によって修飾し、質量分析によって特徴付けした（＞９５％純度）。

細胞培養
Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞株及びＮｅｕｒｏ－２ａマウス神経芽細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州）によるものであった。細胞をＤＭＥＭ－高グルコース培地で維持した。ヒト網膜色素上皮細胞株であるＡＲＰＥ－１９細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地及びＨａｍ’ｓ Ｆ１２の１：１混合物）で培養した。全ての培地に、３７℃で、５％ＣＯ_２雰囲気の存在下で、１０％のＦＢＳ、４ｍＭのｌ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン－１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足した。

Ｎｅｕｒｏ－２細胞死の評価
Ｎｅｕｒｏ－２ａ細胞を４８ウェル培養プレート（１．５×１０^５細胞／ウェル）に２４時間播種し、２０μＭの本ペプチド（０．５ｍｌの培地中に７μｇの６量体）を含む新鮮な０．５ｍｌの２％のＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地でさらに４時間培養した。続いて、（１Ｍのストック及び溶媒としてのＰＢＳによる）１００ｍＭのグルタミン酸をさらに６時間、細胞に添加した。グルタミン酸誘導性細胞死を、損傷した細胞によって培養培地中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を測定することによって定量的に評価した。ＬＤＨ活性を、ＰｉｃｏＰｒｏｂｅ（登録商標）ＬＤＨ－Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（カタログ＃Ｋ３１４－５００、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社）を用いて取扱説明書に従って測定した。ＬＤＨ活性を、自動マイクロプレートリーダー（ＵＶｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、サンフランシスコ、カリフォルニア州）を用いて蛍光生成物（Ｅｘ／Ｅｍ＝５３５／５８７ｎｍ）を測定することにより推定した。

ウェスタンブロット分析
細胞溶解、分画及びＳＤＳ－ＰＡＧＥを、以前に説明された手順（Ｙａｎｇ ＹＣ他、ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ２００７、７、２１６）に従って実施した。この研究で用いた抗体は、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｔａｔ３及びＳＴＡＴ３（１：１０００倍希釈）に対するものであった。対象のタンパク質を、適切なＩｇＧ－ＨＲＰ二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）及びＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて検出した。

定量リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて細胞から抽出した。ｃＤＮＡ合成を、オリゴ（ｄＴ）プライマー及び逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて１μｇの全ＲＮＡとともに５０℃で５０分間行った。簡潔には、ｃＤＮＡの定量化を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社、マンハイム、ドイツ）で、ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉキット（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて以下のサイクリング条件、９５℃で１０分間の初期変性、続いて、９５℃で１０秒間、６０℃で１０秒間及び７２℃で１０秒間の４０サイクル、並びに７２℃で５分間の最終インキュベーション、で行った。データを、ΔΔＣｔで計算した。そして、発現をグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現に対して正規化した。ＰＣＲプライマーは、マウスサバイビン センス、５´－ＴＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＡＣ－３´（配列番号２７）、アンチセンス、５´－ＴＧＡＣＧＧＧＴＡＧＴＣＴＴＴＧＣＡＧＴ－３´（配列番号２８）（アクセッション番号、ＮＭ＿００１０１２２７３．１、ＰＣＲ産物、１３６ｂｐ）、マウスＧＡＰＤＨ センス、５´－ＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＣＣＧＴＡＴＴＧＧ－３´（配列番号２９）、アンチセンス、５´－ＣＡＴＴＣＴＣＧＧＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧ－３´（配列番号３０）（ＮＭ＿００１２８９７２６．１、１４９ｂｐ）であった。ウサギ炎症性遺伝子発現の分析に対して、ＰＣＲプライマーは、ウサギＴＮＦ－α センス、５´－ＣＣＴＧＴＧＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＴＴＡ－３´（配列番号３１）、アンチセンス、５´－ＣＣＣＴＴＡＧＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＴＣ－３´（配列番号３２）、（アクセッション番号、ＮＭ＿００１０８２２６３．１）、ウサギＩＬ－１β センス、５´－ＣＣＴＧＴＴＣＴＴＴＧＡＧＧＣＣＧＡＴＧ－３´（配列番号３３）、アンチセンス、５´－ＧＣＣＧＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＴＴＧＴＡＧ－３´（配列番号３４）、（ＮＭ＿００１０８２２０１．１）、ウサギＧＡＰＤＨ センス、５´－ＡＧＧＴＣＡＴＣＣＡＣＧＡＣＣＡＣＴＴＣ－３´（配列番号３５）、アンチセンス、５´－ＧＴＧＡＧＴＴＴＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＴＣ－３´（配列番号３６）（アクセッション番号、ＮＭ＿００１０８２２５３．１）であった。ＰＣＲ産物のサイクル閾値（Ｃｔ）の値及びＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ）コントロールｍＲＮＡを用いてｍＲＮＡの相対量を計算した。

動物研究
全ての実験は、Ｍａｃｋａｙ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（台湾）によって承認された。動物の検証及び眼の外科的処置は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈに従って実施した。全ての手術を無菌状態下で行った。

