CN109789156A - miR-198在治疗和诊断皮肤鳞状细胞癌中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过施用一种或多种包含miR‑198的序列(SEQ ID NO:1)或其功能部分的寡核苷酸或降低卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ‑2(LAMC2)或尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)表达的寡核苷酸来治疗癌的方法。优选地，针对FSTL1、DIAPH1、LAMC2或PLAU的至少一种或多种寡核苷酸是shRNA或siRNA。还提供了确定受试者中癌的存在的方法，其包括检测和比较miR‑198和/或FSTL1、DIAPH1、LAMC2或PLAU、miR‑181a、表皮生长因子(EGF)和表皮生长因子受体(EGFR)中的至少一种的存在，并将检测到的水平与对照样品中的水平进行比较。

Description

miR-198在治疗和诊断皮肤鳞状细胞癌中的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年6月14日提交的新加坡临时申请号10201604845W的优先权的权益，其内容在此通过引用以其整体并入用于所有目的。
发明领域
本发明一般涉及生物化学领域。具体而言，本发明涉及可用于治疗癌的mi-RNA、抗miRNA和多肽。
背景技术
癌例如鳞状细胞癌(SCC)是由鳞状细胞(一种上皮细胞亚型)的不受控制的生长引起的。另一个实例——头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)从上呼吸消化道的粘膜衬里发展而来，主要发生在鼻腔、鼻旁窦、鼻咽、喉、气管、口咽和口腔。头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是全球发病率第六高的癌症，40％至50％的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)患者的中位生存率仅为5年。具有高转移率的侵袭性疾病进展导致患者存活率低。因此，鉴定靶向癌转移的疗法在癌例如头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的管理中具有临床意义。因此存在找到靶向和治疗癌症例如上皮癌的方法的需求。
发明内容
一方面，本发明涉及治疗癌的方法，其中该方法包括施用i)一种或多种包含miR-198的序列(SEQ ID NO:1)、其功能部分或其组合或者由miR-198的序列(SEQ ID NO:1)、其功能部分或其组合组成的寡核苷酸；和/或ii)至少一种降低任何一种或多种下列靶蛋白表达的寡核苷酸：卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(Protein diaphanoushomolog,DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)或尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)。
另一方面，本发明涉及确定受试者中癌的存在或不存在的方法，其中该方法包括检测从受试者获得的样品中miR-198的存在或不存在；和/或检测所述样品中至少一种或多种靶蛋白的存在或不存在；并将检测到的miR-198水平与对照样品中检测到的miR-198水平进行比较；和/或将检测到的所述至少一种或多种靶蛋白的水平与对照样品中检测到的所述至少一种或多种靶蛋白的水平进行比较，其中所述至少一种或多种靶蛋白选自由以下组成的组：卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)、尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)及其组合。
在又一个实例中，本发明涉及确定受试者中癌的存在或不存在的方法，其中该方法包括a.检测样品中miR-198的不存在或存在；和b.将检测到的miR-198水平与对照样品中检测到的miR-198水平进行比较；和/或c.检测所述样品中至少一种或多种生物标志物的存在或不存在；和d.将检测到的所述至少一种或多种生物标志物的水平与对照样品中检测到的所述至少一种或多种生物标志物的水平进行比较；其中所述至少一种或多种生物标志物选自由以下组成的组：miR-181a、表皮生长因子(EGF)和表皮生长因子受体(EGFR)或其组合。
在另一个实例中，本发明涉及包含至少一种或多种本文公开的寡核苷酸的药物组合物。
在一个实例中，本发明涉及治疗癌的方法，其中所述方法包括施用一种或多种包含miR-198的序列(SEQ ID NO:1)、其功能部分或其组合或者由miR-198的序列(SEQ ID NO:1)、其功能部分或其组合组成的寡核苷酸以及任何一种或多种以下靶蛋白的表达抑制剂：卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)或尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)；其中所述表达抑制剂选自由以下组成的组：siRNA、shRNA和RNAi。
在另一个实例中，本发明涉及使用靶向一种或多种以下蛋白质的表达的siRNA和/或shRNA来治疗癌的方法：卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1；SEQ ID NO:3)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1；SEQ ID NO:4)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2；SEQ ID NO:5)和尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU；SEQ ID NO:6)。
在又一个实例中，本发明涉及如本文所定义的至少一种或多种寡核苷酸在制备用于治疗癌的药物中的用途。
附图说明
当结合非限制性实施例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明，其中：
图1显示了显示皮肤SCC中的缺陷分子开关的数据。a)显示在正常皮肤(n＝5)中分别通过原位杂交(左图)和免疫组织化学(右图)检测的miR-198和FSTL1蛋白的表达结果。b)在SCC患者样品中通过原位杂交检测的miR-198的表达(上图)和FSTL1蛋白的免疫组织化学定位(下图)(n＝73)；比例尺：100μM。
图2显示了显示促侵袭性分子miR-198靶基因的表达增强癌细胞侵袭的数据。a)KRT14、PLAU、LAMC2和DIAPH1对正常皮肤和SCC患者样品的免疫荧光染色。与正常皮肤(左栏)相比，在所有SCC患者样品中清楚地观察到靶基因的蛋白质表达的显著增加(n＝73)。b)SCC患者样品和正常皮肤中c-MET的免疫组织化学(n＝73)。c)用非靶向siRNA或针对DIAPH1、LAMC2和PLAU的siRNA转染的SCC12上的Boyden室侵袭测定。用吉姆萨(Giemsa)染色检测迁移细胞的代表性图像。从六个独立的视野计数细胞，直方图表示侵袭细胞的相对数量。**P<0.001误差棒代表s.d。d)用表达对照shRNA或针对LAMC2、DIAPH1和PLAU的shRNA的SCC12细胞进行的器官型侵袭测定。通过针对KRT14的免疫组织化学检测SCC12细胞(红色)。计数侵袭真皮基质的细胞数，并以侵袭细胞的相对百分比作图。**P<0.001误差棒表示标准偏差(s.d.)
图3呈现了显示促侵袭性FSTL1增强癌侵袭的数据。a)用对照siRNA(左图)或针对FSTL1的siRNA(右图)转染的SCC12细胞进行Boyden室测定。用吉姆萨染色检测迁移细胞的代表性图像。b)从六个独立视野计数细胞，直方图代表侵袭细胞的相对数量。c)使用用对照shRNA或针对FSTL1的shRNA转导的SCC12细胞进行器官型侵袭测定。切片针对KRT14(红色)和CSPG4或FSTL1(绿色)染色。与对照相比，用针对FSTL1的shRNA处理的SCC12细胞显示出对凝胶的侵袭减少。d)直方图显示了侵袭细胞的数量的定量。**P<0.001误差棒表示s.d。e)条带强度的定量形成三个独立的实验，表示为直方图。**P<0.001误差棒代表s.d。f)用来自用对照shRNA或针对FSTL1的shRNA转导的SCC12细胞的等量细胞培养上清液进行明胶酶谱。g)在正常皮肤切片或SCC患者组织上MMP9(上图)和CSPG4(下图)的免疫组织化学检测(n＝73)。
图4显示了描述两种RNA结合蛋白之间的相互作用如何控制FSTL1表达的命运的数据。a)正常皮肤和SCC患者样品上KSRP的免疫荧光染色。与正常皮肤(左栏)相比，所有患者样品中观察到的KSRP蛋白表达显著降低。b)代表用EGF或对照处理的角质形成细胞中miR-181a相对转录物丰度的直方图(n＝3)。c)代表用对照或抗miR-181a寡核苷酸处理的SCC12细胞中的miR-181a相对转录物丰度的直方图(n＝3)。使用学生t-检验计算P值。误差棒表示平均值±s.e.m(*[P<0.05]、**[P<0.001])。d)用对照或抗miR-181a转染的SCC12细胞上的KSRP、FSTL1和β-肌动蛋白的蛋白质印迹检测。e)代表用对照或抗miR-181a寡核苷酸处理的SCC12细胞中miR-198相对转录物丰度的直方图(n＝3)。使用学生t-检验计算P值。误差棒表示平均值±s.e.m.*[P<0.05]。f)在正常皮肤(左图)(n＝5)和SCC组织样品(n＝73)上对成熟miR-181a特异性的LNA探针进行的原位杂交。miR-198染成红色，细胞核染成蓝色。g)正常皮肤和SCC患者样品上HuR的免疫荧光染色。与正常皮肤(左栏)相比，在所有患者样品中观察到HuR蛋白表达的显著增加(n＝73)。h)RNA-凝胶阻滞测定显示HuR与前-miR-198转录物环中的富AU基序的结合(左图)和与缺乏富U基序的突变体前体的结合的消除(右图)。i)用非靶向siRNA或针对KSRP或HuR的siRNA转染的SCC12细胞中的KSRP、HuR、FSTL1和β-肌动蛋白的蛋白质印迹检测(n＝3)。J)嵌合萤光素酶报告物构建体和对照GFP cRNA在来自用对照siRNA或针对HuR或KSRP的siRNA转导的SCC12细胞的胞质提取物存在下进行体外翻译。
图5显示了在SCC12细胞中使用特异性siRNA或shRNA下调miR-198靶基因的结果。a)代表用对照非靶向siRNA或针对DIAPH1、PLAU或LAMC2的基因特异性siRNA转染的SCC12细胞中的DIAPH1、LAMC2和PLAU转录物丰度的直方图(n＝3)**P<0.001。b)代表用对照shRNA或针对DIAPH1、PLAU或LAMC2的shRNA转导的SCC12细胞中的DIAPH1、LAMC2和PLAU转录物丰度的直方图(n＝3)。使用学生t-检验来计算P值。误差棒表示平均值±s.e.m.**P<0.001。
图6显示支持FSTL1在SCC中是促侵袭和促炎的数据。a)代表用对照非靶向siRNA或shRNA或针对FSTL1的基因特异性siRNA或shRNA转染的SCC12细胞中的FSTL1转录物丰度的直方图(n＝3)。使用学生t检验来计算P值。误差棒表示平均值±s.e.m.**P<0.001。b)来自用对照非靶向shRNA或针对FSTL1的shRNA转染的SCC12细胞的微阵列数据的所选基因的基因表达值，其表示为热图。以线性标度相对于基因的个体平均值以红色(低)或蓝色(高)的阴影显示表达值。c)代表从微阵列鉴定并通过qRT-PCR验证的所选基因的相对转录物丰度(对照对比FSTL1敲减)的直方图(n＝3)。结果显示与微阵列数据显著相关。使用学生t检验来计算P值，误差棒表示平均值±s.e.m.*P<0.05，**P<0.001。
图7显示了强调SCC中存在缺陷分子开关的数据。A)转录物的示意图，所述转录物以背景特异性方式起FSTL1mRNA或初级miR-198转录物的作用。B)在正常皮肤(n＝5)、CSCC(n＝73)和HNSCC(n＝64)组织切片上通过原位杂交(上图)和FSTL1蛋白的免疫组织化学定位(下图)检测的miR-198的表达。miR-198染成红色，细胞核染成蓝色(上图)。FSTL1染成棕色，细胞核染成蓝色(下图)。C)正常皮肤和SCC组织切片上KSRP的免疫荧光染色。与正常皮肤(n＝5)相比，在CSCC(n＝73)和HNSCC(n＝64)组织切片(上图)中观察到KSRP蛋白表达的显著降低。在正常皮肤(n＝5)、CSCC(n＝73)、HNSCC(n＝64)组织切片(下图)上用对成熟miR-181a特异性的LNA探针进行原位杂交。比例尺-100μM。D)用对照或抗miR-181a转染的SCC细胞上的KSRP、FSTL1和β-肌动蛋白的蛋白质印迹检测。E)代表用对照或抗miR-181a寡核苷酸处理的SCC细胞中miR-198相对转录物丰度的直方图。使用学生t检验来计算P值。误差棒表示平均值±s.e.m.*[P<0.05]
图8显示支持EGF驱动的微环路劫持分子开关的数据：A)通过免疫组织化学在正常皮肤(n＝5)、CSCC(n＝73)和HNSCC(n＝64)组织切片中检测TGF-β1配体(上图)、EGF配体(中图)和EGFR(下图)。比例尺-上图为50μM，中图和下图为100μM。B)代表用单独的EGF或EGF和PD153035(EGFR酪氨酸激酶的选择性抑制剂)处理的SCC12细胞中的miR-181a转录物丰度的直方图。C)来自用单独的EGF或EGF和PD153035处理的SCC细胞裂解物的KSRP、FSTL1和β-肌动蛋白的蛋白质印迹检测。D)代表用单独的EGF或EGF和PD153035处理的SCC细胞中的miR-198转录物丰度的直方图。使用学生t检验来计算P值。误差棒表示平均值±s.e.m.(*[P<0.05]，**[P<0.001])。E)EGF驱动的微环路的示意图，其劫持分子开关。
图9提供了显示FSTL1和DIAPH1增强SCC细胞迁移和侵袭的数据。A)正常皮肤和SCC组织切片上DIAPH1的免疫荧光染色。在没有miR-198的情况下，与正常皮肤相比，在CSCC(n＝73)和HNSCC(n＝64)患者样品中清楚地观察到DIAPH1的显著增加。比例尺-100μM。B)使用鬼笔环肽缀合的TRITC可视化的具有对照shRNA或针对FSTL1或DIAPH1的shRNA的SCC细胞的形态(上图)。与对照细胞相比，FSTL1或DIAPH1的敲减显示出形态上的显著差异。在对照、shFSTL1和shDIAPH1细胞中在24小时的时间段内细胞轨迹位移的快照(下图)。C)对照、shFSTL1和shDIAPH1细胞中细胞位移的分析。使用Dunnett多重校正检验的单因素方差分析(ANOVA)来计算组间的统计学显著性。*P<0.05**P<0.01。D)用表达对照shRNA或针对FSTL1或DIAPH1的shRNA的SCC12细胞进行的器官型侵袭测定。通过KRT14染色(红色)检测SCC12细胞。E)对侵袭基质的细胞数进行计数并绘制为直方图**P<0.001误差棒代表s.d.。
