CN113264967A - 程序性死亡配体-1靶向的化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种程序性死亡配体‑1靶向的化合物。本发明还公开了这种化合物的制备方法和应用。本发明公开的化合物引入了含多羟基的FDG，其极性增加，同时水溶性也增强，还具备稳定性好、摩尔活度较高的特点。本发明公开的化合物应用于PET显像剂时可以快速到达肿瘤部位，提高了肿瘤相对摄取值，增强了显像靶本比，延长了显像时间窗，其制备流程简单，其在靶向探针开发中极具前景，可以优化图像对比度和改善体内分布，在医学研究中可以有广泛应用。

Description

程序性死亡配体-1靶向的化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于放射性药物化学技术领域，具体涉及程序性死亡配体-1靶向的化合物及其制备方法和用途。

背景技术

程序性死亡受体-1(PD-1)是免疫治疗中一个重要的免疫检查点，主要表达于T细胞表面。它的一个配体为程序性死亡配体-1(PD-L1)，其表达范围较广，在多种肿瘤细胞表面高表达。由于PD-1与PD-L1相互作用，抑制T细胞增殖，导致肿瘤不能被免疫细胞清除，发生免疫逃逸。若阻断PD-1/PD-L1通路，可激活人体免疫系统从而杀伤肿瘤细胞。目前针对靶向PD-1/PD-L1通路的一系列单克隆抗体已广泛应用于临床，并在多数患者取得较好的治疗效果，但并不是所有肿瘤患者都对该类治疗有响应。针对治疗响应率的研究发现，肿瘤微环境PD-L1的表达量与治疗效果有密切的关联，多数病例中发现PD-L1表达越高，治疗效果越显著，可见PD-L1的表达水平是抗PD-1/PD-L1治疗的重要参考标准之一。

正电子发射断层扫描技术(PET)因其高灵敏度、高分辨率、无创性等优点在核医学诊疗领域中占据重要地位。近年来针对PD-L1靶点的特异性PET探针的研发已持续被报道，探针的前体结构已从单克隆抗体、修饰蛋白深入到纳米抗体或核酸适配体。但是研究发现，全长链抗体类探针的血液循环和清除时间较长，不能在相对较短的时间内给出准确的显像评估；另外，此类型探针使用半衰期较长的放射性核素(⁶⁴Cu、⁸⁹Zr、¹³¹I、^99mTc)进行匹配标记。与此相比较，化学小分子探针凸显较多优势，如明确的化学结构，灵活的标记基团，良好的肿瘤渗透能力等。

中国专利文献CN112028916A公开了一种程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针和制备，是一种基于PD-L1小分子抑制剂设计合成的靶向PET探针[¹⁸F]LN，该小分子探针对靶标PD-L1具有中等亲和力，可以选择性在PD-L1阳性肿瘤部位摄取，能够较好区分阴阳性肿瘤，对PD-L1高表达的肿瘤部位有响应，可以用于开发PD-L1小分子PET显像剂。但是[¹⁸F]LN探针冷、热化合物无法分离，同时水溶性差，在注射探针时，需要添加有机溶剂，降低了成药性，同时在PD-L1阳性肿瘤部位的摄取能力一般。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于现有技术中探针冷、热化合物无法分离，水溶性差，成药性低，摄取能力一般的缺陷，从而提供一种程序性死亡配体-1靶向的化合物及其制备方法和用途。

为此，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种程序性死亡配体-1靶向的化合物，具有如下式I所示结构：

其中X为F或¹⁸F，Y为

本发明还提供上述的化合物的制备方法，当X为F时，式I所示结构的化合物由前体化合物与2-脱氧-2-氟-D-吡喃葡萄糖反应制得；

当X为¹⁸F时，式I所示结构的化合物由前体化合物与¹⁸F-脱氧葡萄糖于反应制得；

所述前体化合物具有如式II所示结构：

其中，Y为

进一步地，当X为F时，式I所示结构的化合物由前体化合物与对苯二胺，2-脱氧-2-氟-D-吡喃葡萄糖于70-90℃反应0.8-1.2小时制得；

当X为¹⁸F时，式I所示结构的化合物由前体化合物与对苯二胺，¹⁸F-脱氧葡萄糖于70-90℃反应10-30min制得。

上述制备方法还包括所述前体化合物的制备方法，包括如下步骤：

将式III-5所示结构的化合物和叔丁氧羰基氨氧基乙酸进行缩合反应得到式III-6所示结构的化合物；

将式III-6所示结构的化合物和三氟乙酸反应，得到式II所示结构的前体化合物；

合成路线如下：

优选地，在制备所述式III-6所示结构的化合物的步骤中，将叔丁氧羰基氨氧基乙酸与N,N'-羰基二咪唑混合后溶于二氯甲烷，室温反应0.8-1.2小时后置于冰水中冷却，然后滴入式III-5所示结构的化合物的二氯甲烷溶液中，滴加结束后室温反应过夜；

在制备所述前体化合物的步骤中，在冰浴环境中将三氟乙酸滴入式III-6所示结构的化合物的二氯甲烷溶液中，滴加结束后置于室温反应0.8-1.2小时，用无水乙醚沉淀得到所述前体化合物。

进一步地，还包括式III-5所示结构的化合物的制备方法，包括如下步骤：

将式III-3所示结构的化合物和N-boc-乙二胺进行缩合反应，得到式III-4所示结构的化合物；将式III-4所示结构的化合物进行脱保护反应，得到式III-5所示结构的化合物，式III-4和式III-5所示结构的化合物中Y为

或，将式III-3所示结构的化合物和哌嗪进行缩合反应，得到式III-5所示结构的化合物，式III-5所示结构的化合物中Y为

合成路线如下：

或，

优选地，当Y为

时，在制备式III-4所示结构的化合物的步骤中，将式III-3所示结构的化合物与N-boc-乙二胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，滴加冰醋酸催化，先反应2-5小时后再加入三乙酰氧基硼氢化钠反应过夜；

当Y为

时，在制备式III-5所示结构的化合物的步骤中，将式III-3所示结构的化合物与哌嗪溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，先反应2-5小时再加入硼氢化钠反应过夜。

