CN112999370B - 一种靶向宫颈癌的肿瘤分子探针及其应用 - Google Patents

一种靶向宫颈癌的肿瘤分子探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向宫颈癌的肿瘤分子探针及其应用。本发明提供了一种制备肿瘤分子探针的方法，包括如下步骤：将具有MAG3修饰的Pep‑1多肽进行99mTc标记，得到所述肿瘤分子探针。本发明合成制备符合临床转化标准的99mTc‑MAG3‑Pep‑1探针，经检测其具有很强的体外稳定性，另外本发明还探究了该探针对皮下荷瘤(宫颈癌)小鼠模型的显像应用价值，以更好揭示该分子探针生物学性能及其潜在应用前景。本发明从核医学、基础医学和临床转化三方面着眼，制备得到了具有高标记率、高放射性比活度、高放射化学纯度的99mTc‑MAG3‑Pep‑1分子探针，为进一步动物实验研究及临床转化打下良好的基础。

Description

一种靶向宫颈癌的肿瘤分子探针及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种靶向宫颈癌的肿瘤分子探针及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是一类受多因素影响、多基因改变与多阶段进展的疾病，严重威胁了人类的生命健康和生活质量，所以研究肿瘤微环境变化一直是肿瘤学研究的重点与热点。小分子多肽本身具有分子量小、化学结构明确、序列可控、活性高、毒性低等方面的优势，早已受到材料学、制药学的关注和青睐。近年来，在分子肿瘤与影像学研究领域，多肽因其具有良好的组装性能，已逐步被广泛应用于诊断和疾病治疗的研究策略中。同时与之相关的转化成果也发展迅猛，如靶向生长抑素受体的111In-Octreoscan(功能肽段fC1FwKTC1T)已获得药物管理批准，18F-Galacto-RGD(功能肽段c(RGDfK(SAA)))正在III期临床试验中(NCT01939574)。所以多肽可以作为诊断和治疗肿瘤的重要策略，具有广阔的临床转化前景。
2012年，Pandya等首次报道经七肽噬菌体展示文库筛选出特异性靶向白介素13受体α2(interleukin-13receptorα2,IL-13Rα2)的多肽，分别命名为Pep-1(CGEMGWVRC)、Pep-2(CLPQLWLFC)、Pep-3(CSPFLHLLC)，其中Pep-1对IL-13Rα2的特异靶向性在细胞水平和蛋白水平表现最为显著(Kd＝3.3μM)，且特异性研究显示Pep-1对IL-13Rα2的靶向性具有时间-剂量依赖性，但Pep-1与IL-13Rα2的靶向结合力不受IL-13的影响。此外，细胞内化实验研究显示，随着摄取时间延长，当细胞破膜后Pep-1能逐步弥散入细胞，但其与细胞内蛋白或细胞器结合特异性较弱。
大量临床研究报道IL-13Rα2与多种肿瘤的发生、发展密切相关，有望成为新的肿瘤标志物和药物治疗靶点。而大量基础和临床研究提示以单一靶点药物作为治疗方案可能会使肿瘤发生耐药，从而造成药物治疗失败。所以在研究IL-13Rα2靶向治疗药物的同时，需要增加其分子表达水平的监控，如分子功能显像。核医学作为分子功能显像的重要组成部分，可以直接可视化动态监测探针所示踪的IL-13Rα2蛋白的表达情况，是良好的显像策略。目前常用示踪放射性核素有锝[99mTc]、镓[68Ga]、铜[64Cu]等，其中99mTc的标记方法便捷、临床较易获得，经济成本低，在我国应用最为广泛。故肿瘤微环境IL-13Rα2蛋白水平的表达监控有望成为新的发展趋势，其相应99mTc标记的分子示踪剂(Pep-1)利于临床推广应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向宫颈癌的肿瘤分子探针及其应用。
第一方面，本发明要求保护一种制备肿瘤分子探针的方法。
本发明所要求保护的制备肿瘤分子探针的方法，可包括如下步骤：将具有MAG3修饰的Pep-1多肽进行99mTc标记，得到所述肿瘤分子探针。
进一步地，所述肿瘤分子探针可采用SnCI2还原法制备得到。
