CN113235188B - 一种检测miRNA-198的荧光壳聚糖纤维及其制备方法 - Google Patents

一种检测miRNA-198的荧光壳聚糖纤维及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测miRNA‑198的荧光壳聚糖纤维及其制备方法。本方法是基于目标分子miRNA‑198催化hairpin探针自组装，形成双链结构，将通过双链杂交反应接上荧光壳聚糖纤维的带有淬灭基团BHQ1的DNA探针probe2从荧光壳聚糖纤维上取代下来，从而使壳聚糖纤维端头光波导由淬灭转而恢复，根据不同浓度的miRNA‑198会使得荧光壳聚糖纤维端头荧光强度的变化不同来实现对miRNA‑198进行定量检测。该检测方法，对miRNA‑198显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。

Description

一种检测miRNA-198的荧光壳聚糖纤维及其制备方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，涉及miRNAs的检测分析技术，具体涉及一种检测miRNA-198的荧光壳聚糖纤维及其制备方法。
背景技术
miRNA是内源的微小非编码RNA，可调节基因表达并在各种癌症的发生，发展和治疗中发挥重要作用换言之，它们作为致癌的miRNA(oncomiR)或肿瘤抑制的miRNA(tsmiRNA)，其调节许多肿瘤的生物学功能，包括细胞增殖和凋亡，血管生成，侵入，迁移和转移通过具体的目标和分子途径。已在PDAC患者中发现了几种miRNA失调。迄今为止，已发现许多可能在PC的启动，进展和转移中起重要作用的miRNA，应将其视为PC的早期诊断，预后和有益治疗的潜在生物标志物。其中miRNA-198在胰腺癌患者中的表达显著升高，可以作为胰腺癌早期诊断的潜在生物标志物。
传统的Northern印迹和原位杂交检测技术费力且缺乏灵敏度。芯片技术和定量聚合酶链反应(qPCR)等新技术虽然功能强大，但由于其复杂性，仍然仅限于中央实验室。因此，迫切需要开发简便的技术来检测miRNA的水平。
经典基因和肿瘤标志物检测分别主要基于聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。尽管PCR和ELISA是灵敏的方法，但它们昂贵，费时，并且需要训练有素的人员以及严格的实验条件。因此，迫切需要一种低成本，测定时间短，灵敏度高，易于使用且专用的工具来检测PanIN和早期诊断PDAC。
生物传感器旨在通过将生物识别事件基本上转换为可以检测和分析的可测量信号对特定的生物分析物进行定性和半定量。典型的生物传感器由识别元件，换能器和信号处理单元(信号输出)组成。荧光生物传感器是灵敏，特异且具有成本效益的设备，可以直接评估体液，例如血液，血清，尿液，唾液等。然而目前荧光检测仍然存在一些困境，例如背景信号泄露严重，光漂白，与背景荧光光谱相重叠等等。因此开发一种新型的荧光传感器系统，能够快速、高选择性和高灵敏度地进行miRNA的检测仍然是一项非常有意义的挑战。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种检测miRNA-198的荧光壳聚糖纤维及其制备方法，制备一维荧光壳聚糖纤维，并结合荧光共振能量转移原理、CHA放大原理、toehold调控的链替换反应及浓缩富集效应等，设计灵敏度高、特异性强的新型生物传感器用于在复杂的生物环境中微量miRNA的检测。