进一步地，还包括式III-3所示结构的化合物的制备方法，包括如下步骤：

将苯并-1，4-二氧六环-6-硼酸和3-溴-2-甲基苯甲醇进行Suziki偶联反应，得到式III-1所示结构的化合物；

将式III-1所示结构的化合物和5-氯-2,4-二羟基苯甲醛进行缩合反应，得到式III-2所示结构的化合物；

将式III-2所示结构的化合物和3-溴甲基苯甲腈进行缩合反应，得到式III-3所示结构的化合物；

合成路线如下：

本发明还提供上述化合物作为程序性死亡配体-1靶向的分子探针的用途。

本发明还提供化合物中当所述X为¹⁸F时，在制备程序性死亡配体-1靶向的PET显像剂中的应用。

本发明技术方案，具有如下优点：

(1)本发明得到的化合物引入了含多羟基的FDG，因此使得化合物极性增加，同时水溶性也增强；利用FDG水溶液中存在开链式醛基的特点，在对苯二胺的催化作用下，醛基与前体结构中的羟胺能够快速形成稳定的肟基，从而得到稳定性好、摩尔活度较高的程序性死亡配体-1靶向的化合物。

(2)本发明得到的化合物作为分子探针使用时，经过细胞流式结果表明，能够与A375-hPD-L1细胞膜表面高表达的PD-L1结合；而细胞摄取实验表明，PD-L1高表达的肿瘤细胞对该探针特异性摄取。

(3)本发明得到的经过¹⁸F标记的化合物应用于PET显像剂时，Micro PET结果显示，该显像剂能够对PD-L1高表达的肿瘤部位进行示踪成像，可明显区分不同PD-L1表达水平的肿瘤，同时离体生物分布和放射性自显影分析也表明，在PD-L1高表达的荷瘤鼠体内具有较好的靶向性。

(4)本发明得到的化合物和[¹⁸F]LN相比，解决了其探针冷、热化合物无法分离的缺点，探针极性及水溶性明显增加，Log Do/w脂水分布系数比[¹⁸F]LN降低了4倍，注射探针时，不需要添加有机溶剂，直接溶解在生理盐水中，成药性更好；显著改善了[¹⁸F]LN在体内显像的缺点，可以快速到达肿瘤部位，提高了肿瘤相对摄取值，增强了显像靶本比，延长了显像时间窗。

(5)本发明化合物制备流程简单，其在靶向探针开发中极具前景，可以优化图像对比度和改善体内分布，在医学研究中可以有广泛应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请实施例1中得到的化合物[¹⁸F]LG-1的结构式；

图2是本申请实施例1中得到的化合物LG-1的结构式；

图3是本申请实施例2中得到的化合物[¹⁸F]LG-2的结构式；

图4是本申请实施例2中得到的化合物LG-2的结构式；

图5是本申请实施例1中的中间产物化合物L6的电雾质谱图；

图6是本申请实施例1中的前体化合物L7的电雾质谱图；

图7是本申请实施例1中的得到的化合物LG-1的电雾质谱图；

图8是本申请实施例1中的中间产物化合物L6的核磁共振氢谱；

图9是本申请实施例1中的得到的化合物LG-1的核磁共振氢谱；

图10是本申请实施例2中的中间产物化合物L8的电雾质谱图；

图11是本申请实施例2中的中间产物化合物L9的电雾质谱图；

图12是本申请实施例2中的前体化合物L10的电雾质谱图；

图13是本申请实施例2中得到的化合物[¹⁸F]LG-2的HPLC分析图；

图14是本申请实施例1中得到的化合物[¹⁸F]LG-1的体外热稳定性HPLC分析图(a)和体内稳定性HPLC分析图(b)；

图15是本申请实施例1中得到的化合物LG-1的紫外吸收校正曲线；

图16是本申请实施例1中的前体化合物L7(a)与化合物LG-1(b)分别与A375、A375-hPD-L1细胞孵育24小时的细胞活力分析图；

图17是本申请实施例1中得到的化合物[¹⁸F]LG-1(a)和[¹⁸F]FDG(b)在A375-hPD-L1、A375细胞的摄取情况分析图；

图18是本申请实施例1中得到的化合物LG-1与PD-L1的结合作用图，其中(a)A375-hPD-L1细胞经化合物LG-1孵育后PD-L1在细胞中表达变化的流式分析图，(b)A375-hPD-L1细胞与化合物LG-1孵育后PD-L1表达的半定量分析图；

图19是本申请实施例1中得到的化合物[¹⁸F]LG-1与A375-hPD-L1细胞表达的PD-L1特异性结合曲线；

图20是本申请实施例1中得到的化合物[¹⁸F]LG-1在A375/A375-hPD-L1荷瘤小鼠体内靶向成像动态分析图，其中(a)荷瘤小鼠A375-hPD-L1注射[¹⁸F]LG-1、经LG-1阻断以及注射[¹⁸F]FDG的1小时内动态成像的代表性横断和冠状PET图像，(b)肿瘤摄取图，(c)肿瘤肌肉比值图；

图21为本申请实施例1中得到的化合物[¹⁸F]LG-1在A375/A375-hPD-L1荷瘤小鼠体内靶向成像图；

图22为本申请实施例1中得到的化合物[¹⁸F]LG-1在高血糖A375/A375-hPD-L1双侧荷瘤小鼠体内靶向成像动态分析图，其中(a)荷瘤小鼠注射[¹⁸F]LG-1的1小时内动态成像的代表性横断和冠状PET图像，(b)组织摄取图，(c)肿瘤肌肉比值图；

图23为雌性BALB/c小鼠经尾静脉注射本申请实施例1中得到的化合物[¹⁸F]LG-1后2小时内的药代动力学结果图；

图24为A375/A375-hPD-L1双侧荷瘤鼠注射本申请实施例1中得到的化合物[¹⁸F]LG-1后1小时肿瘤、肌肉组织自显影分析(a)和肿瘤组织的裂解液HPLC分析(b)图；

图25为本申请实施例2中得到的化合物[¹⁸F]LG-2在A375/A375-hPD-L1荷瘤小鼠体内靶向成像动态分析图，其中(a)荷瘤小鼠A375-hPD-L1注射[¹⁸F]LG-2的2小时内动态成像的代表性横断和冠状PET图像，(b)组织摄取图，(c)肿瘤肌肉比值图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。