更进一步地，将所述具有MAG3修饰的Pep-1多肽进行99mTc标记的反应体系中含有所述具有MAG3修饰的Pep-1多肽、99mTcO4 -、SnCI2和酒石酸钠；其中，所述具有MAG3修饰的Pep-1多肽、99mTcO4 -、SnCI2和酒石酸钠的配比为30μg：1.5～2mCi：2.5μg：500μg；反应体系的pH值为5.5-6.5；反应温度为100℃；反应时间为30min。
在本发明的具体实施方式中，所述制备肿瘤分子探针的方法具体包括如下步骤：向反应容器(如EP管)中加入(优选依次加入)缓冲液、所述具有MAG3修饰的Pep-1多肽、SnCI2、酒石酸钠、99mTcO4 -淋洗液，于pH值5.5-6.5、100℃条件下反应30min，即得所述肿瘤分子探针。
进一步地，向所述反应容器中加入(优选依次加入)的所述缓冲液、所述具有MAG3修饰的Pep-1多肽、SnCI2、酒石酸钠、99mTcO4 -淋洗液的配比为90μL所述缓冲液：30μg所述具有MAG3修饰的Pep-1多肽(如30μL的浓度为1μg/μL的所述具有MAG3修饰的Pep-1多肽溶液)：2.5μg SnCI2(如2.5μL的浓度为1μg/μL的SnCI2溶液)：500μg酒石酸钠(如5μL的浓度为100μg/μL的酒石酸钠溶液)：1.5～2mCi99mTcO4 -淋洗液(如50μL99mTcO4 -淋洗液)。
在本发明中，所述99mTcO4 -具体为Na99mTcO4。
所述缓冲液的pH值可为10-11。在本发明的具体实施方式中，所述缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度为0.25mol/L NaHCO3、0.18mol/L氨水、0.125mol/L醋酸铵。
其中，所述具有MAG3修饰的Pep-1多肽为将MAG3修饰在所述Pep-1多肽的C末端最后一个氨基酸残基上。
第二方面，本发明要求保护采用前文第一方面所述方法制备得到的肿瘤分子探针。
第三方面，本发明要求保护前文第二方面所述肿瘤分子探针在宫颈癌显像或制备用于宫颈癌显像的产品中的应用。
第四方面，本发明要求保护前文第二方面所述肿瘤分子探针在靶向宫颈癌细胞或制备用于靶向宫颈癌细胞的产品中的应用。
第五方面，本发明要求保护Pep-1多肽或其标记物在宫颈癌显像或制备用于宫颈癌显像的产品中的应用。
第六方面，本发明要求保护Pep-1多肽或其标记物在靶向宫颈癌细胞或制备用于靶向宫颈癌细胞的产品中的应用。
在第五方面和第六方面中，所述标记物为对Pep-1多肽进行标记后得到的产物，如进行放射性核素标记。
在本发明中，所述Pep-1多肽均为通过氨基乙酸Ahx将寡肽I的C端与寡肽II的N端相连后所得；所述寡肽I的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述寡肽II的氨基酸序列为KK。
本发明合成制备符合临床转化标准的99mTc-MAG3-Pep-1探针，经检测其具有很强的体外稳定性和细胞(宫颈癌)亲和性，另外本发明还探究了该探针对皮下荷瘤(宫颈癌)小鼠模型的显像应用价值，以更好揭示该分子探针生物学性能及其潜在应用前景。本发明从核医学、基础医学和临床转化三方面着眼，制备得到了具有高标记率、高放射性比活度、高放射化学纯度的99mTc-MAG3-Pep-1分子探针，为进一步动物实验研究及临床转化打下良好的基础。
附图说明
图1为探索最适宜反应变量对标记率的影响(依次为温度、酸碱环境、氯化亚锡和酒石酸钠的反应用量)。
图2为99mTc-MAG3-Pep-1探针在生理盐水(常温)和BSA(37℃)的放射性化学纯度。
图3为细胞荧光和流式细胞荧光检测HeLa细胞对FITC-Pep-1的摄取情况。流式图的左侧峰为HeLa+PBS，右侧峰为HeLa+FITC-Pep-1。
图4为HeLa细胞对99mTc-MAG3-Pep-1探针的细胞摄取情况比较。
图5为99mTc-MAG3-Pep-1对HeLa细胞的饱和曲线。
图6为99mTc-MAG3-Pep-1/阻断组在HeLa荷瘤小鼠的显像情况及HepG2荷瘤小鼠(阴性肿瘤对照)的显像情况