图10提供了显示FSTL1和DIAPH1促进转移性定殖的数据。A)通过单独或组合地表达萤光素酶报告物和对照shRNA或针对FSTL1或DIAPH1的shRNA的A253细胞进行的全身性转移的生物发光成像(n＝7)。B)通过HNSCC细胞对肺转移的生物发光定量。C)在第26天提取肺并对KRT5表达进行染色，并显示肺转移集落的代表性图像。D)肺切片中转移灶总数的代表**P<0.001。
图11提供了显示协同基因对：FSTL1-DIAPH1的预后意义的数据。A)262名患者中FSTL1和DIAPH1表达的散点图。基于二维数据驱动的分组(2D-DDg)方法将患者分为四个区段。B)小组显示各个区段A、B、C和D的Kaplan Mayer存活曲线(A：既没有DIAPH1表达也没有FSTL1表达的患者，B：仅具有较高的DIAPH1表达的患者，C：仅具有较高的FSTL1表达的患者，D：表达FSTL1和DIAPH1二者的患者组)。通过对数秩检验评估统计学显著性。C)如曲线A所示的262名患者中的FSTL1和DIAPH1表达的散点图，针对三个区段ABC的共同的颜色编码分组为低风险。D)低风险患者(对应于区段ABC)和高风险患者(对应于区段D)的Kaplan-Meier存活曲线。通过对数秩检验评估统计学显著性(P＝0.000061)。
图12提供了数据，显示DIAPH1和FSTL1在机制上如何通过分别螯合ARPIN和Wnt7a促进转移：A)DIAPH1的所选候选相互作用配偶体的列表，其基于肽覆盖率从BioID中筛选列出。B)来自对照或shDIAPH1细胞的SCC细胞裂解物用抗DIAPH1抗体进行免疫沉淀，并通过蛋白质印迹分析针对ARPIN探测免疫沉淀物(上图)。针对ARPIN(中图)和DIAPH1(下图)探测输入(input)细胞裂解物。C)用抗ARPIN抗体对来自对照或shDIAPH1细胞的A253细胞裂解物进行免疫沉淀，并通过蛋白质印迹分析针对Arp3探测免疫沉淀物(上图)。针对Arp3(中图)和β-肌动蛋白(下图)探测输入细胞裂解物。D)表示为热图的来自用对照非靶向shRNA或针对FSTL1的shRNA转染的SCC12细胞的微阵列数据的所选基因的基因表达值。相对于线性标度中基因的个体平均值，表达值以红色(高)或蓝色(低)的阴影显示。E)用来自用对照shRNA或针对FSTL1的shRNA转导的A253细胞的等量细胞培养上清液进行明胶酶谱。条带强度的定量形成三个独立的实验，表示为直方图(上图)。**P<0.001误差棒代表s.d.。F)对照或shFSTL1A253细胞用30ng/ml的EGF预处理。直方图表示这些样品中MMP9的相对转录物丰度。**P<0.001误差棒代表s.e.m.。G)来自对照或EGF预处理细胞的A253细胞裂解物的蛋白质印迹分析。针对磷酸化ERK或总ERK探测裂解物。H)用IgG或抗FSTL1抗体对A253细胞裂解物进行免疫沉淀，并通过蛋白质印迹分析针对Wnt7a探测免疫沉淀物和输入裂解物。I)用针对Wnt7a的特异性siRNA对用对照或shFSTL1转导的A253细胞进行转染。转染后，用EGF处理细胞以刺激ERK磷酸化。通过蛋白质印迹分析针对磷酸化ERK或总ERK探测细胞裂解物。
图13是EGF驱动的微环路如何劫持分子开关，并引导双分叉途径转向转移的示意图：描述EGF劫持miR-198/FSTL1分子开关的模型，EGF限制miR-198的表达，允许持续表达FSTL1。这导致双分叉途径转向转移。
图14显示了显示微小RNA miR-181a靶向KSRP的数据。A)KSRP mRNA(NM_003685)中的miR-181a结合位点。B)显示直方图，其代表用对照或抗miR-181a寡核苷酸处理的SCC12细胞中miR-181a相对转录物丰度。使用学生t检验来计算P值。误差棒表示平均值+s.e.m**P<0.001。
图15显示了显示FSTL1和DIAPH1是促侵袭的数据。A)用非靶向siRNA或针对FSTL1的基因特异性siRNA转染的SCC细胞中FSTL1的相对转录物丰度。B)对这些细胞的Boyden室侵袭测定显示，与对照细胞相比，siFSTL1中侵袭室基质的细胞数量显著减少。用吉姆萨染色检测迁移细胞的代表性图像。C)从六个独立的视野计数细胞，直方图代表侵袭细胞的相对数量。**P<0.001误差棒代表s.d.。D)用非靶向siRNA或针对DIAPH1的基因特异性siRNA转染的SCC细胞中DIAPH1的相对转录物丰度。E)对这些细胞的Boyden室侵袭测定显示，与对照细胞相比，在siDIAPH1中侵袭室基质的细胞数量显著减少。用吉姆萨染色检测迁移细胞的代表性图像。F)从六个独立的视野计数细胞，直方图代表侵袭细胞的相对数量。**P<0.001；误差条代表s.d.。
图16显示了对FSTL1和DIAPH1的敲减效率的评估结果。直方图代表用对照shRNA或针对FSTL1或DIAPH1的shRNA转导的SCC12细胞中的FSTL1(左图)和DIAPH1(右图)转录物丰度。使用学生t检验来计算P值。误差棒表示平均值±s.e.m.**P<0.001。
图17显示了BioID的靶蛋白的生物素化数据。用表达DIAPH1开放阅读框的pTRIPZ载体瞬时转染293T细胞，该开放阅读框在tet诱导系统下与BirA*-myc标签在N-末端融合。转染后，用单独的生物素(50μM)或单独的10μg/ml的Dox或两者处理细胞。使用抗myc抗体，后接与Alexa-488偶联的物种特异性次级抗体探测BirA*-DIAPH1融合蛋白表达。使用与Alexa-555缀合的链霉抗生物素蛋白检测靶蛋白的生物素化。
图18显示了总结微阵列数据验证结果的柱状图。直方图代表从微阵列(图12d)鉴定并通过qRT-PCR验证的所选基因的相对转录物丰度(对照对比FSTL1敲减)。结果显示与微阵列数据显著相关。使用学生t检验来计算P值，误差棒表示平均值±s.e.m.*P<0.05，**P<0.001。
图19显示了BioGRID网络分析的示意性快照。这是来自BioGRID版本3.4.134的预测与FSTL1蛋白相互作用的蛋白质的快照，显示26个独特的相互作用配偶体。
图20显示柱状图，显示使用基因特异性siRNA敲减WNT7a的结果。用非靶向对照siRNA或针对WNT7A的基因特异性siRNA转染表达对照shRNA或shFSTL1的SCC细胞。描绘的是代表WNT7A mRNA的相对转录物丰度的直方图。使用学生t检验来计算P值。误差棒表示平均值±s.e.m.**P<0.001。
图21显示EGF驱动的微环路如何劫持伤口愈合开关。A)显示转录物的示意图，所述转录物以背景特异性方式起FSTL1mRNA或初级miR-198转录物的作用。B)在正常舌(n＝5)和HNSCC(n＝64)组织切片上通过原位杂交(上图)和FSTL1蛋白的免疫组织化学定位(下图)检测的miR-198的表达。miR-198染成红色，细胞核染成蓝色(上图)。FSTL1染成棕色，细胞核染成蓝色(下图)。C)代表通过qRT-PCR测量的用EGF处理的A253细胞中miR-198的相对转录物丰度的直方图。D)使用FSTL1和KSRP特异性抗体对用EGF处理的A253细胞进行的免疫细胞化学染色。E)KSRP mRNA(NM_003685)中的miR-181a结合位点。F)代表通过qRT-PCR测量的用EGF处理的A253细胞中miR-181a的相对转录物丰度的直方图。G)正常舌(n＝5)和HNSCC(n＝64)组织切片上的KSRP的免疫荧光染色(上图)。与正常舌相比，在HNSCC组织切片中观察到KSRP蛋白质表达的显著降低。在正常舌(n＝5)和HNSCC(n＝64)组织切片上用对成熟miR-181a特异的LNA探针进行原位杂交(下图)。H)用对照或抗miR-181a转染的SCC细胞上的KSRP、FSTL1和β-肌动蛋白的蛋白质印迹检测。I)代表用对照或抗miR-181a寡核苷酸处理的SCC细胞中的miR-198相对转录物丰度的直方图。使用学生t检验来计算p值。误差棒表示平均值±s.e.m.*[p<0.05]。比例尺：100μM。J)劫持分子开关的EGF驱动的微环路的示意图。
图22显示缺陷开关是促侵袭的。A)正常舌和HNSCC组织切片上DIAPH1的免疫染色。与正常舌组织相比，在HNSCC(n＝64)组织切片中清楚地观察到DIAPH1表达的显著增加。比例尺：100μM。B)miR-198和DIAPH1在HNSCC组织样品中的表达模式表明明显的逆相关。C、D)Boyden室侵袭测定显示与对照细胞相比，在siDIAPH1或siFSTL1中侵袭室基质的细胞数量显著减少。用吉姆萨染色检测迁移细胞的代表性图像。从六个独立的视野计数细胞，下面的直方图代表侵袭细胞的相对数量。**P<0.001误差棒代表s.d.。E)使用鬼笔环肽缀合的TRITC显现的用对照shRNA或针对FSTL1或DIAPH1的shRNA转导的SCC细胞的形态(上图)。与对照细胞相比，FSTL1或DIAPH1的敲减显示出形态上的显著差异(上图)。描述了在对照、shFSTL1和shDIAPH1细胞中，在24小时的时间段内细胞轨迹位移的快照(下图)。F)对照、shFSTL1和shDIAPH1细胞中细胞位移的分析。使用Dunnett多重校正检验的单因素方差分析(ANOVA)来计算组间的统计学显著性。*P<0.05**P<0.01。G)用表达对照shRNA或针对FSTL1或DIAPH1的shRNA的SCC12细胞进行的器官型侵袭测定。通过KRT14染色(红色)检测SCC12细胞。
图23显示了描述FSTL1-DIAPH1基因对的预后意义的数据。A)显示了单独或组合地表达萤光素酶报告物和对照shRNA或针对FSTL1或DIAPH1的shRNA的A253细胞的全身转移的生物发光成像的结果(n＝7)。B)显示肺切片中转移灶总数的代表**P<0.001。C)显示了显示在第26天提取并对KRT5表达染色的肺的图像，并显示肺转移集落的代表性图像。D)显示在262名患者中测定的FSTL1和DIAPH1表达的散点图，将该262名患者基于2D-DDg方法分类为四个不同的区段a、b、c和d。E)各个区段的Kaplan-Meier存活曲线。F)通过两组的对数秩检验具有统计学显著性的Kaplan-Meier存活曲线，其中患者被分组为低风险(区段a、b和c)和高风险(区段d)。
图24显示EGF驱动的微环路引导双分叉途径转向转移。A)提供从BioID数据库中筛选列出的的DIAPH1的所选相互作用配偶体的列表。B)显示下拉分析(pull-down analysis)的结果。在用抗DIAPH1抗体免疫沉淀(IP)后，通过蛋白质印迹分析针对Arpin的存在探测来自SCC12对照或shDIAPH1细胞的细胞裂解物(上图)。针对Arpin(中图)和DIAPH1(下图)探测输入细胞裂解物。C)显示进一步下拉分析的结果。在用抗Arpin抗体进行免疫沉淀(IP)后，通过蛋白质印迹分析针对Arp3探测来自SCC12对照或shDIAPH1细胞的细胞裂解物(上图)。针对Arp3(中图)和β-肌动蛋白(下图)探测输入细胞裂解物。D)显示表示为热图的来自用对照非靶向shRNA或针对FSTL1的shRNA转染的SCC12细胞的微阵列数据的所选基因的基因表达值。相对于线性标度中基因的个体平均值，表达值以红色(高)或蓝色(低)的阴影显示。E)显示明胶酶谱的结果，以评估通过聚合酶基因电泳分离的蛋白质的蛋白水解活性。条带强度的定量表示为直方图(上图)。**P<0.001。误差棒表示标准偏差(s.d.)。F)显示来自对照或EGF预处理细胞的A253细胞裂解物的蛋白质印迹分析结果。针对磷酸化ERK或总ERK探测裂解物。G)显示直方图，其代表用EGF处理的A253细胞中对照或shFSTL1中MMP9的相对转录物丰度[**P<0.001]。H)显示A253细胞裂解物的结果，A253细胞裂解物用IgG或抗FSTL1抗体进行免疫沉淀。通过蛋白质印迹分析针对Wnt7a探测免疫沉淀物以及输入裂解物。I)显示用针对Wnt7a的特异性siRNA转染的shFSTL1细胞的结果。在转染后用EGF处理细胞，并通过蛋白质印迹分析针对磷酸化ERK或总ERK探测细胞裂解物。J)显示了一个示意图，其在不受理论的束缚下图示说明了EGF劫持miR-198/FSTL1分子开关，导致双分叉途径转向转移的一种模型机制。
具体实施方式
癌例如鳞状细胞癌(SCC)是由鳞状细胞(一种上皮细胞亚型)的不受控制的生长引起的。例如，头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)从上呼吸消化道的粘膜衬里发展而来，主要发生在鼻腔、鼻旁窦、鼻咽、喉、气管、口咽和口腔。
本文公开的分子开关基于这样的概念：细胞的状态不仅可以影响特定基因的表达水平，而且还可影响所述基因表达什么样的产物。作为解释，在一个实例中，基因FSTL1可以产生促迁移FSTL1蛋白或抗迁移miR-198，这取决于细胞的状态。例如，显示癌细胞具有增加水平的FSTL1蛋白，其本身被理解为导致癌细胞的促迁移行为。相反，无癌细胞被理解为表达更高水平的miR-198，这有助于在大多数疾病/无癌(换句话说，健康)细胞中观察到的非迁移行为。因此，一种可能的治疗方法是将患病细胞的状态转变为类似于无病细胞的状态，从而靶向各种靶标的调节途径，所述靶标例如但不限于本文公开的任何靶蛋白或本文公开的RNA靶标。
本文公开了分子开关，其在伤口愈合中是必需的，但在鳞状细胞癌(SCC)中被劫持或错误调节。在一个实例中，癌症由细胞组成，其中分子开关包括但不限于伤口愈合中涉及的基因和/或核酸。在一个实例中，所述基因是但不限于编码卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)的基因、编码蛋白质透明同源物1(DIAPH1)的基因、编码层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)的基因、编码尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)的基因及其组合。在另一个实例中，所述分子开关包括miR-198。在另一个实例中，所述分子开关包括miR-198和基因，其是但不限于卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)或尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)。在又另一个实例中，所述分子开关包括基因卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)和第二基因，其是但不限于miR-198、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)或尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)。在另一个实例中，所述分子开关包括基因卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、miR-198和第三基因，其是但不限于蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)或尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)。
