CN113331311A

CN113331311A - 一株植物乳杆菌及其在猪饲料中的应用

Info

Publication number: CN113331311A
Application number: CN202110655367.7A
Authority: CN
Inventors: 蔡冬梅; 刘进国; 刘向伟
Original assignee: Shandong Jiurui Agricultural Group Co ltd
Current assignee: Shandong Jiurui Agricultural Group Co ltd
Priority date: 2021-06-11
Filing date: 2021-06-11
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2041-06-11
Also published as: CN113331311B

Abstract

本发明提供一种植物乳杆菌HS‑1，其保藏编号为CGMCC NO.21670；本发明所提供的植物乳杆菌HS‑1株用于制备中药材饲料添加剂。本发明的植物乳杆菌HS‑1产酸能力强，能以中草药为原料发酵产酸，抑制其他微生物的生长，同时给发酵后的产品赋予特殊的风味，提高适口性。应用本发明的菌株发酵中草药，可以提高中药原料中可溶性多肽的含量，有利于中草药在动物体内的吸收利用，微生物发酵破碎了药材植物细胞结构，将纤维素、半纤维素等包裹的药用成分充分释放，提高了母猪对药物的吸收利用速度，药物起效更快，明显优于普通中药散剂和煎剂。

Description

一株植物乳杆菌及其在猪饲料中的应用

技术领域

本发明属于益生菌筛选技术领域，具体涉及一株用于制备母猪中草药饲料添加剂的植物乳杆菌。

背景技术

随着我国大型规模化养猪业的发展，猪场存栏的种猪数量逐年增加。但近年来由于饲喂管理不善，滥用各种化学合成药物、激素、抗生素等因素，造成母猪群体普遍免疫机能下降，繁育性能不高。此外高密度圈养导致母猪运动量不足，多存在免疫力低下，脾胃虚弱气血不足的问题，易发生泪斑、死皮、便秘、炎症反复、不发情、难产、厌食、无精神等病症。母猪群体的健康状况也间接影响仔猪的存活率和生长性能，因此改善母猪免疫机能，是养猪业健康发展的关键因素之一。

有研究表明，在母猪饲粮中添加中草药，可提高母猪机体免疫力，促进消化吸收，提高母猪的繁育性能，间接提高仔猪群体的生长性能。中草药绿色天然，有独特的治病调理机理，是最理想的兽用抗生素的替代物。

但是目前中草药在畜牧业中的应用存在一定的局限，例如中草药直接添加在饲料中用于饲喂，其适口性不好，影响动物的采食量。而且中药的很多有效药用成分需经一定的炮制手段才能释放出来，而中药在养殖业中的加工工艺粗放，利用效率低，应用效果不稳定。发酵中药作为饲料添加剂使用，还存在容易发霉变质不宜存放的问题。为了提高中药材在饲料中的利用效率，需要更有效的加工处理方式。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum HS-1，已于2021年1月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.21670，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所提供的植物乳杆菌HS-1株用于制备中药材饲料添加剂。

本发明的第二个目的是针对目前养猪业中过度使用化学合成药物等因素造成的母猪群体亚健康、免疫机能低下、繁育性能不高等问题，提供一种适用于母猪的中草药发酵饲料添加剂；所提供的饲料添加剂，使用上述的植物乳杆菌HS-1发酵中草药原料制备而成。