图7为99mTc-MAG3-Pep-1/阻断组在HeLa荷瘤小鼠和在HepG2荷瘤小鼠在不同时间点下的肿瘤/肌肉比值比较水平。
图8为99mTc-MAG3-Pep-1在注射6h后分别在HeLa荷瘤小鼠和HepG2荷瘤小鼠的重要脏器分布比较水平。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、肿瘤分子探针99mTc-MAG3-Pep-1的制备及表征
本实施例拟用SnCI2还原法对具有MAG3修饰的Pep-1多肽(ACGEMGWVRCGGGS-Ahx-KK)(北京中科亚光科技有限公司产品，货号为C17282601)(MAG3修饰在Pep-1多肽C端最后一个氨基酸K上，下文简称MAG3-Pep-1多肽)进行99mTc标记，设定主要标记变量，探索其最适宜标记条件。研究设计标记变量包括了反应温度、pH值、SnCI2含量、酒石酸钠含量四个变量，逐一进行探索，筛选出标记率高于95％的标记条件。并应用该标记条件进行标记、纯化，再对产物进行表征，其中包括了生理盐水中体外稳定性、牛血清蛋白中体外稳定性、水脂系数。
前两者设定时间为0.5、1、2、4、6h。具体如下：
一、一步法标记
反应固定体系：MAG3-Pep-1多肽用量固定为30μg(1μg/μL,30μL)，缓冲液固定为90μL(配方：溶剂为水，溶质及浓度为0.25mol/L NaHCO3、0.18mol/L氨水、0.125mol/L醋酸铵，pH为10-11)，Na99mTcO4淋洗液固定为50μL(放射性活度为1.5-2.0mCi)，反应时间固定为30min；体系变量体系：新鲜配制的SnCI2(1μg/μL，溶于0.1M HCI中)，酒石酸钠(100μg/μL，溶于去离子水)。
标记变量设定见下表1。
表1、标记条件主要变量的设定
影响因素 变量条件
反应温度(℃) 室温(约25)、50、100
pH值 4.5-5.5、5.5-6.5、6.5-7.5
SnCI<sub>2</sub>含量(μg) 0.5、1、2.5、5、10
酒石酸钠(μg) 0、125、250、500、1000
注：反应体系的pH值采用HCI、缓冲液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为0.25mol/LNaHCO3、0.18mol/L氨水、0.125mol/L醋酸铵，pH为10-11)和纯净水按照一定比例稀释调配，并用pH试纸测定出来。
将上述反应体系按照缓冲液、多肽、SnCI2、酒石酸钠、Na99mTcO4淋洗液的顺序依次加入EP管中，于设定温度、pH条件下反应30min。
二、纸层析测标记率
标记率的测定采用纸层析法，固相为新华I号滤纸。
展开剂I为乙醇:氨水:水(2:1:5，体积比)，展开剂II为乙腈。
采集胶体锝(99mTcO2·nH2O)、游离锝(99mTcO4 -)、多肽标记物(99mTc-MAG3-Pep-1)的Rf值，计算标记率。标记率＝1-胶体锝(展开剂I原点/总放射性计数)％-游离锝(展开剂II前沿/总放射性计数)％。
三、纯化与放化纯的测定
参照文献报道方法进行纯化，即先用10mL无水乙醇冲洗、活化Sep-Pak C18柱，再用10mL的纯水清洗残液，然后用1mL注射器抽取标记反应液并上样，最后用0.5mL 80％乙醇溶液缓慢连续洗脱得到纯化产物，风干溶解备用。用纸层析法测定纯化后的放射化学纯度。
四、稳定性的测定
取经纯化的99mTc-MAG3-Pep-1 100μL分别加入2倍体积的生理盐水和50％(质量分数)牛血清蛋白(BSA)中，分别置于室温(约25℃)和37℃环境下0.5、1、2、4、6h，然后取少量样品用纸层析法测定其放射化学纯度。
五、脂水分配系数测定
在1.5mL离心管中同时加入500μL正辛醇和480μL磷酸盐缓冲液(PBS)，再取20μL99mTc-MAG3-Pep-1入该管，用封口膜密封。充分震荡1min后高速离心5min，静置10s。用移液枪分别从有机相和水相各取样100μL液体，并连同枪头置于干净的放免管中，分别测量其放射性计数，计算脂水分配系数(lgP)。计算公式如下：lgP＝lg(N(正辛醇)/N(PBS)。其中，N(正辛醇)和N(PBS)分别为所测正辛醇和PBS的放射性计数。