本申请表明，缺陷开关的矫正导致例如鳞状细胞癌(SCC)的侵袭性质的降低，表明这是治疗癌的策略。因此，在一个实例中，本文公开了治疗癌的方法，其中所述方法包括施用至少一种或多种寡核苷酸和/或至少一种或多种RNA分子，其中所述一种或多种寡核苷酸在序列上与miR-198的核酸序列或其功能部分是同源的。在另一个实例中，该方法如本文所公开，其中所述一种或多种RNA分子降低例如miR-198的RNA靶标的水平和/或抑制所述RNA靶标的基因表达。在一个实例中，所述一种或多种RNA分子是但不限于siRNA(小干扰RNA)、shRNA(短发夹RNA)、RNAi(干扰RNA)及其组合。在另一个实例中，所述一种或多种RNA分子是shRNA或siRNA。在又另一个实例中，所述siRNA包含一个或多个由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10及其组合组成的序列。在另一个实例中，所述一种或多种RNA分子是针对FSTL1的shRNA，或针对一种或多种靶标的shRNA的组合。在另一个实例中，所述一种或多种RNA分子是针对FSTL1的siRNA，或针对一种或多种靶标的siRNA的组合。
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指单链或双链核酸聚合物。在某些实例中，包括多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰例如溴尿苷和肌苷衍生物、核糖修饰例如2′,3′-二脱氧核糖和核苷酸间键修饰，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioates)、苯胺磷酸酯(pliosphoro anilidates)和氨基磷酸酯。该术语包括单链和双链形式的DNA，以及单链和双链形式的RNA。寡核苷酸也可以指有义或反义寡核苷酸，这取决于使用该术语的上下文。
如本文所用，术语“siRNA”是指通过切割和加工双链RNA产生的单链RNA分子。siRNA的长度可以是21至25个核苷酸，但也可以更长或更短，因为在siRNA的长度方面，本领域没有惯例。siRNA结合例如mRNA或任何其它RNA靶标中的互补序列，并引起靶标例如mRNA的切割和降解。siRNA的其它功能是例如它们与DNA中的互补序列的结合并引起它们的甲基化。
如本文所用，术语“shRNA”是指短发夹RNA或小发夹RNA(shRNA/发夹载体)，其是具有紧密发夹转角的人工RNA分子，其可用于通过RNA干扰沉默靶基因表达。发夹转角，也称为茎环，是可以在寡核苷酸(例如DNA和RNA)中发生的分子内结构，并且是由于在DNA或RNA序列内发生的碱基配对模式所致。
如本文所用，术语“RNAi”是指RNA干扰，其是其中RNA分子通过中和靶向RNA分子(例如mRNA)来抑制基因表达或翻译的生物学过程。两种类型的核糖核酸(RNA)被认为落入术语RNAi，即miRNA(微小RNA)和siRNA(小干扰RNA)。
如本文所用，术语“功能性”当与寡核苷酸序列相关使用时，是指片段寡核苷酸以与野生型天然存在的对应物相同的方式模拟和起作用的能力。术语“功能性”还取决于要实现的功能。例如，当提到蛋白质(其也可以作为酶起作用)来说它的片段是功能性的时候，也就是说肽片段以与全长肽相同的方式起作用，尽管只是全长肽的片段。
在一个实例中，本文还公开了治疗癌的方法，其中该方法包括将一种或多种在序列上与miR-198的核酸序列(SEQ ID NO:1)或其功能部分同源的寡核苷酸与miR-198的RNA靶标的抑制剂一起施用，其中所述抑制剂选自由siRNA、shRNA和RNAi组成的组，其中所述RNA靶标选自由卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)、尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)及其组合组成的组。换句话说，本文公开了治疗癌的方法，其中所述方法包括施用A)一种或多种包含miR-198的序列(SEQ ID NO:1)、其功能部分或其组合或者由miR-198的序列(SEQ ID NO:1)、其功能部分或其组合组成的寡核苷酸；和/或B)至少一种降低任何一种或多种下列靶蛋白表达的寡核苷酸：卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)或尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)。
在另一个实例中，公开了使用针对SEQ ID NO:3、4、5和6中提供的卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)和/或蛋白质透明同源物1(DIAPH1)和/或层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)和/或尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)序列的任何部分及其组合的siRNA和/或shRNA治疗癌的方法。在一个实例中，所述治疗针对卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)的任何部分。在另一个实例中，所述治疗针对任何部分。在另一个实例中，所述治疗针对蛋白质透明同源物1(DIAPH1)的任何部分。在另一个实例中，所述治疗针对层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)的任何部分。在另一个实例中，所述治疗针对尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)的任何部分。
如本文所用，术语“经修饰的”是指化合物的改变，通常是化学的，以向化合物的化学结构添加或去除官能团。这种修饰通常涉及试剂或官能团与化合物的共价加成。相反，“未经修饰的”是指化合物没有从最常见的形式和/或在自然中或在标准条件下发现的形式化学改变的事实。这些修饰可以在蛋白质中找到，并且这些修饰包括但不限于酰化(例如豆蔻酰化、棕榈酰化)、异戊二烯化(isoprenylation)或异戊二烯化(prenylation)、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)、糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚添加、脂酰化、添加黄素部分(例如，FMN或FAD)、添加血红素基团、磷酸泛酰巯基乙胺化、亚视黄基席夫碱、糖基化、岩藻糖基化、烷基化、酰胺化、酰胺键形成、羟基化、磷酸酯(O-连接)或氨基磷酸酯(N-连接)形成、聚乙二醇化、生物素化、氨基甲酰化、氧化及其组合。在一个实例中，寡核苷酸是未经修饰的或经修饰的，其中一个或多个化学基团是2’O-甲氧基、硫代磷酸酯、锁核酸和胆固醇中的一种或多种。
不受理论束缚，本公开内容涵盖各种方法用于靶向和影响或改变靶基因的基因表达水平。如本文所公开的，基因表达的影响可以是例如靶基因或靶基因的任何下游产物的水平的增加或降低。
如本文所用，术语“增加”和“降低”是指与整个群体中存在的相同性状或特征相比较，在群体(例如细胞)的子集中在受试者中的所选性状或特征例如基因表达水平或蛋白质水平的相对改变。在一个实例中，在患病细胞和无病细胞之间进行比较。换句话说，在患病细胞和来自健康、无疾病的受试者的细胞之间进行比较。例如，表达水平的增加因此表示数值正标度的变化，而降低表示数值负标度的变化。如本文所用，术语“变化”还指分离的群体子集(例如，患病群体)的所选性状或特征与整个群体中的相同性状或特征或者在无病的健康群体中的相同性状或特征相比的差异。使用这些术语时没有看到差异的估算。因此，在一个实例中，对照样品是从无癌受试者获得的样品。
本文还公开了确定受试者是否患有癌的方法，其中所述方法包括提供包含来自受试者的核酸的样品并检测miR-198的存在或不存在；和/或检测同一样品中至少一种或多种生物标志物的不存在或存在；并将检测到的miR-198水平与对照样品中检测到的miR-198水平进行比较；和/或将检测到的所述至少一种或多种生物标志物的水平与对照样品中检测到的所述至少一种或多种生物标志物的水平进行比较。在一个实例中，所述至少一种或多种生物标志物是但不限于卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)或尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)及其组合。在另一个实例中，生物标志物是FSTL1。
在另一个实例中，确定受试者是否患有癌的方法，其中所述方法包括提供包含来自受试者的核酸的第一样品和a.检测第一样品中miR-198的不存在或存在；和/或b.将检测到的miR-198水平与对照样品中检测到的miR-198水平进行比较；和/或提供包含来自受试者的组织的第二样品和c.检测第二样品中至少一种或多种生物标志物的不存在或存在；和d.将检测到的所述至少一种或多种生物标志物的水平与对照样品中检测到的所述至少一种或多种生物标志物的水平进行比较。在一个实例中，所述一种或多种生物标志物是本文公开的一种或多种生物标志物。在另一个实例中，所述至少一种或多种生物标志物是但不限于miR-181a、表皮生长因子(EGF)和表皮生长因子受体(EGFR)或其组合。
在本文公开的方法中，其中确定一种或多种生物标志物的不存在或存在，所关注的癌的存在与所述生物标志物的增加或降低相关。在一个实例中，与对照样品相比，存在降低水平的miR-198表明存在癌细胞。在另一个实例中，与对照样品相比，存在增加水平的miR-198表明不存在癌细胞。该效应还可以与如本文所公开的其它生物标志物相关，所述其它生物标志物也可以存在于样品中。在另一个实例中，与对照样品中相同的一种或多种生物标志物的水平相比，存在增加水平的至少一种或多种以下生物标志物卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)和尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)表明样品中存在癌细胞。在另一个实例中，需要存在或不存在如本文所公开的至少两种或更多种生物标志物来确定癌细胞的存在或不存在。在一个实例中，与对照样品相比，存在增加水平的卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)和尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)表明样品中存在癌细胞。在另一个实例中，与对照样品相比，存在增加水平的FSTL1表明样品中存在癌细胞。在一个实例中，与对照样品相比，存在增加水平的miR-181a、EGF和EGFR表明样品中存在癌细胞。
在一个实例中，与对照样品中相同的一种或多种生物标志物的水平相比，存在降低水平的至少一种或多种以下生物标志物卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)和尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)表明不存在癌细胞。在另一个实例中，与对照样品相比，存在降低水平的卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)和尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)表明不存在癌细胞。在另一个实例中，与对照样品相比，存在降低水平的FSTL1表明样品中不存在癌细胞。在另一个实例中，与对照样品相比，存在降低水平的miR-181a、EGF和EGFR表明样品中存在癌细胞。在另一个实例中，至少FSTL1和DIAPH1的存在或不存在用于确定癌细胞的存在或不存在。在又一个实例中，至少miR-181a、EGF和EGFR的存在或不存在用于确定癌细胞的存在或不存在。
一旦确定，根据本文公开的任何一种或多种方法，不管癌是否存在于受试者中，如果存在癌，则可以根据本公开内容中公开的治疗方法治疗受试者。在一个实例中，如本文所公开地进行确定受试者中癌的存在的方法，其中向所述受试者随后施用i)一种或多种包含miR-198的序列(SEQ ID NO:1)、其功能部分或其组合或者由miR-198的序列(SEQ ID NO:1)、其功能部分或其组合组成的寡核苷酸；和/或ii)至少一种降低任何一种或多种下列靶蛋白表达的寡核苷酸：卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)或尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)。在另一个实例中，如上所述的miR-198的功能部分包含5’GTCCAGAG 3’(SEQ ID NO:2)或由其组成。
如本文所用，术语“增加的”是指相对于对照表达水平的更大量、强度或程度。表达增加可以是比对照表达水平高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
如本文所用，术语“降低的”是指相对于对照表达水平降低的量、强度或程度。表达降低可以是比对照表达水平低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
本文公开了治疗癌的方法，其中所述方法包括施用至少一种或多种寡核苷酸和/或至少一种或多种RNA分子，其中所述一种或多种寡核苷酸在序列上与miR-198的核酸序列(SEQ ID NO:1)或其功能部分同源；其中所述一种或多种RNA分子降低miR-198的RNA靶标的水平和/或抑制其基因表达。因此，还可以并且考虑靶向一种或多种RNA靶标或miR-198。可以同时或顺序地靶向这些目标。在一个实例中，所述RNA靶标是基因，其是但不限于卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)和尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)及其组合。在一个实例中，所述RNA靶标表达具有选自由SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6及其组合组成的组的氨基酸序列的蛋白质。