所述的中药原料包含有黄芪、白术、白芍、马齿苋和茯苓；

其质量份数比为：黄芪20～30、白术20～30、白芍15～25、马齿苋5～15、茯苓10～20；

所述的饲料添加剂，其制备方法如下：

(1)将黄芪、白术、白芍、马齿苋、茯苓原料分别进行拣选，去除所含的杂质；

(2)将各种药材分别进行粉碎，使粉碎颗粒能过20目筛；

(3)称取包含以下质量的中草药：黄芪20～30g、白术20～30g、白芍15～25g、马齿苋5～15g、茯苓10～20g，混合均匀；

(4)添加糖蜜、水及对数期的植物乳杆菌菌液(OD 6-7)，混合均匀，装入呼吸发酵袋中，密封发酵。

本发明所述步骤(4)的发酵条件，其特征在于，所述植物乳杆菌HS-1发酵中药的条件为30～37℃发酵3～5天。

本发明所述步骤(4)的发酵条件，其特征在于，发酵前添加糖蜜的量为2～5％。

所制备的饲料添加剂在母猪基础日粮中的添加应用。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明的植物乳杆菌HS-1产酸能力强，能以中草药为原料发酵产酸，抑制其他微生物的生长，同时给发酵后的产品赋予特殊的风味，提高适口性。

(2)应用本发明的菌株发酵中草药，可以提高中药原料中可溶性多肽的含量，有利于中草药在动物体内的吸收利用，微生物发酵破碎了药材植物细胞结构，将纤维素、半纤维素等包裹的药用成分充分释放，提高了母猪对药物的吸收利用速度，药物起效更快，明显优于普通中药散剂和煎剂。

(3)本发明挑选黄芪、白术、白芍、马齿苋、茯苓等多种可饲用中药材，经过合理配伍，具有增强母猪免疫力、补气生血、滋养五脏的功能，可以有效增强母猪的抗病能力，提高繁育性能，进而提高仔猪群体的生长性能，同时可以减少抗生素、激素等化学合成药物的使用。

附图说明

图1:植物乳杆菌HS-1在MRS培养基中的菌落形态图。

图2：植物乳杆菌HS-1在显微镜下的菌体形态图。

图3：植物乳杆菌HS-1的生长曲线图。

图4：植物乳杆菌HS-1在MRS培养基里生长过程中的pH值变化曲线图。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步描述本发明，但不应以此限定本发明的保护范围。

实施例1：筛选植物乳杆菌HS-1

所述植物乳杆菌HS-1的获得方法如下：

(1)菌种的筛选和分离纯化

从腐烂厨余中筛选产酸菌，取1g厨余样品，加入9mL无菌生理盐水，漩涡振荡10min，制成1:10的初始悬液，然后以生理盐水10倍递增逐级稀释样品。选择3～5个适宜稀释度，取1mL稀释液于灭菌平皿内，倒入凉至40度左右的MRS培养基(添加0.2％的碳酸钙)，充分混匀，待培养基冷却凝固后，倒置于37度恒温培养箱内培养24-72h。

挑选平板上有较大溶钙圈的单菌落4个，在MRS培养基上多次划线分离，得到纯培养物，分别命名为HS-1、HS-2、HS-3、HS-4。

(2)菌株的16SrDNA鉴定

将四株菌经MRS培养后，分别挑取单菌落用作PCR扩增模板。PCR反应条件如下：98℃预变性5min，95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环，72℃终延伸10min。将PCR产物测序后与Genbank数据库中的序列进行同源性比对，可知HS-1、HS-2、HS-3都为植物乳杆菌L.plantarum，HS-4为乳酸乳球菌Lactococcus lactis。

(3)乳酸菌发酵菌剂的制备

MRS培养基配方：蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、牛肉浸膏10.0g、葡萄糖5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、K₂HPO₄ 2.0g、MgSO₄·7H₂O0.58g、MnSO₄·H₂O 0.25g、吐温801mL，蒸馏水定容至1.0L，pH6.8，固体培养基在此基础上添加琼脂15g、CaCO₃ 5.0g，灭菌备用。

取-20℃保存的菌种，以2％的接种量接种于MRS液体培养基中，37度静置培养，15-24h后检测菌液OD值，OD6-7时即可用于中草药发酵。

(4)中草药固体发酵

将上述三株植物乳杆菌HS-1、HS-2、HS-3，一株乳酸乳球菌HS-4以及本实验室储存的另三株乳酸菌(植物乳杆菌HN-1、JNU-6，屎肠球菌KDN-1)都用MRS液体培养至OD6-7，然后以3％的接种量接种于混合中药中(黄芪30g、白术25g、白芍20g、马齿苋10g、茯苓15)，添加水分到40％，混合均匀，37℃密封发酵3天，检测有机酸含量和乳酸菌菌量，结果如下：