網膜虚血－再灌流（Ｉ／Ｒ）動物モデル
実験手順は、Ｍａｃｋａｙ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（台湾、中華民国）によって承認された。全ての手術を無菌状態下で行った。成体の１０週齢のオスのＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（初期体重＝３１２±１１ｇ）を、キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入によって麻酔した。ペプチドを０．８５％の通常の生理食塩水中に１ｍＭに溶解し、Ｉ／Ｒの誘導の前に、マイクロシリンジにより３１Ｇ針を通じた１００μＬのペプチドの結膜下注入によって送達した。通常の生理食塩水をビヒクルコントロールとした。ラットＩ／Ｒを、ペプチド又はビヒクルを注入した後に４時間行った。瞳孔を０．５％のトロピカミド及び０．５％のフェニレフリンで拡張した。体温を、加熱ブランケットを用いて３７℃に維持した。瞳孔の拡張後、右眼の前房に、生理食塩水リザーバーに接続された２７ゲージの針でカニューレ挿入した。眼圧（ＩＯＰ）を、リザーバーを眼の上方１５０ｃｍに保つことによって１１０ｍｍＨｇに上昇させ、網膜虚血を、虹彩の白化及び網膜の赤色反射の喪失を観察することによって確認した。虚血の９０分後、カニューレ挿入針を引き抜いてＩＯＰを正常な圧力に戻し、網膜動脈からの血液供給の回復及び誘導された再灌流傷害をもたらした。再灌流は、赤色反射の復帰によって明白であった。角膜鎮痛を、０．４％のオキシブプロカイン塩酸塩を１又は２滴使用することによって達成し、オフロキサシン点眼ジェル（０．３％）を手順の前後に眼に局所的に塗布した。右眼のみを全ての実験で使用した。偽手技を、動物内コントロールの役割を果たす左眼で行った。

Ｉ／Ｒ誘導性網膜傷害の組織学的評価
ラット（各群でｎ＝６）を、Ｉ／Ｒ傷害の１４日後にペントバルビタールの過剰投与（静脈内に体重１ｋｇあたり１００ｍｇ）を用いて安楽死させ、眼球を絹の縫合糸で角膜の１２時の位置にマーキングし、その後、摘出して４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）において４℃で２４時間固定した。固定後、前区を除去し、視神経乳頭を含む後部眼球を段階的な一連のエタノールで脱水し、パラフィン中に包埋した。ヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色のために、厚さ５μｍの切片をミクロトームを用いて視神経頭を通じて垂直子午線に沿って採取し、２００倍のＣＣＤカメラを装備する光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社、ハイデルベルク、ドイツ）で観察した。網膜におけるＩ／Ｒ損傷の程度を定量化するために、中心網膜厚の全体（ＯＴ、ＧＣＬとＯＮＬの間）、内顆粒層（ＩＮＬ）及び外顆粒層（ＯＮＬ）を測定した。神経節細胞層（ＧＣＬ）の細胞数を、線形細胞密度（２００μｍあたりの細胞数）を用いて計算した。１個の眼ごとに３切片を平均し、６個の眼の平均を各群の代表値として記録した。

Ｉ／Ｒ傷害網膜のＴＵＮＥＬ染色
２０時間のＩ／Ｒ後、ラット（各群でｎ＝６）をペントバルビタールの過剰投与によって安楽死させた。摘出した眼球を４％のＰＦＡで２４時間４℃で固定した。固定された網膜組織をパラフィン中に包埋した。網膜細胞のアポトーシスを同定するために、５μｍ厚の切片を、視神経乳頭を通過して切り、脱パラフィンし、再水和し、２０μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫとともに１０分間インキュベートし、アポトーシス細胞の免疫蛍光染色を、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介性ｄＵＴＰニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）ベースキット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、インディアナポリス、インディアナ州）を用いて製造者の説明書に従って行った。核を、ヘキスト３３２５８で７分間対比染色することにより位置特定した。切片を電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＨＲｍ、Ｚｅｉｓｓ社）（４００倍、６フィールド／サンプル）を装備する落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ２ ｉｍａｇｉｎｇ、Ｚｅｉｓｓ社、オーバーコッヘン、ドイツ）下で観察し、定量化をＡｘｉｏｖｅｒｔソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ リリース４．８．２、Ｚｅｉｓｓ社）を用いて行った。１個の眼ごとに３切片を平均し、６個の眼の平均を各群の代表値として記録した。

免疫蛍光染色
脱パラフィンした網膜切片を、非特異的染色をブロックするために、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中の１０％のヤギ血清及び５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、室温で２０分間ブロッキングした。染色を、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（１：１００希釈）又はＩｂａ－１（１：１００希釈）に対する一次抗体を用いて３７℃で３時間行った。続いて、スライドを、適切な蛍光標識二次抗体（１：５００希釈）とともに３７℃で１時間インキュベートし、その後にヘキスト３３２５８で６分間、対比染色した。そして、スライドをＰＢＳＴで３回リンスし、ＦｌｕｏｒＳａｖｅ（登録商標）試薬（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を用いてマウントし、落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ２ ｉｍａｇｉｎｇ、Ｚｅｉｓｓ社、オーバーコッヘン、ドイツ）で目視した。１個の眼ごとに３切片を平均し、６個の眼の平均を各群の代表値として記録した。

網膜血管構造の調製及び分析
ラット（各群でｎ＝６）を、Ｉ／Ｒ傷害の１４日後にペントバルビタールの過剰投与を用いて安楽死させ、眼球を４％のＰＦＡで４℃で一晩固定した。網膜を単離し、ＰＢＳＴで５分間透過処理し、水で一晩洗浄し、スライドガラス上に配置し、２．５％のトリプシン（５０μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）とともに３７℃で３０分間インキュベートし、時折、穏やかに振とうした。非血管細胞を血管構造から静かに払い落とし、ＰＢＳで洗浄した。そして、切片をイソレクチンＧＳ－ＩＢ４（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８コンジュゲート、１：２００希釈、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で３７℃で１時間染色し、その後、ヘキスト３３２５８で１０分間対比染色し、ＰＢＳＴでリンスしてから、ＦｌｕｏｒＳａｖｅ（登録商標）試薬を用いてマウントし、２００倍の落射蛍光顕微鏡下で視覚化した。変性毛細血管を、その長さに沿っていずれの箇所にも周皮細胞がない小血管の管として同定し、網膜領域の平方ミリメートルごとに報告する。１個の眼ごとに１０切片を平均し、６個の眼の平均を各群の代表値として記録した。

