CN113252807A - 一种缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法，采用以苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱，采用由乙腈和缓冲液组成的流动相按1.0mL/min的流速进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～15分钟：乙腈体积分数为40％；15～30分钟：乙腈体积分数由40％匀速升高至60％；30～60分钟：乙腈体积分数为60％。该高效液相色谱分离方法能够有效地检测出缩宫素及各杂质峰，且分离度都大于1.5，分离效果好，方法专属性强、精密度好，准确度高，且简单易行，操作快捷，在原料药及制剂质量研究方面具有重要的研究价值。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法。
背景技术
缩宫素(oxytocin)属于多肽类激素子宫收缩药，于1953年首次实现人工合成，其可与分布在子宫平滑肌上的缩宫素受体结合，起到促进子宫收缩的作用。缩宫素已在临床上应用几十年，疗效确切，被广泛用于引产、催产及预防因分娩后子宫乏力引起的出血等方面。
国内已获批的缩宫素原料药因各厂家生产工艺水平不同差异较大，普遍存在纯度低、杂质多、升压物质加压素和其它小分子活性肽无法去除等缺点，因此易产生升压的副作用。随着我国对药品杂质研究的要求日趋严格，对缩宫素的分离检测方法进行规范严谨的深入研究，将利于将杂质控制在安全合理的限度范围内，在原料药及制剂质量研究方面具有重要的研究价值，对提高缩宫素的产品质量有重要意义。
缩宫素是由8种氨基酸组成的九肽药物，其性质不稳定，杂质较多且结构相近，通过调整HPLC系统方法中梯度、流动相比例或组成，均不能较好的分离各个杂质，或分离杂质数量有限，经过筛选，一些特殊填料的色谱柱能较好的分离个杂质，节约分析时间、简化操作流程。
中国专利文献CN111812240A公开了一种缩宫素及三种杂质的分离方法，该方法针对[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素3种缩宫素杂质建立分离方法，而缩宫素原料药因各厂家生产工艺水平不同差异较大，普遍存在纯度低、杂质多的问题，且缩宫素在储藏与制备过程中还会产生杂质，因此缩宫素产品不仅仅包含以上三种杂质，该方法对缩宫素原料药缺乏实用性。
中国专利文献CN111077243A公开了一种用于缩宫素注射液的检测方法，该检测方法主要是缩宫素含量测定方法，且此检测方法中主峰保留时间为26min左右，需55min左右杂质才能分离完毕。
发明内容
本发明提供一种缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法，以解决国内缩宫素原料药普遍存在的纯度低、杂质多、升压物质加压素和其它小分子活性肽无法去除等问题，该方法能在27分钟内将缩宫素原料药有关物质分离完毕。
本发明提供的技术方案具体如下：
一种缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法，采用以苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱，采用由乙腈和缓冲液组成的流动相按1.0mL/min的流速进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～15分钟：乙腈体积分数为40％；15～30分钟：乙腈体积分数由40％匀速升高至60％；30～60分钟：乙腈体积分数为60％。
在上述技术方案的基础上，该高效液相色谱分离方法采用紫外检测器检测缩宫素原料药有关物质，检测波长为220nm。
作为上述技术方案的优选，进样体积为20μL。
作为上述技术方案的优选，柱温为35～40℃。
作为上述技术方案的优选，缓冲液为戊烷磺酸钠缓冲液、己烷磺酸钠缓冲液、庚烷磺酸钠缓冲液中的一种。
作为上述技术方案的优选，缓冲液为己烷磺酸钠缓冲液。
作为上述技术方案的优选，缓冲液的浓度为10mM。
作为上述技术方案的优选，该高效液相色谱分离方法采用以下色谱柱中的一种：
品牌为Waters XBridge BEH Phenyl，规格为4.6*100mm*5μm；
品牌为AgilentZORBAX SB-Phenyl，规格为4.6*75mm*3.5μm；
品牌为Phenomenex LunaPhenyl-Hexyl，规格为4.6*100mm*3μm。
在上述技术方案的基础上，缩宫素原料药中的杂质包括Di-Gly9-缩宫素、D-Gln4-缩宫素、乙酰化缩宫素、Des-Gly9-缩宫素中的一种或多种。
在上述技术方案的基础上，进样所采用的供试品溶液通过以下方法制备而成：将样品溶于体积分数为20％的乙腈水溶液中，配制成缩宫素浓度不低于0.1mg/mL的供试品溶液。
本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明提供的缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法，能够有效地检测出缩宫素及各杂质峰，且分离度都大于1.5，分离效果好，方法专属性强、精密度好，准确度高。