下述实施例中涉及的室温温度范围为20-30℃。

下述实施例中涉及的溶剂均为分析纯。

下述试验例中涉及的细胞系和细胞培养：将人黑色素瘤A375细胞以及转染人PD-L1高表达的A375-hPD-L1细胞平铺于10cm孔径的培养皿中，在含1％(v/v)青霉素-链霉素双抗、10％(v/v)胎牛血清(FBS)的高葡萄糖Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)培养基中贴壁生长，置于37℃含5％CO₂的培养箱中孵育，及时更换新鲜培养基，使用含0.25％胰酶的细胞消化液进行传代，待细胞处于对数增长期，细胞状态良好时用于体外细胞实验。

下述试验例中涉及的动物模型：实验动物品系源于BALB/c白鼠和BALB/c裸鼠，性别雌，周龄4～5周，体重约17克，购自常州卡文斯实验动物有限公司。异种移植双侧A375/A375-hPD-L1荷瘤鼠的构建，将A375-hPD-L1细胞接种于裸鼠右上肢腋窝，另将A375细胞接种于同一只裸鼠左上肢腋窝，每只约注射1×10⁶个细胞数。首先将人黑色素瘤A375细胞以及高表达PD-L1的黑色素瘤A375-hPD-L1细胞在恒温培养箱中培养，经对数生长期后，收集细胞并重悬于PBS缓冲液中，然后将两种细胞系悬液用胰岛素针经皮下注射于裸鼠腋窝下，每只约注射1×10⁶个细胞数。SPF级动物实验室内正常饲养荷瘤鼠，使用游标卡尺监测肿瘤体积(V＝1/2长径×短径²)，待体积约100～120mm³时用于体内实验。所有程序和动物方案均经江苏省原子医学研究所实验动物福利伦理委员会批准。

以下具体实施例是对本发明的进一步说明，所举案例并不能列举出本发明的全部实施方式，仅以其中部分实施方式为例进行说明，具体实施例如下：

实施例1

本实施例提供程序性死亡配体-1靶向的化合物，分别为图1所示结构的化合物[¹⁸F]LG-1和图2所示结构的化合物LG-1，其具体制备方法如下：

一、首先制备化合物L5，其制备方法和CN112028916A相同，具体其合成路线如下所示：

(1)化合物L1的合成：

先将溶剂(1,4-二氧六环：纯水＝4：1，v/v)共200mL，通氮气排去混合溶剂中氧。取苯并-1,4-二氧六环-6-硼酸(1.8g，0.01mol)，3-溴-2-甲基苯甲醇(2.0g，0.01mol)，无水碳酸钾(13.0g，0.09mol)放入反应瓶中，放入磁力搅拌子，再加入四(三苯基膦)钯(1.0g，0.80mmol)。反应瓶口插上干燥冷凝管，注入溶剂，氮气保护下100℃加热，冷凝水回流，反应24小时。反应结束后冷却反应液，使用旋转蒸发仪去除溶剂1,4-二氧六环。在反应瓶中加入适量水，溶解碳酸钾。再加二氯甲烷萃取5次，每次加入体积约50mL。无水硫酸钠干燥后旋干，柱层析法分离纯化(正己烷：乙酸乙酯＝1：3，v/v)，真空干燥，得黄色油状物，即化合物L1；

(2)化合物5-氯-2,4-二羟基苯甲醛的合成：

称取N-氯代琥珀酰亚胺(5.1g，0.04mol)加入无水乙醚(50mL)中，注入哌啶(3.6mL，0.04mol)，在氮气保护下室温搅拌反应4小时。处理反应液时，加适量水洗不溶于乙醚的物质，水洗5次，收集乙醚相并旋干，产物为无色油状物，称重得3.6g(0.03mol)。配置混合溶剂(浓硫酸/水＝1/1，v/v)共200毫升，在冰上取浓硫酸慢滴入水中，再将混合溶剂冷却至室温。将上述所得产物(3.6g，0.03mol)注入含2,4-二羟基苯甲醇(4.17g，0.03mol)的浓硫酸水溶液中，在氮气保护下，室温搅拌反应24小时。反应结束处理反应液时，反复用纯水洗涤抽滤，直至pH近中性，最后烘干产物，得粉色固体产物，即得化合物5-氯-2,4-二羟基苯甲醛；

(3)化合物L2的合成化合物L1称取1.28g(5.0mmol)，化合物5-氯-2,4-二羟基苯甲醛称取0.86g(5.0mmol)，三苯基膦称取1.5g(5.7mmol)，将这三者加入反应瓶中，放入磁力搅拌子，加入四氢呋喃(20mL)溶解。通风橱内将反应瓶置于冰上，慢慢滴加偶氮二甲酸二异丙酯(1mL，5.0mmol)，滴加完后取出反应瓶，恢复到室温，在氮气保护下，搅拌反应过夜。反应结束时有不溶物，反应液呈棕黄色。用旋转蒸发仪去除四氢呋喃，用乙酸乙酯多次洗涤，收集乙酸乙酯相并旋干。柱层析法分离纯化(正己烷：乙酸乙酯＝1：3，v/v)。将产物真空干燥，得淡黄色固体，即得化合物L2；

(4)化合物L3的合成：

化合物L2称取2.60g(6.3mmol)，3-溴甲基苯甲腈称取4.95g(12.1mmol)，碳酸铯称取8.24g(25.4mmol)，三者溶于N,N-二甲基甲酰胺(17mL)，室温搅拌过夜。反应结束后加水溶解碳酸铯，用乙酸乙酯萃取，加入无水硫酸钠，旋干乙酸乙酯相。经过柱层析法分离纯化(正己烷：乙酸乙酯＝1：1，v/v)得黄色固体，即得化合物L3；

(5)化合物L5的合成：

将化合物L3(500mg，0.95mmol)与N-boc-乙二胺(160μL,1mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(15mL)，滴加冰醋酸使反应液偏酸性。先反应5小时后再加入三乙酰氧基硼氢化钠(807mg，3.8mmol)反应过夜。反应原液通过乙酸乙酯萃取后旋干，柱层析法分离纯化(乙酸乙酯/甲醇＝10/1，v/v)得产物L4。将所得的化合物L4(1.5g)溶于二氯甲烷中，滴加三氟乙酸1.5ml，室温反应2小时，将反应液多次加入二氯甲烷旋干，得到化合物L5。