其中，菌株HS-1发酵中草药后产有机酸含量最高，乳酸菌的菌量也最高，因此选择植物乳杆菌HS-1为最佳菌株，用于中草药固体发酵的进一步研究。

所筛选的植物乳杆菌HS-1，已于2021年1月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.21670，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2：

利用植物乳杆菌L.plantarum HS-1发酵制备一种适用于母猪的饲料添加剂，具体步骤如下：

(1)将黄芪、白术、白芍、马齿苋、茯苓各种药材原料分别进行拣选，去除所含的杂质；

(2)将各种药材分别进行粉碎，使粉碎颗粒能过20目筛；

(3)称取包含以下质量的中草药：黄芪30g、白术25g、白芍20g、马齿苋10g、茯苓15g，混合均匀；

(4)添加2％糖蜜作为碳源，按3％的量接入对数期的植物乳杆菌菌液(OD 6-7)，混合均匀，调整水分到40％，混合均匀。

(5)将混匀后的物料装入呼吸发酵袋中，37℃密封发酵3天，即获得一种适用于母猪的中草药饲料添加剂。

所述一种适用于母猪的发酵中草药饲料添加剂在母猪饲粮中的添加量为基础日粮的0.75％。

实施例3：

(2)将各种药材分别进行粉碎，使粉碎颗粒能过20目筛；

(3)称取包含以下质量的中草药：黄芪20g、白术30g、白芍20g、马齿苋15g、茯苓15g，混合均匀；

(4)添加2％糖蜜作为碳源，按5％的量接入对数期的植物乳杆菌菌液(OD 6-7)，混合均匀，调整水分到45％，混合均匀。

(5)将混匀后的物料装入呼吸发酵袋中，35℃密封发酵5天，即获得一种适用于母猪的中草药饲料添加剂。

所述一种适用于母猪的中草药饲料添加剂在母猪饲粮中的添加量为基础日粮的0.5％。

实施例4：

利用植物乳杆菌L.plantarum HS-1发酵制备一种适用于母猪的中草药饲料添加剂，具体步骤如下：

(2)将各种药材分别进行粉碎，使粉碎颗粒能过20目筛；

(3)称取包含以下质量的中草药：黄芪25g、白术25g、白芍15g、马齿苋15g、茯苓20g，混合均匀；

(4)添加5％糖蜜作为碳源，按2％的量接入对数期的植物乳杆菌菌液(OD 6-7)，混合均匀，调整水分到45％，混合均匀。

所述一种适用于母猪的发酵饲料添加剂在母猪饲粮中的添加量为基础日粮的1％。

对制备的添加剂进行检测：

(一)成分测定

将实施例2～4所制备的适用于母猪的中草药发酵饲料进行营养成分测定，结果如下表所示：

样品名称	水分％	粗蛋白％	小肽％	有机酸％
					实施例2	39.11	8.55	2.68	4.17
实施例3	38.92	8.30	2.70	4.12
					实施例4	39.06	8.44	2.95	3.74

微生物含量：

样品名称	植物乳杆菌
		实施例2	4.55×10<sup>9</sup>
实施例3	3.33×10<sup>9</sup>
		实施例4	2.81×10<sup>9</sup>

本发明的适用于母猪的中草药发酵饲料添加剂，以合理的中草药配伍，通过植物乳杆菌发酵，含有丰富的有机酸、活性小肽和乳酸菌活菌。

(二)抑菌试验

将实施例2～4所制备的植物乳杆菌发酵中草药样品进行抑菌效果测定。

指示菌的菌悬液制备：将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、和沙门氏菌三株致病菌从甘油管接种于培养基中，在37度振荡培养15～20小时，检测OD到6左右，稀释OD到0.8～1，备用。

