CN113337506A

CN113337506A - CRISPRi介导的抑制瘢痕形成的外泌体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113337506A
Application number: CN202110685029.8A
Authority: CN
Inventors: 黄国滨; 周红艳; 李爱群; 鲁浩; 龚春丽; 王子轩
Original assignee: Zhuhai Leviregen Medical Technology Co ltd
Current assignee: Zhuhai Leviregen Medical Technology Co ltd
Priority date: 2021-06-21
Filing date: 2021-06-21
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2041-06-21
Also published as: CN113337506B

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体而言，提供了一种CRISPRi介导的抑制瘢痕形成的外泌体及其制备方法和应用。本发明提供的sgRNA，通过设计特定的负责识别靶片段的核苷酸序列使得Engrailed‑1基因编辑的特异性强，在进行基因编辑时，可以显著减少脱靶现象，准确、高效地靶向修饰En1基因。同时，通过本发明提供的基因编辑系统，利用CRISPRi技术，再以外泌体作为载体，可以实现En1基因的精准、显著抑制，这避免了传统瘢痕修复技术效果差、成本高的问题，对于抑制瘢痕形成具有重要意义，安全性高。

Description

CRISPRi介导的抑制瘢痕形成的外泌体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种CRISPRi介导的抑制瘢痕形成的外泌体及其制备方法和应用。

背景技术

皮肤受伤后形成的瘢痕也称为疤痕，在日常生活中遇到烫伤、烧伤、机械划伤、手术缝合等会使皮肤形成疤痕。疤痕形成的本质就是原有皮肤正常的组织结构受到破坏，机体在修复过程中发生的一种无序的修复形态。正常未受伤的皮肤与疤痕具有以下不同的特点。一，与正常皮肤相比，形成疤痕处的皮肤部位缺乏皮脂腺、毛囊以及其他的真皮附属物。二，正常皮肤呈现出规则的编织结构，而疤痕处呈现出致密的细胞外基质纤维。三，由于疤痕处组织结构发生了改变，导致失去了正常皮肤的弹性以及强度。疤痕的形成不仅影响美观，还会降低生活质量。传统的疤痕修复常见的有放射线治疗、药物注射、激光修复、中药外用以及手术切除等，但是传统的疤痕修复大部分达不到明显的效果，在修复过程中还有产生新疤痕的风险，难以让人满意。大面积的疤痕不仅影响美观还使生活质量降低，使用传统的疤痕修复方法不仅得不到很好的效果，还使个人承担起巨大的心理压力和经济压力。

疤痕形成过程中Engrailed-1(En1)基因的表达起着十分重要的作用。在伤口再生过程中不表达En1的成纤维细胞会转化为表达En1的成纤维细胞，表达En1的成纤维细胞会促进伤口的修复但是也会导致疤痕的产生。不表达En1的成纤维细胞不仅具有皮肤再生的能力，而且不会产生疤痕，但是在伤口再生过程中成纤维细胞的En1会被激活，可见En1的表达在疤痕形成中起着非常重要的作用。如果能够在皮肤修复过程中抑制成纤维细胞En1的表达，则对瘢痕修复具有重大意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种特异性识别Engrailed-1基因的 sgRNA。

本发明的第二目的在于提供与sgRNA相关的生物材料。

本发明的第三目的在于提供sgRNA或生物材料的应用。

本发明的第四目的在于提供一种用于抑制Engrailed-1基因表达的基因编辑系统。

本发明的第五目的在于提供一种抑制瘢痕形成的外泌体。

本发明的第六目的在于提供外泌体的制备方法。

本发明的第七目的在于提供外泌体的应用。

本发明的第八目的在于提供一种抑制瘢痕形成的修复剂。

本发明的第九目的在于提供修复剂的制备方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种特异性识别Engrailed-1基因的sgRNA，编码该sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3；