二、制备中间产物L7，具体其合成路线如下所示：

(1)化合物L6的合成：

将叔丁氧羰基氨氧基乙酸(108mg，0.56mmol)与N,N'-羰基二咪唑(99mg，0.61mmol)溶于超干二氯甲烷(2mL)，室温(27℃)搅拌反应约1小时，放置冰水中冷却。其次，将化合物L5(200mg，0.35mmol)溶于二氯甲烷(4mL)。将叔丁氧羰基氨氧基乙酸与N,N'-羰基二咪唑反应的混合溶液用恒压滴液漏斗滴入化合物L5溶液中，滴加时不加热，滴加结束后室温反应过夜。反应结束，将二氯甲烷稍旋干，使用柱层析法分离纯化(乙酸乙酯：甲醇＝50：1)得产物L6共180mg(白色固体，产率：69.3％，纯度>90％)，化合物L6的电雾质谱图如图5所示，¹H NMR图谱如图8所示，以d₆-DMSO为氘代试剂，通过核磁共振氢谱对L6进行表征，结构验证。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,δ:ppm)δ8.70(s,2H),8.23(s,1H),8.02(s,1H),7.86(d,J＝18.4Hz,2H),7.64(t,J＝7.8Hz,1H),7.57(s,1H),7.43(d,J＝7.3Hz,1H),7.31–7.09(m,3H),6.93(d,J＝8.2Hz,1H),6.84–6.71(m,2H),5.36(s,2H),5.29(s,2H),4.29(s,4H),4.17(d,J＝8.8Hz,4H),3.44(d,J＝6.1Hz,2H),3.02(s,2H),2.24(s,3H),1.37(s,9H)；

(2)前体化合物L7的合成

取化合物L6(180mg,0.24mmol)溶于二氯甲烷(2mL)，置于冰浴中，将三氟乙酸(0.5mL)滴加至化合物L6的溶液中，滴加结束后置于27℃反应1小时。反应结束后，旋干二氯甲烷溶液，用无水乙醚沉淀产物L7。然后使用柱层析法分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20：1)得产物L7共150mg。直接用于标记的前体需要半制备HPLC分离。取部分产物L7经半制备HPLC分离后，冻干得产物L7(白色固体，产率：90.0％，纯度>95％)，化合物L7的电雾质谱图如图6所示。

三、化合物LG-1的合成

取化合物L7(65mg，0.10mmol)，2-脱氧-2-氟-D-吡喃葡萄糖(10mg，0.05mmol)，对苯二胺(17mg,0.15mmol)溶于DMSO中再添加超纯水200μL。将反应置于80℃加热1小时，溶液渐变棕黑色，反应1小时结束然后冷却取出。化合物LG-1经半制备HPLC分离(棕色固体，产率：26.3％，纯度>95％)，化合物LG-1的电雾质谱图如图7所示，¹H NMR图谱如图9所示，以d6-DMSO为氘代试剂，通过核磁共振氢谱对LG-1进行表征，结构验证。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,)δ8.78–8.58(m,2H),8.02(s,2H),7.95–7.79(m,2H),7.68(dt,J＝30.3,7.4Hz,1H),7.57(d,J＝2.8Hz,1H),7.42(dd,J＝7.6,1.7Hz,1H),7.35–7.11(m,3H),6.94(d,J＝8.2Hz,1H),6.79–6.69(m,2H),5.35(s,2H),5.28(s,2H),5.10–5.01(m,1H),4.93(t,J＝7.0Hz,1H),4.50(d,J＝16.5Hz,2H),4.29(s,4H),4.16(s,2H),4.07–3.92(m,1H),3.67–3.35(m,4H),3.33(d,J＝8.6Hz,5H),3.02(d,J＝6.7Hz,2H),2.24(s,3H)。

四、化合物[¹⁸F]LG-1的合成

首先合成[¹⁸F]FDG的：使用加速器通过¹⁸O(p，n)¹⁸F反应生产¹⁸F-F^-，经阴离子交换柱(QMA)固定吸附；在氟多功能模块中(北京派特科技有限公司)，打开V9，六通阀，V1，将K2.2.2/K₂CO₃溶液将¹⁸F^-从QMA柱洗脱至反应管中；然后，打开V8通N₂蒸干温度，至反应干燥完后冷却；再打开V2，加入无水乙腈，打开V8通N₂蒸干除水，至反应干燥完后冷却；打开V3，加入前体，反应条件，反应完成蒸干除乙腈；打开V4，加入NaOH溶液水解；将反应液经放射性TLC检测转化率，打开V5，加入DMSO清洗反应管，将清洗液通过复合柱进入产物瓶，得[¹⁸F]FDG；

将前体化合物L7溶液(0.1M，30μL)和对苯二胺溶液(3M，10μL)加入装有[¹⁸F]FDG的反应瓶中，于油浴80℃加热反应20分钟。反应结束后使用半制备HPLC进行产物分离，将收集的产物使用C18柱富集后洗脱，得到化合物[¹⁸F]LG-1。将收集后的产物使用氮吹仪在80℃加热吹干后调节pH，待使用。

实施例2

本实施例提供程序性死亡配体-1靶向的化合物，分别为图3所示结构的化合物[¹⁸F]LG-2和图4所示结构的化合物LG-2，其具体制备方法如下：

一、化合物LG-2的合成

本实施例中，化合物L3的制备方法和实施例1相同，从L3开始制备得到化合物LG-2的合成路线如下：

(1)化合物L8的合成：将化合物L3(200mg，0.40mmol)与哌嗪(70mg,0.80mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)，45℃加热反应4小时后，加入硼氢化钠(5mg)反应过夜。反应原液通过二氯甲烷萃取后旋干，柱层析法分离纯化(乙酸乙酯/正己烷＝3/2，v/v)得产物L8(淡黄色固体，94mg，产率：41.7％)，化合物L8的电雾质谱图如图10所示。

(2)前体化合物L10的合成：将叔丁氧羰基氨氧基乙酸(38mg，0.20mmol)与N,N'-羰基二咪唑(32mg，0.20mmol)溶于超干二氯甲烷(2mL)，室温搅拌反应约1小时，放置冰水中冷却；将化合物L8(34mg，0.06mmol)溶于二氯甲烷(4mL)。将叔丁氧羰基氨氧基乙酸与N,N'-羰基二咪唑反应的混合溶液用恒压滴液漏斗滴入化合物L8溶液中，滴加时不加热，滴加结束后室温反应过夜。反应结束，将二氯甲烷稍旋干，使用柱层析法分离纯化(乙酸乙酯：正己烷＝1：1)得产物L9共16mg(淡黄色固体，产率：34.7％)，将所得的化合物L9溶于二氯甲烷(4mL)中，滴加三氟乙酸1ml，室温反应1小时，将反应液多次加入二氯甲烷旋干，用无水乙醚沉淀得到化合物L10，化合物L9、L10的电雾质谱图如图11、图12所示。