本发明提供了一种BHQ1修饰的荧光壳聚糖纤维对于胰腺癌相关microRNA-miRNA-198的微量检测方法。该方法基于目标分子miRNA-198催化hairpin探针组装，形成双链结构并进行循环放大，通过toehold取代荧光壳聚糖纤维上带有淬灭基团BHQ1的probe2，从而使微米管端头光波导由淬灭转而恢复。随着反应循环进行，低浓度的目标miRNA-198就可产生高的信号，而的单碱基变异，三碱基变异以及其他microRNA产生极低的信号。该检测方法，对miRNA-198显示了极高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种荧光壳聚糖纤维的制备方法，包括：将荧光染料FITC溶解于二甲亚砜中制备混合液，将壳聚糖溶解于三氟乙酸中制备混合液，待各自溶解完全以后，将上述两种混合液再混合，机械搅拌均匀；通过手工拉丝的方法产出纤维，生产出来的纤维在碱性条件下反应，使FITC与壳聚糖充分反应，完成荧光壳聚糖纤维的制备；优选地，所述荧光染料FITC与所述壳聚糖的质量比为(1：250)～(1：300)；更优选地，所述荧光染料FITC与所述壳聚糖的质量比为1：300。
优选地，所述壳聚糖为中等分子量的壳聚糖。
本发明还提供了一种检测miRNA-198的方法，包括以下步骤：
步骤一、将单链DNA探针probe1修饰到如上所述的方法制备的荧光壳聚糖纤维上，将碱性条件下反应超过24小时的荧光壳聚糖纤维加入到乙二醇二缩水甘油醚中，在室温下反应12-16个小时，然后将反应好的荧光壳聚糖纤维继续加入5’端带有氨基的单链DNA探针probe1中32.0-37.0℃反应6-12小时得到probe1修饰的荧光壳聚糖纤维；
步骤二、将带有荧光淬灭基团BHQ1的DNA探针probe2修饰到荧光壳聚糖纤维上进行荧光淬灭，修饰BHQ1的单链DNA与修饰荧光壳聚糖纤维的单链DNA部分碱基互补配对，通过DNA的链杂交反应将接有淬灭基团BHQ1的probe2修饰到荧光壳聚糖纤维上根据荧光共振能量转移原理进行荧光淬灭；
步骤三、将淬灭后的荧光壳聚糖纤维与CHA反应所需的发夹探针H1,H2以及含有目标miRNA-198的样品混合，检测荧光淬灭后的荧光壳聚糖纤维端头光波导荧光亮度的变化；miRNA-198作为催化剂通过toehold催化H1、H2形成双链结构，形成的双链通过toehold使BHQ1-ssDNA2离开荧光壳聚糖纤维表面，使微米管端头光波导荧光恢复；
步骤四、将单碱基突变，三碱基突变，以及其他种类的microRNA放置于CHA链置换反应中，来反映探针组对miRNA-198的高特异性；优选地，所述其他种类的microRNA包括miRNA-21和miRNA-34A。
进一步地，所述接有淬灭基团BHQ1的单链DNA的序列如SEQ ID NO：1所示；所述修饰荧光壳聚糖纤维的单链DNA的序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步地，所述H1探针的序列如SEQ ID NO：3所示；所述H2探针的序列如SEQ IDNO：4所示。
本发明还提供一种检测miRNAs-198的探针组，包括H1探针和H2探针，所述H1探针的序列如SEQ ID NO：3所示；所述H2探针的序列如SEQ ID NO：4所示。
进一步地，H1和H2探针会形成发夹结构，在目标miRNA-198的存在下会催化两个发夹探针装配成双链，形成双链的探针会将杂交成双链的probe1探针和probe2探针分开。
本发明提供一种检测miRNAs-198的试剂盒，包括如上所述探针组。
特别地，本发明通过如下实现：
一种荧光壳聚糖纤维的制备方法，荧光染料FITC与中等分子量的壳聚糖以质量比为1：200的比例分别溶解于DMSO和三氟乙酸中，待各自溶解完全以后再混合，机械搅拌均匀，由于壳聚糖的粘度较高，可以通过手工拉丝的方法产出纤维，生产出来的纤维在碱性条件下反应，使FITC与壳聚糖充分反应，完成荧光壳聚糖纤维的制备。
一种检测miRNA-198的方法，包括如下步骤：
步骤1、称取1.2g壳聚糖溶于15mL的三氟乙酸中，机械搅拌5h，将壳聚糖搅拌均匀，让它完全溶解于三氟乙酸中，溶解过程中将温度控制在25.0-30.0摄氏度之间。称取3mg的异硫氰酸荧光素(FITC)粉末，将其溶解于50μL的二甲亚砜(DMSO)中，充分溶解以后用移液枪将50μL的异硫氰酸荧光素FITC-二甲亚砜DMSO溶液注入已经搅拌均匀完全溶解的壳聚糖-三氟乙酸溶液中继续机械搅拌3h，直至混合均匀。