En1-i1：5’-GGCCTCTGTCACGCTCGACC-3’(SEQ ID NO.1)；

En1-i2：5’-GTTGTCGATGAAAAAGTTGG-3’(SEQ ID NO.2)；

En1-i3：5’-GAAGCCTCAGCGAAGGCACG-3’(SEQ ID NO.3)。

与上述sgRNA相关的生物材料，包括如下(a)-(c)任一种：

(a)核酸分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3；

(b)重组载体，含有(a)的核酸分子；

(c)工程细胞，含有(a)的核酸分子或(b)的重组载体。

上述sgRNA或生物材料在如下(a)-(e)任一项中的应用：

(a)对Engrailed-1基因进行基因编辑；

(b)制备对Engrailed-1基因进行基因编辑的产品；

(c)抑制瘢痕形成；

(d)制备抑制瘢痕形成的外泌体；

(e)制备抑制瘢痕形成的修复剂。

一种用于抑制Engrailed-1基因表达的基因编辑系统，包括编辑载体和导向载体；

所述编辑载体包括编码dCas9-KRAB融合蛋白的核苷酸序列和编码上述sgRNA的核酸分子；

所述导向载体包括编码CD63的核苷酸序列SEQ ID NO.4；

导向载体含有特异性结合对中的一种，编辑载体含有特异性结合对中的另一种；

优选地，特异性结合对包括抗原和抗体或生物素和亲和素；优选为 EGFP和EGFP抗体；

优选地，所述编辑载体包括pLV hU6-En1-i1-sgRNA-hUbC-GFP Nanobody-dCas9-KRAB-T2a-Puro、pLV hU6-En1-i2-sgRNA-hUbC-GFP Nanobody-dCas9-KRAB-T2a-Puro或pLVhU6-En1-i3-sgRNA-hUbC-GFP Nanobody-dCas9-KRAB-T2a-Puro；

优选地，所述导向载体包括pLVX-CD63-EGFP-puro。

一种抑制瘢痕形成的外泌体，所述外泌体包括外泌体载体以及设置于外泌体载体内的内部基质，所述内部基质包括dCas9-KRAB融合蛋白和上述sgRNA；其中，sgRNA能够与dCas9-KRAB融合蛋白形成功能性复合体。

外泌体的制备方法，在适于细胞生长的条件下培养具有外泌功能的细胞使得dCas9-KRAB融合蛋白和sgRNA进入外泌体，分离得到外泌体；

优选地，所述细胞包括HEK293T细胞或MSC细胞；

优选地，将基因编辑系统导入细胞并进行细胞培养，分离得到外泌体。

外泌体在抑制瘢痕形成或制备抑制瘢痕形成产品中的应用。

一种抑制瘢痕形成的修复剂，包括上述外泌体。

进一步地，包括1-5w/v％的外泌体、10-20v/v％甘油、5-10v/v％聚乙二醇、0.5-1w/v％羟丙基壳聚糖、0.1-1w/v％山梨酸和2.5-6w/v％羟乙基纤维素。

修复剂的制备方法，甘油、聚乙二醇、羟丙基壳聚糖、山梨酸和水按比例加热混匀，再加入羟乙基纤维素混匀，经灭菌后加入外泌体，混匀得到修复剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的sgRNA，通过设计特定的负责识别靶片段的核苷酸序列使得Engrailed-1基因编辑的特异性强，在进行基因编辑时，可以显著减少脱靶现象，准确、高效地靶向修饰En1基因。同时，通过本发明提供的基因编辑系统，利用导向载体的CD63导向作用，可以实现编辑载体的 dCas9-KRAB融合蛋白和sgRNA成功装载进外泌体中，利用CRISPRi技术，再以外泌体作为载体，可以实现En1基因的精准、显著抑制，这避免了传统瘢痕修复技术效果差、成本高的问题，对于抑制瘢痕形成具有重要意义，安全性高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例菌液PCR筛选pEGFP-N1-CD63克隆的琼脂糖凝胶电泳结果图；

图2为本发明实施例pLVX-HnCoV-S-Puro双酶切结果图；

图3为本发明实施例GFP Nanobody PCR扩增结果图；

图4为本发明实施例菌液PCR筛选sgRNA-EGFP Nanobody-dCas9-KRAB克隆的琼脂糖凝胶电泳结果图；

图5为本发明实施例En1-i1-sgRNA-EGFP Nanobody-dCas9-KRAB测序结果；

图6为本发明实施例En1-i2-sgRNA-EGFP Nanobody-dCas9-KRAB测序结果；

图7为本发明实施例En1-i3-sgRNA-EGFP Nanobody-dCas9-KRAB测序结果；

图8为本发明实施例病毒感染MSC后荧光结果图；

图9为本发明实施例成纤维细胞中抑制En1基因的表达后qPCR检测结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

本发明提供的特异性识别Engrailed-1基因的sgRNA，其编码核苷酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3。