六、结果
1、99mTc-MAG3-Pep-1分子探针的制备
Rf值在纸层析的分布如表2所示。由表2可见，在展开剂丙酮中，99mTcO2·nH2O和99mTc-MAG3-Pep-1的Rf值为0～0.1，99mTcO4 -的Rf值为0.9～1.0；在展开剂氨水混合物中，99mTcO2·nH2O的Rf值为0～0.1，99mTc-MAG3-Pep-1的Rf值为0.8～1.0，99mTcO4 -的Rf值为0.9～1.0。
表2、Rf值在纸层析的分布
Figure BDA0003012997940000051
根据实验设定变量，探索最适宜反应变量对标记率的影响(温度、pH值、SnCI2和酒石酸钠的用量)结果如图1所示。
最适宜反应温度(℃)：100℃，此时标记率为88.56±1.55％。
最优酸性反应环境条件：pH＝5.5-6.5，此时标记率为87.92±1.31％。
最适宜反应温度SnCI2用量(μg)：2.5，此时标记率为93.89±0.73％。
最适宜酒石酸钠用量(μg)：500，此时标记率为95.55±0.89％。
最终反应体系：90μL buffer缓冲液，30μg多肽，50μL 1.5～2mCi 99mTcO4 -淋洗液，2.5μL SnCI2，5μL酒石酸钠。
最佳条件下的标记率：95.20±0.22％。
最佳条件下的放化纯：96.52±0.44％。
比活度：5.93MBq/nmol。
故根据上述结果，初步确定反应条件为：90μL buffer缓冲液，30μg多肽，50μL1.5～2mCi 99mTcO4 -淋洗液，2.5μg SnCI2，500μg酒石酸钠，pH为5.5-6.5，于100℃，反应30min。此时为标记率为95.20±0.22％，放射性化学纯度为96.52±0.44％；放射性比活度为5.93MBq/nmol；此结果符合临床转化要求。
2、99mTc-MAG3-Pep-1分子探针的体外表征
99mTc-MAG3-Pep-1探针在生理盐水(常温)和牛血清白蛋白BSA(37℃)的放射性化学纯度如图2所示。
水脂分配系数：-2.43±0.04。
99mTc-MAG3-Pep-1在常温生理盐水中，6h内放射性纯度均高于90％。
99mTc-MAG3-Pep-1在37℃牛血清蛋白中，6h内放射性纯度均高于90％。
本研究探针6h在生理盐水和牛血清白蛋白的放射性纯度均高于90％，说明探针稳定性良好；水脂分配系数提示药物亲水性良好利于体内代谢清除。
实施例2、评估99mTc-MAG3-Pep-1在宫颈癌皮下荷瘤小鼠中的显像应用价值
本实施例将评估制备探针99mTc-MAG3-Pep-1的活体皮下肿瘤显像效果。首先用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)修饰Pep-1多肽，再通过细胞荧光染色和流式细胞荧光分别定性、定量评估HeLa(人宫颈癌细胞系)对FITC-Pep-1探针的摄取能力；通过放射性细胞摄取实验，设定99mTc-MAG3-Pep-1、99mTc-MAG3-Pep-1+MAG3-Pep-1(阻断组)和Na99mTcO4(阴性对照)评估HeLa对99mTc-MAG3-Pep-1探针的选择特异性；通过细胞饱和结合试验评估99mTc-MAG3-Pep-1对HeLa的亲和力。再制备动物模型，包括HeLa和HepG2荷瘤小鼠，进行静态SPECT显像，分析其感兴趣区域(region of interest，ROI)和肿瘤/本底比值，确定最佳显像时间和评估显像效果；实验分组为：实验组(99mTc-MAG3-Pep-1)、阻断组(99mTc-MAG3-Pep-1+MAG3-Pep-1)、阴性肿瘤对照组(99mTc-MAG3-Pep-1)。最后进行生物分布实验，根据各脏器组织的单位质量的放射性摄取百分数(％ID/g)分析其放射性浓聚分布器官和时间代谢特点，实验设置分组同前。显像时间设置为：5min，15min、0.5、1、2、4、6h，生物分布时间设置为：0.5、2、4、6h。具体如下：