(3)化合物LG-2的合成

取化合物L10(0.10mmol)，2-脱氧-2-氟-D-吡喃葡萄糖(10mg，0.05mmol)，对苯二胺(17mg,0.15mmol)溶于DMSO中再添加超纯水200μL。将反应置于80℃加热1小时，溶液渐变棕黑色，反应1小时结束然后冷却取出，然后经半制备HPLC分离，得到化合物LG-2。

二、化合物[¹⁸F]LG-2的合成

其中合成[¹⁸F]FDG的方法同实施例1。

将前体化合物L10溶液(0.05M，30μL)和对苯二胺溶液(3M，10μL)加入装有[¹⁸F]FDG的反应瓶中，于油浴80℃加热反应20分钟。反应结束后使用半制备HPLC进行产物分离，将收集的产物使用C18柱富集后洗脱，得到化合物[¹⁸F]LG-2。将收集后的产物使用氮吹仪在80℃加热吹干后调节pH，待使用。化合物[¹⁸F]LG-2的HPLC分析图如图13所示。

对比例1

本对比例1为采用中国专利文献CN112028916A中的方法制得的靶向PET探针[¹⁸F]LN。

试验例1

本试验例为对实施例1得到的化合物进行体外稳定性实验。

(1)取实施例1制得的化合物[¹⁸F]LG-1(37MBq，50μL)加入450μL PBS或血清，置于37℃下分别孵育1h、2h以及4h，在相应的时间点取样进行HPLC分析。对于血清样品使用等体积乙腈沉淀蛋白，经8000r/min离心5min后取上清分析。

(2)雌性BALB/c正常小鼠(n＝2)通过尾静脉注射[¹⁸F]LG-1(～3.7MBq)，在注射探针10分钟，30分钟和60分钟后，从小鼠的尾巴末端提取血浆分析样品，然后用等体积的乙腈沉淀，样品经高速离心(10000r/min,5min)使用放射性HPLC分析上清液。

为探究[¹⁸F]LG-1体内外的稳定性，首先在37℃与PBS(pH＝7.0)孵育一小时，经放射性HPLC图谱分析，如图14(a)所示，在一小时内时间点显示单峰(>95％)。同时将探针[¹⁸F]LG-1溶于PBS在80℃以及90℃加热，发现该探针仍可以获得良好的稳定性。其次，将探针[¹⁸F]LG-1经尾静脉注入小鼠体内，取血分析，如图14(b)所示，可见该探针在体内1小时保持良好的稳定性，这表明[¹⁸F]LG-1可在体内和体外进行进一步的生物学评价。

试验例2

本试验例为对实施例1得到的化合物进行摩尔活度、脂水分布系数测定。

(1)摩尔活度：化合物[¹⁸F]LG-1单位摩尔物质的放射性活度，物质的量以化合物LG-1作为对照，设置不同的梯度浓度，在相同仪器、相同色谱条件下，用等体积进样法测定不同浓度的峰面积，根据峰面积和进样浓度绘制校正曲线，经线性回归得到校正公式。根据公式，用纯化后标记化合物[¹⁸F]LG-1峰面积计算浓度，最后根据注入放射性活度计算摩尔活度。经衰减校正[¹⁸F]LG-1的最终放射化学产率(RCY)为18.6％。以化合物LG-1的紫外吸收做校正曲线，见图15，线性方程为y＝2940660.84x-566465.91，其中R²＝0.9981，经计算摩尔活度为37.186±2.868GBq/μmol。

(2)脂水分布系数：室温条件下将正辛醇和去离子水混合并超声震荡使两相饱和，分别收集两相以备用。将[¹⁸F]LG-1(18.5MBq)放入等体积的正辛醇和去离子水中，震荡将其分散到两相中，取等体积的正辛醇和水，用伽马计数器测定。Co表示有机相的浓度，Cw表示水相的浓度，通过下列公式判断探针的LogP。

LogP＝Log(Co/Cw)

化合物[¹⁸F]LG-1在正辛醇相和水相中分布情况如下表1所示，测得其脂水分布系数(Log Do/w)为0.198±0.062，初步显示引入[¹⁸F]FDG标记基团可显著性改善其亲水性。

表1标记探针[¹⁸F]LG-1在正辛醇相和水相分布情况

同时，对对比例1得到的探针[¹⁸F]LN做同样的实验，可以得到其脂水分布系数0.93±0.01，说明其极性过高，水溶性太低。

试验例3

本试验例为对实施例1得到的化合物进行细胞生物相容性分析。

通过MTT法评价化合物的生物相容性，使用化合物LG-1进行细胞活力分析。在96孔板中每孔以1×10⁴个黑色素瘤A375和A375-hPD-L1细胞铺板，将化合物LG-1(DMSO溶液)设置梯度浓度(0～100μM)于每孔加入200μL，分别孵育24h。检测用MTT(5mg/mL，20μL/孔)预处理细胞4h，每孔加入DMSO(150μL)振荡10min，使紫色甲臜结晶溶解，通过酶联免疫检测仪在490nm波长下检测每孔的吸光度(OD)，并计算样品孔与参比孔的细胞存活率百分比。如图16(b)所示，可以看出化合物LG-1对A375-hPD-L1和A375细胞的毒性较低，在50μM中孵育24小时，细胞活性均大于70％，高浓度LG-1(100μM)处理后，细胞存活率仍大于65％。而对前体化合物L7进行同样的实验，如图16(a)所示，可以看出在高浓度下，显示较大的细胞毒性。结果表明，经FDG修饰后的LG-1具有较低的细胞毒性和良好的生物相容性。

试验例4

本试验例为对实施例1得到的化合物进行细胞摄取实验。

将A375细胞和A375-hPD-L1细胞以每管1×10⁶个细胞数收集于放免管中，实验组分为A375([¹⁸F]LG-1和[¹⁸F]FDG)、A375-hPD-L1([¹⁸F]LG-1和[¹⁸F]FDG)以及A375-hPD-L1(LG-1阻断和FDG阻断)，共六个组别，并设置三个平行对照组。其中，阻断组分别使用化合物LG-1以及FDG(50μM,100μL)提前孵育30分钟，然后分别在每孔中加入[¹⁸F]LG-1(3.7×10^{- 2}MBq)在37℃下孵育0.25h、0.5h、1h、2h和4h。使用冷PBS阻断摄取，再用PBS洗两次后离心弃去上清，由伽马计数器测得样品的每分钟计数(CPM)值，细胞摄取值(％AD)由样本计数与标记化合物的空白参比计数的比值计算得。