糖尿病マウスの網膜における血管異常の測定
糖尿病マウスを、１日目及び３日目にストレプトゾトシン（ＳＴＺ、体重１ｋｇあたり２００ｍｇ）の腹腔内注入によって生成した。ＳＴＺを、０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）で新規に調製した。注入後、マウスに一晩１０％のスクロースを供給し、突然の低血糖ショックを防いだ。１週間後（７日目）、空腹時血糖値＞５００ｍｇ／ｄｌのマウスを糖尿病と定義し、実験に用いた。平衡塩類溶液（ＢＳＳ）を、ペプチドビヒクル（Ａｌｃｏｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）として使用した。（ＢＳＳに２００μＭに溶解した）６量体類似体点眼薬を１日３回眼に局所投与した。２週間後（１４日目）、マウスに１００ｍｇ／ｋｇのＦＩＴＣ－ＢＳＡをさらに３０分間腹腔内注入して網膜における血管病変（出血領域）を決定した。続いて、動物をＣＯ_２吸入によって安楽死させ、眼を摘出し、４％のＰＦＡにおいて４℃で一晩固定し、スライドガラス上にフラットマウントして光学切片を得た。網膜における血管病変を、２００倍の落射蛍光顕微鏡検査によってフラットマウントの４つの網膜象限の全てでスコアリングした。中枢及び末梢網膜の双方の各象限で３つの顕微鏡視野をサンプリングし、データを病変／網膜の平均数として示した。

ドライアイ動物モデル
動物
このモデルシステムでは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７～８週齢、各体重約１８～２５ｇ）を用いた。全てのマウスを、Ｍａｃｋａｙ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（台湾、中華民国）によって承認された手順に従って動物施設で維持した。全ての動物実験手順を、ＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈに従って実施した。

ドライアイ誘導
ドライアイを、Ｂａｒａｂｉｎｏ他（ＩＶＯＳ（２００５）４６（８）、２７６６－２７７１）による前述の手順に従って、マウスを環境制御室（ＣＥＣ）に１４日間配置することによって誘導した。ＣＥＣに配置されたマウスを、相対湿度（ＲＨ）を２５％未満、温度を２０～２２℃、気流を約１５Ｌ／ｍｉｎに維持する条件に、１日あたり１２時間曝露した。コントロールマウスを正常な環境（ＲＨ＞５０％、気流無し、温度２０～２２℃）で同じ期間保持した。

処置
一般的な人工涙液製剤、平衡塩類溶液（ＢＳＳ）に溶解した１％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）をペプチドビヒクルとして使用した。ペプチド（一方の眼の処置に使用される１０μｌの点眼薬中に１００μＭ、約０．７μｇのペプチド）又は１％のＣＭＣビヒクルを１日３回、眼に局所投与した。本合成ペプチドがドライアイに対していずれかの治療的な作用を与え得るか否かを試験するために、マウスを局所処置無しで、１４日間ＣＥＣで収容し、そして本ペプチドで４日間処置した。

角膜フルオレセイン染色
動物をゾレチル（６ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（３ｍｇ／ｋｇ）の混合物の腹腔内注入によって麻酔した。角膜上皮傷害を局所フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒ－Ｉ－Ｓｔｒｉｐ、Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、フィラデルフィア、ペンシルベニア州）で染色することによって決定した。角膜フルオレセイン染色をコバルトブルー照明下で細隙灯生体顕微鏡で検査し、デジタルカメラで撮影した。角膜の染料染色を、以下の盲検様式でスコアリングした：点状染色無しに対してスコア０、角膜の３分の１未満が染色された場合にスコア１、３分の２以下が染色された場合にスコア２、及び３分の２より多く染色された場合にスコア３（Ｈｏｒｗａｔｈ－Ｗｉｎｔｅｒ Ｊ ２０１３）。

角膜上皮細胞の培養及び処置
輪部幹上皮細胞（ＬＳＥＣ）を、６ヶ月齢のニュージーランドホワイトウサギから単離し、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２基礎培地ベースの細胞浮遊培養によって１４日間継続的に培養し、前述（Ｈｏ他、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２０１３、３１、１７７５）のように、角膜様上皮細胞の分化を達成した。ＬＳＥＣ（６ウェルプレートのウェルごとに２×１０^５細胞）を、２０μＭの６量体変異体ペプチドと混合した２％のＦＢＳ含有基礎培地で６時間処置し、そして９０ｍＭのＮａＣｌで直接処置すると、細胞は高浸透圧（ＨＯＰ）を受けた。３時間後、定量リアルタイムＰＣＲを用いてＨＯＰ誘導性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α及びインターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１β）の発現を推定した。ＤＭＥＭ／Ｆ－１２基礎培地（３０９ ｍＯｓｍ）において培養した細胞を陰性コントロールとして使用した。

統計
結果を、３つの独立した実験で生成した。全ての数値を平均±ＳＤとして表した。２つの群の比較を、マンホイットニーの検定を用いて行った。Ｐ＜０．０５を有意であるとみなした。

実施例１ 神経保護ペプチドの同定及び特徴付け
１．１ 神経保護ペプチドの同定
この実施例では、表２に列挙されるように一連の短鎖合成ペプチドを合成し、「材料及び方法」の章に記載される手順に従って、それらの神経保護効果をＮｅｕｒｏ－２ａ神経芽細胞におけるグルタミン酸誘導性細胞死によって評価した。さらに、各合成ペプチド（配列番号２～１１）の第１のアミノ酸残基（すなわち、セリン）は、プロテアーゼ耐性を増加するようにＤ体であった。

