CN113336627B - 单萜类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

单萜类化合物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及单萜类化合物及其制备方法和在制备预防或治疗神经退行性疾病药物、抗氧化剂中的应用，所述化合物的结构如下：
Figure DDA0003078196800000011
R1为氢或氧；R2和R3各自独立为C1‑C4烷氧基或羟基。

Description

单萜类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及文冠果花中的1个单萜类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
文冠果(XanthocerassorbifoliumBunge)为无患子科(Sapindaceae)文冠果属植物，单属单种。灌木或乔木，生于山坡、沟谷间，分布于我国辽宁、河北、陕西等省，为我国特有的珍稀木本油料作物。其茎干或枝条的干燥木部称为文冠木，为蒙古族习用药材，蒙药名为西拉·森登，主要用于治疗风湿性关节炎，风湿内热，皮肤风热等症。文冠果种仁为原料研制开发的国家二类新药——遗尿停胶囊，临床上用于治疗小儿遗尿，且疗效显著。其花和叶中富含的黄酮、酚酸和木脂素类化合物具有抗氧化、降血压等多方面保健功效，目前已有保健茶、化妆品等多种类型的产品广为应用。而对文冠果花中的化学物质基础报道却较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一系列结构新颖的单萜化合物及其制备方法和新的医药用途。从文冠果花中分离鉴定的1个新单萜类化合物的结构、制备方法及其在开发预防或治疗神经退行性疾病药物、抗氧化剂中的应用。
本发明提供的单萜类化合物及其药学上可接受的盐、异构体或溶剂化物，其具有如下结构：
Figure BDA0003078196790000011
R1为氢或氧；
R2和R3各自独立为C1-C4烷氧基或羟基；
本发明优选如下1个具体化合物：
Figure BDA0003078196790000012
本发明异构体优选为(3R,4S；3S,4S；3R,4R)-构型异构体，溶剂化物优选为甲醇或氯仿溶剂化物。
本发明还提供了所述单萜类化合物1的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)文冠果花(flower ofXanthocerassorbifoliumBunge)用乙醇或甲醇提取，回收提取液得粗提物；
(2)步骤(1)所得粗提物经水溶解后，用有机溶剂萃取，所述有机溶剂为石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇，即分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，得到萃取物；
(3)步骤(2)所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比100:3～100:100、石油醚和丙酮混合溶剂中石油醚和丙酮体积比100:3～100:100、氯仿和丙酮混合溶剂中氯仿和丙酮体积比100:0～100:50、二氯甲烷和丙酮混合溶剂中体积比100:0～100:50、氯仿和甲醇混合溶剂中氯仿和甲醇体积比100:0～100:30、或二氯甲烷和甲醇混合溶剂中二氯甲烷和甲醇体积比100:0～100:30为洗脱溶剂梯度洗脱；
(4)上述步骤(3)中各溶剂洗脱系统所得100:1～100:30以下各有机溶剂混合比例流分经ODS柱色谱分离，以甲醇和水混合溶剂、或乙腈和水混合溶剂为流动相梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇和水体积比1:9～9:1、或乙腈和水体积比1:9～8:2流分经制备型HPLC-UV色谱进一步分离，以甲醇和水混合溶剂中甲醇和水体积比1:9～7:3，或乙腈和水混合溶剂中乙腈和水体积比1:9～6:4为流动相洗脱，得到单萜类化合物1。
本发明提供的所述的单萜类化合物1的制备方法，步骤(1)中所述的提取方法为冷浸或热回流法(温度为25～90℃)提取3-6次，每次3-24h，所用溶剂为：50％～100％的乙醇。药材：溶剂重量体积比为1:5～1:15g/mL，优选1:8～1:12g/mL。
本发明提供的所述的新化合物1的制备方法，步骤(2)中所述的有机溶剂萃取法，采用水溶解粗提物，按照水相和有机相的体积比1:1，分别使用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取3-6次，优选5次，减压回收以上有机溶剂。