En1-i1：5’-GGCCTCTGTCACGCTCGACC-3’(SEQ ID NO.1)；

En1-i2：5’-GTTGTCGATGAAAAAGTTGG-3’(SEQ ID NO.2)；

En1-i3：5’-GAAGCCTCAGCGAAGGCACG-3’(SEQ ID NO.3)。

该sgRNA通过设计特定的负责识别靶片段的核苷酸序列使得 Engrailed-1基因编辑的特异性强，在进行基因编辑时，可以显著减少脱靶现象，准确、高效地靶向修饰En1基因。

本发明还提供与上述sgRNA相关的生物材料，例如核酸分子、重组载体和工程细胞等，这些生物材料均可作为生物模块直接应用于基因工程操作，转录sgRNA，用于En1基因编辑、制备En1基因编辑产品、抑制瘢痕形成及制备相关产品。

本发明还提供一种用于抑制Engrailed-1基因表达的基因编辑系统，该基因编辑系统包括编辑载体和导向载体，其中，编辑载体可以表达 dCas9-KRAB融合蛋白和上述的sgRNA(sgRNA能够与dCas9-KRAB融合蛋白形成功能性复合体)，导向载体可以表达核苷酸序列SEQ ID NO.4的 CD63，同时，编辑载体和导向载体还分别可以表达特异性结合对中的一个。通过特异性结合对CD63和dCas9-KRAB融合蛋白与sgRNA实现连接，再通过CD63的导向作用，实现dCas9-KRAB融合蛋白与sgRNA成功装载进外泌体中。CD63作为四次跨膜蛋白超家族的成员，是经典的外泌体标记物，其表达会影响外泌体的生物发生。在细胞中将CD63敲除会减少外泌体的分泌，但是不影响大囊泡的分泌，这表明CD63有助于外泌体的生物发生。

需要说明的时，dCas9蛋白为对Cas9蛋白的功能结构域进行突变，使其失去核酸内切酶的功能但保留其靶向目标基因能力和加工pre-cr RNA的功能后，得到的突变型蛋白；在突变的Cas9蛋白的碳端将转录抑制子KRAB 进行融合表达，在sgRNA的引导下dCas9-KRAB融合蛋白结合到基因的转录起始区域，从而可以高效地抑制靶基因的表达。特异性结合对是指具有特异性结合关系的两种物质，例如抗体和抗原、生物素和亲和素等等，本发明优选为EGFP和EGFP抗体。例如，导向载体上含有EGFP抗体(GFP Nanobody)，其与CD63连接，编辑载体上含有EGFP，其与dCas9-KRAB 融合蛋白和sgRNA形成复合物，在GFP Nanobody与GFP结合的作用下，使得En1-i-sgRNA-GFP Nanobody-dCas9-KRAB复合物聚集到外泌体中，通过分离培养上清中的外泌体，可以得到具有特异抑制En1基因表达的外泌体。

ATGGCGGTGGAAGGAGGAATGAAATGTGTGAAGTTCTTGCTCTA CGTCCTCCTGCTGGCCTTTTGCGCCTGTGCAGTGGGACTGATTGCCGT GGGTGTCGGGGCACAGCTTGTCCTGAGTCAGACCATAATCCAGGGGG CTACCCCTGGCTCTCTGTTGCCAGTGGTCATCATCGCAGTGGGTGTCT TCCTCTTCCTGGTGGCTTTTGTGGGCTGCTGCGGGGCCTGCAAGGAG AACTATTGTCTTATGATCACGTTTGCCATCTTTCTGTCTCTTATCATGTT GGTGGAGGTGGCCGCAGCCATTGCTGGCTATGTGTTTAGAGATAAGGT GATGTCAGAGTTTAATAACAACTTCCGGCAGCAGATGGAGAATTACCC GAAAAACAACCACACTGCTTCGATCCTGGACAGGATGCAGGCAGATT TTAAGTGCTGTGGGGCTGCTAACTACACAGATTGGGAGAAAATCCCTT CCATGTCGAAGAACCGAGTCCCCGACTCCTGCTGCATTAATGTTACTG TGGGCTGTGGGATTAATTTCAACGAGAAGGCGATCCATAAGGAGGGC TGTGTGGAGAAGATTGGGGGCTGGCTGAGGAAAAATGTGCTGGTGGT AGCTGCAGCAGCCCTTGGAATTGCTTTTGTCGAGGTTTTGGGAATTGT CTTTGCCTGCTGCCTCGTGAAGAGTATCAGAAGTGGCTACGAGGTGAT GTAG(SEQ ID NO.4)。