簡潔には、細胞を、指定されたペプチド（すなわち、配列番号２～１１のいずれか）で４時間、前処置し、そして１００ｍＭのグルタミン酸で６時間処置した。細胞死を、市販の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞毒性アッセイキットによって検出した。結果を図１に示す。

表２ 以下を有する短鎖合成ペプチド

いずれの配列中の太字も、特定のアミノ酸がＤ体であることを示す。

図１に示すように、グルタミン酸は時間の経過とともに細胞死を誘発した（７．６±０．８％、グルタミン酸を添加したペプチド溶媒ＤＭＳＯを陽性コントロールとして使用した）。興味深いことに、６量体ｄＳペプチド（ＳＬＧＡＥＱ、配列番号９）のみがＮｅｕｒｏ－２ａ細胞に対して保護効果を示したのに対し、６個よりも多くアミノ酸残基を有するペプチド（すなわち、１３量体ｄＳ～７量体ｄＳ（配列番号２～８））も、６個未満のアミノ酸残基を有するペプチド（すなわち、５量体ｄＳ又は４量体ｄＳ（配列番号１０又は１１））も、細胞保護効果を示さない（１．５±０．５％に対して８．２±０．６％～１１．４±０．３％）ことが見出された。

結果は、６量体ｄＳ（ＳＬＧＡＥＱ、配列番号９）中の第６のアミノ酸残基（Ｇｌｎ、Ｑ）が６量体の神経保護活性を維持する重要な残基であることを暗示した。結果はまた、アルギニン（Ｒ）残基（７量体ｄＳ（配列番号８）の最後のアミノ酸）が６量体の生体機能に対して阻害的役割を果たし得ることも示唆している。

１．２ ６量体ｄＳペプチドの特徴付け
１．２．１ ６量体ｄＳペプチドはＳＴＡＴ３依存様式を介したサバイビン発現を誘導する
サバイビンは、虚血中の神経細胞の生存に重要なＳＴＡＴ３（シグナル伝達兼転写活性化因子）の転写標的である。したがって、この実施例では、ＳＴＡＴ３シグナル伝達が６量体ｄＳの神経保護効果に役割を果たすか否かを調べた。結果を図２に示す。

ウェスタンブロット分析は、６量体ｄＳによって刺激されたＣ２Ｃ１２筋芽細胞が、刺激後５～２０分の期間に発生したＳＴＡＴ３リン酸化を誘発したことを明らかにした。対照的に、５量体ｄＳは、そのような効果を有していなかった（図２、パネルＡ）。

さらに、６量体ｄＳで３時間刺激した後、Ｃ２Ｃ１２細胞のサバイビンｍＲＮＡのレベルは、溶媒処置細胞のレベルと比較して、２．６倍に有意に増加した（図２、パネルＢ）。他のペプチド（すなわち、配列番号２～８又は１０～１１のいずれか）で処置されたＣ２Ｃ１２細胞は、そのような誘導をもたらさなかった。

ＳＴＡＴ３ｐｅｐ及びＳＴＡＴ３阻害剤Ｖを含む周知の薬理学的阻害剤も、サバイビン誘導の分子メカニズムを調査するように使用した。リアルタイムｑＰＣＲアッセイは、６量体ｄＳによって誘導されるサバイビンｍＲＮＡの発現が、ＳＴＡＴ３阻害剤（すなわち、ＳＴＡＴ３ｐｅｐ又はＳＴＡＴ３阻害剤Ｖ）で前処置した細胞において２．６倍から１．３倍まで抑制されることを明らかにした（図２、パネルＢ）。

まとめると、この実施例における発見は、６量体ｄＳペプチドがＳＴＡＴ３シグナル伝達経路の活性化を介してサバイビン発現を誘導することによりその神経保護効果を与えたことを示唆した。

１．２．２ グルタミン酸残基は６量体ｄＳペプチドによって誘導されるサバイビン発現に重要である
６量体ｄＳペプチドの重要な残基をさらに調べるために、アラニンスキャニング及びアミノ酸置換をそれぞれ用いて、６量体ｄＳペプチドの残基をアラニン若しくはそのＤ体－アミノ酸で系統的に置換又は突然変異させた６量体変異体を作成し、そのように作成された６量体変異体を表３～４に示す。

表３ アラニンスキャニングアプローチによって作成された６量体変異体

表４ Ｄ体アミノ酸による置換によって作成された６量体変異体

いずれの配列中の太字も、特定のアミノ酸がＤ体であることを示す。

表５ 突然変異によって作成された６量体変異体

実施例１．２．１でのアプローチと同様に、表３～５の６量体変異体の機能についての指標としてＣ２Ｃ１２細胞におけるサバイビンｍＲＮＡの発現レベルを用いた。簡潔には、低血清培地中のＣ２Ｃ１２細胞を、２０μＭの６量体変異体によって６時間処置した。リアルタイムｑＰＣＲアッセイは、６量体Ｓａ（１．７倍）、６量体Ｌａ（１．５倍）、６量体Ｇａ（１．６倍）、６量体Ａｇ（１．５倍）及び６量体Ｑａ（１．６倍）がサバイビン誘導に関して６量体ｄＳ活性を部分的に保持可能であることを明らかにした（溶媒コントロールに対して^＊Ｐ＜０．００４、図３）。結果はまた、グルタミン酸（Ｅ）残基でのアラニン置換が６量体の活性を著しく損なうことも裏付けた。