(2)本发明在27min内就能分离缩宫素原料药中所有物质，节省分析时间，减少有机溶剂的消耗，降低能耗、保护环境，且简单易行，操作快捷，在原料药及制剂质量研究方面具有重要的研究价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例3的空白溶剂的高效液相色谱图谱；
图2为实施例3的系统适用性溶液的高效液相色谱图谱；
图3为实施例3的供试品溶液的高效液相色谱图谱。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，以下实施例仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法，采用以苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱，采用由乙腈和缓冲液组成的流动相按1.0mL/min的流速进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～15分钟：乙腈体积分数为40％；15～30分钟：乙腈体积分数由40％匀速升高至60％；30～60分钟：乙腈体积分数为60％。
在上述技术方案的基础上，该高效液相色谱分离方法采用紫外检测器检测缩宫素原料药有关物质，检测波长为220nm。
作为上述技术方案的优选，进样体积为20μL。
作为上述技术方案的优选，柱温为35～40℃。
作为上述技术方案的优选，缓冲液为戊烷磺酸钠缓冲液、己烷磺酸钠缓冲液、庚烷磺酸钠缓冲液中的一种。
作为上述技术方案的优选，缓冲液为己烷磺酸钠缓冲液。
作为上述技术方案的优选，缓冲液的浓度为10mM。
作为上述技术方案的优选，该高效液相色谱分离方法采用以下色谱柱中的一种：
品牌为Waters XBridge BEH Phenyl，规格为4.6*100mm*5μm；
品牌为AgilentZORBAX SB-Phenyl，规格为4.6*75mm*3.5μm；
品牌为Phenomenex LunaPhenyl-Hexyl，规格为4.6*100mm*3μm。
在上述技术方案的基础上，缩宫素原料药中杂质包括Di-Gly9-缩宫素、D-Gln4-缩宫素、乙酰化缩宫素、Des-Gly9-缩宫素中的一种或多种。
在上述技术方案的基础上，进样所采用的供试品溶液通过以下方法制备而成：将样品溶于体积分数为20％的乙腈水溶液中，配制成缩宫素浓度不低于0.1mg/mL的供试品溶液。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明采用的缩宫素样品购于上海苏豪逸明制药有限公司，批号为：1909012、1909013、1909014。
由于缩宫素对温度及pH均比较敏感，在储藏与制备过程中均有可能产生杂质，如乙酰化杂质、脱酰胺杂质、降解杂质等。主要杂质如表1所示。
表1缩宫素原料药中主要杂质
本发明涉及到的几种溶液的制备：
(1)空白溶剂的制备：20％乙腈水溶液(v/v)；
(2)供试品溶液的制备：称取缩宫素纯品适量，加空白溶剂使其溶解并稀释成缩宫素浓度约为0.25mg/mL的供试品溶液；
(3)系统适用性溶液的制备：称取缩宫素纯品、杂质A和杂质B适量，加空白溶剂使三者溶解并稀释成缩宫素浓度为0.25mg/mL、杂质A与杂质B浓度均为0.1mg/mL的系统适用性溶液。
为考察不同品牌、型号的色谱柱对缩宫素原料药有关物质分离的影响，按实施例1-3的仪器与色谱条件对缩宫素原料药有关物质进行分离，并进行分析比较：
实施例1
仪器与色谱条件：采用Agilent1260高效液相色谱系统；色谱柱为Waters XBridgeBEHPhenyl 4.6*100mm*5μm，流动相A：10mM己烷磺酸钠缓冲液(由约1.882g己烷磺酸钠溶于1000mL二次水中制得)；流动相B：乙腈。检测波长为220nm；流速为1.0mL/min；进样体积为20μL；柱温为40℃。梯度洗脱程序如表2所示：
表2实施例1的梯度洗脱程序
| 时间/min | 流动相A | 流动相B |
| 0～15 | 60％ | 40％ |
| 15～30 | 60％～40％ | 40％～60％ |
| 30～60 | 40％ | 60％ |
取系统适用性溶液与供试品溶液，按照上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
实施例2
仪器与色谱条件：采用Agilent1260高效液相色谱系统；色谱柱为AgilentZORBAXSB-Phenyl 4.6*75mm*3.5μm，流动相A：10mM己烷磺酸钠缓冲液；流动相B：乙腈。检测波长为220nm；流速为1.0mL/min；进样体积为20μL；柱温为40℃。梯度洗脱程序如表3所示：
表3实施例2的梯度洗脱程序
| 时间/min | 流动相A | 流动相B |
| 0～15 | 60％ | 40％ |
| 15～30 | 60％～40％ | 40％～60％ |
| 30～60 | 40％ | 60％ |
将系统适用性溶液与供试品溶液按照上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
