CN112999369A - 一种her2亲合体放射性核素标记物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种HER2亲合体99mTc标记物组合物及其应用，属于放射性药物及核医学领域。本发明所述的HER2亲合体99mTc标记物组合物包括HEPES、葡庚糖酸钠、维生素C、半胱氨酸、氯化亚锡及HER2亲合体，其标记率高，且不易产生二聚体，稳定性好，室温下可保存60天以上，降低保存成本和运输成本，具有更好的临床应用前景。

Description

一种HER2亲合体放射性核素标记物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及放射性药物及核医学领域，具体涉及一种HER2亲合体放射性核素99mTc标记物组合物及其应用。
背景技术
人表皮生长因子受体2(Human Epidermal Growth Factor Receptor，HER2)是一种跨膜蛋白，在细胞生长、生存及分化中具有重要作用。大概1/3乳腺癌患者HER2表达显著增高，HER2高表达的细胞增殖异常，最终导致肿瘤的发生。HER2表达阳性乳腺癌(HER2+BC)是乳腺癌中最具侵袭性亚型，其预后往往较差且容易复发，且HER2+BC对化疗及内分泌治疗的抵抗概率也大大增加。因此，HER2是HER2+BC重要的分子显像标识物及理想的靶向治疗目标。对于HER2靶向治疗具有两个重要难题：一是HER2高表达患者的筛选：只有高表达HER2患者才有可能从靶向治疗中受益，而不表达或少表达HER2患者则有可能过度治疗，有可能增加靶向治疗带来的副反应及错过更适合的治疗方式；二是治疗效果的监测：针对靶向治疗需要寻找一种动态、无创、整体的评估方法，以达到最佳的治疗效果。
临床上对肿瘤HER2表达检测一般采用取活检标本进行生化和组织病理学检查的方法，包括使用实时定量PCR测定HER2基因的含量，使用蛋白印迹电泳测定HER2蛋白表达量，或使用免疫组织染色检测病理组织切片的HER2蛋白表达。虽然病理活检是评价HER2表达的金指标，但是这种有创性的检查不能作为肿瘤疗效评价的常规检查而多次进行，且阳性率依赖操作者的临床经验和水平，其次活检的局部情况不能反映肿瘤的整体，缺乏时效性和全面性。CT和MRI往往基于解剖形态学特征分析肿瘤特性及治疗反应，缺乏对肿瘤内在基础生物及生理信息表达分析，尤其对治疗初始时期生物及生理信息的改变缺乏敏感性。对于分子靶向药物疗效监测，CT与MRI同样面临困境，因为分子靶向药物通常对肿瘤细胞起到抑制作用，肿瘤形态特征改变不明显。对于分子靶向治疗生存收益程度与毒性效应、药效比迫使临床需要一种更为准确及迅速的评估HER2状态的方法。因此寻找一种对HER2的表达检测可活体、无创、整体、动态的评价方法是HER2+BC诊治的重点及难点。
HER2显像具有以下意义：一是通过显像筛选最适合的治疗方案；二是通过显像对治疗效果进行早期判定及预测；三是通过载体将诊断和治疗药物相结合。诊疗一体化是近年来核医学研究发展的新趋势，在核素显像的基础上，根据患者的个体情况指导实施治疗，减少不良反应，提高治疗效果。核素显像通过检测体内器官功能的改变因而成为诊疗一体化的重要手段，借助诊疗一体化的分子探针在探测疾病生理功能改变的同时实施治疗作用。由于HER2+BC高表达HER2受体的特性及现阶段分子靶向治疗疗效预测及耐药性抵抗仍然是临床面临的重点难题，因此，基于HER2受体开发诊疗一体化分子探针是实现乳腺癌精准诊治的重要策略。
亲和体是一类新型支架蛋白，最初来源于金黄色葡萄球菌蛋白A，由58个氨基酸残基组成，分子量介于抗体和多肽之间(约6.5kDa)，它可以与靶向蛋白特异性的结合，具有很高的亲和力及靶向特异性。亲和体和抗原结合区域大小和抗体相当。亲和体没有激活作用，可以在注射剂量上不受太多限制。由于亲和体具有相对分子量小、结合力高、特异性强、靶向浓聚迅速、血液清除快等优点，因此放射性标记的HER2靶向的亲和体在HER2表达阳性的肿瘤体内显像中具有很好的应用价值。