在另一个实例中，公开了至少一种或多种寡核苷酸和/或至少一种或多种RNA分子在制备用于治疗癌的药物中的用途。在一个实例中，所述一种或多种寡核苷酸在序列上与miR-198的核酸序列(SEQ ID NO:1)或其功能部分同源。在另一个实例中，所述一种或多种RNA分子降低RNA靶标的水平和/或抑制其基因表达。在又一个实例中，其中所述RNA靶标是选自由以下组成的组的基因：卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)和尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)。在另一个实例中，公开了至少一种或多种寡核苷酸和/或至少一种或多种RNA分子在制备用于治疗癌的药物中的用途，其中所述一种或多种寡核苷酸在序列上与miR-198的核酸序列(SEQ ID NO:1)或其功能部分同源；和/或其中所述一种或多种RNA分子降低RNA靶标的水平和/或抑制其基因表达；其中所述RNA靶标是选自由卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)和尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)组成的组的基因。在又一个实例中，公开了至少一种或多种寡核苷酸和/或至少一种或多种RNA分子在制备用于治疗癌的药物中的用途，其中所述一种或多种寡核苷酸在序列上与miR-198的核酸序列(SEQ IDNO:1)或其功能部分同源；并且其中所述一种或多种RNA分子降低RNA靶标的水平和/或抑制其基因表达；其中所述RNA靶标是选自由卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)和尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)组成的组的基因。
为了使例如寡核苷酸结合并由此靶向或影响靶基因，所述寡核苷酸必须具有与靶基因的序列相似性，因为本领域理解这样的结合由例如与靶序列的互补结合决定。在其它实例中，所述寡核苷酸模拟所述靶基因的功能。在这样的实例中，所述寡核苷酸然后会具有与所述靶序列相似(即以确定的百分比同源)或相同(即100％同源)的序列。因此，在一个实例中，本文公开的一种或多种寡核苷酸在序列上与miR-198的核酸序列(SEQ ID NO:1)为约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％同源的。在另一个实例中，本文公开的一种或多种寡核苷酸在序列上与miR-198的核酸序列(SEQ ID NO:1)为50％至99％、66％至77％、75％至99％、82％至99％、86％至95％、87％至93％或95％至99.9％同源的。在另一个实例中，所述寡核苷酸具有根据SEQ ID NO:1的miR-198的核酸序列，即所述寡核苷酸与miR-198的核酸序列100％同源。
在另一个实例中，本申请中公开的一种或多种寡核苷酸包含5’GGTCCAGAGGGGAGATAGGT TC 3’(SEQ ID NO:1)或其功能部分。在另一个实例中，所述一种或多种寡核苷酸包含5’GTCCAGAG 3’(SEQ ID NO:2)。
如本文所用，术语“序列同一性”是指两个多核苷酸或氨基酸序列在比较窗口内相同(即在逐个核苷酸或逐个残基的基础上)的情况。通过在比较窗口内比较两个最佳比对序列，确定在两个序列中出现相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)或残基的位置数以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比，来计算术语“序列同一性百分比”。本文所用的术语“基本同一性”表示多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中该多核苷酸或氨基酸包含与参考序列相比在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗口内、经常在至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的窗口内，具有至少85％序列同一性，优选至少90至95％序列同一性，更通常至少99％的序列同一性的序列，其中通过将该参考序列与可包括在比较窗口内总共为参考序列的20％或更少的缺失或添加的序列进行比较来计算序列同一性的百分比。该参考序列可以是较大序列的子集。
因此，在一个实例中，本文公开的一种或多种寡核苷酸与miR-198的核酸序列(SEQID NO:1)具有约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％的序列同一性。在另一个实例中，本文公开的一种或多种寡核苷酸与miR-198的核酸序列具有50％至99％、66％至77％、75％至99％、82％至99％、86％至95％、87％至93％或95％至99.9％的序列同一性。在另一个实例中，所述寡核苷酸具有根据SEQ ID NO:1的miR-198的核酸序列，即所述寡核苷酸与miR-198的核酸序列具有100％的序列同一性。
本申请鉴定了双态分子开关，其中单个转录物可以制备抗迁移微小RNA-198(miR-198)或促迁移卵泡抑素样-1(FSTL1)蛋白质。在正常即无疾病的皮肤中，外显子miR-198的表达在受伤时从FSTL1mRNA转变为促迁移FSTL1蛋白，从而增强暂时迁移和协调伤口再上皮化。
在本申请中，揭示了伤口愈合开关中的缺陷，其中关闭miR-198表达以有利于持续的FSTL1表达。显示这种情况存在于癌症例如头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中。表皮生长因子(EGF)驱动的微环路劫持miR-198和FSTL1的这种分子开关，然后引导细胞转向转移的双分叉途径。在没有miR-198的情况下，其靶标DIAPH1的持续表达通过螯合Arpin(这种迁移过程的竞争性抑制剂)来增强迁移的定向持续性。分泌的糖蛋白FSTL1与Wnt7a相互作用并阻断Wnt7a介导的ERK磷酸化的抑制。这允许ERK的磷酸化，其反过来刺激MMP9的表达，导致细胞外基质降解和促进癌细胞的转移行为，和/或癌细胞的转移的形成。在不存在miR-198的情况下，该示例性FSTL1-DIAPH1基因对的这种预后意义突出了该基因对作为治疗干预的潜在靶标。
之前已经显示miR-198/FSTL1分子开关控制来自单个转录物的两种替代基因产物的背景特异性表达，从而调节伤口再上皮化。miR-198是外显子miRNA，其前体序列位于编码蛋白质的卵泡抑素样-1(FSTL1)基因的3'非翻译区内。在正常皮肤中，该转录物起初级miRNA的作用，该miRNA被加工成成熟的miR-198，其又作为角质形成细胞迁移的抑制剂起作用。然而，在受伤时，相同的转录物起信使RNA(mRNA)的作用并导致FSTL1蛋白(卵泡抑素样-1蛋白)的表达，FSTL1蛋白对细胞具有促迁移作用。这种从正常皮肤中抗迁移miR-198的表达转变为受伤后的促迁移FSTL1表达促进了角质形成细胞的暂时迁移和伤口再上皮化。
角质形成细胞的增殖和迁移对于例如伤口愈合是必不可少的，但也是所有上皮癌的标志。该过程在愈合伤口中是自限性的，并且通常在再上皮化完成时终止。在癌中，角质形成细胞增殖和迁移延长，导致不受控制的生长和转移。在角质形成细胞迁移和增殖中伤口愈合和上皮癌之间的相似性促使在进行性头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的背景下研究伤口愈合开关。在该开关中观察到缺陷，其导致抗迁移miR-198的下调，有利于促迁移FSTL1的持续表达。在一些情况下，在没有miR-198的情况下分析了头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中促迁移靶标的表达。显示miR-198的靶标DIAPH1以及FSTL1的持续的增加的表达增强癌细胞的迁移、侵袭和转移。
因此，在一个实例中，所述靶标是选自由卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)和尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)组成的组的基因。在另一个实例中，所述靶标是RNA靶标。在又一个实例中，所述RNA靶标是选自由卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)和尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)组成的组的基因。
分泌的(糖)蛋白FSTL1在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中与Wnt7a相互作用并拮抗Wnt7a介导的ERK磷酸化的抑制。这允许ERK的磷酸化，其反过来刺激基质金属肽酶9(MMP9)的表达，MMP9是参与细胞外基质降解的蛋白质。因此，MMP9的磷酸化导致所述MMP9蛋白的活化，从而导致细胞外基质降解和促进癌细胞的转移行为。
DIAPH1通过螯合Arpin来增强迁移的定向持续性，Arpin是这一过程的抑制剂。结果，Arpin的活性受阻，细胞迁移持续，从而支持癌细胞的转移行为。总之，缺陷分子开关发挥双管齐下作用以增强头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的侵袭和转移，导致疾病的进展。
上皮癌以延长的方式激活宿主的潜在伤口愈合程序以促进恶性转化。在这里，在伤口愈合和鳞状细胞癌(SCC)的交叉路口检查了分子开关。该分子开关控制来自单个转录物的两种替代基因产物的背景特异性表达。皮肤鳞状细胞癌(SCC)样品的研究显示缺乏外显子微小RNA-198(miR-198)，然而FSTL1从连锁的开放阅读框中的持续表达是明显的。在肿瘤微环境中，促侵袭miR-198靶基因的持续表达和FSTL1介导的基质金属蛋白酶(MMP)的表达促进鳞状细胞癌(SCC)的侵袭。人抗原R(HuR)的表达和EGF介导的微小RNA-181a的表达使得FSTL1的持续表达成为可能，微小RNA-181a下调KH型剪接调节蛋白(KSRP)。总之，EGF信号传导微环路促进癌细胞对调节开关的获取；阻止肿瘤抑制因子miR-1983的加工，并允许促致癌因子FSTL1的持续表达，导致SCC的进展。
发现了一种新的miR-198/FSTL1调节开关，其在皮肤鳞状细胞癌(SCC)中被劫持，皮肤鳞状细胞癌是一种常见的皮肤癌形式。在人鳞状癌细胞(SCC)样品中观察到miR-198的缺失以及促迁移基因FSTL1以及miR-198靶基因DIAPH1、LAMC2和PLAU的伴随的持续表达。进一步证明，FSTL1、DIAPH1、LAMC2和PLAU的敲减抑制角质形成细胞侵袭(通过体外跨孔(transwell)测定和器官型测定)。此外，还证明了FSTL1介导促炎基因的表达，促炎基因的表达是癌症中的常见观察结果。miR-198/FSTL1调节开关对于伤口愈合中角质形成细胞迁移和伤口再上皮化的调节至关重要；在SCC中的致癌转化背景下，该途径被错误调节和过度活跃。
为了探索涉及伤口愈合和鳞状细胞癌(SCC)的平行分子机制，寻求研究伤口愈合开关在癌症中例如在上皮癌例如头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和皮肤鳞状细胞癌中的作用。如本文所用，术语“癌”可互换使用，是指源自上皮细胞或从上皮细胞发展的增殖性疾病。
因此，在一个实例中，本文公开的疾病是癌症。在另一个实例中，该疾病是癌。在另一个实例中，该癌症是上皮癌。在又一个实例中，该癌来源于细胞，所述细胞是但不限于来自上呼吸消化道的细胞，主要在鼻腔、鼻旁窦、鼻咽、喉、气管、口咽和口腔中。在另一个实例中，所述细胞是上皮细胞。在又一个实例中，所述细胞是粘膜衬里的细胞。在一个实例中，该疾病是但不限于鳞状细胞癌(SCC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌(BCC)、基底细胞肿瘤、黑素瘤、腺癌、腺鳞状细胞癌、移行细胞癌、间变性癌、大细胞癌、小细胞癌、胆管癌、肝细胞癌、腺样囊性癌、肾细胞癌、Grawitz肿瘤、附件和皮肤附属肿瘤、粘液表皮样肿瘤、囊性肿瘤、粘液性肿瘤、浆液性肿瘤、导管肿瘤、小叶肿瘤、髓质肿瘤、腺泡细胞肿瘤、复杂上皮肿瘤、胆管癌和不明原因的癌。在一个实例中，所述癌是鳞状细胞癌(SCC)。在另一个实例中，所述癌是皮肤鳞状细胞癌。在另一个实例中，所述癌是头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。如本领域技术人员所理解的，在癌领域中，癌的位置是癌表征中的限定性状之一。例如，在甲状腺中发现的癌被认为是甲状腺癌。基于患病细胞的形态进行进一步表征，即比较病变细胞本身和无病状态的细胞的形状。例如，鳞状细胞甲状腺癌是一种罕见的甲状腺恶性肿瘤，其显示具有明显鳞状分化的肿瘤细胞。话虽如此，鳞状细胞通常不会出现在甲状腺中，但可能来自胚胎残余物，如甲状舌管或鳃裂。
本发明还公开了诊断和治疗上皮癌例如鳞状细胞癌(SCC)和头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的方法。在一个实例中，公开了miR-198和/或另外的生物标志物在诊断上皮癌中的方法或用途。在另一个实例中，公开了miR-198的寡核苷酸模拟物或miR-198本身在治疗上皮癌中的方法或用途。在又一个实例中，公开了针对FSTL1、DIAPH1、LAMC2、PLAU的siRNA或组合siRNA在治疗上皮癌中的方法或用途。在一个实例中，上皮癌是鳞状细胞癌(SCC)。在另一个实例中，上皮癌是皮肤鳞状细胞癌(SCC)。在另一个实例中，上皮癌是头颈部鳞状细胞癌(SCC)。
本公开内容还涉及不存在miR-198表达和/或存在FSTL1表达作为用于诊断癌的生物标志物。在一个实例中，所述癌是皮肤鳞状细胞癌(SCC)。此外，miR-198及其下游靶标DIAPH1、LAMC2和PLAU也被认为是治疗癌例如皮肤鳞状细胞癌(SCC)的治疗靶标。
显示了与正常皮肤样品相比，皮肤鳞状细胞癌(SCC)细胞显示出特异性和强烈的FSTL1表达以及伴随的低(可忽略)水平的miR-198。还证明了敲减FSTL1以及miR-198靶基因(DIAPH1、LAMC2和PLAU)导致皮肤鳞状细胞癌(SCC)细胞系的侵袭性降低。该数据表明以下事实：皮肤鳞状细胞癌(SCC)中存在缺陷miR-198/FSTL1开关，并且恢复该开关的正常功能提供了用于治疗SCC的创新策略。
miR-198/FSTL1可有效用作诊断皮肤鳞状细胞癌(SCC)的生物标志物，因为已证实miR-198在正常皮肤表皮中高表达，在测定的所有皮肤鳞状细胞癌(SCC)组织切片(n＝73)中低表达。相反，FSTL1在皮肤鳞状细胞癌(SCC)组织切片(n＝73)中以高水平存在，在正常组织中可忽略不计。