步骤2、取下盛有溶液的锥形瓶，将其放置于通风橱在室温中使三氟乙酸充分挥发大约8个小时，溶液粘度增加到一定的程度，通过是否能扯出细丝来判断，将较高粘度的溶液通过手工拉丝的方法生产出纤维。将生产出的纤维放置于真空干燥箱中干燥一晚上约18小时，去除大部分的三氟乙酸。称取2g的NaOH溶解于98mL的水中，配制成质量分数为2％的NaOH溶液，将真空干燥以后的荧光壳聚糖纤维完全浸泡在2％的NaOH溶液中，浸泡48h。FITC-荧光壳聚糖纤维制备完成。
步骤3、将probe1修饰到FITC-荧光壳聚糖纤维上
将过碱以后的荧光壳聚糖纤维浸没在1mL的乙二醇二缩水甘油醚溶液中，室温下反应过夜12小时，将反应过夜的纤维挑取出来用大量的TAE缓冲液(PH＝8.4)冲洗，TAE缓冲液(TAE Buffer)是由三羟甲基氨基甲烷(Tris base)、乙酸(acetic acid)和乙二胺四乙酸(EDTA)组成的缓冲液，得到环氧修饰的荧光壳聚糖纤维；再将5’端修饰了氨基的probe1探针(60μL,10μM)与接有环氧基团的荧光壳聚糖纤维37℃反应过夜，得到probe1修饰的荧光壳聚糖纤维。
步骤4、根据碱基互补配对原则，将5‘端修饰有BHQ1淬灭剂的probe2探针与接上probe1的荧光壳聚糖纤维在95℃退火10分钟，然后自然冷却至37℃，在37摄氏度时恒温进行杂交4小时。杂交后probe2的5’端的BHQ1淬灭基团的距离缩至10nm以下，通过荧光共振能量转移(FRET)使荧光壳聚糖纤维上的绿色荧光淬灭。
步骤5、CHA循环放大反应进行淬灭荧光壳聚糖纤维的荧光恢复。将放大探针H1和H2分别配置成溶液后先置于95℃退火10分钟然后自然降温至37度，在37度反应形成发夹结构。首先配置含有100nM H1，400nM H2的TAE缓冲溶液中，并向该缓冲液中加入不同浓度的目标microRNA-198，使它们在37℃反应1小时随后将制备好的BHQ1@荧光壳聚糖纤维放入含H1,H2,microRNA-198的溶液。反应4个小时以后，反应结束，用TAE缓冲液冲洗荧光壳聚糖纤维，将荧光壳聚糖纤维表面黏附的DNA分子清除，通过光波导手段来对荧光壳聚糖纤维端头荧光强度的变化进行测量。以miRNA-198浓度为横坐标，以微米管光波导荧光亮度变化为纵坐标作图。在此过程中，miRNA-198作为反应的催化剂。此过程可提高荧光壳聚糖纤维传感器检测目标分子的灵敏度，降低反应极限。
步骤6、分别用单碱基突变的miRNA-198,三碱基突变的miRNA-198,miRNA-21以及miRNA-34A作为目标microRNA,将它们以相同的浓度加入含有100nM的H1，400nM的H2的缓冲溶液中进行CHA循坏放大反应，发现只有加入miRNA-198时微米管端头光波导荧光变化强烈，说明荧光壳聚糖纤维对miRNA-198具有高特异性。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：高效检测微量miRNA-198，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确，检测手段简单。本发明和其他基于荧光壳聚糖纤维的循环放大方法检测miRNA都将被保护起来。
附图说明
图1实施例1，荧光壳聚糖纤维生产制备的过程。荧光壳聚糖纤维的表征图如下，图1a荧光壳聚糖纤维的荧光显微镜图；图1b为SEM图，可见荧光壳聚糖纤维的直径大约在25微米左右；图1c为荧光壳聚糖纤维的光波导图。图1d为FITC-荧光壳聚糖纤维的激发光谱和发射光谱，从图中可以看出467nm和507nm是该材料的激发波长，而该材料的发射波长主要在532nm处。
图2实施例2，probe1修饰到DITC-荧光壳聚糖纤维上。图2a是probe1修饰到荧光壳聚糖纤维上的图示过程。图2b为，修饰上环氧后接入DNA探针probe1的荧光壳聚糖纤维的红外光谱，i代表表面接上环氧的荧光壳聚糖纤维的红外光谱，ii代表接上probe1后的红外光谱，多出来的峰如895，1256，1324，1423处等为DNA的特征峰。