通过探究[¹⁸F]LG-1的细胞摄取来反映其靶向能力，并用放射示踪剂总吸收率(％AD)表示，以[¹⁸F]FDG为对照化合物。[¹⁸F]LG-1和[¹⁸F]FDG实验组均在PBS中孵育。从图17(a)可以看出，在A375-hPD-L1细胞中，[¹⁸F]LG-1具有较高的摄取，30分钟时最大摄取值为14.01±0.45％AD，尽管随后略有降低，4小时后，其摄取值仍为9.63±0.14％AD。但在A375细胞中，[¹⁸F]LG-1的摄取明显偏低，其最大摄取值为9.06±0.83％AD，约为A375-hPD-L1细胞中的0.6倍。

经化合物LG-1处理的阻断组，在15分钟时细胞摄取值为阳性组的1/2，具有显著性差异。由于LG-1与PD-L1的结合，与[¹⁸F]LG-1相竞争，降低了A375-hPD-L1细胞对其摄取，间接说明该化合物与细胞表达的PD-L1有结合作用。同时在图17(a)可以看出FDG对该探针细胞摄取的影响，FDG阻断组的摄取趋势与阳性组相同，在四小时内摄取值略有下降，30分钟最大摄取值为12.87±0.25％AD，但与阳性组无明显统计学差异。

如图17(b)所示，以探针[¹⁸F]FDG的阴阳性细胞摄取为对比，发现[¹⁸F]FDG在A375和A375-hPD-L1细胞摄取值相近，且在同一时间点的两细胞摄取值无统计学差异，进一步凸显了[¹⁸F]LG-1在细胞摄取中的靶向性作用。

同时，对对比例1得到的探针[¹⁸F]LN做同样的实验，最大摄取值为4.02±0.15％AD，说明对比例1的靶向性远低于本申请实施例1得到的[¹⁸F]LG-1。

试验例5

本试验例为对实施例1得到的化合物进行流式细胞测竞争结合分析。

将A375-hPD-L1细胞分别按每孔3×10⁵个细胞数铺在6孔板中，使其贴壁生长。设置不同药物浓度孵育的实验组，每孔按照梯度加入化合物LG-1(10～100μM)孵育4h，使用不含EDTA的胰酶消化液收集细胞于离心管中。每管细胞加入无血清DMEM(1mL)重悬细胞，另加入荧光流式抗体PE小鼠抗人CD274(20μL)，在4℃冰箱中避光孵育30分钟后使用流式细胞仪检测，每管一次检测2×10⁴个细胞，用荧光素PE的平均荧光强度(MFI)反映细胞膜表面PD-L1的表达。

应用流式细胞术分析化合物LG-1与PD-L1的竞争结合，其定量描述为平均荧光强度，如图18所示，当A375-hPD-L1细胞与化合物LG-1孵育后，LG-1阻断anti-CD274-PE与细胞表达PD-L1的结合，表现为MFI的减小；当药物浓度为5μM时，MFI值降低至空白对照组的50％；随着LG-1的浓度加大，MFI值逐渐下降，LG-1为50μM时，MFI值降低至空白对照组的15％。当细胞与50～100μM的LG-1孵育后，此范围内MFI没有明显变化，可见anti-CD274-PE与LG-1对于PD-L1的竞争结合趋于饱和。结果表明，本申请实施例1得到的化合物LG-1与A375-hPD-L1细胞上的PD-L1具有较强的相互结合作用。

试验例6

本试验例为对实施例1得到的化合物进行亲和力测定。

解离常数Kd表示待测化合物与A375-hPD-L1细胞表达的PD-L1结合倾向，反映平衡状态里的亲和力。将A375-hPD-L1细胞以每孔2×10⁵个细胞数铺于6孔板中，每孔加入化合物[¹⁸F]LG-1(0，0.5，1，2，4，8，16，32，64，128nM)，分为总结合组和非特异性结合组，其中非特异性结合组使用超过100倍的LG-1(25μM，1mL)共孵育，两组均在4℃孵育2小时后，用冷PBS洗一次，用胰酶消化收集细胞，使用伽马计数器测CPM值，特异性结合由总结合减去非特异性结合计算的，由软件GraphPad Prism 5拟合特异性结合曲线，由Scatchard图分析亲和力解离常数Kd值。

如图19所示，通过特异性结合实验评估[¹⁸F]LG-1对A375-hPD-L1细胞表达的PD-L1的解离常数＝，经计算得出[¹⁸F]LG-1与PD-L1结合的Kd值为63.13±3.24nM。

对对比例1的[¹⁸F]LN使用同样的方法进行检测，其Kd值为，说明的[¹⁸F]LG-1和[¹⁸F]LN结合能力相近，说明不同标记方法的引入未改变母体结构对PD-L1的结合能力，仍可保持较好的靶向能力。

试验例7

本试验例为对实施例1得到的化合物进行A375/A375-hPD-L1双侧荷瘤鼠PET显像。

将双侧A375/A375-hPD-L1荷瘤鼠随机分为[¹⁸F]LG-1注射实验组以及阻断组，其中阻断组的荷瘤鼠将预先30分钟尾静脉注射化合物LG-1(5mg/kg)。在动态PET扫描过程中，用含2％异氟烷的混合氧气以1.5L/min的流量麻醉小鼠。使用Micro-PET动物扫描仪成对扫描，在扫描仪开始时，荷瘤鼠经尾静脉注射化合物[¹⁸F]LG-1(～5.0MBq，150μL生理盐水稀释)。扫描结束后采用OSEM3D/MAP对1小时的动态图像进行重构并分割成12帧，采用ASIPro图像处理软件对实时动态图像进行半定量分析，采用衰减校正系数计算肿瘤部位或其他器官感兴趣区(ROI)半定量吸收值(％ID/mL)。