在优选的实施方式中，编辑载体包括pLV hU6-En1-i1-sgRNA-hUbC-GFPNanobody-dCas9-KRAB-T2a-Puro、pLV hU6-En1-i2-sgRNA-hUbC-GFP Nanobody-dCas9-KRAB-T2a-Puro或pLV hU6-En1-i3-sgRNA-hUbC-GFP Nanobody-dCas9-KRAB-T2a-Puro；导向载体包括pLVX-CD63-EGFP-puro。

本发明还提供一种抑制瘢痕形成的外泌体，该外泌体以外泌体载体为生物相容性外壳，内部包裹有内部基质，其内部基质包括dCas9-KRAB融合蛋白和sgRNA；其中，sgRNA能够与dCas9-KRAB融合蛋白形成功能性复合体。该外泌体可以实现En1基因的精准、显著抑制，这避免了传统瘢痕修复技术效果差、成本高的问题，对于抑制瘢痕形成具有重要意义，安全性高。

上述外泌体的制备方法为：在适于细胞生长的条件下培养具有外泌功能的细胞使得dCas9-KRAB融合蛋白和sgRNA进入外泌体，分离得到外泌体。其中，细胞优选为HEK293T细胞或MSC细胞。具体地，可以优选利用本发明上述提供的基因编辑系统，将其导入细胞并进行细胞培养，分离上清得到抑制瘢痕形成的外泌体。

该外泌体可以直接作为活性成分用于制备成抑制瘢痕形成的修复剂，具体成分可以为：1-5w/v％的外泌体、10-20v/v％甘油、5-10v/v％聚乙二醇、 0.5-1w/v％羟丙基壳聚糖、0.1-1w/v％山梨酸和2.5-6w/v％羟乙基纤维素。其中，“w/v”是指，每100ml修复剂中含有某物质的克数；“v/v％”是指，每100ml修复剂中含有某物质的毫升数。外泌体的含量可以但不限于为1 w/v％、2w/v％、3w/v％、4w/v％或5w/v％；甘油的含量可以但不限于为 10v/v％、12v/v％、14v/v％、16v/v％、18v/v％或20v/v％；聚乙二醇的含量可以但不限于为5v/v％、6v/v％、7v/v％、8v/v％、9v/v％或10 v/v％；羟丙基壳聚糖的含量可以但不限于为0.5w/v％、0.6w/v％、0.7 w/v％、0.8w/v％、0.9w/v％或1w/v％；山梨酸的含量可以但不限于为0.1 w/v％、0.2w/v％、0.4w/v％、0.6w/v％、0.8w/v％或1w/v％；羟乙基纤维素的含量可以但不限于为2.5w/v％、4w/v％或6w/v％。

上述修复剂的制备方法如下：甘油、聚乙二醇、羟丙基壳聚糖、山梨酸和水按比例加热混匀，再加入羟乙基纤维素混匀，经灭菌后加入外泌体，混匀得到修复剂。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

一、载体的构建：

1.pEGFP-N1-CD63质粒的构建：

(1)设计合成扩增CD63的上下游引物，序列如下：

CD63-F：gcgggcccgggatccaccggtATGGCGGTGGAAGGAGGA(SEQ ID NO.5)。

CD63-R：ctcaccatggtggcgaccggCATCACCTCGTAGCCACTTCTGA(SEQ ID NO.6)。

(2)PCR扩增体系，以及PCR反应程序如下：

PCR扩增体系配制，在冰上配制以下组分，混匀：

PCR反应程序如下：

(3)pEGFP-N1质粒进行AgeI单酶切，37度酶切1h，反应体系如下：

(4)将CD63的PCR产物以及pEGFP-N1酶切产物进行纯化回收。

(5)pEGFP-N1与CD63进行同源重组，反应体系如下：

37℃反应30min，降至4℃备用。

(6)重组产物转化：将重组产物导入DH5α感受态细胞中，并涂到含有Kana抗性的LB平板上，37℃培养箱中培养过夜；

(7)克隆挑选以及验证：挑选10个克隆进行菌液PCR验证，结果如图1所示，以菌液为模板，使用CD63扩增引物进行PCR扩增，扩增后将PCR产物在2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，可见克隆编号为2,4,6号PCR产物条带大小与CD63吻合，判断2,4,6号克隆成功表达CD63序列。最终获得pEGFP-N1-CD63质粒，备用。