图3实施例3，BHQ1-probe2修饰荧光壳聚糖纤维后的光波导荧光变化。图3a为，荧光壳聚糖纤维-probe1和BHQ1-probe2杂交后，荧光壳聚糖纤维端头荧光淬灭过程。图3b为光波导方法下，同一根荧光壳聚糖纤维在于probe2探针退火杂交前的端头荧光亮度明显高于淬灭后的，由此可见probe2探针上BHQ1基团对荧光壳聚糖纤维的荧光淬灭成功。
图4实施例4，用PAGE凝胶电泳的方法来验证CHA体系的探针的可行性。图4a为，在BHQ1-荧光壳聚糖体系中，由450nm光激发后，微米管端头荧光微弱，当加入检测的miRNA-198后，微米管端头荧光亮度增强。图4b为，CHA可行性凝胶电泳图。
图5实施例5，将淬灭后的荧光壳聚糖纤维放入含有H1，H2以及不同浓度的miRNA-198中，端头光波导荧光变化，及检测极限示意图。在BHQ1-荧光壳聚糖纤维体系中，加入不同浓度的miRNA-198溶液，浓度由1pM到30fM，微米管端头荧光逐渐恢复。并发现，荧光壳聚糖纤维端头荧光变化和miRNA-198的浓度成比例关系。
图6实施例6，分别用单碱基突变的miRNA-198,三碱基突变的miRNA-198,miRNA-21以及miRNA-34A作为目标microRNA,将它们以相同的浓度加入含有100nM的H1，400nM的H2的缓冲溶液中进行CHA循坏放大反应。从图6可以看出该体系对miRNA-198的特异性还是较强的。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例详细介绍本发明。但以下的实施例仅限于解释本发明，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容，而且通过以下实施例的叙述，本领域的技术人员是可以完全实现本发明权利要求的全部内容。
实施例1
称取1.2g购自aldrich公司的中等分子量的壳聚糖溶于15mL的三氟乙酸中，机械搅拌5h，将壳聚糖搅拌均匀，让它完全溶解于三氟乙酸中，溶解过程中将温度控制在25.0-30.0摄氏度之间。称取4mg的异硫氰酸荧光素(FITC)粉末，将其溶解于50μL的二甲亚砜(DMSO)中，充分溶解以后用移液枪将50μL的异硫氰酸荧光素FITC-二甲亚砜DMSO溶液注入已经搅拌均匀完全溶解的壳聚糖-三氟乙酸溶液中继续机械搅拌3h，直至混合均匀。配置好异硫氰酸荧光素(FITC)-壳聚糖-三氟乙酸溶液，25.0-30.0℃的温度下充分搅拌混合均匀，室温下放置于通风橱中8个小时使三氟乙酸挥发，溶液粘度较高，可以扯出细丝时，通过手工拉丝的方法生产出FITC-荧光壳聚糖纤维，真空干燥18小时以后，在室温条件下放置于质量分数为2％的NaOH碱性溶液中浸泡48h除酸，使FITC与壳聚糖充分结合，荧光壳聚糖纤维至此制备完成。荧光壳聚糖纤维的性能表征见图1。a图为荧光壳聚糖纤维的荧光显微镜图；b图为扫描电镜图,所使用的扫描电镜为GeminiSEM 500肖特基场发射扫描电子显微镜仪器型号为GeminiSEM 500；c图为荧光壳聚糖纤维的光波导图；d图为FITC-荧光壳聚糖纤维的激发光谱和发射光谱。
如图1所示，荧光壳聚糖纤维生产制备的过程。荧光壳聚糖纤维的表征图如下，图1a荧光壳聚糖纤维的荧光显微镜图；图1b为SEM图，可见荧光壳聚糖纤维的直径大约在25微米左右；图1c为荧光壳聚糖纤维的光波导图。图1d为FITC-荧光壳聚糖纤维的激发光谱和发射光谱，从图中可以看出467nm和507nm是该材料的激发波长，而该材料的发射波长主要在532nm处。
实施例2
将实施例1制备的荧光壳聚糖纤维从质量分数为2％的NaOH碱液中捞出放入200微升的乙二醇二缩水甘油醚中并将其放置在室温下反应12个小时，得到环氧修饰的荧光壳聚糖纤维。将环氧修饰的荧光壳聚糖纤维与60μL的浓度为10μM的5’端带有氨基修饰的DNA探针probe1反应，在37℃反应6个小时，得到probe1修饰的荧光壳聚糖纤维。