A375/A375-hPD-L1双侧荷瘤小鼠随机分为三个PET显像实验组，分别为[¹⁸F]LG-1组、LG-1阻断组和[¹⁸F]FDG组，如图20所示。PET动态扫描显示，探针注射十分钟后[¹⁸F]LG-1快速进入A375-hPD-L1肿瘤，并达到最大摄取值4.80±0.46％ID/mL，随后1小时内，摄取值保持相对稳定。然而探针在A375阴性肿瘤中摄取较低，小于1.14±0.11％ID/mL，说明该探针能够明显区分PD-L1阳性肿瘤部位与阴性肿瘤部位。从图20(c)可以看出，A375-hPD-L1的肿瘤与肌肉的比值(T/M)始终在3.0以上。从图21可以看出，随后在静态扫描中，该探针在体内保持较高的肿瘤摄取，充分体现了该探针在两小时内有良好的显像时间窗。双侧荷瘤小鼠经化合物LG-1进行预处理后，右侧A375-hPD-L1肿瘤摄取显著降低，小于1.81±0.32％ID/mL，比[¹⁸F]LG-1组摄取降低2.5倍，同时1小时内阻断组T/M始终比[¹⁸F]LG-1低2.2倍。与[¹⁸F]LG-1不同，[¹⁸F]FDG在A375-hPD-L1肿瘤中的摄取为4.99±0.79％ID/mL，在A375肿瘤中的摄取为5.16±0.54％ID/mL，无明显差异。结果表明在A375-hPD-L1肿瘤内，探针[¹⁸F]LG-1与高表达的PD-L1能够特异性结合，从而呈现良好的靶本比。

同时，对比例1得到的探针[¹⁸F]LN做同样的实验，可以得到其最大肿瘤摄取1.96±0.27％ID/g，明显低于[¹⁸F]LG-1的4.80±0.46％ID/mL。

试验例8

本试验例为对实施例1得到的化合物进行高血糖A375/A375-hPD-L1双侧荷瘤鼠的PET显像。

随机取出双侧A375/A375-hPD-L1荷瘤鼠(n＝3)设为高糖组，在显像前一天予以禁食并喂以50％(v/v)葡萄糖水，以诱导体内血糖升高。PET扫描前，使用血糖仪将荷瘤鼠减尾测血糖水平，筛选出血糖高于正常值(～7mmol/L)的小鼠以注射化合物[¹⁸F]LG-1(～5.0MBq)进行PET成像，后续操作同试验例7。研究发现高血糖对[¹⁸F]FDG的生物分布以及诊断效率有较大影响，于是进一步探索[¹⁸F]LG-1在这种高血糖生理状况下是否会影响PD-L1的检测能力。因此构建高血糖双侧荷瘤小鼠模型，在化合物[¹⁸F]LG-1注射前测定血糖为10.6mmol/L。如图22所示，A375-hPD-L1的最大值为3.95±0.35％ID/mL，明显高于A375(1.89±0.29％ID/mL)，并且1小时内的靶本比均高于3.0，充分说明[¹⁸F]LG-1对PD-L1的靶向性良好，该探针不会受到高血糖的影响，不会降低检测PD-L1效率。

试验例9

本试验例为对实施例1得到的化合物进行体内生物分布与药代动力学分析。

(1)生物分布

将A375-hPD-L1荷瘤小鼠经尾静脉注射化合物[¹⁸F]LG-1(2.5MBq，100μL)活动1小时和2小时后(n＝4)进行解剖，观察主要组织器官的生物分布。在注射探针1、2小时的时间点，小鼠被异氟烷麻醉后安乐死，解剖取主要组织和器官(脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、骨、肿瘤等)，使用分析天平称取质量(g)，置于放免管中，同时以100μL的[¹⁸F]LG-1作为标准品测定放射性计数，用γ计数器检测样品的放射性计数，计算主要组织器官的生物分布情况(％ID/g)。

注射后60分钟或120分钟，[¹⁸F]LG-1在A375/A375-hPD-L1双侧荷瘤小鼠中进行生物分布研究，结果见下表2，可以观察到主要器官和组织的放射性摄取随时间的延长而衰减。

表2[¹⁸F]LG-1在A375/A375-hPD-L1双侧荷瘤鼠体内60、120分钟的生物分布

化合物在肾脏中有较高的摄取，注射后1小时，其摄取值为59.13±2.53％ID/g，因此化合物可能主要通过肾脏代谢，除此之外，在60分钟时探针在心脏和肝脏中摄取也较高，但120分钟时急剧下降。注射1小时后，A375-hPD-L1肿瘤中的摄取值为4.77±1.10％ID/g，2小时后为3.98±0.21％ID/g，而在A375肿瘤中，摄取明显偏少，注射后1小时和2小时的摄取值分别为2.25±0.86、1.38±0.34％ID/g。化合物在肌肉与血液中摄取较低，因此[¹⁸F]LG-1拥有较高的肿瘤/肌肉比及肿瘤/血液比，在120分钟其分别为4.25、7.11，这一结果与PET显像结果相一致。

(2)药代动力学

在每只雌性BALB/c正常小鼠(n＝4)体内注射化合物[¹⁸F]LG-1，剪尾取血。在不同时间点用棉球采集小鼠静脉尾端血液，即时称取每个时间点每只小鼠所收集的血液质量(湿重)，使用γ计数器检测样品的放射性计数，并以等体积的[¹⁸F]LG-1为参考，计算纵坐标血液浓度，同时以横坐标时间(min)绘制药代动力学曲线。

临床诊断用探针应具有良好的药代动力学和良好的代谢稳定性，是剂量学的必备指标。通过小鼠体内血药浓度测定[¹⁸F]LG-1的药代动力学参数，如图23所示，血药浓度迅速达到最大值(17.24±0.65％ID/g)。[¹⁸F]LG-1分布半衰期(t_1/2α)平均为12.41分钟，因此[¹⁸F]LG-1可以随血液循环快速靶向转运至肿瘤部位。此外，清除半衰期平均为23.54分钟，比已报道PD-L1单克隆抗体的生物半衰期短。同时也说明了PET成像采集后容易代谢的优点，避免了长期内辐射的健康风险。