2.pLVX-CD63-EGFP-puro质粒的构建：

(1)将pLVX-HnCoV-S-Puro质粒进行BamHI、XbaI双酶切，并切胶回收线性化载体片段，37度酶切1h，反应体系如下：

酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，回收线性化的载体片段(8000bp)，备用。

(2)设计合成克隆CD63-EGFP的上下游引物，序列如下：

CD63-EGFP-F： ggtaccgcgggcccgggatccGCCACCATGGCGGTGGAAGGAGGA(SEQ IDNO.7)。

CD63-EGFP-R： tacccggtagaattatctagaTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC(SEQ IDNO.8)。

(3)PCR扩增体系，以及PCR反应程序如下：

PCR扩增体系配制，在冰上配制以下组分，混匀：

PCR反应程序如下：

(4)pLVX-HnCoV-S-puro线性化载体片段与CD63-EGFP扩增片段进行重组反应，反应体系如下：

37℃反应30min，降至4℃备用。

(5)重组产物转化：将重组产物导入DH5α感受态细胞中，并涂到含有Amp抗性的LB平板上，37℃培养箱中培养过夜；

(6)克隆挑选以及验证：挑选并进行测序验证。最终获得 pLVX-CD63-EGFP-puro质粒，备用。

3.sgRNA-GFP Nanobody-dCas9-KRAB-Puro载体的构建：

(1)设计扩增GFP Nanobody同源重组引物，序列如下：

GFP Nanobody-dCas9-F： gggctgcaggtcgactctagaGCCACCATGCAGGTTCAACT(SEQID NO.9)。

GFP Nanobody-dCas9-R： gtagtccatggtggctctagaAGAGCTCACCGTCACCTGAGTC(SEQID NO.10)。

(2)GFP Nanobody序列的PCR扩增与纯化，反应如下：

PCR扩增体系配制，在冰上配制以下组分，混匀：

PCR反应程序如下：

产物如图3所示，可见在400bp大小位置处能看到GFP Nanobody的扩增条带，回收GFP Nanobody片段用于下一步sgRNA-EGFP Nanobody-dCas9-KRAB载体构建。

(3)pLV hU6-sgRNA-hUbC-dCas9-KRAB-T2a-Puro质粒进行XbaI单酶切及纯化，37度酶切1h，反应如下：

酶切产物进行纯化，回收线性化的载体片段，备用。

(4)GFP Nanobody与线性化pLV hU6-sgRNA-hUbC-dCas9-KRAB-T2a-Puro进行重组，反应体系如下：

37℃反应30min，降至4℃备用。

(5)重组产物转化：将重组产物导入DH5α感受态细胞中，并涂到含有抗性的LB平板上，37℃培养箱中培养过夜；

(6)克隆挑选以及验证：挑选12个克隆进行菌液PCR初步验证，结果如图4所示，以菌液为模板，使用GFP Nanobody扩增引物进行PCR扩增，扩增后将PCR产物在2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，可见克隆编号为 4,5,6,8号PCR产物条带大小与EGFP Nanobody吻合，初步判断4,5,6,8号克隆成功表达EGFP Nanobody序列，将含有阳性条带的克隆进行测序进一步验证。最终获得pLV hU6-sgRNA-hUbC-GFP nanobody-dCas9-KRAB-T2a-Puro质粒，备用。

4.En1-i-sgRNA-GFP Nanobody-dCas9-KRAB-Puro载体的构建：

(1)针对En1基因序列，在En1基因转录起始位点附近设计了3对sgRNA，合成以下引物，具体的序列如下：

En1-i1-F：CACCGGGCCTCTGTCACGCTCGACC(SEQ ID NO.11)；

En1-i1-R：AAACGGTCGAGCGTGACAGAGGCCC(SEQ ID NO.12)；

En1-i2-F：CACCGGTTGTCGATGAAAAAGTTGG(SEQ ID NO.13)；

En1-i2-R：AAACCCAACTTTTTCATCGACAACC(SEQ ID NO.14)；

En1-i3-F：CACCGGAAGCCTCAGCGAAGGCACG(SEQ ID NO.15)；

En1-i3-R：AAACCGTGCCTTCGCTGAGGCTTCC(SEQ ID NO.16)。

(2)质粒酶切以及连接反应：

1)将pLV hU6-sgRNA-hUbC-GFP Nanobody-dCas9-KRAB-T2a-Puro质粒进行酶切，37度酶切30min，酶切体系如下：

2)将退火的Oligos引物与酶切好的pLV hU6-sgRNA-hUbC-GFP Nanobody-dCas9-KRAB-T2a-Puro载体进行连接，4度连接过夜；