样品的制备：以实施例1～3未经发酵的原料为对照，各称取5g样品，加入50mL无菌水，室温振荡提取1h，离心取上清备用。

然后以双层平板法检验发酵后产品对致病菌的抑制效果，上层半固体培养基每25ml培养基加入稀释好的指示菌液25ul，每个牛津杯孔中加入150ul样品提取液，37度培养15～20小时，测量各抑菌圈直径对抑菌效果做出评价，结果如下：

注：抑菌圈直径>20mm为极敏，抑菌圈直径15～20mm为高敏，抑菌圈直径10～15mm为中敏，抑菌圈直径<10mm为低敏，无抑菌圈的为不敏感。

植物乳杆菌HS-1发酵中草药后所得饲料添加剂对致病菌的抑制效果统计如下：

由上述结果可知，与未经植物乳杆菌发酵的原料相比，植物乳杆菌HS-1发酵处理过的中草药饲料添加剂对致病菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果有了显著的提高。

(三)母猪饲喂试验

以实施例2所得产品进行母猪饲喂实验，实验选择48只预产期相近的健康母猪，随机分成2组(对照组和实验组)，每组4个重复，每个重复6头母猪，母猪从产前一个月开始按设计饲喂相应的日粮，常规饲养，至母猪产后21天结束。对照组母猪采用基础日粮饲喂，实验组在基础日粮中额外添加0.75％的中草药超微粉饲料添加剂，相同的防疫管理程序，母猪自由采食。实验期内观察并记录母猪的采食和繁殖情况，实验结束后称量体重，计算每个实验组母猪的采食量、窝产仔数、活仔数、死胎、仔猪发病、成活情况。中草药超微粉制剂对母猪繁育性能的影响如下：

由上表数据可知，实验组比对照组总产仔数高5.11％，活仔数高6.24％，初生窝重高7.49％，采食量高6.89％。

母猪的健康状况直接影响所产仔猪的健康状况，仔猪断奶前的免疫保护主要从母乳中获得，母猪饲粮中添加中草药超微粉制剂后，对哺乳仔猪生长状况的影响如下：

实验组仔猪比对照组初生均重高1.4％，21日龄均重高6.3％，成活率高2.36％。此外，实验组仔猪比对照组黄痢低16％，白痢低7％，其他疾病低7％。

实验结果表明，本发明制得的中草药超微粉饲料添加剂能有效增强母猪的繁育性能，改善仔猪群体的生产性能和抗病能力，提高养殖效益。

Claims

1.一种植物乳杆菌，其特征在于，所述的植物乳杆菌的保藏编号为CGMCC NO.21670。

2.权利要求1所述的植物乳杆菌在发酵中药原料制备饲料添加剂中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的饲料为母猪饲料。

4.一种母猪饲料添加剂，其特征在于，所述的饲料添加剂是使用权利要求1所述的植物乳杆菌发酵中药原料制备的。

5.如权利要求4所述的母猪饲料添加剂，其特征在于，所述的中药原料包含有黄芪、白术、白芍、马齿苋和茯苓。

6.如权利要求5所述的母猪饲料添加剂，其特征在于，所述的黄芪、白术、白芍、马齿苋和茯苓的质量份数比为：黄芪20～30、白术20～30、白芍15～25、马齿苋5～15、茯苓10～20。

7.权利要求4-6任一项所述的母猪饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述的制备方法的步骤如下：

1)将黄芪、白术、白芍、马齿苋、茯苓原料分别进行拣选，去除所含的杂质；

2)将各种药材分别进行粉碎，使粉碎颗粒能过20目筛；

3)将黄芪、白术、白芍、马齿苋和茯苓混合均匀；

4)添加糖蜜、水及对数期的植物乳杆菌菌液，混合均匀，装入呼吸发酵袋中，密封发酵。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步骤4)中发酵中药的条件为30～37℃发酵3～5天。

9.权利要求4-6任一项所述母猪饲料添加剂在制备母猪基础日粮中的应用。

10.一种母猪基础日粮，其特征在于，所述的母猪基础日粮中添加有权利要求4-6任一项所述母猪饲料添加剂。