その非天然アミノ酸（Ｄ体アミノ酸）による置換によって作成される６量体変異体の機能に関して、リアルタイムｑＰＣＲアッセイは、そのＤ体残基によるセリン（Ｓ）の置換が溶媒コントロールのもの（図４、ｄＳ対溶媒）と比較してサバイビンｍＲＮＡのレベルを増加させ、したがって６量体ｄＳは陽性コントロールとして作用したが、その一方で、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）又はグルタミン（Ｑ）の、それに対応するＤ体残基による置換はサバイビン遺伝子誘導活性を有意に妨害することを明らかにした（図４、ｄＬ、ｄＡ又はｄＱ対６量体ｄＳ）。グルタミン酸（Ｅ）の、そのＤ体残基による置換は、サバイビンｍＲＮＡに適度な誘導をもたらし（図４、ｄＥ対６量体ｄＳ）、レベルは溶媒コントロールよりも未だ有意に高かった。

アミノ酸は通常、側鎖（すなわち、Ｒ基）の特性によって分類されるため、突然変異を、Ｒ基において同様の特性を示す他の残基によって６量体中のアミノ酸残基を置換することによって作成した（表５参照）。図５のリアルタイムｑＰＣＲアッセイは、ロイシン（Ｌ）をイソロイシン（Ｉ）に（６量体Ｌｉ）、グリシン（Ｇ）をアスパラギン（Ｎ）に（６量体Ｇｎ）、グリシン（Ｇ）をバリン（Ｖ）に（６量体Ｇｖ）、アラニン（Ａ）をグルタミン酸（Ｅ）に（６量体Ａｅ）、グルタミン（Ｑ）をアスパラギン（Ｎ）に（６量体Ｑｎ）置換することが、溶媒コントロールと比較して、サバイビンｍＲＮＡを独立して２．１倍、１．５倍、２．３倍、１．５倍及び２．１倍に誘導可能であったことを明らかにした（図５、^＊Ｐ＜０．０５）。対照的に、セリン（Ｓ）をスレオニン（Ｔ）に（６量体Ｓｔ）、アラニン（Ａ）をイソロイシン（Ｉ）に（６量体Ａｉ）、アラニン（Ａ）をセリンに（６量体Ａｓ）又はグルタミン酸（Ｅ）をアスパラギン酸（Ｄ）に（６量体Ｅｄ）置換することは、サバイビンｍＲＮＡの誘導を著しく損った（すなわち、基礎レベルと同等以下）。

まとめると、結果は、グルタミン酸残基（Ｅ）は６量体ペプチドの神経保護活性に重要であるが、６量体ｄＳ（配列番号９）の６残基のうちの５個がアミノ酸置換を許容し得ることを示唆した。

実施例２ ６量体ｄＳ、６量体Ｓａ、６量体Ｌｉ、６量体Ｇｖ及び６量体Ｑｎは、網膜虚血／再灌流傷害に対して網膜を保護する
網膜血管閉塞症、急性緑内障、糖尿病網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜剥離及び未熟児網膜症などの多数の眼疾患は、これらの患者を失明させ得る網膜虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害に関連する。通常、網膜虚血は網膜の領域におけるエネルギー枯渇をもたらす毛細血管閉塞が原因であり、その後の自然な再灌流が強い酸化ストレスを誘導する。Ｉ／Ｒ傷害の数時間後、炎症及び細胞死が起こる。最終的に、これらの病理学的反応は、視神経及び網膜毛細血管の変性をもたらす。

この実施例では、神経網膜細胞及び網膜毛細血管系に対する６量体変異体ペプチドの神経保護効果を、「材料及び方法」の章において説明したＩ／Ｒ傷害のラットモデルを用いて調べた。簡潔には、Ｉ／Ｒの誘導の前に、６量体変異体ペプチド（１ｍＭ、１２０μｌ）をＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの結膜下腔に４時間注入した。そして、眼圧（ＩＯＰ）を眼において９０分間１１０ｍｍＨｇに上昇させてから２０時間再灌流することにより、ラット網膜にＩ／Ｒ傷害を誘導した。続いて、網膜細胞アポトーシスのレベルを、ＴＵＮＥＬ染色を用いて評価した。さらに、網膜形態を、Ｉ／Ｒ傷害の１４日後にＨ＆Ｅ染色により分析した。結果を図６～１０及び表６～９にまとめる。

ＡＲＰＥ－１９細胞の４－ヒドロキシ－２－ノネナール（４－ＨＮＥ）誘導性アポトーシスに対する６量体ｄＳ又は６量体ｄＥの保護効果を示す図６を参照する。４－ヒドロキシ－２－ノネナール（４－ＨＮＥ）は脂質酸化の生成物であり、種々の細胞標的、特にレドックスシグナル伝達に関与するタンパク質との付加物を形成可能な最も厄介な反応性アルデヒドの１つともみなされている。明らかに、４－ＨＮＥは、ＡＴＰａｓｅ活性を損い、酸素消費を途絶し、最終的には早期アポトーシスをトリガすることにより、ミトコンドリアに影響を及ぼすことが示されている。６量体ｄＳは４－ＨＮＥ誘導性アポトーシスを抑制でき、６量体ｄＳは６量体よりも効果的であることが見出された（図６、パネルＢ）。

６量体ペプチド（６量体ｄＳ又は６量体Ｓｔ）の無し又は有りで処置されたＩ／Ｒ傷害後に眼から採取された網膜の画像を図７に提示する。ビヒクルによって処置された偽物群の眼について、網膜細胞核はＴＵＮＥＬ染色に対して陰性であり、豊富な緑色蛍光網膜細胞核がビヒクルプラスＩ／Ｒ群における内顆粒層（ＩＮＬ）、外顆粒層（ＯＮＬ）及び神経節細胞層（ＧＣＬ）内に見出された。対照的に、６量体ｄＳによって処置された眼では、ラット網膜のＴＵＮＥＬ染色によって、少数の緑色蛍光核のみが同定され、一方で６量体Ｓｔにはそのような効果（すなわち、Ｉ／Ｒ誘導性網膜細胞アポトーシスの阻害）がなかった。特に、表６にまとめるように、Ｉ／Ｒの前の６量体Ｓａ、６量体Ｌｉ、６量体Ｇｖ又は６量体Ｑｎペプチドの結膜下注入は、Ｉ／Ｒによって誘導される網膜細胞アポトーシスも低減した。