3)连接产物的转化：将连接产物导入DH5α感受态细胞中，并涂到含有抗性的LB平板上，37℃培养箱中培养过夜；

(3)克隆挑选以及验证：挑选克隆进行测序验证，结果如图5(En1-i1)、图6(En1-i2)、图7(En1-i3)所示，可见靶向序列成功插入到载体中。最终获得pLV hU6-En1-i-sgRNA-hUbC-GFP Nanobody-dCas9-KRAB-T2a-Puro 质粒，备用。

二、病毒的包装以及浓缩：

1.转染前一天接种HEK293T细胞到10cm直接的培养皿中，每皿接种1000万细胞数量，培养箱中培养过夜；

2.转染当天，从培养箱中取出HEK293T细胞观察生长情况，细胞状况良好则可进行转染；

3.在离心管上分别标记Opti MEM-质粒、Opti MEM-PEI；

4.往标记好的离心管中对应加入Opti MEM培养基以及质粒，Opti MEM 培养基以及PEI，轻轻吹吸2-3下混匀，室温静止5min；

5.静止5min后将Opti MEM-PEI混合液加入到Opti MEM-质粒混合液中，混合均匀后室温静止15min；

6.将Opti MEM-PEI-质粒混合液逐滴均匀加入到HEK293T细胞中，细胞培养箱中培养6h后更换新鲜培养基；

7.在细胞转染48h的时候第一次收集病毒上清液，在细胞转染72h的时候第二次收集病毒上清液，并使用0.45μm滤膜过滤病毒上清液；

8.超速离心进行病毒上清液的浓缩，19400rpm 4℃离心2h，离心后弃上清，并用基础培养基重悬病毒，分装，负80保存。

三、细胞感染、培养上清液的收集：

1.使用胰蛋白酶消化MSC细胞，计数200万细胞数量，将 pLVX-CD63-EGFP-puro病毒和pLV hU6-En1-i-sgRNA-hUbC-GFP Nanobody-dCas9-KRAB-T2a-Puro病毒以及细胞完全培养基共同加入到直径 10cm的细胞培养皿中，并添加终浓度为5μg/ml的Polybrene，细胞培养箱中培养过夜；

2.第二天将细胞从培养箱中取出，吸弃培养上清，用DPBS漂洗两遍后，更换新鲜的完全培养基，继续培养过夜；

3.在细胞感染48小时，第一次收集培养上清液，并更换新鲜培养基继续培养；

4.在细胞感染72小时，第二次收集培养上清液，并将第一次收集的上清液混合一起进行外泌体的分离。

结果如图8所示，将CD63-EGFP、En1-i-sgRNA-GFP Nanobody-dCas9-KRAB病毒共感染MSC后，通过荧光显微镜观察其定位，其中绿色荧光显示的是CD63-EGFP融合蛋白，可见其表达均在细胞浆中。

四、外泌体的分离以及细胞摄入：

1.分离外泌体步骤如下：

(1)细胞培养的密度达到80％左右时候，收集细胞培养上清液；

(2)将培养上清液5000xg 4℃离心30min，离心后将上清液转移至新的离心管中；

(3)将上清液20000xg 4℃离心30min，离心后将上清转移至新的离心管中；

(4)将上清液120000xg 4℃离心1.5h；

(5)离心结束将上清吸弃，用生理盐水重悬沉淀，分装，-80℃保存。

2.成纤维细胞摄入外泌体，步骤如下：

(1)细胞密度达到90％时候，消化细胞计数60万细胞数量，用1.5ml 无血清完全培养基重悬细胞，并加入500μl外泌体，吹吸混匀细胞后接种到 6孔板中；

(2)将孔板离心30min，离心条件25℃2250rpm，离心后放回培养箱中培养过夜；

(3)细胞培养48小时后更换新鲜的含有外泌体的无血清完全培养基继续培养；

(4)细胞培养72小时，收集细胞用于RT-PCR检测En1基因的表达水平。

五、En1基因表达水平检测：

1.收集细胞并进行总RNA提取；

(1)加入1ml的Trizol到离心管中，吹打均匀裂解细胞；

(2)加入0.2ml的氯仿，剧烈涡旋15s，放于冰上静置5min，4℃12000 rpm离心10min；

(3)小心吸取上层水相到另一干净离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，室温放置20min；