李欣等人成功制备了99Tcm-人表皮生长因子受体2(HER2)亲和体(ABH2)，通过核瘤鼠实验表明99Tcm-ABH2能够特异地对HER2阳性乳腺癌进行显像。在保证肿瘤靶向性的前提下，尽可能减少对非肿瘤组织的辐射损坏以及通过减少肝脏的非特异性摄取以提高对病灶的探测效能，加速基础研究向临床应用的转化，推进个体化诊疗，实现HER2+BC早发现早治疗的重要策略(李欣,蔡炯,朱朝晖,李方.HER2放射性配体99Tcm-ABH2的制备及荷乳腺癌裸鼠显像.中华核医学与分子影像杂志.2015,35(3):222-226)。Ahlgrena等进行了小分子HER2靶向单光子显像亲和体放射性药物的临床前药物组方研究，其药盒组分为葡庚糖酸、EDTA和氯化亚锡，但该配方存在标记率低的问题，标记率不足10％。相比之下，葡庚糖酸、HEPES和氯化亚锡组方的标记率为90％左右(TaitJF,BrownDS,GibsonDF,BlankenbergFG,StraussHW.Development and characterization of annexin V mutants withendogenous chelation sites for(99m)Tc.BioconjugChem.2000,11(6):918-925)。即便如此，药盒一般保存在-20℃，温度要求低，有效期在1个月左右，在-20℃条件保存3个月的药盒，标记率只有80％左右，存在有效期短的问题。
因此，亟需开发一种稳定性更高的HER2亲合体99mTc标记物组合物，用于HER2的显像。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了一种HER2亲合体放射性核素99mTc标记物组合物。本发明所述的HER2亲合体99mTc标记物组合物包括HEPES、葡庚糖酸钠、维生素C、半胱氨酸、氯化亚锡及HER2亲合体，其不易产生二聚体，稳定性好，可降低保存成本和运输成本，具有更好的应用前景。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种HER2亲合体99mTc标记物组合物，所述的组合物包括HEPES、葡庚糖酸钠、维生素C、半胱氨酸、氯化亚锡及HER2亲合体。
具体地，所述HEPES浓度为2-30mmol/L，所述葡庚糖酸钠浓度为5-40mmol/L，所述维生素C浓度为2-30mmol/L，所述半胱氨酸浓度为5-40mmol/L，所述氯化亚锡浓度为0.1-5mmol/L，所述HER2亲合体浓度为0.01-0.6mmol/L，所述组合物pH为5.0-7.5。
进一步具体地，所述HEPES浓度为5-20mmol/L，所述葡庚糖酸钠浓度为10-30mmol/L，所述维生素C浓度为5-20mmol/L，所述半胱氨酸浓度为10-30mmol/L，所述氯化亚锡浓度为0.2-2mmol/L，所述HER2亲合体浓度为0.03-0.3mmol/L，所述组合物pH为6.0-7.0。
进一步具体地，所述HEPES浓度为10mmol/L，所述葡庚糖酸钠浓度为20mmol/L，所述维生素C浓度为10mmol/L，所述半胱氨酸浓度为20mmol/L，所述氯化亚锡浓度为0.4mmol/L，所述HER2亲合体浓度为0.05mmol/L，所述组合物pH为6.6。
具体地，所述的HER2亲合体羧基端设计GGGC序列便于同位素标记，氨基端设计HEHEHE序列便于亲和柱纯化。
另一方面，本发明提供了上述HER2亲合体99mTc标记物组合物在制备显像剂产品中的应用。
又一方面，本发明提供了一种显像剂产品，所述的显像剂产品包括上述HER2亲合体99mTc标记物组合物。
具体地，所述的显像剂为PET或SPECT显像剂，所述的产品为独立试剂或试剂盒。
又一方面，本发明提供了一种HER2亲合体99mTc标记物制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：在上述HER2亲合体99mTc标记物组合物中加入500-20000μCi的99mTc，在密闭条件下室温反应5-60min。
具体地，所述的99mTc的加入量为2000-10000μCi，优选为5000μCi。
具体地，反应时间为10-15min。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
本发明所述的HER2亲合体99mTc标记物组合物标记率高，且不易产生二聚体，稳定性好，室温下可保存60天以上，降低保存成本和运输成本，具有更好的临床应用前景。
附图说明
图1为低温及室温保存60天后SDS-PAGE二聚体鉴定结果图。
图2为HER2亲合体在不同配方中的保存时限结果图。
图3为大肠杆菌上清液HER2亲和体和大肠杆菌菌体HER2亲和体稳定性检测结果图。
图4为实施例2-1099mTc-ABH2 ITLC图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学用语均具有本领域技术人员通常理解的含义。
实施例1 HER2亲合体(ABH2)制备