表６ ラットの眼におけるＩ／Ｒ傷害の２０時間後における網膜におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞数の定量分析

データを平均±標準偏差として表す（１群あたりｎ＝６個の眼）。
ビヒクル＋Ｉ／Ｒに対して^＊Ｐ＜０．０００１。

ここで、６量体ｄＳの有り又は無しで処置したＩ／Ｒ傷害後に眼から採取した、Ｈ＆Ｅ染色網膜切片の写真である図８を参照する。１４日間のＩ／Ｒ傷害後のＨ＆Ｅ染色網膜断面は、偽コントロール群と比較して、低減した網膜厚（ビヒクルＩ／Ｒ群）を示した。さらに、Ｉ／Ｒ傷害の眼への６量体ｄＳの単回結膜下注入は、網膜厚の全体を偽コントロール群と同様のレベルに改善し、６量体ｄＳ処置がＩ／Ｒ誘導性網膜変性を効果的に防止可能であることを示唆した。統計的に、６量体ｄＳプラスＩ／Ｒ群の総網膜、ＩＮＬ及びＯＮＬの厚さは、ビヒクルプラスＩ／Ｒ群のものよりも有意に大きく、コントロール群に匹敵した（Ｐ＞０．０５）（表７）。結果は、６量体ｄＳがＩ／Ｒによって初期段階（２０時間）で誘導される網膜細胞アポトーシスを防止する能力を有し、それにより網膜厚の全体をＩ／Ｒ傷害に続く１４日間、保持することをさらに裏付ける。これらの結果はまた、６量体変異体が網膜変性を緩和する神経保護効果を有することも示唆する。

表７ Ｉ／Ｒ傷害の１４日後のＨ＆Ｅ染色による網膜萎縮の組織学的検査

データを平均±標準偏差として表す（１群あたりｎ＝６）。

炎症は、遅延相中のＩ／Ｒ傷害の一般的な特徴であり、更なる網膜細胞死をもたらし、それは次に血液網膜関門（ＢＲＢ）破壊を引き起こす。網膜炎症は、糖尿病網膜症及び緑内障などの複数の網膜疾患に関連する。ミクログリア及びアストロサイトは、視覚系（網膜、視神経及び脳の視覚中枢）の常在免疫細胞であり、主要なエフェクター細胞として炎症性ストレスに応答する。

図９に示すように、Ｉ／Ｒ傷害の１４日後の網膜炎症の免疫蛍光染色がＩｂａ－１陽性ミクログリア細胞の有意な活性化を裏付け、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトがコントロール群と比較してビヒクルで処置されたＩ／Ｒ傷害の眼において見られ、その一方で、Ｉｂａ－１陽性ミクログリア細胞及びＧＦＡＰ陽性アストロサイトの活性化は６量体ｄｓによって処置された眼においてはあまり顕著ではなかった。さらに、２つの炎症性エフェクターがＧＣＬにごく接近して全ての群の内網膜の境界に沿って局在することが見出された。平均して、６量体ｄＳプラスＩ／Ｒ群と比較して、有意に多い数のミクログリア及びアストロサイトが、ビヒクルプラスＩ／Ｒ群で認められた（表８）。まとめると、６量体ｄＳは、Ｉ／Ｒによって刺激された網膜において、ミクログリア及びアストロサイトの病理学的活性化を効果的に抑制することができる。

表８ Ｉ／Ｒ傷害の１４日後における免疫蛍光染色による網膜ミクログリア／アストロサイト分析

データを平均±標準偏差として表す（１群あたりｎ＝６）。

網膜Ｉ／Ｒ傷害モデルにおいて、網膜内皮細胞及び周皮細胞の死は、無細胞毛細血管をもたらす。６量体ｄＳ処置がＩ／Ｒ傷害後の網膜血管構造を効果的に保護し得るか否かを判定するために、ホールマウント網膜をイソレクチンＧＳ－ＩＢ４（内皮細胞に結合する蛍光標識イソレクチン）及びヘキスト３３２５８（マーキングされた細胞核に対する蛍光色素）で染色した。偽試験によって対側眼から得られたコントロール網膜と比較して、無細胞毛細血管の数の増加が、ビヒクルで処置したＩ／Ｒ傷害の眼の網膜において見出された（図１０）。変性毛細血管の数は、６量体ｄＳ処置によって低減した。無細胞毛細血管の定量化を表９にまとめる。さらに、ビヒクル又は６量体ｄＳのいずれかによる対側眼の偽試験の成績は、網膜血管構造に対して細胞毒性効果を有さなかった。まとめると、６量体ｄＳペプチドは、網膜微小血管構造へのＩ／Ｒ誘導性傷害に対する保護を可能とする。

表９ 虚血後１４日目のＩ／Ｒ損傷網膜における無細胞毛細血管の数

データを平均±標準偏差として表す（１群あたりｎ＝６）。

要約すると、Ｉ／Ｒ動物モデル研究による結果は、６量体ｄＳ、６量体Ｓａ、６量体Ｌｉ、６量体Ｇｖ及び６量体Ｑｎを含む６量体変異体が、Ｉ／Ｒ誘導性の神経及び血管損傷並びに網膜の炎症から網膜を独立して保護可能であることを裏付けた。さらに、動物研究は、６量体変異体の結膜下注入がＩ／Ｒ誘導性網膜傷害を処置する潜在的な治療選択肢として作用し得ることを示唆する。