(4)4℃12000rpm离心10min，吸弃上清；

(5)加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀；

(6)4℃12000rpm离心5min，吸弃上清；

(7)室温干燥5min，可见白色沉淀变成透明；

(8)往离心管中加入20μl DEPC处理水溶解RNA；

(9)测浓度后，放于-80℃保存，备用。

2.cDNA第一链的合成；

(1)配制以下组分，操作在冰上进行：

(2)反应条件如下：37℃反应15min，85℃反应5s，降温至4℃，-20℃保存备用。

3.qRT-PCR检测细胞中En1基因的表达水平；

PCR所用的En1和Actin引物如下：

En1-F：TTCCAGGCAAACCGCTACATC(SEQ ID NO.17)；

En1-R：ACTCGCTCTCGTCTTTGTCCT(SEQ ID NO.18)；

Actin-F：TGACGTGGACATCCGCAAAG(SEQ ID NO.19)；

Actin-R：CTGGAAGGTGGACAGCGAGG(SEQ ID NO.20)。

结果如图9所示，从结果可以看出3条靶向En1的序列均可降低En1 的表达，但是降低的程度不一，其中En1-i1和En1-i2的抑制效果与对照组相比具有显著性差异，而En1-i3也能抑制En1的表达，但是没有统计学差异。

六、抑制瘢痕形成的外泌体修复剂制备：

1、按以下比例进行混匀，去离子水占比为60-80％、甘油为10-20％、聚乙二醇为5-10％、羟丙基壳聚糖占比为0.5-1％、山梨酸为0.1-1％，搅拌均匀并加热至完全溶解，完全溶解后再加入羟乙基纤维素2.5-6％，再继续搅拌至混合均匀；

2、将步骤1配好的混合液于高压灭菌锅中进行高压灭菌，灭菌后自然冷却至室温；

3、将分离好的外泌体按2％的比例加入步骤2得到的混合液中，边加入边搅拌，待混合均匀后，灌装保存。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海乐维再生医学科技有限公司

<120> CRISPRi介导的抑制瘢痕形成的外泌体及其制备方法和应用

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggcctctgtc acgctcgacc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttgtcgatg aaaaagttgg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaagcctcag cgaaggcacg 20

<210> 4

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggcggtgg aaggaggaat gaaatgtgtg aagttcttgc tctacgtcct cctgctggcc 60

ttttgcgcct gtgcagtggg actgattgcc gtgggtgtcg gggcacagct tgtcctgagt 120

cagaccataa tccagggggc tacccctggc tctctgttgc cagtggtcat catcgcagtg 180

ggtgtcttcc tcttcctggt ggcttttgtg ggctgctgcg gggcctgcaa ggagaactat 240

tgtcttatga tcacgtttgc catctttctg tctcttatca tgttggtgga ggtggccgca 300

gccattgctg gctatgtgtt tagagataag gtgatgtcag agtttaataa caacttccgg 360

cagcagatgg agaattaccc gaaaaacaac cacactgctt cgatcctgga caggatgcag 420

gcagatttta agtgctgtgg ggctgctaac tacacagatt gggagaaaat cccttccatg 480

tcgaagaacc gagtccccga ctcctgctgc attaatgtta ctgtgggctg tgggattaat 540

ttcaacgaga aggcgatcca taaggagggc tgtgtggaga agattggggg ctggctgagg 600

aaaaatgtgc tggtggtagc tgcagcagcc cttggaattg cttttgtcga ggttttggga 660

attgtctttg cctgctgcct cgtgaagagt atcagaagtg gctacgaggt gatgtag 717

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcgggcccgg gatccaccgg tatggcggtg gaaggagga 39

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctcaccatgg tggcgaccgg catcacctcg tagccacttc tga 43