将99mTc-MAG3-Pep-1经荷瘤小鼠尾静脉注入，新型分子探针随着血液循环在荷瘤小鼠活体进行分布。一旦流经靶区可与相关蛋白进行结合，且短时间不随血液循环流动，故形成放射性浓聚影。但靶区/非靶区的放射性浓聚差异除了受分子探针与靶蛋白本身结合力的制约以外，还与其药物代谢动力学、内环境稳定性等多方面因素有关。本研究拟从探针体内显像和生物分布，评估99mTc-MAG3-Pep-1显像价值，并探究其修饰开发方向。主要实验手段如下：
一、细胞荧光爬片
将HeLa肿瘤细胞以适宜密度(1×105)种于共聚焦培养皿中，并放置于二氧化碳培养箱中，正常培养24h，待细胞融合60％开始进行后续实验。换液后加入FITC-Pep-1(上海吉尔多肽公司，产品编号P191009-JQ753565)(终浓度为6μg/mL)，总体积0.5mL，在37℃环境下，孵育1h，洗涤、固定、DAPI染核后上机检测。分析其荧光亚细胞定位图像。
二、流式细胞仪检测
待HeLa肿瘤细胞融合70％～80％，消化、洗涤、重悬细胞，加入0.5μg FITC-Pep-1(终浓度为1μg/mL)孵育0.5h，总体积0.5mL，洗涤、后上机检测。分析其平均荧光强度偏移量、阳性细胞率。
三、细胞摄取实验
将HeLa肿瘤细胞以适宜密度(1×106)种于6孔板中，并放置于二氧化碳培养箱中，正常培养24h，待细胞融合60％开始进行后续实验。PBS换液，加入10％BSA封闭探针可能存在的非特异性摄取，室温下孵育1h。换液，对应加入放射性活度为0.05mCi且等体积的探针(99mTc-MAG3-Pep-1或Na99mTcO4)，总孵育体系为2mL PBS，室温下孵育1h。实验分组为：实验组(99mTc-MAG3-Pep-1)、阻断组(99mTc-MAG3-Pep-1+MAG3-Pep-1)和阴性对照(Na99mTcO4)；其中阴性对照须加入100μg MAG3-Pep-1。再PBS洗涤3次，用蛋白裂解液收集细胞，井型计数器测定放射性计数。
四、细胞饱和结合试验
取处于对数生长期的HeLa细胞铺到2个24孔板中生长24小时。实验共设置8个终浓度梯度：640、320、160、80、40、20、10nM 99mTc-MAG3-Pep-1，每组3个复孔。实验组24孔板每孔分别加入20μL相应浓度的分子探针，阻断组24孔板在加入20μL相应浓度的99mTc-MAG3-Pep-1的同时加入20μL 10μM MAG3-Pep-1。实验组和阻断组总体系均为500μL PBS，于37℃培养箱中孵育1h。结束后，分别吸弃上清液，PBS洗3遍，蛋白裂解液收集细胞，井型计数器测定放射性计数。用实验组放射性计数减去阻断组放射性计数可得到特异性放射性计数，即特异性结合放射性计数＝总结合放射性计数-非特异结合放射性计数。通过Graphpad Prism 5软件绘制99mTc-MAG3-Pep-1饱和结合曲线。
五、动物模型制备
BALB/c Nude裸鼠，雌性，4周龄，20～22g，SPF级。每只裸鼠左前肢皮下接种HeLa肿瘤细胞或HepG2肿瘤细胞(5～10×106)，待肿瘤体积为0.8～1cm3进行动物实验。按照动物饲养参考标准饲养裸鼠，肉眼成瘤后无菌水中加入0.1％(0.1g/100ml)碘化钠以减少非特异性锝摄取。
六、SPECT显像
准备步骤五制备的模型BALB/c Nude裸鼠15只。随机分3组，每组5只，分为实验组、阻断组、对照组。各组实验动物经尾静脉注射150μL，活度为18.5MBq(0.5mCi)的99mTc-MAG3-Pep-1探针入体，其中阻断组为等体积等活度的99mTc-MAG3-Pep-1/MAG3-Pep-1混合液，MAG3-Pep-1约为250μg。各实验组分别于注射后5min、15min、0.5、1、2、4、6h进行俯卧位全身静态SPECT图像采集。采集条件为：能峰140.5keV，矩阵512×512，放大倍数为2，每只采集500000计数。
七、生物分布