本发明提供的所述的单萜类化合物1的制备方法，步骤(3)中所述洗脱溶剂石油醚和乙酸乙酯混合溶剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比为100：3～100：100，优选100:10～100:50；石油醚和丙酮混合溶剂中石油醚和丙酮的体积比为100：3～100：100，优选100:10～100:50；二氯甲烷和丙酮混合溶剂中二氯甲烷和丙酮的体积比为100：0～100：50，优选100:5～100:30；氯仿和丙酮混合溶剂中氯仿和丙酮的体积比为100:0～100:50，优选100:5～100:30；二氯甲烷和甲醇混合溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比为100：0～100：30，优选100:3～100:15；氯仿和甲醇混合溶剂中中氯仿和甲醇的体积比为100:0～100:30，优选100:3～100:15。
本发明提供的单萜类化合物1的制备方法，步骤(4)中所述甲醇和水混合溶剂中甲醇和水的体积比为1:9～9:1，优选1:9～6:4；乙腈和水混合溶剂中乙腈和水的体积比为1：9～8：2，优选1:9～5:5。
本发明提供的单萜类化合物1的制备方法，步骤(5)中所述流动相甲醇和水混合溶剂中甲醇和水的体积比例为1:9～6:4，优选2:8～5:5；乙腈和水混合溶剂的比为1:9～5:5，优选1:9～4:6。
本发明还提供了一种药物组合物，包含上述的单萜类化合物及其药学上可接受的盐、异构体或溶剂化物和药学上可接受的载体。
本发明还提供了上述的单萜类化合物及其药学上可接受的盐、异构体或溶剂化物，或上述的药物组合物在制备预防或治疗神经退行性疾病药物、抗氧化剂中的应用。
本发明以LPS诱导的BV2小胶质细胞过度活化模型，对制备得到的单萜类化合物1的抗神经炎症活性进行了评价。结果显示，新化合物1能够抑制LPS诱导的过度活化的BV2小胶质细胞NO的释放，表现出中等强度的抗神经炎症活性。因此，本发明中制备的新化合物1可在开发治疗神经退行性疾病药物方面应用。
本发明评价了制备得到的新化合物1的DPPH、OH自由基清除活力及其总还原活力。结果显示，化合物1具有良好的清除DPPH、OH自由基活力，单萜类化合物1表现出中等强度的还原能力。因此，本发明中制备的单萜类化合物1具有开发抗氧化剂的潜力。
本发明首次提供了以文冠果花为原料，制备、鉴定的1个单萜类化合物的方法，并系统评价了其在预防或治疗神经退行性疾病药物、抗氧化剂中的应用。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
(1)文冠果花1kg用75％乙醇冷浸(25℃)3次，每次24h(每次用量:12L)，减压回收提取液得粗提物；
(2)步骤(1)所得乙醇提取物经水溶解，石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯和正丁醇萃取，提取液与萃取溶剂的体积比为1:1，每种溶剂萃取5次，得到萃取物；
(3)步骤(2)所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂100:3,100:7,100:10,100:15,100:20,100:30,100:50洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得100:7～100:20流分经ODS色谱分离，以甲醇-水1:9,3:7,5:5,7:3,9:1为流动相梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇:水(1:9～5:5)流分经HPLC-UV色谱分离，210nm检测，流速为3.5mL/min，以甲醇:水(25：75)为流动相洗脱得到化合物1(tR＝27.5min)，收率为0.00004％。
根据新化合物1的理化性质和波谱数据鉴定了其结构。
单萜类化合物1的结构鉴定数据如下：
白色粉末(CH3OH)，
Figure BDA0003078196790000042
(c 0.1，CH3OH)，HR-ESI-MS给出准分子离子峰[M+Na]+m/z：209.1148(209.1154for C10H18O3Na)，推测其分子式为C10H18O3，不饱和度为2。1H-NMR(600MHz,CD3OD-d4)给出一组连氧亚甲基氢信号:δH4.12(1H,dd,J＝11.5Hz,H-7a),4.07(1H,dd,J＝11.5Hz,H-7b)；两个连氧次甲基氢信号:δH 3.78(1H,d,J＝3.2Hz,H-4),3.73(1H,dt,J＝12.6,3.2Hz,H-3)；两个次甲基信号:δH 1.76(1H,t,J＝12.6Hz,H-2a),1.40(1H,dd,J＝12.6,3.2Hz,H-3)；三组甲基信号:δH 1.87(3H,s,CH3-10),1.09(3H,s,CH3-8),1.06(3H,s,CH3-9)。13C-NMR(150MHz,CD3OD-d4)：共给出10个碳信号，其中3个甲基信号：δC29.5(CH3-8),27.7(CH3-9),18.1(C-10)；2个亚甲基碳信号:δC 41.8(C-2),58.3(C-7)；2个次甲基碳信号:δC 67.9(C-3),72.8(C-4)；2个双键碳信号:δC 133.6(C-5),140.2(C-6)；1个季碳信号:δC 37.8(C-1)。HMBC谱中观测到H-7(4.12,4.07)与C-1(37.8),C-6(140.2)相关,H-4(3.78)与C-2(41.8),C-6(140.2),C-10(18.1)相关,H-3(3.73)与C-2(41.8),C-4(72.8)相关，从而确定了化合物的平面结构。1H-NMR和13C-NMR见表1。1H-NMR谱上H-3和H-4的偶合常数为3.6Hz，因此确定其为顺式构型；根据经验规则，化合物1位于1位的两个甲基中，α-CH3的碳谱化学位移值较β-CH3的大，NOESY谱中，H3(3.73,1H,dt,J＝12.6,3.2Hz)与β-CH3(1.06,3H,s)相关，确定了化合物的相对构型。化合物1的绝对构型通过比较实测ECD曲线和计算ECD曲线确定，命名为(3S,4R)-xanthoceterpene 1。