试验例10

本试验例为对实施例1得到的化合物进行放射性自显影分析。

为研究[¹⁸F]LG-1在肿瘤组织内部的分布，将PET显像后的双侧A375/A375-hPD-L1荷瘤鼠的肿瘤进行解剖，对A375和A375-hPD-L1肿瘤切片组织进行自显影分析，以肌肉组织切片为阴性对照。解剖组织用冷PBS(pH＝7.4，0.01M)洗1次，使用组织包埋剂在-25℃下冷冻。然后使用病理切片机将肿瘤、肌肉组织切片(～12μm)，载于载玻片上，待组织自然风干后，测量组织样本放射性活度(>0.02μCi),使用磷屏成像系统对其曝光2小时，图像结果使用OptiQuant软件进行分析处理。对肿瘤组织切片进行放射自显影分析，其中以肌肉为阴性对照，如图24(a)所示，A375-hPD-L1肿瘤中放射性剂量平均为1845333±115727DLU/mm²，明显高于A375肿瘤(946534±43607DLU/mm²)或肌肉(465368±78047DLU/mm²)中的剂量。

试验例11

本试验例为对实施例1得到的化合物进行肿瘤等组织探针含量分析。

将PET显像后的双侧A375/A375-hPD-L1荷瘤鼠的肿瘤进行解剖，分别在A375、A375-hPD-L1肿瘤组织中添加200μL组织裂解液进行研磨，加入等体积的乙腈进行蛋白沉淀，样品经高速离心后取上清，使用放射性HPLC分析。如图24(b)所示，在探针注射1小时后，A375-hPD-L1肿瘤中[¹⁸F]LG-1的主峰占75％以上，而在A375肿瘤中仅有少量[¹⁸F]LG-1，体现了[¹⁸F]LG-1对PD-L1的靶向能力。

试验例12

本试验例为对实施例2得到的化合物进行A375/A375-hPD-L1双侧荷瘤鼠PET显像。

将双侧A375/A375-hPD-L1荷瘤鼠随机分为[¹⁸F]LG-2注射实验组。在动态PET扫描过程中，用含2％异氟烷的混合氧气以1.5L/min的流量麻醉小鼠。使用Micro-PET动物扫描仪成对扫描，在扫描仪开始时，荷瘤鼠经尾静脉注射化合物[¹⁸F]LG-2(～5.0MBq，150μL生理盐水稀释)。扫描结束后采用OSEM3D/MAP对1小时的动态图像进行重构并分割成12帧，采用ASIPro图像处理软件对实时动态图像进行处理分析。

如图25所示，PET动态扫描显示，探针注射十分钟后[¹⁸F]LG-2快速进入A375-hPD-L1肿瘤，摄取值为4.18±0.49％ID/mL，随后1小时内，摄取值保持相对稳定，最大摄取值为4.924.18±0.53％ID/mL。探针在A375阴性肿瘤中摄取较低，小于2.51±0.35％ID/mL，说明该探针能够明显区分PD-L1阳性肿瘤部位与阴性肿瘤部位。从图25(c)可以看出，A375-hPD-L1的肿瘤与肌肉的比值(T/M)始终在2.5以上。随后90分钟以及120分钟扫描时，该探针在体内保持较高的肿瘤摄取，充分体现了该探针在两小时内有良好的显像时间窗。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种程序性死亡配体-1靶向的化合物，其特征在于，具有如下式I所示结构：

其中X为F或¹⁸F，Y为

2.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，当X为F时，式I所示结构的化合物由前体化合物与2-脱氧-2-氟-D-吡喃葡萄糖反应制得；

当X为¹⁸F时，式I所示结构的化合物由前体化合物与¹⁸F-脱氧葡萄糖于反应制得；

所述前体化合物具有如式II所示结构：

其中Y为

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，当X为F时，式I所示结构的化合物由前体化合物与对苯二胺，2-脱氧-2-氟-D-吡喃葡萄糖于70-90℃反应0.8-1.2小时制得；

当X为¹⁸F时，式I所示结构的化合物由前体化合物与对苯二胺，¹⁸F-脱氧葡萄糖于70-90℃反应10-30min制得。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，还包括所述前体化合物的制备方法，包括如下步骤：

将式III-5所示结构的化合物和叔丁氧羰基氨氧基乙酸进行缩合反应得到式III-6所示结构的化合物；

将式III-6所示结构的化合物和三氟乙酸反应，得到式II所示结构的前体化合物；

合成路线如下：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在制备所述式III-6所示结构的化合物的步骤中，将叔丁氧羰基氨氧基乙酸与N,N'-羰基二咪唑混合后溶于二氯甲烷，室温反应0.8-1.2小时后置于冰水中冷却，然后滴入式III-5所示结构的化合物的二氯甲烷溶液中，滴加结束后室温反应过夜；

在制备所述前体化合物的步骤中，在冰浴环境中将三氟乙酸滴入式III-6所示结构的化合物的二氯甲烷溶液中，滴加结束后置于室温反应0.8-1.2小时，用无水乙醚沉淀得到所述前体化合物。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，还包括式III-5所示结构的化合物的制备方法，包括如下步骤：

将式III-3所示结构的化合物和N-boc-乙二胺进行缩合反应，得到式III-4所示结构的化合物；将式III-4所示结构的化合物进行脱保护反应，得到式III-5所示结构的化合物，式III-4和式III-5所示结构的化合物中Y为

或，将式III-3所示结构的化合物和哌嗪进行缩合反应，得到式III-5所示结构的化合物，式III-5所示结构的化合物中Y为

合成路线如下：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，当Y为

时，在制备式III-4所示结构的化合物的步骤中，将式III-3所示结构的化合物与N-boc-乙二胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，滴加冰醋酸催化，先反应2-5小时后再加入三乙酰氧基硼氢化钠反应过夜；

当Y为

时，在制备式III-5所示结构的化合物的步骤中，将式III-3所示结构的化合物与哌嗪溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，先反应2-5小时再加入硼氢化钠反应过夜。

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，还包括式III-3所示结构的化合物的制备方法，包括如下步骤：

将苯并-1，4-二氧六环-6-硼酸和3-溴-2-甲基苯甲醇进行Suziki偶联反应，得到式III-1所示结构的化合物；

将式III-1所示结构的化合物和5-氯-2,4-二羟基苯甲醛进行缩合反应，得到式III-2所示结构的化合物；

将式III-2所示结构的化合物和3-溴甲基苯甲腈进行缩合反应，得到式III-3所示结构的化合物；

合成路线如下：

9.权利要求1所述的化合物作为程序性死亡配体-1靶向的分子探针的用途。

10.权利要求1所述的化合物在制备程序性死亡配体-1靶向的PET显像剂中的应用，其特征在于，所述X为¹⁸F。

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