皮肤鳞状细胞癌(SCC)是第二常见的皮肤癌，并且是原发性恶性肿瘤，其特征在于显著的细胞异型性、异常的角质化和侵袭性特征。皮肤鳞状细胞癌(SCC)具有基底细胞癌(BCC)和黑素瘤的特征，具有局部侵袭性并具有转移能力。恶性转化被认为是不愈合的溃疡伤口的严重并发症。此外，上皮肿瘤通过激活不受控制的伤口愈合反应促进其基质的形成。为了探索伤口愈合的再上皮化阶段的常见分子机制以及与皮肤鳞状细胞癌(SCC)的相似性，分析了miR-198/FSTL1调节开关，其控制两种替代基因产物的背景特异性表达和作为伤口再上皮化的协调者。在稳定状态下，健康的表皮角质形成细胞表达高水平的外显子miR-198，但没有FSTL1蛋白(图1a)。相反，类似于伤口微环境，皮肤鳞状细胞癌(SCC)组织切片中迁移和增殖的角质形成细胞表达高水平的FSTL1，并且很少或没有miR-198(图1b)。总之，在不受理论束缚的情况下，这支持了肿瘤是过度愈合伤口的假设并加强伤口愈合与癌之间的联系。然而，促迁移FSTL1的持续表达和抗迁移miR-198的不存在表明癌细胞可能利用该分子开关来增强皮肤鳞状细胞癌(SCC)细胞的迁移和侵袭。
由于鳞状细胞癌细胞的集体迁移和伤口愈合过程中的细胞迁移的惊人相似性，研究了miR-198靶基因在皮肤鳞状细胞癌(SCC)中的表达。在没有抗迁移miR-198的情况下，所有检查的促迁移靶基因(包括尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)(一种降解细胞外基质6的丝氨酸蛋白酶)、参与肌动蛋白聚合7的透明同源物1(DIAPH1)、作为基底膜蛋白层粘连蛋白3328的必需成分的层粘连蛋白γ2链(LAMC2)和编码酪氨酸激酶活性的met原癌基因9(cMET))在皮肤鳞状细胞癌(SCC)中的高度增殖的角质形成细胞中被清晰表达(图2a、2b)。此外，研究了这些靶基因在促进角质形成细胞侵袭中的作用。将针对miR-198靶基因的siRNA或对照siRNA转染的SCC12细胞进行Boyden室跨孔测定(图5a)。迁移后，在孵育后24小时计数附着于过滤器下表面的细胞(图2c、2d)。靶基因的敲减导致侵袭通过基质的细胞数量显著减少(图2c，右图)。
为了证实miR-198靶基因在皮肤鳞状细胞癌(SCC)侵袭中的作用，使用了癌细胞侵袭的器官型模型，其密切模拟了体内基质侵袭。将用针对LAMC2、PLAU和DIAPH1的特异性shRNA转导的SCC12细胞在具有掺入的成纤维细胞的胶原：基质胶凝胶上培养。靶基因的大量敲减(图6)导致胶原基质中侵袭细胞数量的显著减少(图2d)。总之，这清楚地表明miR-198靶标的敲减抑制了角质形成细胞的迁移和侵袭，并强调了外显子miR-198作为皮肤鳞状细胞癌(SCC)中的肿瘤抑制因子的作用。
为了推广由miR-198初级转录物的连锁开放阅读框表达的促迁移糖蛋白FSTL1在SCC中的作用，将用针对FSTL1的siRNA或对照siRNA转染的SCC12细胞进行Boyden室跨孔测定(图6a)。FSTL1的敲减导致迁移细胞数量显著减少(图3a、3b)。在SCC12细胞中使用shRNA稳定敲减FSTL1显示器官型测定中侵袭细胞的数量以及侵袭深度显著减少(图3c)。侵袭深度的定量显示具有FSTL1的皮肤鳞状细胞癌(SCC)细胞几乎侵入凝胶两倍更深(图6b，图3d)。此外，SCC12细胞中FSTL1的敲减导致硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)的显著下调，其对于肿瘤细胞11的生长、迁移和转移性传播是必需的(图3c，3d)。作为MMP复合物12的激活剂，CSPG4是侵袭性原发性肿瘤前沿处的局部侵袭的必需因子。癌症侵袭通常与细胞外基质(ECM)降解蛋白酶的过表达相关，所述蛋白酶例如明胶酶BMMP913。SCC12细胞系中的FSTL1敲减导致pro-MMP9的表达和活性降低，如通过qRT-PCR和条件培养基上的明胶酶谱检测的(图3e，3f)。总之，多功能糖蛋白FSTL1潜在地调节CSPG4的表达，其可以激活MMP复合物并促进癌症侵袭。为了支持上述结果，皮肤鳞状细胞癌(SCC)组织阵列的分析显示与正常表皮角质形成细胞相比，癌细胞中CSPG4和MMP9的表达均增加(图3g)。总之，尽管不是根据本领域经典定义的致癌基因，但FSTL1的持续表达增加直接或间接增强了与致癌转化相关的多种信号传导途径的活化，并促进了皮肤SCC的进展。
为了解导致皮肤鳞状细胞癌(SCC)中分子开关失败的分子机制，分析了KSRP的表达，其对于miR-198的加工是必需的。与正常皮肤相比，在皮肤鳞状细胞癌(SCC)样品中观察到低水平的KSRP(图4a)。已知癌症中频繁过表达的因子表皮生长因子(EGF)刺激miR-181a的表达。显示miR-181a直接靶向并显著下调SCC14中的KSRP表达(图4b-f)。使用抗miR-181a下调miR-181a导致KSRP的上调，伴随FSTL1的显著下调和伴随的miR-198的上调(图4c-e)。总之，低水平的KSRP在皮肤鳞状细胞癌(SCC)中阻碍miR-198的加工并促进FSTL1表达。
FSTL1在皮肤鳞状细胞癌(SCC)中的长期和持续表达促使检查能够增强FSTL1转录物的稳定性的其它因子。例如，Hu抗原R(HuR)是结合不稳定转录物(包括与SCC中癌发生相关的环加氧酶-2(COX-2))的mRNA结合蛋白。假设Hu抗原R(HuR)基于外显子miR-19817的前体序列中共有HuR结合基序(NNUUNNUUU-富含U的元件)的存在来控制FSTL1转录物的稳定性(数据未显示)。显示HuR的表达升高存在于皮肤鳞状细胞癌(SCC)样品中(图4g)。使用重组HuR的RNA凝胶阻滞测定证实了HuR与前体miR-198转录物的结合(图4h，左图)。在重组HuR存在下形成RNA-蛋白质复合物，其中野生型探针含有富含U的基序，但突变探针则不然(缺乏富含U的基序)，这证实了结合的特异性(图4h，右图)。使用特异性靶向HuR或KSRP的siRNA，在放线菌素D存在下敲减HuR而不敲减KSRP导致FSTL1蛋白表达的丧失。这强调了HuR在增强FSTL1转录物稳定性中的作用(参见图4i)。
最后，使用在全长FSTL1 3′-UTR上游含有Luc的封端的嵌合报告转录物[Luc-FSTL1 3′-UTR]进行体外翻译测定，以证实HuR的作用。在存在来自用对照siRNA或针对HuR或KSRP的siRNA转染的SCC12细胞的裂解物的情况下，使该报告物在兔网织红细胞裂解物中进行体外翻译。HuR而不是KSRP的下调明显影响了该报告物的翻译，从而证实了HuR赋予转录物稳定性的作用。作为靶特异性的对照，向每种反应混合物中加入编码GFP的cRNA。在所有条件下均显示GFP的表达是恒定的，表明抑制活性对含有FSTL1 3′-UTR的嵌合转录物是特异性的(图4i)。总之，显示KSRP的下调和HuR的表达增强FSTL1mRNA的稳定性，导致FSTL1蛋白在皮肤鳞状细胞癌(SCC)中的组成型表达。
伤口愈合是一种自限性动态事件，其中屏障破坏是短暂的，并且炎症随着再上皮化的完成而消退。在伤口修复后，角质形成细胞恢复为上皮样表型并重新分化以恢复表皮屏障，而癌细胞失去细胞-细胞接触，并且转分化以获得具有以下基因表达谱的间充质样表型，所述基因表达谱有助于增加的迁移和侵袭。此外，表皮基因表达的永久扰动不仅导致不受控制的生长，而且还导致与癌发生相关的慢性炎症。显示miR-198/FSTL1基因开关紧密调节伤口微环境中的基因表达以促进有效的伤口愈合。
在皮肤损伤后，抗迁移miR-198的瞬时下调对于促进角质形成细胞向伤口边缘的迁移是必需的。然而，在皮肤鳞状细胞癌(SCC)中，永久缺失miR-198和持续表达促迁移靶基因增强角质形成细胞迁移和侵袭。癌细胞持续表达PLAU和LAMC2导致纤维蛋白溶解和细胞外基质组分降解增加。尽管基底膜是保护性的并且作为肿瘤生长的屏障，但是基底膜增强的自分泌因子(包括LAMC2和层粘连蛋白332)的分泌促进了皮肤鳞状细胞癌(SCC)中的肿瘤发生。肌动蛋白结合蛋白DIAPH1的表达促进极化癌细胞迁移。通过靶向促有丝分裂和促运动(motogenic)途径的调节因子，miR-198抑制迁移。进一步抑制致癌基因cMET，miR-198也起肿瘤抑制因子的作用。通过靶向FUT8和FGFR1，miR-198进一步分别控制结肠直肠癌中的转移并诱导肺癌细胞凋亡，所有这些都强调了miR-198作为肿瘤抑制因子的作用。
检查FSTL1在伤口愈合和癌症交叉处的作用；该蛋白质对于角质形成细胞迁移和伤口再上皮化是必需的。然而，在癌细胞中，FSTL1的持续表达通过下游调节因子CSPG4和MMP9促成致癌转化。CSPG4不仅激活FAK和ERK1/2促进肿瘤侵袭和生长，CSPG4还通过调节MMP-2和MMP-912的活性激活细胞外基质的蛋白水解降解。另外，FSTL1是分泌的促炎性糖蛋白，其在各种炎性条件下升高时，介导炎症反应并增强免疫细胞合成促炎细胞因子和趋化因子，其包括但不限于IL-6、TNF-α和IL1-β。支持该观察结果，SCC12细胞中的FSTL1敲减导致促炎基因的下调，所述促炎基因包括IL-27B、IL-1β、TNFAIP2/3、CCL5和IL-32(图6c)。总之，中和FSTL1导致开发用于解决慢性炎性病症中的炎症的有效策略。最后，FSTL1作为促炎特征在皮肤鳞状细胞癌(SCC)、结肠直肠癌中的表达以及FSTL1作为骨转移中癌细胞侵袭的介质的作用均表明靶向FSTL1以治疗多种形式的癌症的治疗潜力。
FSTL1在伤口愈合中的作用与其在皮肤鳞状细胞癌(SCC)病理学中的作用之间的微妙但关键的界限表明FSTL1表达受到严格调节，允许蛋白质发挥其生理学功能，同时避免持续表达的严重后果。FSTL1在损伤/伤口愈合中的关键作用与其对皮肤鳞状细胞癌(SCC)中致癌转化的贡献之间的对比强调了FSTL1的调节复杂性。总之，这突出了控制miR-198和FSTL1的时间和互斥表达的调节开关的重要性。然而，癌细胞通过阻断抗迁移性肿瘤抑制因子miR-198的加工来利用调节开关，以促进促迁移、促侵袭和促炎性FSTL1的持续产生。在正常伤口愈合中发生的事件不足以触发肿瘤形成；然而，伤口微环境中组分的持续异常表达可引发表皮过度增殖、慢性炎症和侵袭，从而导致癌发生。调节该分子开关的组分可以为皮肤鳞状细胞癌(SCC)设计更好的治疗选项，改善患者后果。
如本文所用，术语“miRNA”被理解为单链非编码RNA序列，其能够与mRNA的3'非翻译区相互作用从而阻止其翻译。可在本文中互换使用的术语“微小RNA”或“miRNA”是内源RNA，已知其中一些在转录后水平上调节蛋白质编码基因的表达。如本文所用，术语“微小RNA”是指任何类型的微干扰RNA，包括但不限于内源微小RNA和人工微小RNA。通常，内源性微小RNA是在基因组中编码的小RNA，其能够调节mRNA的生产利用。成熟miRNA是长度为约21-23个核苷酸的单链RNA分子，其与靶序列互补，并与靶RNA序列杂交以抑制其翻译。miRNA本身由基因编码，其从DNA转录但未翻译成蛋白质(非编码RNA)；相反，它们从称为pri-miRNA的初级转录物加工成称为pri-miRNA的短茎环结构，最后转化为功能性miRNA。成熟的miRNA分子与一种或多种信使RNA(mRNA)分子部分互补，其主要功能是下调基因表达。
因此，如本文所用，“抑制剂”是指使本文公开的任何一种或多种生物标志物的表达失活和/或下调的任何分子。抑制剂可以是小分子、反义核酸、小干扰RNA或基于微小RNA的化合物。例如，FSTL1表达抑制剂可以是直接抑制剂，从而其与FFSTL1蛋白质或与编码FSTL1蛋白质的核酸相互作用。或者，抑制剂可以是间接抑制剂，其在例如调节途径中的FSTL基因的上游或下游相互作用，并且不与FSTL蛋白或与编码FSTL蛋白的核酸直接相互作用。在一个实例中，抑制剂可以是FSTL抑制剂序列的肽核酸(PNA)衍生物或针对抑制剂种子序列的微小锁核酸(LNA)抗miR。
如本文所用的术语“肽核酸(PNA)”是指具有假肽骨架的DNA模拟物。
如本文所用，术语“锁核酸”(也称为LNA或“难以接近的RNA”)是指修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分用连接2'氧和4'碳的额外桥修饰。该桥将核糖“锁定”在3'-内(北)构象中，其与A-形式双链体中经常发现的构象相同。无论何时需要，通常合成的锁核酸核苷酸可以与寡核苷酸中的DNA或RNA残基混合，并根据Watson-Crick碱基配对规则与DNA或RNA杂交。锁定的核糖构象增强了碱基堆叠和骨架预组织。这显著增加了寡核苷酸的杂交性质(解链温度)。
本文所用的术语“微小LNA抗miR”是指难以接近的RNA，是修饰的RNA核苷酸。在一个实例中，将微小LNA转染到细胞中导致同时抑制共享相同种子的家族内的RNA，同时伴随上调直接靶标。在一个实例中，微小LNA的转染系统地显示长期RNA沉默。
在跨孔和器官型测定中证明，FSTL1以及miR-198靶基因DIAPH1、LAMC2和PLAU的敲减导致皮肤鳞状细胞癌(SCC)细胞系中侵袭性质的显著丧失。通过KSRP调节miR-198的水平导致FSTL1的反向调节，KSRP对于miR-198的加工是必需的。该数据表明，例如通过施用寡核苷酸模拟物来增强miR-198的水平可以用于皮肤鳞状细胞癌(SCC)的治疗，可以容易地制备所述寡核苷酸模拟物用于例如局部施用。
本文所述的组合物可以多种方式施用，这依赖于是否期望局部或全身治疗和依赖于要治疗的部位。施用可为局部的、肺部的(如，通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和透皮)，或者全身的如口服和/或胃肠外的。在一个实例中，本文所述的组合物可经全身或局部施用来施用。在另一个实例中，本文公开的化合物根据以下方法中的任一种施用：口服、脂肪内、动脉内、关节内、颅内、皮内、病灶内、肌内、鼻内、眼内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、直肠内、鞘内、气管内、肿瘤内、脐内、静脉内、膀胱内、玻璃体内、脂质体、局部、粘膜、口服、肠内、胃肠外、直肠、结膜下、皮下、舌下、局部、经口腔、透皮、阴道、在乳膏中、在脂质组合物中、通过导管、通过灌洗、通过连续输注、通过输注、通过吸入、通过注射、通过局部递送、通过局部灌注或其任何组合。
胃肠外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉注射或输注；或颅内，如鞘内或心室内施用。
在一个实例中，施用经局部施用。用于局部施用的组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规药物载体，水性的、粉末或油性基质、增稠剂等可为必要的或期望的。
在一个实例中，用于局部施用的组合物包含如本文所述的组合物和皮肤病学可接受媒介物。所述媒介物可为水性或非水性的。用于局部组合物的皮肤病学可接受媒介物可为洗剂、凝胶、软膏剂、液体、乳膏或乳剂的形式。如果该媒介物为乳剂，则该乳剂可具有连续的水相和不连续的非水或油相(水包油型乳剂)，或者连续的非水或油相和不连续的水相(油包水型乳剂)。
在一个实例中，如本文所述的组合物可使用透皮贴剂局部施用。在一个实例中，透皮贴剂包含用于粘合贴剂至皮肤的粘合剂层，和药物不可渗透性背衬层。在一个实例中，该粘合剂层含有如本文所述的组合物和粘合剂聚合物。在这种系统中，如本文所述的组合物从粘合剂层释放并直接穿至皮肤。
在一个实例中，透皮系统具有包含如本文所述的组合物的储层。该药物储层为含有药物溶液或悬浮液的液体、凝胶或半固体区室，其中所述储层位于粘合剂层和背衬层之间。在这种系统中，如本文所述的组合物从储层释放并穿过粘合剂层。