表1化合物1的1H-NMR和13C-NMR(CD3OD)数据
Figure BDA0003078196790000041
实施例2
(1)文冠果花1kg用85％甲醇冷浸(25℃)4次，每次24h(每次用量:15L)，减压回收提取液得粗提物；
(2)步骤(1)所得乙醇提取物经水溶解，石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯和正丁醇萃取，提取液与萃取溶剂的体积比为1:1，每个溶剂萃取4次，得到不同极性部位的萃取物；
(3)步骤(2)所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂100:3,100:7,100:10,100:15,100:20,100:30,100:50洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得100:10～100:30流分经ODS色谱分离，以甲醇/水1:9,3:7,5:5,7:3,9:1为流动相梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇:水(1:9～7:3)流分经HPLC-UV色谱分离，210nm检测，流速为3.5mL/min，以甲醇:水(25:75)为流动相洗脱得到化合物1(tR＝27.5min)，收率为0.00004％。
化合物鉴定数据参见实施例1。
实施例3
(1)文冠果花1kg用100％乙醇热回流(80℃)2次，每次3h(每次用量:12L)，减压回收提取液得粗提物；
(2)步骤(1)所得乙醇提取物经水溶解，石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯和正丁醇萃取，提取液与萃取溶剂的体积比为1:1，每个溶剂萃取5次，得到不同极性部位的萃取物；
(3)步骤(2)所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以二氯甲烷和甲醇混合溶剂100:0,100:1,100:3,100:5,100:7,100:10,100:20,100:30,100:50洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得100:3～100:20流分经ODS色谱分离，以乙腈/水1:9,3:7,6:4,8:2为流动相梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得乙腈:水(1:9～4:6)流分经HPLC-UV色谱分离，210nm检测，流速为3.5mL/min，以乙腈:水(15:85)为流动相洗脱得到化合物1(tR＝20.5min)，收率为0.00004％。
化合物鉴定数据参见实施例1。
实施例4
(1)文冠果花1kg用65％甲醇热回流(85℃)5次，每次3h(每次用量:10L)，减压回收提取液得粗提物；
(2)步骤(1)所得乙醇提取物经水溶解，石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯和正丁醇萃取，提取液与萃取溶剂的体积比为1:1，每个溶剂萃取6次，得到不同极性部位的萃取物；
(3)步骤(2)所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以氯仿和甲醇混合溶剂100:0,100:1,100:3,100:5,100:7,100:10,100:30,100:50洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得100:1～100:10流分经ODS色谱分离，以甲醇/水1:9,3:7,5:5,7:3,9:1为流动相梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇:水(2:8～5:5)流分经HPLC-UV色谱分离，210nm检测，流速为3.5mL/min，以甲醇:水(25：75)为流动相洗脱得到化合物1(tR＝27.5min),收率为0.00004％。
化合物鉴定数据参见实施例1。
实施例5
(1)文冠果花1kg用50％乙醇热回流(90℃)6次，每次3h(每次用量:8L)，减压回收提取液得粗提物；