亲和体羧基端设计GGGC序列便于同位素标记，氨基端设计HEHEHE序列便于亲和柱纯化，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。按照三联密码，使用DNAstar软件，设计出大肠杆菌表达偏好的HER2亲和体基因(SEQ ID NO:1)，通过寡核苷酸合成，重叠PCR的方法合成HER2亲和体基因，HindIII酶切鉴定合成基因长度，基因测序确定合成基因的序列。
将HER2亲和体基因用NcoI和EcoRI双酶切后，插入经过同样方式酶切的pET22b(+)载体，转化入DH5α感受态大肠杆菌中，经抗生素筛选后送菌液进行基因测序鉴定，提取质粒转化BL21(DE3)感受态大肠杆菌。用IPTG诱导表达，经过SDS-PAGE鉴定表达新生蛋白的细菌克隆。
表达HER2亲和体的大肠杆菌经离心，菌体用洗涤缓冲液(50mM Na2HPO4，300mMNaCl，pH7.0)洗涤，重悬于纯化缓冲液(20mM Tris·HCl，500mM NaCl，pH7.9)中超声破碎。通过离心去除细胞碎片，上清液60℃处理10min。然后离心，上清液经过滤膜过滤后上预先用破碎缓冲液(20mM Tris·HCl，500mM NaCl，1mM EDTA，pH7.9)平衡的镍柱。经含5mM咪唑的纯化缓冲液洗涤后，用含60mM咪唑的纯化缓冲液洗脱纯化。再通过Q柱进行离子交换纯化，在0.5M NaCl条件下洗脱纯化，纯化产物经过超滤去除缓冲液，更换为水溶液得到大肠杆菌菌体HER2亲和体。
实施例2
与实施例1的区别在于，本实施例表达HER2亲和体的大肠杆菌经离心后，直接取上清经纯化缓冲液(20mM Tris·HCl，500mM NaCl，pH7.9)透析过夜后离心，上清液经过滤膜过滤后上预先用破碎缓冲液平衡的镍柱。经含5mM咪唑的纯化缓冲液洗涤后，用含60mM咪唑的纯化缓冲液洗脱纯化。再通过Q柱进行离子交换纯化，在0.5M NaCl条件下洗脱纯化，纯化产物经过超滤去除缓冲液，更换为水溶液，得到大肠杆菌上清液HER2亲和体。
实施例3
HER2亲合体99mTc标记物
采用99mTc标记HER2亲合体，具体步骤为：将实施例1或2制备的亲合体中加入维生素C，亲合体浓度调整到1mg/mL。取浓度调整后的亲合体100μL加入到标记瓶中，加入脱氧的标记缓冲液(10mmol/L HEPES，20mmol/L葡庚糖酸钠，20mmol/L半胱氨酸，0.4mmol/L氯化亚锡)200μL，加入5000μCi 99mTc，室温反应10min完成反应。
经ITLC检测可知，99mTc-ABH2和99mTc有显著区别，99mTc-ABH2的Rf＝0，99mTc的Rf＝1。
实验例1稳定性检测
1.将实施例1纯化后的HER2亲合体加入不同的组合物配方中，分别在室温及4℃低温下进行保存，每2-3天通过SDS-PAGE鉴定二聚体的产生。组合物配方如下表1所示。
表1组合物配方
Figure BDA0002959232960000061
图1为低温及室温保存60天后SDS-PAGE二聚体鉴定结果图，图2为HER2亲合体在不同配方中的保存时限。
由图1可知，HER2亲合体在不加入维生素C和半胱氨酸条件下，稳定性差，易产生二聚体；加半胱氨酸的稳定性相比于加维生素C的稳定性较差；而同时加入维生素C和半胱氨酸，稳定性优于单独加维生素C或半胱氨酸。
由图2可知，在低温下保存较好的配方包括添加维生素C、SnCl2、通氩气等；而室温下同时添加半胱氨酸、维生素C和SnCl2，HER2亲合体可以保存60天以上。
2.将实施例2纯化后的HER2亲合体分别在室温、4℃低温和-20℃冷冻条件下保存，结果如图3所示。由图3可知，大肠杆菌上清液HER2亲和体的稳定性低于大肠杆菌菌体HER2亲和体稳定性。
实验例2
组合物配方：HEPES 10mmol/L；葡庚糖酸钠20mmol/L；维生素C10mmol/L；半胱氨酸20mmol/L；氯化亚锡0.4mmol/L；HER2亲合体0.05mmol/L；pH 6.6。
同位素：5000μCi(463GBq/L)。
其中，HER2亲合体按实施例1制备得到，按实施例3制备99mTc-ABH2。
实验例3
组合物配方：HEPES 10mmol/L；葡庚糖酸钠20mmol/L；维生素C1mmol/L；半胱氨酸20mmol/L；氯化亚锡0.4mmol/L；HER2亲合体0.05mmol/L；pH 6.6。
同位素：5000μCi(463GBq/L)。
其中，HER2亲合体按实施例1制备得到，按实施例3制备99mTc-ABH2。
实验例4
组合物配方：HEPES 10mmol/L；葡庚糖酸钠20mmol/L；维生素C 35mmol/L；半胱氨酸20mmol/L；氯化亚锡0.4mmol/L；HER2亲合体0.05mmol/L；pH 6.6。