用于本公开的局部制品的药物赋形剂可选自由以下组成的组：溶剂、软化剂和/或乳化剂、油基、防腐剂、抗氧化剂、张力调节剂、渗透增强剂和增溶剂、螯合剂、缓冲剂、表面活性剂、一种或多种聚合物及其组合。
用于水性或亲水性局部制剂的适当溶剂包括但不限于水；乙醇；异丙醇；水和乙醇和/或异丙醇的混合物；甘油；乙二醇、丙二醇或丁二醇；DMSO；及其混合物。用于疏水性局部制剂的适当溶剂包括但不限于矿物油、植物油和硅油。必要时，如本文所述的组合物可溶解或分散于疏水性油相，接着油相可在包含单独的水或水与低级醇、甘油和/或二醇类组合的水相中乳化。
适当软化剂包括但不限于烃油和蜡如矿物油、矿脂、石蜡、纯地蜡(ceresin)、地蜡(ozokerite)、微晶蜡、聚乙烯、角鲨烯、全氢化角鲨烯、硅油、三酸甘油酯、乙酰甘油酯如乙酰化单甘酯；乙氧基化甘油酯，如乙氧基化单硬脂酸甘油酯；脂肪酸或二羧酸的烷基酯。
用作软化剂的适当的硅油包括但不限于二甲基聚硅氧烷、甲基(苯基)聚硅氧烷和水溶性和醇溶性硅酮二醇共聚物。用作软化剂的适当的三酸甘油酯包括但不限于植物和动物油脂，包括蓖麻油、红花油、棉籽油、玉米油、橄榄油、鱼肝油、杏仁油、鳄梨油、棕榈油、芝麻油、大豆油及其组合。
用作软化剂的适当的羧酸酯或二酸酯包括但不限于脂肪酸的甲基酯、异丙酯和丁基酯。烷基酯的具体实例包括月桂酸己酯、月桂酸异己酯、棕榈酸异己酯、棕榈酸异丙酯、油酸癸酯、油酸异癸酯、硬脂酸十六烷基酯、硬脂酸癸酯、异硬脂酸异丙酯、乳酸二月桂酯、乳酸肉豆蔻酯和乳酸鲸蜡酯；和脂肪酸的烯基酯如肉豆蔻酸油基烯酯、硬脂酸油烯基酯和油酸油烯基酯。二酸的烷基酯的具体实例包括己二酸二异丙酯、己二酸二异己酯、己二酸双(己基癸基)酯、癸二酸二异丙酯及其组合。
可用于局部制剂的软化剂或乳化剂的其它适当类别包括但不限于脂肪酸、脂肪醇、脂肪醇醚、乙氧基化脂肪醇、乙氧基化脂肪醇的脂肪酸酯、蜡及其组合。
用作软化剂的脂肪酸的具体实例包括但不限于壬酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、异硬脂酸、羟基硬脂酸、油酸、亚油酸、蓖麻油酸、花生酸、山嵛酸、和芥酸。用作软化剂的脂肪醇的具体实例包括月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇(cetyl)、十六烷基醇(hexadecyl)、硬脂醇、异硬脂醇、羟基硬脂醇、油醇、蓖麻油醇、山嵛醇、二十二烯醇以及2-辛基十二烷醇及其组合。
适于用作软化剂的蜡的具体实例包括但不限于羊毛脂及其衍生物，包括羊毛脂油、羊毛酯蜡、羊毛脂醇、羊毛脂脂肪酸、羊毛脂酸异丙酯、乙氧基化羊毛脂、乙氧基化羊毛脂醇、乙氧基化胆固醇(ethoxolated cholesterol)、丙氧基化羊毛脂醇、乙酰化羊毛脂、乙酰化羊毛脂醇、羊毛脂醇亚油酸酯、羊毛脂醇蓖麻油酸酯、羊毛脂醇蓖麻油酸酯的乙酸盐、羊毛脂醇蓖麻油酸酯的乙酸盐、乙氧基化醇酯的乙酸盐、羊毛脂的氢解产物(hydrogenolysates)、氢化羊毛脂、乙氧基化氢化羊毛脂、乙氧基化山梨糖醇羊毛脂、和液体和半固体羊毛脂。还适用作蜡的包括烃蜡、酯蜡和酰胺蜡。有用的蜡包括蜡酯如蜂蜡、鲸蜡、肉豆蔻基肉豆蔻酸酯、和硬脂基硬脂酸酯；蜂蜡衍生物如聚氧乙烯山梨糖醇蜂蜡；和植物蜡，包括棕榈蜡和小烛树蜡；及其组合。
多元醇和聚醚衍生物可用作局部制剂中的溶剂和/或表面活性剂。适当的多元醇和聚醚包括但不限于丙二醇，二丙二醇，聚丙二醇2000和4000，氧化亚乙基二醇-氧化亚丙基二醇共聚物，甘油，山梨糖醇，乙氧基化山梨糖醇，羟基丙基山梨糖醇，聚乙二醇200-6000，甲氧基聚乙二醇350、550、750、2000和5000，聚[环氧乙烷]均聚物(100,000-5,000,000)，聚亚烷基二醇和衍生物，己二醇，2-甲基-2,4-戊二醇，1,3-丁二醇，1,2,6-己三醇，2-乙基-1,3-己二醇，具有15至18个碳原子的邻二醇类(vicinal glycols)，三羟甲基丙烷的聚氧丙烯衍生物，以及其组合。
多元醇酯可用作乳化剂或软化剂。适当的多元醇酯包括但不限于乙二醇单-和二-脂肪酸酯、二乙二醇单-和二-脂肪酸酯、聚乙二醇(200-6000)单-和二-脂肪酸酯、丙二醇单-和二-脂肪酸酯、聚丙二醇2000单油酸酯、聚丙二醇2000单硬脂酸酯、乙氧基化丙二醇单硬脂酸酯、单-和二-脂肪酸甘油酯、聚丙三醇聚脂肪酸酯、乙氧基化单硬脂酸甘油酯、1,3-丁二醇单硬脂酸酯、1,3-丁二醇二硬脂酸酯、聚氧乙烯多元醇脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯及其组合。
用于局部制剂的适当乳化剂包括阴离子、阳离子、非离子和两性离子表面活性剂。合适的离子乳化剂包括磷脂，如卵磷脂及衍生物。
卵磷脂和其它磷脂可用于制备包含如本文所述的组合物的脂质体。一旦施加足够的能量，当磷脂如卵磷脂被置于水中，并随后形成一个双层或一系列双层(各双层通过水分子分隔)时，则形成脂囊泡。脂质体可通过对水中的磷脂进行超声处理来产生。低剪切率产生多层脂质体。持续高剪切超声处理倾向于形成较小的单层脂质体。疏水性化学品可溶于磷脂双层膜中。脂质体的脂双层通过与角质形成细胞的细胞膜融合而将如本文所述的组合物递送至角质形成细胞。
在一个实例中，局部制剂可包含分散在水性溶液中的表面活性剂分子的胶束或聚集体。胶束可通过将油溶剂分散于包含表面活性剂的水性溶液中来制备，其中表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度。所得制剂包含胶束，即被分散于水性溶剂中的极性表面活性剂分子的膜包围的球状油滴。
甾醇类也可用作软化剂和/或渗透增强剂，其包括例如但不限于胆固醇和胆固醇脂肪酸酯；酰胺类如脂肪酸酰胺、乙氧基化脂肪酸酰胺和脂肪酸链烷醇酰胺。
可用于制备具有水性基质的粘性凝胶或乳膏的适当的粘度增强剂或增稠剂包括但不限于聚丙烯酸钠、黄原胶、聚乙烯吡咯烷酮、丙烯酸聚合物、角叉菜胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙氧基化聚丙烯酰胺、聚乙氧基化丙烯酸酯、聚乙氧基化链烷硫醇及其组合。
用于局部制剂的适当的防腐剂和/或抗氧化剂包括但不限于苯扎氯铵、苄醇、苯酚、尿素、对羟基苯甲酸酯类、丁羟甲苯(BHT)、丁羟茴醚(BHA)、生育酚及其混合物。
用于局部制剂的适当的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、其碱金属盐、其碱土金属盐、其铵盐和其四烷基铵盐。
载体优选具有约4.0至10.0，更优选约6.8至约7.8的pH。pH可使用缓冲溶液或其它pH调节剂控制。适当的pH调节剂包括磷酸和/或磷酸盐、柠檬酸和/或柠檬酸盐、氢氧化物盐(即氢氧化钙、氢氧化钠、氢氧化钾)，和胺类如三乙醇胺。适当的缓冲溶液包括含有磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的溶液的缓冲液，维持pH在5.8至8；和含有磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的溶液的缓冲液，维持pH在6至7.5。其它缓冲液包括柠檬酸/柠檬酸钠，磷酸氢二钠/柠檬酸。
乳膏、软膏剂、洗剂、溶液、凝胶、喷雾剂和贴剂的各种实例可将如本文所述的组合物作为活性成分掺入，与渗透增强剂和其它活性剂一起组合，协同作用于皮肤，用于促进伤口愈合或伤口闭合或治疗慢性皮肤伤口。
在一个实例中，局部制剂可包含浓度为约0.005％重量至约50％重量的至少一种或多种寡核苷酸和/或至少一种或多种RNA分子。在水性载体中含有至少一种或多种寡核苷酸和/或至少一种或多种RNA分子的制剂通常可含有约0.005％重量至约0.5％重量的至少一种或多种寡核苷酸和/或至少一种或多种RNA分子，优选约0.01％重量至约0.1％重量，更优选约0.01％重量至约0.05％重量。在油或蜡载体中含有至少一种或多种寡核苷酸和/或至少一种或多种RNA分子的制剂通常可含有约0.005％至约50％重量的至少一种或多种寡核苷酸和/或至少一种或多种RNA分子，优选约0.01％重量至约25％重量，更优选约0.1％重量至约10％重量，最优选约0.1％重量至约5％重量。含有油相和水相的乳膏、洗剂或其它乳液通常含有至少一种或多种寡核苷酸和/或至少一种或多种RNA分子，其量为约0.005％至约25％重量，优选约0.005％至约10％重量，更优选约0.01％至约5％重量。乳膏、洗剂或其它乳液可以制备成油包水或水包油乳液；在任一种情况下，将含有至少一种或多种寡核苷酸和/或至少一种或多种RNA分子的疏水化合物溶解或分散在油相中。
合适的制剂包含浓度为约0.1至约0.3mg/mL(0.01％至0.03％)的至少一种或多种寡核苷酸和/或至少一种或多种RNA分子，以及浓度为约0.05至约0.2mg/ml的防腐剂苯扎氯铵。该制剂在媒介物中提供，所述媒介物包含pH为约6.8至约7.8的水作为溶剂。制剂可进一步包含氯化钠、磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲液和任选的氢氧化钠和/或盐酸以调节pH。
局部制剂可在瓶中提供给受试者，该受试者具有例如在受试者表面上发现的癌，所述瓶被设计为以逐滴形式施用制剂。该受试者可接着例如以1滴每5平方厘米受累皮肤至5滴每平方厘米受累皮肤的量，优选1滴(其中1滴为约0.02mL至约0.05mL，更优选约0.03mL)每5平方厘米受累皮肤至1滴每平方厘米受累皮肤的量，更优选1滴每2平方厘米受累皮肤的量，定期施用局部制剂至受累组织。在多个实施方案中，局部制剂可在每天四次至每周一次，优选每天两次至每周两次，更优选每天两次至每天一次的间隔下施用。施用的频率可依赖于局部制剂的浓度来调节，即，具有高浓度如本文所述的组合物的局部制剂可以比具有较低浓度的类似制剂少的频率施用。
口服施用的组合物和制剂包括粉末或颗粒，在水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、小药囊(sachet)或片剂。增稠剂、风味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘结剂可以是合适的。
胃肠外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可包括还可含有缓冲液、稀释剂和其它适当添加剂的无菌水溶液，所述添加剂例如但不限于渗透增强剂、载体化合物和其它药学上可接受载体或赋形剂。因此，在一个实例中，一种或多种寡核苷酸和/或一种或多种RNA分子还包含选自由药学上可接受的载体、脂质体载体、赋形剂、佐剂或其组合组成的组的化合物。
本文所述的组合物包括，但不限于，溶液、乳剂和含脂质体的制剂。这些组合物可由包括但不限于预形成的液体、自乳化固体和自乳化半固体的多种组分生成。
如本文所述的制剂可常规上以单位剂量形式存在，可根据制药工业中公知的常规技术来制备。此类技术包括使活性成分与一种(或多种)药物载体或一种(或多种)赋形剂联合的步骤。一般而言，制剂通过使活性成分与液体载体或细碎的固体载体或二者均一且紧密地联合，接着如必要将产物成形来制备。
如本文所述的组合物可制成多种可能的剂型中的任一种，所述剂型例如但不限于片剂、胶囊、液体糖浆剂、软凝胶、栓剂和灌肠剂。如本文所述的组合物还可制成水、非水或混合介质中的悬浮剂。水性悬浮剂可进一步包含增加悬浮剂粘性的物质，所述物质例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。悬浮剂还可包含稳定剂。
因此，在一个实例中，一种或多种寡核苷酸和/或一种或多种RNA分子以片剂、囊片、胶囊、硬胶囊、软胶囊、软弹性明胶胶囊、硬明胶胶囊、扁囊剂、糖锭、锭剂、分散剂、栓剂、软膏、巴布剂、膏药、糊剂、粉剂、敷料、乳膏、膏药、溶液、贴剂、气雾剂、鼻腔喷雾剂、吸入剂、凝胶、悬浮液、水性液体悬浮液、非水液体悬浮液、水包油乳液、油包水液体乳液、溶液、无菌固体、结晶固体、无定形固体、用于重构的固体或其组合。
在一个实例中，可将药物组合物配制并用作泡沫剂。药物泡沫剂包括制剂例如但不限于乳剂、微乳剂、乳膏、凝胶剂和脂质体。尽管性质基本类似，但这些制剂在终产物的组分和稠度上不同。
因此，在一个实例中，公开了包含至少一种或多种寡核苷酸和/或至少一种或多种RNA分子的药物组合物，其中所述一种或多种寡核苷酸在序列上与miR-198的核酸序列(SEQID NO:1)或其功能部分同源；和/或其中所述一种或多种RNA分子降低RNA靶标的水平和/或抑制RNA靶标的基因表达；其中RNA靶标是选自由卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)和尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)组成的组的基因。在另一个实例中，药物组合物中包含的一种或多种RNA分子是针对FSTL1的shRNA或shRNA的组合。在另一个实例中，siRNA序列选自由SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10及其组合组成的组。
如本文所述的组合物可另外包含常规见于药物组合物中的其它辅助组分。因此，例如，组合物可包含另外的、相容的、药学上的活性材料，诸如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或消炎剂等，或可包含用于物理上配制本发明组合物的各种剂型的另外的材料，例如染料、风味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，此类材料在添加时不应不适当地妨碍本发明组合物的组分的生物学活性。该制剂可被灭菌，必要时同不与制剂的核酸不利地相互作用的助剂混合，所述助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压用盐、缓冲液、着色剂、风味剂和/或香料等。
如本文所用的术语“治疗有效量”在其含义内包括足够但无毒量的至少一种或多种寡核苷酸和/或至少一种或多种RNA分子，以提供所需的治疗效果。所需的确切量将因受试者而异，取决于诸如所治疗的物种、受试者的年龄和一般状况、所治疗病症的严重程度、所施用的特定药剂、给药方式、活性化合物的生物利用度等因素。因此，不可能指定确切的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，本领域普通技术人员使用常规实验可以确定合适的“有效量”。
给药取决于待治疗疾病的严重程度和反应性，治疗过程持续数天至数月，或直至实现治愈，或实现疾病的减轻。可以根据受试者体内药物积累的测量来计算最佳给药方案。本领域技术人员可以容易地确定最佳剂量，给药方法和重复率。最佳剂量可以根据组合物的相对效力而变化，并且通常可以基于在体外和体内动物模型中发现的有效的EC50值或基于本文描述的实施例来估计。通常，剂量为0.01μg至100g/kg体重，并且可以每天、每周、每月或每年施用一次或多次。因此，在一个实例中，其中将所述寡核苷酸和/或RNA分子每天、每周、每周两次、每周三次、每两周和/或每月施用。