(2)步骤(1)所得乙醇提取物经水溶解，石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯和正丁醇萃取，提取液与萃取溶剂的体积比为1:1，每个溶剂萃取5次，得到不同极性部位的萃取物；
(3)步骤(2)所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以二氯甲烷和甲醇混合溶剂100:0,100:1,100:3,100:5,100:7,100:10,100:30洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得100:3～100:10流分经ODS色谱分离，以乙腈/水1:9,3:7,6:4,8:2为流动相梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得乙腈:水(1:9～4:6)流分经HPLC-UV色谱分离，210nm检测，流速为3.5mL/min，以乙腈:水(15:85)为流动相洗脱得到化合物1(tR＝20.5min)，收率为0.00004％。
化合物鉴定数据参见实施例1。
实施例6实施例1-5中制备得到的单萜类化合物1的抑制小胶质细胞过度活化活性测试
(1)实验原理：小胶质细胞活化介导的慢性炎症反应是神经退行性疾病的发生、发展过程中的重要环节，抑制小胶质细胞的激活可能成为药物发现的一个新的靶点。LPS激活小胶质细胞释放NO、促炎症细胞因子和活性氧等。本实验通过建立体外LPS激活BV2小胶质细胞异常活化的筛选模型，以激活小胶质细胞释放NO为指标，评价文冠果花中新化合物1的抗炎活性。
(2)实验方法：
①小鼠小胶质细胞系BV2的培养
细胞培养和模型建立中使用的所有玻璃器皿及金属器械(培养瓶，移液管，溶液瓶等)，均经过121℃高压灭菌30min，以彻底去除污染的LPS。以DMDM培养基作为基础配制成内含10％胎牛血清培养液。小胶质细胞以约4×105cells/ml的浓度在5％CO2，37℃培养瓶中传代培养，至第三天贴壁细胞约占培养瓶底面积70-80％，以胰酶消化贴壁细胞，传代至另一培养瓶。以-80℃超低温冰箱冻存复苏后的BV-2作为第一代，选择第3-8代BV2细胞进行实验。
②药物配制方法
该化合物为粉末状，用DMSO溶解。配成母液，浓度为100mM，储存于-20℃。临用时用DMEM培养液将其进行稀释，依次稀释为100μM、30μM、10μM、1μM。DMSO终浓度<1‰。
③Griess法检测化合物对LPS激活小胶质细胞的抑制作用
取对数生长期的BV2小胶质细胞，用含10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞密度调至0.2×105cells/ml，接种于96孔板内，100μl/well，于37℃，5％CO2的培养箱内培养。细胞贴壁培养24h后换成无血清的新鲜培养液，同时进行加药处理。该化合物设剂量1、10、30、100μM与LPS共同作用。同时设空白对照。各给药组中LPS终浓度为100ng/mL。细胞加药后继续培养24h后，收集上清液，Griess比色法检测上清液中NO2-含量。
④MTT法检测化合物对小胶质细胞细胞成活率的影响
取对数生长期培养的BV2小胶质细胞，用含10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞密度调至0.2×105cells/ml，接种于96孔板内，100μl/well，于37℃，5％CO2的培养箱内培养。细胞贴壁培养24h后换成新鲜培养液，同时进行加药处理。化合物设剂量1、10、30、100μM与LPS共同作用。同时设空白对照。各给药组中LPS终浓度为100ng/ml。细胞加药后继续培养24h，然后向细胞液中加入MTT溶液，10μl/well，将细胞与0.25mg/ml MTT于37℃下共同孵育3h，吸除培养液，然后加入150μl的DMSO溶液，测定其OD值。数据处理，利用酶标仪相应软件进行数据处理，计算每一种样品3个孔OD值的平均值，利用平均值按如下公式计算细胞成活率(cell viability，CV％)。
细胞成活率％＝样品组OD值的平均值/空白对照组OD值的平均值×100％
⑤统计方法
全部资料采用SPSS(22.0)统计软件包进行检验分析。结果用平均值±标准误表示，评价整体性差异，组间均数采用One-Way ANOVA分析法进行方差齐性分析，并结合Dunnett’stest分析方法进行组间比较。多样本方差齐性检验采用Levene检验，当p>0.05，方差是齐的，采用Dunnett’s双侧T检验多组间均数的差异，当p<0.05，方差不齐，采用Dunnett T3检验多组间均数的差异。
⑥IC50的计算方法
将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC50。
(3)实验结果：见表2
表2新化合物1的小胶质细胞活化作用实验结果
Figure BDA0003078196790000071
a抑制小胶质细胞过度活化；b DPPH清除能力；c OH清除能力；d总还原能力
结果可知，实施例1-5中制备得到的新化合物1在不影响小胶质细胞BV2存活率的情况下，可显著抑制LPS诱导的过度活化的BV2细胞的NO释放，对抗神经炎症起到预防和治疗的作用。