准备HeLa荷瘤动物模型BALB/c Nude裸鼠40只，雌性。随机分2组，其中实验组和阻断组每组5只。各实验组分别于注射后0.5、2、4、6h处死模型。准备HepG2荷瘤动物模型BALB/c Nude 5只，雌性。于注射后4h处死模型。取各组动物的心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、肌肉、长骨、肿瘤、血液，称重并井型计数器测定放射性计数。结果经参考源校正后，计算每克组织放射性摄取百分数(％ID·g-1)。
八、结果
1、HeLa细胞对Pep-1的摄取情况
(1)HeLa细胞对FITC-Pep-1的摄取情况
细胞荧光和流式细胞荧光检测HeLa细胞对FITC-Pep-1的摄取情况如图3所示，
流式和细胞免疫荧光均可检测到HeLa细胞对Pep-1的摄取。
阳性细胞率：98.99±0.76％，PBS阴性对照：0.18±0.42％％(P<0.05)。
平均荧光强度：552.67±10.02，PBS阴性对照：43.75±2.53％(P<0.05)。
(2)HeLa细胞对99mTc-MAG3-Pep-1的摄取情况
HeLa细胞对99mTc-MAG3-Pep-1探针的细胞摄取情况如图4所示，HeLa细胞对99mTc-MAG3-Pep-1探针的摄取放射性计数(CPM)为101306.67±2599.86；加入过量未标记的前体MAG3-Pep-1后细胞(阻断组)摄取的放射性计数明显降低，计数达43008.67±84.00(P<0.05)。该结果说明细胞能特异性摄取99mTc-MAG3-Pep-1探针。同等条件下，阴性对照Na99mTcO4的放射性计数为21049.00±104.50，99mTc-MAG3-Pep-1和Blocking组均与其有统计学差异(P<0.05)。该结果说明细胞对探针的摄取与99mTcO4 -无关，主要与其标记的Pep-1多肽相关。
(3)99mTc-MAG3-Pep-1对HeLa细胞的亲和力测定
99mTc-MAG3-Pep-1对HeLa细胞的饱和结合曲线如图5所示，平衡解离常数Kd值为78.13±11.52nM；Bmax值为70111±4907.44；R2＝0.99。结果说明99mTc-MAG3-Pep-1探针对HeLa细胞的亲和力强。
2、99mTc-MAG3-Pep-1的影像应用价值
在SPECT静态显像中，99mTc-MAG3-Pep-1可在HeLa荷瘤小鼠模型成功靶向显影HeLa皮下肿瘤。在注射后4小时显像效果最佳，此时的肿瘤/肌肉比值为6.10±1.00。相比于阻断组，肿瘤/肌肉比值为2.41±0.76，具有明显统计学差异(P<0.05)，说明99mTc-MAG3-Pep-1能特异性被HeLa皮下肿瘤摄取、滞留，并在注射后4h获得良好的对比分辨图像，为临床应用，评估病灶奠定基础。从不同时间点图像分析可得，该药物主要通过肾脏途径排泄，少数因脱靶，在胃肠也有一定量的摄取。此外阴性对照肿瘤(HepG2)在各个显像时间点均无明显摄取探针，4h肿瘤/肌肉比值为2.07±0.18，与HeLa荷瘤小鼠相比具有明显统计学差异(P<0.05)。这说明99mTc-MAG3-Pep-1不能被阴性对照肿瘤(HepG2)大量摄取，从而证明99mTc-MAG3-Pep-1具有较好的靶点特异性。
图6为99mTc-MAG3-Pep-1/阻断组在HeLa荷瘤小鼠的显像情况及HepG2荷瘤小鼠(阴性肿瘤对照)的显像情况
图7为99mTc-MAG3-Pep-1/阻断组在HeLa荷瘤小鼠和在HepG2荷瘤小鼠在不同时间点下的肿瘤/肌肉比值比较水平。
在生物分布实验中，与显像结果基本一致，该探针主要通过肾脏排泄，肝、胃肠、脾脏有轻微摄取。重要器官脏器在注射后0.5～2h后有明显的清除，约4h时，99mTc-MAG3-Pep-1在非靶区器官几乎已被清除。在注射探针0.5h后，肿瘤区域开始有明显富集，随着时间代谢，部分99mTc-MAG3-Pep-1被继续摄取、滞留在肿瘤组织。阻断组能明显减少肿瘤对99mTc-MAG3-Pep-1的摄取。在注射后4h，肿瘤/肌肉比值到达峰值，为6.37±0.43，此时阻断组为3.77±0.17，具有明显统计学差异(P<0.05)(表3)。此外，在注射4h后，生物分布证实阴性对照肿瘤(HepG2)对99mTc-MAG3-Pep-1的摄取量很少，此时肿瘤摄取值为0.59±0.10，肿瘤/肌肉比值为1.51±0.21，均明显低于阳性HeLa肿瘤(P<0.05)。见图8。