本领域技术人员可以基于所测量的体液或组织中药物的停留时间和浓度来估计给药的重复率。在成功治疗后，可能需要使受试者接受维持治疗以预防疾病的复发，其中组合物以维持剂量施用，例如，范围为0.01μg至100g/kg体重，每天一次或多次至每两年一次。
在一个实例中，如本文所述的包含至少一种或多种寡核苷酸和/或至少一种或多种RNA分子的组合物可以以约0.01μg、0.05μg、0.1μg、0.5μg、1μg、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、210μg、220μg、230μg、240μg、250μg、260μg、270μg、280μg、290μg、500μg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg中的任一个至约0.01μg、0.05μg、0.1μg、0.5μg、1μg、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、210μg、220μg、230μg、240μg、250μg、260μg、270μg、280μg、290μg、500μg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg或300mg中的任一个之间的浓度或量施用。应理解，此处提供的值是指待治疗的受试者的每千克体重的值。
在一个实例中，所述至少一种或多种寡核苷酸和/或所述至少一种或多种RNA分子可以独立施用或作为彼此的组合施用。在一个实例中，寡核苷酸和RNA分子彼此独立地施用，其量为约0.01μg、0.05μg、0.1μg、0.5μg、1μg、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、210μg、220μg、230μg、240μg、250μg、260μg、270μg、280μg、290μg、500μg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg中的任一个至约0.01μg、0.05μg、0.1μg、0.5μg、1μg、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、210μg、220μg、230μg、240μg、250μg、260μg、270μg、280μg、290μg、500μg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg或300mg中的任一个之间。应理解，此处提供的值是指待治疗的受试者的每千克体重的值。在一个实例中，所述至少一种或多种寡核苷酸和所述至少一种或多种RNA分子以约10μg/kg至300mg/kg体重的量彼此独立地施用。
在一个实例中，所述至少一种或多种寡核苷酸和/或所述至少一种或多种RNA分子可以彼此独立地施用，其量为约0.01μg、0.05μg、0.1μg、0.5μg、1μg、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、210μg、220μg、230μg、240μg、250μg、260μg、270μg、280μg、290μg、500μg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg中的任一个至约0.01μg、0.05μg、0.1μg、0.5μg、1μg、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、210μg、220μg、230μg、240μg、250μg、260μg、270μg、280μg、290μg、500μg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg或300mg中的任一个之间。应理解，此处提供的值是指待治疗的受试者的每千克体重的值。
在另一个实例中，所述至少一种或多种寡核苷酸和/或至少一种或多种RNA分子以0.1mg/kg至10mg/kg、0.1mg/kg至5mg/kg、1mg/kg至2.5mg/kg、2.5mg/kg至5mg/kg、5mg/kg至10mg/kg、5mg/kg至7.5mg/kg、7.5mg/kg至10mg/kg、至少1mg/kg、至少1.5mg/kg、至少1.8mg/kg、至少2mg/kg、至少2.5mg/kg、至少2.8mg/kg、至少3mg/kg、至少3.2mg/kg、至少3.5mg/kg、至少4mg/kg、至少4.5mg/kg、至少5mg/kg、至少5.5mg/kg、至少6mg/kg、至少6.5mg/kg、至少7mg/kg、至少7.5mg/kg、至少8mg/kg、至少8.5mg/kg、至少9mg/kg、至少9.5mg/kg或至少10mg/kg克体重的浓度施用。
如本文所用，术语“约”，在制剂组分的量或浓度的上下文中，通常表示所述值的+/-5％，更通常为所述值的+/-4％，更通常为所述值的+/-3％，更通常为所述值的+/-2％，甚至更通常为所述值的+/-1％，甚至更通常为所述值的+/-0.5％。
在一个实例中，如本文所公开的寡核苷酸和/或RNA分子可以彼此同时或相继施用。
如本文所公开和涵盖的试剂盒可以进一步掺入可检测的标记，例如荧光团、放射性部分、酶、生物素/抗生物素蛋白标记、发色团、化学发光标记等，或者试剂盒可以包括用于标记核酸引物、核酸探针的试剂或用于检测如本文所述的至少一种突变的存在或不存在的核酸引物和核酸探针。引物和/或探针、校准物和/或对照可以在单独的容器中提供或预先分配成合适的测定形式，例如，微量滴定板。
试剂盒可任选地包括进行诊断测定或促进质量控制评估所需的其它试剂，例如缓冲液、盐、酶、酶辅因子、底物、检测试剂等。其它组分，例如用于分离和/或处理测试样品的缓冲液和溶液(例如，预处理试剂)也可以包括在试剂盒中。试剂盒可另外包括一种或多种其它对照。可以将试剂盒的一种或多种组分冻干，并且试剂盒可以进一步包含适合于重构冻干组分的试剂。
将该试剂盒的各种组分任选地提供在合适的容器中。如上所述，一个或多个容器可以是微量滴定板。该试剂盒还可包括用于容纳或储存样品的容器(例如，用于血液或尿液样品的容器或药筒)。适当时，该试剂盒还可任选地包括反应容器、混合容器和便于制备试剂或测试样品的其它组分。该试剂盒还可以包括一个或多个用于辅助获得测试样品的仪器，例如注射器、移液器、镊子、测量的勺子等。
本文说明性描述的本发明可以在缺少本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应当被广泛地理解而不受限制。另外，本文使用的术语和表述已被用作描述而非限制的术语，并且无意使用这些术语和表述排除所示和所述特征的任何等同物或其部分，但认识到的是，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解的是，尽管已经通过优选实施方案和任选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用本文公开的其中体现的本发明的修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在本发明的范围内。
在本文中广泛和一般性地描述了本发明。落入通用公开内容中的每个较窄种类和亚属群组也构成本发明的一部分。这包括具有从该属中去除任何主题的附带条件或负面限制的本发明的一般描述，无论是否在本文中具体记载了被移除的材料。
贯穿本公开内容，某些实施方案可以以范围格式公开。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对所公开范围的范围的不能转变的限制。因此，应该认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，应当认为对诸如1至6的范围的描述具体公开了子范围例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的各个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。
其它实施方案在所附权利要求和非限制性实施例内。另外，在根据马库什群组描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以马库什群组的任何单个成员或成员亚组的形式描述。
实验部分
SCC中的缺陷分子开关
以前已经描述了miR-198/FSTL1分子开关，其控制来自单个转录物的两种替代基因产物的表达(图7A)。在正常皮肤中，来自FSTL1的3'-UTR的抗迁移miR-198的表达在受伤时转变为促迁移FSTL1蛋白的表达，以促进角质形成细胞迁移和伤口再上皮化。探索伤口愈合和进展性SCC之间平行的分子机制，检测miR-198和FSTL1在CSCC和HNSCC中的表达。与正常皮肤相比，使用特异性探针检测成熟miR-198的荧光原位杂交显示来自CSCC和HNSCC的组织切片中很少或没有miR-198(图7B，上图)。然而，在CSCC和HNSCC组织切片上用抗FSTL1抗体进行的免疫组织化学揭示了FSTL1蛋白的持续表达(图7B，下图)。这表明SCC中的伤口愈合期延长。此外，促迁移FSTL1的持续表达和抗迁移miR-198的永久缺失表明缺陷开关，其可能增强SCC中的细胞迁移。
微小RNA-198属于一小组miRNA，其需要KH型剪接调节蛋白(KSRP)进行加工。miR-198的缺失促使我们检查了SCC中KSRP的表达。SCC组织切片的免疫组织化学显示，与正常皮肤相比，KSRP表达显著下调(图7C，上图)。RNA结合蛋白KSRP是微小RNA-181a(miR-181a)的潜在靶标(图14a)。对SCC组织切片的研究揭示了miR-181a表达的显著上调(图7C下图)，表明KSRP可能是SCC中miR-181a的靶标。使用抗miR-181a敲减miR 181a(图14b)，导致KSRP蛋白表达显著增加(图7D，上图)，这证实KSRP是SCC中miR-181a的直接靶标。此外，在敲减miR-18a时明显的是FSTL1表达显著降低(图7D中图)伴随着miR-198表达的增加(图7E)。总之，这些结果表明miR-181a是SCC中分子开关的上游调节因子。增加的miR-181a的异常表达抑制KSRP，并且在不存在KSRP的情况下，miR-198的加工失败，导致FSTL1的持续表达。
EGF驱动的微环路劫持了分子开关
已知TGF-β介导的致癌miR-181a表达的上调促进乳腺癌转移并诱导肝细胞癌中的上皮-间质转化(EMT)。尽管miR-181a在CSCC和HNSCC中异常过表达，仍观察到极低水平的TGF-β(图8A，上图)。由于EGFR扩增和EGF诱导的EMT在SCC中是众所周知的，因此研究了EGF作为miR-181a的上游调节因子的作用。与正常皮肤相比，在CSCC和HNSCC组织切片中清楚地看到增加的EGF表达(图8A，中图)和增加的EGFR表达(图8A，下图)。用外源性EGF刺激SCC12细胞导致miR-181a的上调，并且EGFR抑制剂(PD153035)的加入导致miR-181a的下调，证实了EGF作为miR-181a在SCC中的上游调节因子的作用(图8B)。此外，用EGF下调KSRP表达和用EGFR抑制剂PD153035恢复KSRP表达(图8C，上图)证实EGF是SCC中miR-181a的上游调节因子。最后，用EGF处理导致FSTL1的上调，伴随着miR-198的下调。使用EGFR抑制剂消除EGF信号传导逆转了这种反应，表明EGF是SCC中该开关的主控制器(图8C，8D)。该观察结果在来自CSCC和HNSCC的细胞系中是一致的。总之，EGF驱动的微环路劫持分子开关，从而阻止抗迁移miR-198的表达，并允许促迁移FSTL1的持续表达(图8E)。
FSTL1和DIAPH1增强SCC细胞的迁移和侵袭
然后寻求研究SCC中miR-198的促迁移靶标的表达。透明同源物1(DIAPH1)是肌动蛋白聚合和定向细胞迁移的关键参与者，是miR-198的直接靶标。使用抗DIAPH1抗体对CSCC和HNSCC组织切片的免疫组织化学显示DIAPH1的高表达(图9A)。因此，调节分子开关，EGF阻断抗迁移miR-198的表达。这导致促迁移靶基因DIAPH1的持续表达。
为了研究FSTL1和DIAPH1的特定作用，在评估敲减效率后，将对照SCC12细胞、siFSTL1或siDIAPH1细胞进行Boyden室跨孔测定(图152A，152D)。在跨孔迁移后，计数附着于过滤器下表面的细胞。与对照SCC12细胞相比，FSTL1或DIAPH1的瞬时敲减导致细胞迁移显著减少，减少率分别为37.45±3.65％和34.23±2.88％(图15)。此外，使用针对FSTL1或DIAPH1的特异性shRNA对FSTL1或DIAPH1的组成型敲减(图16)导致从间充质到上皮表型的转变(图9B，上图)。在24小时内跟踪细胞轨迹的活细胞成像显示细胞迁移显著减少，同时失去FSTL1或DIAPH1(图9B，下图，9C)。作为最终确认，对照SCC12细胞、shFSTL1和shDIAPH1细胞进行3维器官型测定，其模拟体内基质侵袭。与对照SCC12细胞相比，FSTL1或DIAPH1的敲减导致侵袭基质胶的细胞数量显著减少(图9D，9E)。这些结果表明，FSTL1和DIAPH1的持续表达可能增强癌细胞的迁移和侵袭。
FSTL1和DIAPH1促进转移性定殖
然后寻求确定FSTL1和DIAPH1在癌转移进展中的作用。表达遗传修饰的萤光素酶的HNSCC细胞系(A253细胞系)单独或组合地用编码shFSTL1或shDIAPH1的慢病毒转导。通过侧尾静脉注射将细胞植入免疫缺陷的NSG小鼠中并评估转移性定殖。与对照细胞相比，FSTL1或DIAPH1的沉默独立地显著降低了肺定殖(图10A和B)。组织学定量揭示了敲减FSTL1或DIAPH1后转移集落总数的显著减少(图10C和D)。值得注意的是，FSTL1和DIAPH1的同时敲减导致肺集落数量显著减少，大多数小鼠中没有可见集落(图10C和D，P值<0.001)。总之，这些结果表明FSTL1和DIAPH1对于转移是必需的，并突出了协同基因对FSTL1-DIAPH1在转移性定殖中的重要性。
协同基因对FSTL1-DIAPH1的预后意义
询问来自TCGA数据库中的262名HNSCC患者的数据，产生常规的Kaplan-Meier存活曲线以比较他们的总体存活。这里，使用能够识别二维轴上的表达截止值的2维数据驱动分组(2D-DDg)方法将患者群组分层为显著存活的亚组。根据2D-DDg方法将患者分为四个区段(图11A和11B)。结果表明FSTL1和DIAPH1分别表现出致癌行为(图11A和11B)，然而组合时，基因对的预后特征产生稳健的患者分层，对数秩p值＝0.000061(图11C和D)。
机制上DIAPH1和FSTL1分别通过螯合ARPIN和Wnt7a促进转移