実施例３ ６量体ｄＳは糖尿病マウスにおいて網膜血管構造を保護する
Ｉ／Ｒ誘導性網膜における変性毛細血管の顕微鏡像は、糖尿病網膜症に見られる無細胞毛細血管のものと同様である。糖尿病網膜症に対する６量体ｄＳの可能な有益な効果を評価するために、ＳＴＺ誘導性糖尿病マウスの眼を６量体ｄＳ又はビヒクル点眼薬によって１４日間、１日３回局所処置した。網膜血管異常を、フルオレセインイソチオシアネート－ウシ血清アルブミン（ＦＩＴＣ－ＢＳＡ）の血管外漏出を検出することによって調べた。顕微鏡画像は、ビヒクル処置糖尿病マウスの網膜において幾つかの出血領域を明らかにし（図１１）、一方で、６量体ｄＳ点眼薬によって処置された眼では、血管病変の数が低減した（６量体ｄＳでは２．８±０．６に対してビヒクルコントロールでは８．２±１．５）。

網膜では、内皮細胞、周皮細胞及びアストロサイトが協力して作用し、網膜内毛細血管網内に血液網膜関門を形成した。アストロサイトは糖尿病マウスにおいて炎症性反応の増幅に関与し、それは次に網膜での血管漏洩の一因となる。図１２を参照すると、ＳＴＺ注入の１４日後の網膜のＧＦＡＰ免疫蛍光染色は、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトの有意な活性化は（コントロール群と比較して）ビヒクル／ＳＴＺ群で見られたが、一方で、６量体ｄＳ／ＳＴＺ群ではあまり顕著ではなかったことを示し（数／４００倍のフィールド、２４．３±２．７対１１．０±１．４）、６量体ｄＳが糖尿病マウスの網膜においてアストロサイトの病理学的活性化を効果的に抑制可能であることを示している。

非増殖性糖尿病網膜症（ＮＰＤＲ）のまだ対処されていない処置ニーズは未だ存在し、それは患者が増殖性糖尿病網膜症（ＰＤＲ）及び／又は糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）に進行するのを防止するのに重要である。６量体ｄＳ点眼薬は、糖尿病網膜症の初期段階において網膜炎症及び血管異常を防止するのに効果的であり、新規治療法の臨床開発への前進を可能とし得る。

実施例４ ６量体ｄＳは角膜の創傷治癒を促進する
重度のドライアイ疾患（ＤＥＤ）は、通常、損傷を受けた角膜上皮を伴う。この実施例では、「材料及び方法」の章で記載した手順に従って確立したマウスドライアイモデルを用いて損傷角膜に対する６量体変異体ペプチドの治療効率を評価した。

簡潔には、マウスを環境制御室（ＣＥＣ）に１４日間収容して（０日目として設定）、角膜表面破壊を誘導した。角膜フルオレセイン染色を用いて角膜表面傷害を推定し、染色スコアが２の動物（ＣＥＣに１４日間配置した後のマウス）についてペプチド処置を行った。ＤＥＤの処置のための６量体変異体ペプチド製剤を方法において説明した。６量体ｄＳによる４日間の処置の後、結果は、０日目のその染色スコアと比較して、角膜フルオレセイン染色における有意な減少を示した（スコア、１．４±０．２対３±０、図１３）。ビヒクル、６量体ｄＡ又は６量体Ｓｔによる４日間の処置は、治療効果を有さなかった。

乾燥ストレス誘導性ドライアイ動物において、炎症によって眼表面損傷が誘導及び／又は促進されることは周知である。炎症性メディエーターの中で、ＩＬ－１β及びＴＮＦ－αの抑制は、動物においてドライアイの改善に有益であると報告されている。さらに、涙液浸透圧の上昇は、炎症及び眼表面損傷を誘導するドライアイのコアなメカニズムであると考えられている。

６量体変異体が角膜上皮細胞における炎症性遺伝子発現に対する高浸透圧ストレスの影響を抑制する能力を有するか否かを調べるために、ウサギ角膜上皮細胞を単離し、培養下で増殖させ、その後（４６３ｍＯｓＭ、９０ｍＭのＮａＣｌの添加による）高浸透圧培地で細胞培養する前に、６量体変異体ペプチド（２０μＭ）によって６時間処置した。基礎培地（３０９ｍＯｓｍ）で培養した細胞を陰性コントロールとして使用した。

細胞を高浸透圧培地で３時間にわたって培養した後、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１β遺伝子発現を含む炎症性メディエーターのｍＲＮＡレベルをリアルタイムｑＰＣＲによって決定した。結果は、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１βｍＲＮＡは、基礎培地（溶媒単体）で培養した細胞と比較して、それぞれ１２．８倍及び４．５倍有意にアップレギュレーションされたことを示した（図１４）。一方、６量体ｄＳ、６量体Ｓａ又は６量体Ｇｖによって６時間にわたって前処置した細胞は、溶媒処置した細胞と比較して、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１βのｍＲＮＡ発現をそれぞれ明らかに制止した。

炎症は、ドライアイ発症の主要な要因である。結果は、６量体ｄＳ、６量体Ｓａ及び６量体Ｇｖが実際に抗炎症剤として可能であり、改善された角膜の創傷治癒を導き得ることを裏付けた。

まとめると、前述の効果的な実施例に提示された結果は、本開示の短鎖合成ペプチドが神経保護機能を有し、神経変性疾患（例えば、網膜変性疾患）並びに組織修復及び再生（例えば、網膜虚血／再灌流傷害、創傷治癒、ドライアイ症候群など）に関する疾患又は状態の処置及び／又は予防に使用され得ることを裏付ける。