实施例7实施例1-5中制备得到的化合物1的DPPH自由基清除活力
(1)实验原理
DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)即1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种稳定的氮中心自由基，在517nm处有一强吸收，当有自由基抑制剂存在时，由于其单电子被配对使其吸收逐渐减弱甚至小时，从而进行快速定量分析。近些年来，该方法已广泛应用于测定中药和食品的抗氧化能力。
(2)实验方法：
①DPPH测试液的配制
取1mg DPPH溶于20mL棕色容量瓶中，加入适量乙醇超声溶解，并定容至刻度，即得0.05mg/mL的DPPH溶液，于避光处保存，并在3.5小时内使用。
②药物配制方法
该化合物为粉末状，用乙醇溶解。配成浓度为500μM的母液，取上述母液依次稀释至500μM、250μM、125μM、62.5μM、31.26μM系列浓度。
③阳性对照品
取适量维生素C(Vc)，用乙醇超声溶解至适当浓度。取上述母液，将其稀释至500μM、250μM、125μM、62.5μM、31.26μM系列浓度。
④DPPH自由基清除活力测试
取2mLDPPH(0.05mg/mL)乙醇溶液于试管中，加入2mL样品溶液，震荡摇匀，黑暗中静置30min，测定其吸光值A。实验对照组以等体积乙醇代替DPPH溶液，空白组以等体积的纯净水溶液代替供试品溶液，分别于相同波长处测定吸收度Ai和A0。每组样品设定3个平行实验，取其平均值。按式[1-(A-Ai)/A0]×100％计算供试品的自由基清除率。
⑤IC50的计算方法
样品的DPPH自由基清除率IC50值计算：使用spss22.0软件，对DPPH自由基的清除率进行回归拟合，最终取清除率为50％时的浓度。将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC50，实验结果见表2。
由实验结果可知，实施例1-5中制备得到的新化合物1可显著的清除作用DPPH自由基。
实施例8实施例1-5中制备得到的化合物1的羟基自由基清除能力测定
(1)实验原理
羟基自由基(·OH)是一种活性氧自由基，能与活细胞中核酸、蛋白质等发生反应，从而导致多种疾病发生。H2O2与Fe2+发生Fenton反应产生羟基自由基，若在反应体系中加入水杨酸，水杨酸将捕获羟基自由基，生成与510nm处具有特殊吸收的2,3-二羟基苯甲酸。若反应体系中有自由基抑制剂存在时，有色物质的生成量将减少。采用固定时间法，在510nm处测量反应体系的吸光度，以测定供试品的羟基自由基清除作用。清除率越高，抗氧化活性越强。(2)实验方法：
①试剂的配制
称取2.502gFeSO4·7H2O，经纯净水溶解，定容至100mL，然后稀释10倍即得9mmol/L硫酸亚铁溶液；称1.243g水杨酸，乙醇溶解，定容至100mL，然后稀释10倍即得9mmol/L水杨酸-乙醇溶液；称9.926g30％H2O2，经水定容至100mL，然后稀释100倍即得8.8mmol/L H2O2溶液。
②药物配制方法
该化合物为粉末状，用乙醇溶解。配成母液，浓度为500μM，储存于-20℃。取上述母液，将其稀释至500μM、250μM、125μM、62.5μM、31.26μM系列浓度。
③阳性对照品
取适量维生素C(Vc)，用乙醇超声溶解至适当浓度。取上述母液，将其稀释至500μM、250μM、125μM、62.5μM、31.26μM系列浓度。
④羟基自由基清除活力测试
10mL试管中依次加入9mmol/L硫酸亚铁溶液0.5mL，样品溶液0.5mL，8.8mmol/LH2O2溶液0.5mL，摇匀，静置10min后加入9mmol/L水杨酸-乙醇溶液0.5m L，最后加8mL纯净水，震荡摇匀，水浴(37℃)30min，测定其吸光值A。实验对照组以等体积纯净水代替H2O2溶液，空白组以等体积的纯净水溶液代替供试品溶液，分别于相同波长处测定吸收度Ai和A0。每组样品设定3个平行实验，取其平均值。按式[1-(A-Ai)/A0]×100％计算供试品的羟基自由基清除率。
⑤IC50的计算方法
使用spss22.0软件，对羟基自由基的清除率进行回归拟合，最终取清除率为50％时的浓度。将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC50，实验结果见表2。
由实验结果可知，实施例1-5中制备得到的新化合物1表现出较强的清除羟基自由基作用。
实施例9实施例1-5中制备得到的化合物1的总还原能力测定
(1)实验原理
还原剂通过自身的还原作用，给出电子而清除自由基，还原能力越强，抗氧化性越强。实验中，样品的抗氧化剂能使铁氰化钾的三价铁还原成二价铁(亚铁氰化钾)，二价铁(亚铁氰化钾)进一步在和三氯化铁的反应下生成在700nm处有最大吸光度的普鲁士蓝(Fe4[Fe(CN)6]3)，因此测定700nm处的吸光值即可间接反映还原剂的还原能力大小，吸光度越大，还原能力越强。
(2)实验方法：
①试剂的配制
配制0.2mol/L，pH＝6.6的磷酸盐缓冲液、质量分数为1％的铁氰化钾溶液、质量分数为10％的三氯乙酸溶液、质量分数为10％的三氯化铁溶液。