如图2所示，probe1修饰到DITC-荧光壳聚糖纤维上。图2a是probe1修饰到荧光壳聚糖纤维上的图示过程。图2b为，修饰上环氧后接入DNA探针probe1的荧光壳聚糖纤维的红外光谱，i代表表面接上环氧的荧光壳聚糖纤维的红外光谱，ii代表接上probe1后的红外光谱，多出来的峰如895，1256，1324，1423处等为DNA的特征峰。
以上所有的DNA探针都是从上海生工生物公司购得。
实施例3
由于probe2探针与probe1探针部分互补配对，根据碱基互补配对原则，将5‘端修饰有BHQ1淬灭剂的probe2探针与实施例2制得的接上probe1的荧光壳聚糖纤维在95℃退火10分钟，然后自然冷却至37℃，在37摄氏度时恒温进行杂交4小时。杂交所使用的缓冲溶液为TAE缓冲溶液。反应完成后，用针管从溶液中挑出淬灭后的荧光壳聚糖纤维，用1*TAE缓冲溶液轻轻地冲洗纤维数次，除去吸附的BHQ1-probe2。杂交后probe2的5’端的BHQ1淬灭基团的距离缩至10nm以下，通过荧光共振能量转移(FRET)使荧光壳聚糖纤维上的绿色荧光淬灭。
如图3所示，BHQ1-probe2修饰荧光壳聚糖纤维后的光波导荧光变化。图3a为，荧光壳聚糖纤维-probe1和BHQ1-probe2杂交后，荧光壳聚糖纤维端头荧光淬灭过程。图3b为光波导方法下，同一根荧光壳聚糖纤维在于probe2探针退火杂交前的端头荧光亮度明显高于淬灭后的，由此可见probe2探针上BHQ1基团对荧光壳聚糖纤维的荧光淬灭成功。图3b可以看出，在进行probe1和probe2探针的杂交以后，荧光壳聚糖纤维的端头荧光亮度明显变暗，荧光得到淬灭。
实施例4
将实施例1-3制备的BHQ1@荧光壳聚糖纤维放入具有100nM的H1，400nM的H2以及不同梯度浓度的miRNA-198溶液的离心管中。37℃反应4个小时，1*TAE缓冲液(pH＝8.4)清洗后进行光波导荧光变化的检测，见图3。同时通过PAGE凝胶电泳来验证CHA放大体系探针的可行性。在BHQ1-荧光壳聚糖纤维体系，由450nm光激发后，纤维端头荧光微弱，当加入检测的miRNA-198后以及CHA循环放大体系以后，微米管端头荧光增强。b图为，CHA循环放大体系探针可行性验证，凝胶电泳的方法对其进行验证，结果如图4b所示，在target存在的情况下，会使H1和H2探针形成大量的双链结构。
实施例5
首先配置含有100nM H1，400nM H2的1*TAE缓冲溶液(PH＝8.4)中，并向该缓冲液中加入不同浓度的目标microRNA-198，使它们在37℃反应1小时随后将实施例4制备好的BHQ1@荧光壳聚糖纤维放入含100nM的H1，400nM的H2，不同浓度的microRNA-198的溶液。反应4个小时以后，反应结束，用1*TAE缓冲液(pH＝8.4)冲洗荧光壳聚糖纤维，将荧光壳聚糖纤维表面黏附的DNA分子清除，通过光波导手段来对荧光壳聚糖纤维端头荧光强度的变化进行测量。以miRNA-198浓度为横坐标，以微米管光波导荧光亮度变化为纵坐标作图。在此过程中，miRNA-198作为反应的催化剂。此过程可提高荧光壳聚糖纤维传感器检测目标分子的灵敏度，降低反应极限。图4为在BHQ1-荧光壳聚糖纤维体系中，加入不同浓度的miRNA-198溶液，浓度由30fM到1pM，荧光壳聚糖纤维端头荧光逐渐恢复。随着检测miRNA-198的浓度逐渐增加，荧光壳聚糖纤维端头荧光亮度逐渐增强。从30fM到1000fM的浓度范围内，荧光壳聚糖纤维端头荧光变化和miRNA-198的浓度成正比。
如图5所示，将淬灭后的荧光壳聚糖纤维放入含有H1，H2以及不同浓度的miRNA-198中，端头光波导荧光变化，及检测极限示意图。在BHQ1-荧光壳聚糖纤维体系中，加入不同浓度的miRNA-198溶液，浓度由1pM到30fM，微米管端头荧光逐渐恢复。并发现，荧光壳聚糖纤维端头荧光变化和miRNA-198的浓度成比例关系。
实施例6