表3、99mTc-MAG3-Pep-1/阻断组(上/下)在HeLa荷瘤小鼠的生物分布情况(均值±标准差,n＝5)
Figure BDA0003012997940000101
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 北京大学第一医院
<120> 一种靶向宫颈癌的肿瘤分子探针及其应用
<130> GNCLN210433
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Ala Cys Gly Glu Met Gly Trp Val Arg Cys Gly Gly Gly Ser
1 5 10

Claims (7)

1.一种制备肿瘤分子探针的方法，包括如下步骤：将具有MAG3修饰的Pep-1多肽进行99mTc标记，得到所述肿瘤分子探针；
所述肿瘤分子探针是采用SnCl2 还原法制备得到的；
所述方法包括如下步骤：向反应容器中加入缓冲液、所述具有MAG3修饰的Pep-1多肽、SnCl2、酒石酸钠、99mTcO4 -淋洗液，于pH值5.5-6.5、100 ℃条件下反应30 min，即得所述肿瘤分子探针；
所述缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度为0.25 mol/L NaHCO3、0.18 mol/L氨水、0.125mol/L醋酸铵；
所述Pep-1多肽为ACGEMGWVRCGGGS-Ahx-KK，是通过氨基乙酸Ahx将寡肽I的C端与寡肽II的N端相连后所得；所述寡肽I的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述寡肽II的氨基酸序列为KK。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：向所述反应容器中加入的所述缓冲液、所述具有MAG3修饰的Pep-1多肽、SnCl2、酒石酸钠、99mTcO4 -淋洗液的配比为90 μL所述缓冲液：30 μg所述具有MAG3修饰的Pep-1多肽：2.5 μg SnCl2：500 μg酒石酸钠：1.5~2 mCi 99mTcO4 -淋洗液。
3.采用权利要求1或2所述方法制备得到的肿瘤分子探针。
4.权利要求3所述肿瘤分子探针在制备用于宫颈癌显像的产品中的应用。
5.权利要求3所述肿瘤分子探针在制备用于靶向宫颈癌细胞的产品中的应用。
6.Pep-1多肽或其标记物在制备用于宫颈癌显像的产品中的应用；
所述Pep-1多肽为ACGEMGWVRCGGGS-Ahx-KK，是通过氨基乙酸Ahx将寡肽I的C端与寡肽II的N端相连后所得；所述寡肽I的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述寡肽II的氨基酸序列为KK。
7.Pep-1多肽或其标记物在制备用于靶向宫颈癌细胞的产品中的应用；
所述Pep-1多肽为ACGEMGWVRCGGGS-Ahx-KK，是通过氨基乙酸Ahx将寡肽I的C端与寡肽II的N端相连后所得；所述寡肽I的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述寡肽II的氨基酸序列为KK。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Protein Vaccination with HPV16 E7/Pep-1Nanoparticles Elicits a Protective T-Helper Cell-mediated Immune Response;Golnaz Mardani等;《IUBMB Life》;20160419;第459-467页 *

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