実施形態の上記説明は例示のみのために与えられること及び種々の変形が当業者によってなされ得ることが理解されるはずである。上記仕様、実施例及びデータは、発明の例示的実施形態の構造及び使用の完全な説明を与える。発明の種々の実施形態がある程度の特殊性で又は１以上の個別の実施形態を参照して上述されたが、当業者であれば、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく開示の実施形態に対して多数の変更を行うことができるはずである。

Claims (22)

1. Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＥＸ_５（配列番号１）として記載されるアミノ酸配列からなる合成ペプチドであって、
   Ｘ_１は、セリン（Ｓ）又はアラニン（Ａ）であり、
   Ｘ_２は、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）又はイソロイシン（Ｉ）であり、
   Ｘ_３は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、
   Ｘ_４は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
   Ｘ_５は、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、
   Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４及びＸ_５は独立してＬ体であり、Ｘ_１及びＥは独立してＬ体又はＤ体であり、
   前記配列番号１がＳＬＧＡＥＱ（配列番号９）の配列を有する場合には、前記セリン（Ｓ）又は前記グルタミン酸（Ｅ）はＤ体である、合成ペプチド。
2. 前記アミノ酸配列のＮ末端がアセチル化され、前記アミノ酸配列のＣ末端がアミド化された、請求項１に記載の合成ペプチド。
3. 前記合成ペプチドは、配列番号９、１２、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２又は２６のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の合成ペプチド。
4. 請求項１に記載の合成ペプチド及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物。
5. 前記合成ペプチドは、配列番号９、１２、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２又は２６のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の薬学的組成物。
6. 前記薬学的に許容可能な担体は、液体、ゲル、クリーム及び軟膏からなる群から選択される、請求項５に記載の薬学的組成物。
7. 網膜変性疾患又は組織傷害を患う被検体を処置する方法であって、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＥＸ_５（配列番号１）として記載されるアミノ酸配列からなる合成ペプチドの有効量を前記被検体に投与するステップを備え、
   Ｘ_１は、セリン（Ｓ）又はアラニン（Ａ）であり、
   Ｘ_２は、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）又はイソロイシン（Ｉ）であり、
   Ｘ_３は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、
   Ｘ_４は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
   Ｘ_５は、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、
   Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４及びＸ_５は独立してＬ体であり、Ｘ_１及びＥは独立してＬ体又はＤ体であり、
   前記配列番号１がＳＬＧＡＥＱ（配列番号９）の配列を有する場合には、前記セリン（Ｓ）又は前記グルタミン酸（Ｅ）はＤ体である、方法。
8. 前記アミノ酸配列のＮ末端がアセチル化され、前記アミノ酸配列のＣ末端がアミド化された、請求項７に記載の方法。
9. 前記合成ペプチドは、配列番号９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２２又は２６のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の方法。
10. 前記網膜変性疾患は、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜色素変性症（ＲＰ）、緑内障又は急性ＵＶ網膜症のいずれかである、請求項７に記載の方法。
11. 前記組織傷害は、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）又は網膜虚血／再灌流傷害である、請求項７に記載の方法。
12. 前記被検体はヒトである、請求項１１に記載の方法。
13. 網膜変性疾患又は組織傷害を処置するための医薬品を製造するための合成ペプチドの使用であって、該合成ペプチドはＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＥＸ_５（配列番号１）として記載されるアミノ酸配列からなり、
    Ｘ_１は、セリン（Ｓ）又はアラニン（Ａ）であり、
    Ｘ_２は、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）又はイソロイシン（Ｉ）であり、
    Ｘ_３は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、
    Ｘ_４は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
    Ｘ_５は、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、
    Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４及びＸ_５は独立してＬ体であり、Ｘ_１及びＥは独立してＬ体又はＤ体であり、
    前記配列番号１がＳＬＧＡＥＱ（配列番号９）の配列を有する場合には、前記セリン（Ｓ）又は前記グルタミン酸（Ｅ）はＤ体である、使用。
14. 前記アミノ酸配列のＮ末端がアセチル化され、前記アミノ酸配列のＣ末端がアミド化された、請求項１３に記載の使用。
15. 前記合成ペプチドは、配列番号９、１２、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２又は２６のアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の使用。
16. 前記網膜変性疾患は、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜色素変性症（ＲＰ）、緑内障又は急性ＵＶ網膜症のいずれかである、請求項１３に記載の使用。
17. 前記組織傷害は、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）又は網膜虚血／再灌流傷害である、請求項１３に記載の使用。
18. 網膜変性疾患又は組織傷害の処置のための医薬品としての使用のための合成ペプチドであって、該合成ペプチドはＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＥＸ_５（配列番号１）として記載されるアミノ酸配列からなり、
    Ｘ_１は、セリン（Ｓ）又はアラニン（Ａ）であり、
    Ｘ_２は、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）又はイソロイシン（Ｉ）であり、
    Ｘ_３は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、
    Ｘ_４は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
    Ｘ_５は、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、
    Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４及びＸ_５は独立してＬ体であり、Ｘ_１及びＥは独立してＬ体又はＤ体であり、
    前記配列番号１がＳＬＧＡＥＱ（配列番号９）の配列を有する場合には、前記セリン（Ｓ）又は前記グルタミン酸（Ｅ）はＤ体である、使用のための合成ペプチド。
19. 前記アミノ酸配列のＮ末端がアセチル化され、前記アミノ酸配列のＣ末端がアミド化された、請求項１８に記載の使用のための合成ペプチド。
20. 前記合成ペプチドは、配列番号９、１２、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２又は２６のアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の使用のための合成ペプチド。
21. 前記網膜変性疾患は、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜色素変性症（ＲＰ）、緑内障又は急性ＵＶ網膜症のいずれかである、請求項１８に記載の使用のための合成ペプチド。
22. 前記組織傷害は、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）又は網膜虚血／再灌流傷害である、請求項１８に記載の使用のための合成ペプチド。

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