同位素：5000μCi(463GBq/L)。
其中，HER2亲合体按实施例1制备得到，按实施例3制备99mTc-ABH2。
实验例5
组合物配方：HEPES 10mmol/L；葡庚糖酸钠20mmol/L；维生素C10mmol/L；半胱氨酸4mmol/L；氯化亚锡0.4mmol/L；HER2亲合体0.05mmol/L；pH 6.6。
同位素：5000μCi(463GBq/L)。
其中，HER2亲合体按实施例1制备得到，按实施例3制备99mTc-ABH2。
实验例6
组合物配方：HEPES 10mmol/L；葡庚糖酸钠20mmol/L；维生素C10mmol/L；半胱氨酸45mmol/L；氯化亚锡0.4mmol/L；HER2亲合体0.05mmol/L；pH 6.6。
同位素：5000μCi(463GBq/L)。
其中，HER2亲合体按实施例1制备得到，按实施例3制备99mTc-ABH2。
实验例7
组合物配方：HEPES 10mmol/L；葡庚糖酸钠20mmol/L；维生素C10mmol/L；半胱氨酸20mmol/L；氯化亚锡0.4mmol/L；HER2亲合体0.005mmol/L；pH 6.6。
同位素：5000μCi(463GBq/L)。
其中，HER2亲合体按实施例1制备得到，按实施例3制备99mTc-ABH2。
实验例8
组合物配方：HEPES 10mmol/L；葡庚糖酸钠20mmol/L；维生素C10mmol/L；半胱氨酸20mmol/L；氯化亚锡0.4mmol/L；HER2亲合体0.65mmol/L；pH 6.6。
同位素：5000μCi(463GBq/L)。
其中，HER2亲合体按实施例1制备得到，按实施例3制备99mTc-ABH2。
实验例9
组合物配方：HEPES 10mmol/L；葡庚糖酸钠20mmol/L；维生素C10mmol/L；半胱氨酸20mmol/L；氯化亚锡0.4mmol/L；HER2亲合体0.05mmol/L；pH 6.6。
同位素：300μCi(28GBq/L)。
其中，HER2亲合体按实施例1制备得到，按实施例3制备99mTc-ABH2。
实验例10
组合物配方：HEPES 10mmol/L；葡庚糖酸钠20mmol/L；维生素C10mmol/L；半胱氨酸20mmol/L；氯化亚锡0.4mmol/L；HER2亲合体0.05mmol/L；pH 6.6。
同位素：25000μCi(2313GBq/L)。
其中，HER2亲合体按实施例1制备得到，按实施例3制备99mTc-ABH2。
实验例11
1.标记率检测：取0.5μL反应混合物点样于ITLC-SG层析纸原点，以0.1M柠檬酸为流动相上行层析，放射扫描仪测量放射性计数，计算标记率。
2.放化纯检测：以沃特世Sep-pek固相萃取柱C18反相柱纯化99mTc-ABH2，取0.5μL反应混合物点样于ITLC-SG层析纸原点，以0.1M柠檬酸为流动相上行层析，放射扫描仪测量放射性计数，计算放化纯。
3.体外稳定性检测：将上述实验例2-10制备的99mTc-ABH2与0.1mol/L PBS(pH7.4)或健康人血清按照1:10体积比混合，37℃保温，于6h测定99mTc-ABH2的放化纯。
4.生物结合活性检测：卵巢癌细胞株SKOV-3用DMEM高糖培养基加体积分数10％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素培养。活性测定前1d将SKOV-3细胞接种于24孔板，每孔1mL(5×105/mL)。第2天现用现标记99mTc-ABH2，按照1:2倍比稀释加入不同浓度(26、56、112、225、450、900、1800、36000nmol/L，每个浓度3个平行孔)的99mTc-ABH2(比活度为12.9GBq/μmol)。阻断组第2天先加入50倍非阻断组99mTc-ABH2物质的量浓度的ABH2，然后加入与非阻断组同样的99mTc-ABH2。24孔板37℃下放置1h后用冰冷的PBS洗涤，0.1N NaOH消化细胞后用多道γ谱仪测量细胞结合的放射性：用非阻断组减去阻断组结合的放射性计数得到特异性结合的放射性计数。通过GraphPad Prism5软件测定Kd值。
标记率、放化率、体外稳定性、生物结合活性检测如下表2所示。
表2
Figure BDA0002959232960000091
Figure BDA0002959232960000101
杂质IPTG、氨苄青霉素、DTT、TCEP、EDTA采用HPLC检测。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 江苏元本生物科技有限公司