分别用单碱基突变的miRNA-198，三碱基突变的miRNA-198，miRNA-21以及miRNA-34A作为目标microRNA，将它们加入1*TAE缓冲液中，其中含有100nM的H1，400nM的H2以及200fM的目标miRNA中进行CHA循坏放大反应，发现只有加入miRNA-198时微米管端头光波导荧光变化强烈，说明荧光壳聚糖纤维对miRNA-198具有高特异性。如图6所示，分别用单碱基突变的miRNA-198,三碱基突变的miRNA-198,miRNA-21以及miRNA-34A作为目标microRNA,将它们以相同的浓度加入含有100nM的H1，400nM的H2的缓冲溶液中进行CHA循坏放大反应。从图6可以看出该体系对miRNA-198的特异性还是较强的。
SEQUENCE LISTING
Figure BDA0003058483930000081
Figure BDA0003058483930000091
需要说明的是，按照本发明上述各实施例，本领域技术人员是完全可以实现本发明独立权利要求及从属权利的全部范围的，实现过程及方法同上述各实施例；且本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。
以上所述，仅为本发明部分具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种荧光壳聚糖纤维的制备方法，其特征在于：将荧光染料异硫氰酸荧光素溶解于二甲亚砜中制备混合液，将壳聚糖溶解于三氟乙酸中制备混合液，待各自溶解完全以后，将上述两种混合液再混合，机械搅拌均匀，通过手工拉丝的方法产出纤维，生产出来的纤维在碱性条件下反应，使异硫氰酸荧光素与壳聚糖充分反应，完成荧光壳聚糖纤维的制备。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述荧光染料异硫氰酸荧光素与所述壳聚糖的质量比为（1：250）~（1：300）。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述荧光染料异硫氰酸荧光素与所述壳聚糖的质量比为1：300。
4.一种非诊断目的的检测miRNA-198的方法，其特征在于：
步骤一、将单链DNA探针probe1修饰到根据权利要求1所述的方法制备的荧光壳聚糖纤维上：将碱性条件下反应超过24小时的荧光壳聚糖纤维加入到乙二醇二缩水甘油醚中，在室温下反应12-16个小时，然后将反应好的荧光壳聚糖纤维继续加入5’端带有氨基的单链DNA探针probe1中于32℃-37℃反应6-12小时得到probe1修饰的荧光壳聚糖纤维；
步骤二、将带有荧光淬灭基团BHQ1的DNA探针probe2修饰到荧光壳聚糖纤维上进行荧光淬灭：所述probe2与所述probe1部分碱基互补配对，通过DNA的链杂交反应将接有淬灭基团BHQ1的probe2修饰到荧光壳聚糖纤维上根据荧光共振能量转移原理进行荧光淬灭；
步骤三、将淬灭后的荧光壳聚糖纤维与CHA反应所需的发夹探针H1,发夹探针H2以及含有目标miRNA-198的样品混合，检测荧光淬灭后的荧光壳聚糖纤维端头光波导荧光亮度的变化；miRNA-198作为催化剂通过toehold催化发夹探针H1、发夹探针H2形成双链结构，形成的双链通过toehold替换下BHQ1-ssDNA2，使微米管端头光波导荧光恢复；
步骤四、将单碱基突变，三碱基突变，以及其他种类的microRNA放置于CHA链置换反应中，来反映探针组对miRNA-198的特异性；所述其他种类的microRNA包括miRNA-21和miRNA-34A；所述探针组包括发夹探针H1和发夹探针H2，所述发夹探针H1的序列如SEQ ID NO：3所示；所述发夹探针H2的序列如SEQ ID NO：4所示，发夹探针H1和发夹探针H2会形成发夹结构，在目标miRNA-198的存在下会催化两个发夹探针装配成双链，形成双链的探针会将杂交成双链的probe1和probe2分开。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述probe2的序列如SEQ ID NO：1所示；所述probe1的序列如SEQ ID NO：2所示。
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