②药物配制方法
该化合物为粉末状，用乙醇溶解。配成母液，浓度为100mM，储存于-20℃。取上述母液，将其稀释至100μM、80μM、60μM、40μM、20μM、10μM系列浓度。
③阳性对照品
取适量维生素C(Vc)，用乙醇超声溶解至适当浓度。取上述母液，将其稀释至100μM、80μM、60μM、40μM、20μM、10μM系列浓度。
④总还原能力测试
量取2.5mL待测样品溶液加入试管中，依次加入2.5mL磷酸盐缓冲液(0.2mol/L，pH＝6.6)及2.5mL铁氰化钾(1％，m/v)，混合均匀后在50℃水浴中恒温20.0min，迅速冷却后加入2.5mL三氯乙酸溶液(10％，m/v)，混匀，离心，取反应上清液5mL，加4mL蒸馏水和1mL三氯化铁(0.1％，m/v)，混匀后静置，测定其吸光值A(700nm)。以维生素C(Vc)为阳性对照品，制作标准曲线，得到吸光度(y)和Vc含量(x)之间的回归方程。化合物的总还原能力用Vc当量抗氧化能力来表示。每个样品重复测定3次。实验结果见表2。
由实验结果可知，实施例1-5中制备得到的新化合物1均具有良好的总还原能力。

Claims (9)

1.单萜类化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于，其为以下结构：
Figure FDA0003927622670000011
2.权利要求1所述的单萜类化合物及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)文冠果花(flower of Xanthoceras sorbifolium Bunge)用乙醇或甲醇提取，回收提取液得粗提物；
(2)步骤(1)所得粗提物经水溶解后，分别使用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇，依次萃取得到萃取物；
(3)步骤(2)所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂、石油醚和丙酮混合溶剂、氯仿和丙酮混合溶剂、二氯甲烷和丙酮混合溶剂、氯仿和甲醇混合溶剂、或二氯甲烷和甲醇混合溶剂为洗脱溶剂梯度洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得流分经ODS色谱分离，以甲醇和水混合溶剂、或乙腈和水混合溶剂为流动相梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇和水体积比2:8～6:4、或乙腈和水体积比1:9～5:5流分经HPLC-UV色谱进一步分离，以甲醇和水混合溶剂、或乙腈和水混合溶剂为流动相洗脱，得到单萜类化合物1。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的提取方法为冷浸或热回流法提取3-6次，每次3-24h，甲醇或乙醇的体积浓度为50％～100％，文冠果花与甲醇或乙醇的重量体积比为1:5～1:15g/mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的有机溶剂萃取法，采用水溶解粗提物，按照水相和有机相的体积比1:1，分别使用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取3-6次。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述石油醚和乙酸乙酯混合溶剂中石油醚和乙酸乙酯体积比为100：3～100：100；石油醚和丙酮混合溶剂中石油醚和丙酮的体积比为100：3～100：100；二氯甲烷和丙酮混合溶剂中二氯甲烷和丙酮的体积比为100：0～100：50；氯仿和丙酮混合溶剂中氯仿和丙酮的体积比为100：0～100：50；二氯甲烷和甲醇混合溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比为100：0～100：30；氯仿和甲醇的混合溶剂中氯仿和甲醇的体积比为100：0～100：30。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述甲醇和水混合溶剂中甲醇和水的体积比为1:9～9:1；乙腈和水混合溶剂中乙腈和水的体积比为1:9～8:2。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述甲醇和水混合溶剂中甲醇和水的体积比为1:9～7:3；乙腈和水混合溶剂中乙腈和水的比为1:9～6:4。
8.一种药物组合物，包含权利要求1所述的单萜类化合物及其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
9.权利要求1所述的单萜类化合物及其药学上可接受的盐，或权利要求8所述的药物组合物在制备预防或治疗神经退行性疾病药物、抗氧化剂中的应用。
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