实施例3
仪器与色谱条件：采用Agilent1260高效液相色谱系统；色谱柱为PhenomenexLunaPhenyl-Hexyl 4.6*100mm*3μm，流动相A：10mM己烷磺酸钠缓冲液；流动相B：乙腈。检测波长为220nm；流速为1.0mL/min；进样体积为20μL；柱温为40℃。梯度洗脱程序如表4所示：
表4实施例3的梯度洗脱程序
| 时间/min | 流动相A | 流动相B |
| 0～15 | 60％ | 40％ |
| 15～30 | 60％～40％ | 40％～60％ |
| 30～60 | 40％ | 60％ |
系统适用性溶液与供试品溶液按照上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，如图1～图3所示，图1与图2中2min左右的峰均为空白溶剂峰。表5展示了图3中供试品溶液在高效液相色谱图谱中的色谱峰归属。
表5图3中供试品溶液在高效液相色谱图谱中的色谱峰归属
| 名称 | 保留时间 | 分离度 |
| 杂质A | 9.237 | 1.52 |
| 缩宫素 | 9.741 | 13.83 |
| 杂质B | 未检出 | 未检出 |
| 杂质D | 14.733 | 1.7 |
| 杂质C | 15.294 | 35.22 |
精密度试验：
表6系统适用性-精密度结果(以保留时间统计)
表7系统适用性的精密度结果(以峰面积统计)
准确度试验：在缩宫素供试品溶液中，分别加入低、中、高三种浓度的杂质A与杂质B对照品，配制成含不同限度浓度的混合溶液，依实施例3的条件测定，结果见表8与表9：
表8杂质A的准确度结果
表9杂质B的准确度结果
最后，以上仅为本发明的较佳实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法，其特征在于：采用以苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱，采用由乙腈和缓冲液组成的流动相按1.0mL/min的流速进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～15分钟：乙腈体积分数为40％；15～30分钟：乙腈体积分数由40％匀速升高至60％；30～60分钟：乙腈体积分数为60％。
2.根据权利要求1所述的缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法，其特征在于：该高效液相色谱分离方法采用紫外检测器检测缩宫素原料药有关物质，检测波长为220nm。
3.根据权利要求1所述的缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法，其特征在于：进样体积为20μL。
4.根据权利要求1所述的缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法，其特征在于：柱温为35～40℃。
5.根据权利要求1所述的缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法，其特征在于：所述缓冲液为戊烷磺酸钠缓冲液、己烷磺酸钠缓冲液、庚烷磺酸钠缓冲液中的一种。
6.根据权利要求5所述的缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法，其特征在于：所述缓冲液为己烷磺酸钠缓冲液。
7.根据权利要求5或6所述的缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法，其特征在于：所述缓冲液的浓度为10mM。
8.根据权利要求1所述的缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法，其特征在于：该高效液相色谱分离方法采用以下色谱柱中的一种：
品牌为Waters XBridge BEH Phenyl，规格为4.6*100mm*5μm；
品牌为Agilent ZORBAX SB-Phenyl，规格为4.6*75mm*3.5μm；
品牌为Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl，规格为4.6*100mm*3μm。
9.根据权利要求1所述的缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法，其特征在于：缩宫素原料药中的杂质包括Di-Gly9-缩宫素、D-Gln4-缩宫素、乙酰化缩宫素、Des-Gly9-缩宫素中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述的缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法，其特征在于：进样所采用的供试品溶液通过以下方法制备而成：将样品溶于体积分数为20％的乙腈水溶液中，配制成缩宫素浓度不低于0.1mg/mL的供试品溶液。
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