<120> 一种HER2亲合体放射性核素标记物组合物及其应用
<130> 20210220
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 198
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
gcccatgaac acgagcacga ggcggaaaac aaattcaaca aagaaatgcg caacgcgtac 60
tgggaaattg ccctgctgcc gaacctgacc aaccaacaga aacgcgcctt catccgctcc 120
ctgtacgacg acccatccca atctgcaaac ctgctggcgg aagcgaagaa actgaacgat 180
gcacagggtg gtggttgc 198
<210> 2
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
Ala His Glu His Glu His Glu Ala Glu Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met
1 5 10 15
Arg Asn Ala Tyr Trp Glu Ile Ala Leu Leu Pro Asn Leu Thr Asn Gln
20 25 30
Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser
35 40 45
Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Gly Gly
50 55 60
Gly Cys
65

Claims (10)

1.一种HER2亲合体99mTc标记物组合物，其特征在于，所述的组合物包括HEPES、葡庚糖酸钠、维生素C、半胱氨酸、氯化亚锡及HER2亲合体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述HEPES浓度为2-30mmol/L，所述葡庚糖酸钠浓度为5-40mmol/L，所述维生素C浓度为2-30mmol/L，所述半胱氨酸浓度为5-40mmol/L，所述氯化亚锡浓度为0.1-5mmol/L，所述HER2亲合体浓度为0.01-0.6mmol/L，所述组合物pH为5.0-7.5。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述HEPES浓度为5-20mmol/L，所述葡庚糖酸钠浓度为10-30mmol/L，所述维生素C浓度为5-20mmol/L，所述半胱氨酸浓度为10-30mmol/L，所述氯化亚锡浓度为0.2-2mmol/L，所述HER2亲合体浓度为0.03-0.3mmol/L，所述组合物pH为6.0-7.0。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述HEPES浓度为10mmol/L，所述葡庚糖酸钠浓度为20mmol/L，所述维生素C浓度为10mmol/L，所述半胱氨酸浓度为20mmol/L，所述氯化亚锡浓度为0.4mmol/L，所述HER2亲合体浓度为0.05mmol/L，所述组合物pH为6.6。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述的HER2亲合体羧基端包括GGGC序列，氨基端包括HEHEHE序列。
6.权利要求1-5任一项所述的HER2亲合体99mTc标记物组合物在制备显像剂产品中的应用。
7.一种显像剂产品，其特征在于，所述的显像剂产品包括权利要求1-5任一项所述的HER2亲合体99mTc标记物组合物。
8.根据权利要求7所述的显像剂产品，其特征在于，所述的显像剂为PET或SPECT显像剂，所述的产品为独立试剂或试剂盒。
9.一种HER2亲合体99mTc标记物制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：在上述HER2亲合体99mTc标记物组合物中加入500-20000μCi的99mTc，在密闭条件下室温反应5-60min。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的99mTc的加入量为2000-10000μCi，加入量为5000μCi；反应时间为10-15min。
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