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggtaccgcgg gcccgggatc cgccaccatg gcggtggaag gagga 45

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tacccggtag aattatctag attacttgta cagctcgtcc atgcc 45

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gggctgcagg tcgactctag agccaccatg caggttcaac t 41

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtagtccatg gtggctctag aagagctcac cgtcacctga gtc 43

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

caccgggcct ctgtcacgct cgacc 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aaacggtcga gcgtgacaga ggccc 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

caccggttgt cgatgaaaaa gttgg 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aaacccaact ttttcatcga caacc 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

caccggaagc ctcagcgaag gcacg 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aaaccgtgcc ttcgctgagg cttcc 25

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ttccaggcaa accgctacat c 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

actcgctctc gtctttgtcc t 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tgacgtggac atccgcaaag 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ctggaaggtg gacagcgagg 20

Claims

1.一种特异性识别Engrailed-1基因的sgRNA，其特征在于，编码该sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3；

En1-i1：5’-GGCCTCTGTCACGCTCGACC-3’(SEQ ID NO.1)；

En1-i2：5’-GTTGTCGATGAAAAAGTTGG-3’(SEQ ID NO.2)；

En1-i3：5’-GAAGCCTCAGCGAAGGCACG-3’(SEQ ID NO.3)。

2.与权利要求1所述sgRNA相关的生物材料，其特征在于，包括如下(a)-(c)任一种：

(a)核酸分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3；

(b)重组载体，含有(a)的核酸分子；

(c)工程细胞，含有(a)的核酸分子或(b)的重组载体。

3.权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的生物材料在如下(a)-(e)任一项中的应用：

(a)对Engrailed-1基因进行基因编辑；

(b)制备对Engrailed-1基因进行基因编辑的产品；

(c)抑制瘢痕形成；

(d)制备抑制瘢痕形成的外泌体；

(e)制备抑制瘢痕形成的修复剂。

4.一种用于抑制Engrailed-1基因表达的基因编辑系统，其特征在于，包括编辑载体和导向载体；

所述编辑载体包括编码dCas9-KRAB融合蛋白的核苷酸序列和编码权利要求1所述sgRNA的核酸分子；

所述导向载体包括编码CD63的核苷酸序列SEQ ID NO.4；

优选地，特异性结合对包括抗原和抗体或生物素和亲和素；优选为EGFP和EGFP抗体；

优选地，所述编辑载体包括pLV hU6-En1-i1-sgRNA-hUbC-GFPNanobody-dCas9-KRAB-T2a-Puro、pLV hU6-En1-i2-sgRNA-hUbC-GFPNanobody-dCas9-KRAB-T2a-Puro或pLV hU6-En1-i3-sgRNA-hUbC-GFPNanobody-dCas9-KRAB-T2a-Puro；

优选地，所述导向载体包括pLVX-CD63-EGFP-puro。

5.一种抑制瘢痕形成的外泌体，其特征在于，所述外泌体包括外泌体载体以及设置于外泌体载体内的内部基质，所述内部基质包括dCas9-KRAB融合蛋白和权利要求1所述的sgRNA；其中，sgRNA能够与dCas9-KRAB融合蛋白形成功能性复合体。

6.权利要求5所述的外泌体的制备方法，其特征在于，在适于细胞生长的条件下培养具有外泌功能的细胞使得dCas9-KRAB融合蛋白和sgRNA进入外泌体，分离得到外泌体；

优选地，所述细胞包括HEK293T细胞或MSC细胞；

优选地，将权利要求4所述的基因编辑系统导入细胞并进行细胞培养，分离得到外泌体。

7.权利要求5所述的外泌体在抑制瘢痕形成或制备抑制瘢痕形成产品中的应用。

8.一种抑制瘢痕形成的修复剂，其特征在于，包括权利要求5所述的外泌体。

9.根据权利要求8所述的修复剂，其特征在于，包括1-5w/v％的外泌体、10-20v/v％甘油、5-10v/v％聚乙二醇、0.5-1w/v％羟丙基壳聚糖、0.1-1w/v％山梨酸和2.5-6w/v％羟乙基纤维素。

10.权利要求8或9所述修复剂的制备方法，其特征在于，甘油、聚乙二醇、羟丙基壳聚糖、山梨酸和水按比例加热混匀，再加入羟乙基纤维素混匀，经灭菌后加入外泌体，混匀得到修复剂。