为了理解DIAPH1增强转移的机制，进行BioID(邻近依赖性生物素鉴定)分析以鉴定与DIAPH1相互作用的候选蛋白质(图18)。在与DIAPH1相互作用的几个候选者中，ARPIN被鉴定为新的潜在相互作用配偶体(图12A)。ARPIN是细胞迁移的负调节因子，其阻断Arp2/3复合物与其它成核因子的缔合并抑制细胞迁移。为了研究DIAPH1与ARPIN的相互作用，用抗DIAPH1抗体对来自对照或shDIAPH1A253细胞的细胞裂解物进行免疫沉淀(IP)，并通过蛋白质印迹分析针对ARPIN探测免疫沉淀物。ARPIN仅在对照样品中富集，但在DIAPH1耗尽的样品中没有富集，证实了ARPIN与DIAPH1的特异性相互作用(图12B)。据推测，DIAPH1相互作用并螯合ARPIN以阻止其与Arp3(Arp2/3复合物的组分)的相互作用，从而增强SCC中的极化细胞迁移。为了验证该假设，来自对照或shDIAPH1A253细胞的细胞裂解物进一步用抗ARPIN抗体进行免疫沉淀，并通过蛋白质印迹分析针对Arp3探测免疫沉淀物。与对照样品相比，DIAPH1耗尽样品中Arp3的显著富集突出了DIAPH1在螯合ARPIN并由此阻止ARPIN与Arp3的相互作用中的作用(图12C)。总之，DIAPH1螯合ARPIN，ARPIN是Arp2/3复合物的竞争性抑制剂，并促进癌细胞的不断迁移。接下来，研究了FSTL1促进SCC侵袭和转移的机制。转录组分析显示，SCC细胞中FSTL1的敲减导致细胞外基质(ECM)降解酶基质金属蛋白酶9(MMP9)的显著下调(图12D，18)。此外，FSTL1敲减后MMP9活性的降低表明，FSTL1可能是MMP9表达的上游调节因子(图12E)。EGF通过细胞外信号调节激酶(ERK)途径刺激ECM降解蛋白酶MMP9的表达。此外，EGF劫持分子开关并使FSTL1持续表达。将这些发现联系起来，假设FSTL1是SCC中EGF介导的MMP9表达的潜在上游调节因子。为了验证该假设，用30ng/ml的EGF处理对照或shFSTL1A253细胞。qRT-PCR分析清楚地表明，在缺乏FSTL1的情况下，EGF介导的MMP9上调不能发生，证实FSTL1对于EGF介导的MMP9表达是必需的(图12F)。当EGF调节MMP9表达时，通过激活ERK，针对ERK或磷酸化ERK的表达探测来自EGF处理的对照或shFSTL1A253细胞的细胞裂解物。FSTL1的缺失导致EGF介导的ERK磷酸化显著降低(图12G)。总之，这些结果强调了FSTL1作为SCC中MMP9表达的上游调节因子的作用。接下来，询问分泌的糖蛋白FSTL1如何调节MMP9的表达。为了鉴定该调节的潜在效应物，筛选了生物相互作用数据集通用库(BioGRID)，该数据库包含经实验验证的蛋白质-蛋白质相互作用物。BioGRID分析揭示了FSTL1的26个潜在相互作用配偶体，其包括Wnt4、Wnt5a、Wnt7a和Wnt10b(图19)。为了鉴定FSTL1的特异性相互作用物，将来自A253细胞的细胞裂解物用抗FSTL1抗体或IgG对照进行免疫沉淀，并通过蛋白质印迹分析针对Wnt4、Wnt5a、Wnt7a和Wnt10b探测免疫沉淀物。检测到Wnt7a的显著富集证实了其与FSTL1的特异性相互作用(图12H)。Wnt7a抑制EGF信号传导，抑制肿瘤细胞侵袭，但其确切机制尚不清楚。
为了理解Wnt7a在SCC中的作用，用对照或shFSTL1RNA转导的A253细胞用针对Wnt7a的特异性siRNA进行转染(图20)。转染后，用EGF处理细胞以刺激ERK磷酸化。FSTL1的敲减导致ERK磷酸化的抑制，相反，Wnt7a的敲减导致ERK磷酸化的恢复(图12I)。这些结果表明，与FSTL1相反，Wnt7a是SCC中EGF介导的ERK磷酸化的抑制剂。然而，FSTL1和Wnt7a的同时敲减不影响ERK的磷酸化(图12I)。总之，所有上述结果表明FSTL1拮抗Wnt7a并允许永久性EGF介导的ERK磷酸化。通过排除作为EGF-ERK-MMP9级联的负调节因子的Wnt7a，FSTL1增强癌细胞的侵袭和转移(图13)。
EGF驱动的微环路劫持了伤口愈合开关
在正常皮肤中，来自FSTL1的3'-UTR的抗迁移miR-198的表达在受伤时转变为促迁移FSTL1蛋白的表达，以促进角质形成细胞迁移和伤口再上皮化。miR-198/FSTL1伤口愈合开关控制来自单个转录物的两种替代基因产物的表达(图1A)。探索伤口愈合和进行性鳞状细胞癌之间平行的分子机制，分析头颈部小细胞癌(HNSCC)中miR-198和FSTL1的表达。使用特异性探针检测成熟miR-198的荧光原位杂交揭示了，与正常舌组织相比，来自HNSCC的组织切片中很少或没有miR-198(图1B，上图)。
然而，在HNSCC组织切片上使用抗FSTL1抗体的免疫组织化学揭示了HNSCC中FSTL1蛋白的持续表达(图21B，下图)。促迁移FSTL1的持续表达和抗迁移miR-198的永久缺失表明可促进HNSCC中细胞迁移增加的缺陷开关。
伤口愈合开关由TGF-β调节，其关闭miR-198并在受伤时打开FSTL1表达。然而，低水平的TGF-β(图8，上图)表明HNSCC中的不同调节模式。然而，表皮生长因子(EGF)在HNSCC中的表达增加(图8，下图)和EGF在乳腺癌中下调miR-198，表明EGF与分子开关之间存在联系。用EGF处理HNSCC细胞系(包括A253、SCC12或FaDu细胞)导致miR-198的下调(图21C)伴随FSTL1表达的增加(见图21D(上图))。为了解决EGF调节分子开关的潜在机制，检查了KH型剪接调节蛋白(KSRP)的表达。微小RNA-198属于需要KSRP进行加工的一小组miRNA。用EGF处理后，KSRP表达显著下调(图21D(下图))。所有上述结果表明，表皮生长因子(EGF)通过下调KSRP关闭miR-198表达并允许FSTL1的持续表达。
接下来，为了研究EGF下调KSRP的机制，分析了miR-181a的表达。KSRP 3'-UTR具有miR-181a的高度保守结合位点(图21E)，被表明是miR-181a的直接靶标。用EGF处理后miR-181a表达显著增加(图21F)，表明miR-181a是EGF的下游效应物。此外，在HNSCC组织中KSRP的下调(图21G，上图)和miR-181a的表达模式的反相关(图21G，下图)，均表明KSRP和miR-181a之间存在联系。然而，在敲减miR-181a后(图21H)，KSRP蛋白表达显著增加(图21H，上图)，证实KSRP是miR-181a的靶标。此外，FSTL1表达显著降低(图21H，中图)伴随miR-198表达的增加(图21I)在miR-181a的敲减后是明显的，因此强调了miR-181a作为分子开关的上游调节因子的作用。总之，上游网络被破译，其中EGF介导的miR-181a上调靶向KSRP，并且在不存在KSRP的情况下，miR-198的加工失败，导致HNSCC中FSTL1的持续表达(图21J)。
缺陷开关是促侵袭的
在不存在抗迁移miR-198的情况下，检查了HNSCC中促迁移靶标的表达。在正常的表皮创伤后，miR-198沉默开关解抑制几种不同的机制途径，其促进细胞迁移和组织重塑以进行伤口愈合。这些促迁移miR-198靶基因包括尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)(参与细胞外基质降解的丝氨酸蛋白酶)、参与肌动蛋白聚合的透明同源物1(DIAPH1)和层粘连蛋白γ2链(LAMC2)(形成部分必需基底膜蛋白层粘连蛋白332)。然而，基于HNSCC中的表达模式，这里的重点是DIAPH1及其在HNSCC中的作用。使用抗DIAPH1抗体对HNSCC组织切片的免疫组织化学清楚地表明在HNSCC中DIAPH1的异常表达(图22A)。DIAPH1是miR-198的直接靶标，并且如在正常舌组织中存在高水平miR-198时所预期的，很少或没有观察到DIAPH1(图22A)。此外，miR-198和DIAPH1表达的逆相关是明显的(图22B)，～80％的患者显示在HNSCC组织切片中DIAPH1表达增加伴随miR-198减少。缺陷开关促进促迁移DIAPH1和FSTL1的持续表达。为了研究两种基因在HNSCC中的特定作用，对细胞进行Boyden室跨孔测定。在跨孔迁移后，计数附着于过滤器下表面的细胞。DIAPH1或FSTL1的瞬时敲减(图5A和6A)导致与对照SCC12细胞相比，细胞迁移显著减少，减少率分别为37.45±3.65％和34.23±2.88％(图22C和22D)。此外，使用针对FSTL1或DIAPH1的特异性shRNA对FSTL1或DIAPH1进行组成型敲减(图5B和6B)导致从间充质到上皮表型的转变(图22E，上图)。在24小时的时间内跟踪细胞轨迹的活细胞成像显示细胞迁移显著减少，同时FSTL1或DIAPH1缺失(图22E，下图和22F)。最后，将shFSTL1或shDIAPH1细胞或组合的敲减细胞进行3维器官型测定，其模拟体内基质侵袭。与对照SCC细胞相比，FSTL1或DIAPH1的敲减导致侵袭基质胶的细胞数量显著减少，然而两种基因的组合敲减几乎完全抑制细胞侵袭基质胶(图22G)。总之，这些结果表明FSTL1和DIAPH1的持续表达潜在地增强癌细胞的迁移/侵袭，并且缺陷开关是促侵袭的。
FSTL1-DIAPH1基因对的预后意义
为了确定FSTL1和DIAPH1在转移中的作用，单独或组合地用编码shFSTL1或shDIAPH1的慢病毒转导表达遗传修饰的萤光素酶的A253和FaDu细胞系。通过侧尾静脉注射将细胞植入免疫缺陷的NSG小鼠中并评估转移性定殖。与对照细胞相比，FSTL1或DIAPH1的沉默独立地显著降低了肺定殖(图23A)。组织学定量显示在敲减FSTL1或DIAPH1后转移集落的总数显著减少(图23B)。FSTL1和DIAPH1的同时敲减导致肺集落数量的显著减少，在大多数小鼠中没有可见的集落(图23A，23B和23C，p<0.001)。结果在A253和FaDu细胞系中均一致(数据未显示)。总之，上述结果突出了基因对FSTL1-DIAPH1在HNSCC转移性定殖中的重要性。
为了解缺陷开关的临床意义，对来自癌症基因组图谱(TCGA)研究网络(TCGA，2015)的262名经诊断有头颈癌的患者的表达谱和临床数据进行了询问。从数据库下载RNA表达的3级RPKM强度值并进行分析。独立地，通过1D-DDg评估基因FSTL1和DIAPH1的存活意义。结果显示，FSTL1(边界显著，秩和检验p＝0.0583)和DIAPH1(秩和检验p＝0.00160)均独立地表现出致癌行为，而较高的表达对应于患者的总体存活率差。
接下来，为了研究两种基因FSTL1和DIAPH1的潜在组合效应，使用2维数据驱动分组(2D-DDg)方法来鉴定二维轴上的表达截止值以将患者群组分层为显著生存亚组。基于通过2D-DDg方法获得的表达截止值，Kaplan-Meier存活图显示FSTL1和DIAPH1低表达的患者表现出相对良好的总体存活率(图23D-象限a和3E)。相反，在其中只有FSTL1(图23D-象限c和3E)或DIAPH1(图23D-象限b和23E)具有更高的表达的患者亚组中，存在可观察到的向生存率差的趋势。
最后，在FSTL1和DIAPH1高表达的患者中(图23D-象限d和23E)，与其它患者亚组相比，总体存活率显著较差。结果表明，FSTL1和DIAPH1都表现出致癌行为，然而，当组合时，该基因对的预后特征产生了稳健的患者分层，其中秩和检验p值＝6.111e-05(图23F)。这表明这两个基因之间在HNSCC的发展、进展和预后中具有潜在的组合效应。
EGF驱动的微环路引导双分叉途径转向转移
为了研究DIAPH1促进转移的潜在分子机制，进行BioID(邻近依赖性生物素鉴定)分析以鉴定DIAPH1的潜在相互作用配偶体。Arpin是细胞迁移的负调节因子，被鉴定为DIAPH1的候选相互作用配偶体(图24A)。已知Arpin(Arp2/3复合物的竞争性抑制剂)有助于片状伪足的崩溃并限制细胞迁移。另一方面，DIAPH1是EGF调节的肌动蛋白成核剂，已知其与Arp2/3复合物一起使分支的肌动蛋白丝聚合成核，形成驱动细胞迁移的片状伪足(薄片状膜突起)。不受理论束缚，假设DIAPH1可以螯合Arpin，并防止其与Arp2/3复合物缔合，从而增强细胞迁移。
为了证实DIAPH1与Arpin的相互作用，使用抗DIAPH1抗体对来自对照或shDIAPH1A253、SCC12或SCC13细胞的细胞裂解物进行免疫沉淀(IP)，并通过蛋白质印迹分析针对的Arpin探测免疫沉淀物。与DIAPH1耗尽的样品相比，对照样品中Arpin的显著富集证实了Arpin与DIAPH1的特异性相互作用(图24B)。此外，来自对照或shDIAPH1细胞的细胞裂解物用抗Arpin抗体进行免疫沉淀，并通过蛋白质印迹分析针对Arp3探测免疫沉淀物。与对照样品相比，DIAPH1耗尽样品中Arp3的显著富集突出了DIAPH1在螯合Arpin中的作用，从而阻止Arpin与Arp3的相互作用(图24C)。这些结果在多个细胞系中是一致的。总之，数据突出了DIAPH1对负调节因子Arpin的螯合。已知Arpin同时降低迁移的细胞速度和定向持续性。本文显示的数据表明DIAPH1螯合并阻断Arpin与Arp2/3复合物的相互作用，导致增加的细胞运动性、迁移的定向持续性和癌的转移。
为了研究FSTL1促成HNSCC转移的机制途径，进行微阵列分析，比较来自对照与shFSTL1SCC12细胞的基因表达。在敲减FSTL1时MMP9的显著下调是明显的(图24D)并通过qRT-PCR分析进一步验证(图24G)。此外，对照细胞中MMP9的检测和在FSTL1敲减后MMP9活性降低(图24E)均表明FSTL1是MMP9表达的上游调节因子。然而，已知EGF激活细胞外信号调节激酶(ERK)刺激MMP9的表达。当EGF通过激活ERK途径调节MMP9表达时，针对ERK或磷酸化ERK的表达探测来自EGF处理的、对照或shFSTL1A253细胞的细胞裂解物。FSTL1的缺失导致EGF介导的ERK磷酸化显著降低(图24F)，表明FSTL1对于EGF介导的ERK磷酸化是必需的。此外，qRT-PCR分析清楚地表明，在缺乏FSTL1的情况下，EGF介导的MMP9上调失败，证实FSTL1对于EGF介导的MMP9表达是必需的(图24G)。这些结果在测试的多个细胞系中是一致的。总之，所有上述结果表明FSTL1作为EGF介导的MMP9表达的上游调节因子的重要作用。EGF劫持分子开关并允许FSTL1持续表达，导致ERK激活；其由此刺激MMP9表达，导致ECM降解和HNSCC转移。
为了理解分泌的糖蛋白FSTL1如何调节ERK磷酸化，阐明了FSTL1的蛋白质相互作用因子。用于生物相互作用数据集通用库(BioGRID)分析揭示了FSTL1的多个相互作用配偶体，包括Wnt4、Wnt5a、Wnt7a和Wnt10b(图19)。将来自A253细胞的细胞裂解物用抗FSTL1抗体或IgG对照进行免疫沉淀，并通过蛋白质印迹分析针对Wnt4、Wnt5a、Wnt7a和Wnt10b探测免疫沉淀物。然而，仅检测到Wnt7a，表明在HNSCC中FSTL1与Wnt7a的特异性相互作用(图24H)。另一方面，已知Wnt7a抑制EGF信号传导，并抑制肿瘤细胞的侵袭。总之，这导致以下假设，即FSTL1相互作用、螯合并阻断Wnt7a，从而允许EGF介导的ERK磷酸化，其导致MMP9表达。为了测试该假设，用针对Wnt7a的特异性siRNA转染shFSTL1A253细胞并且转染后，用EGF处理细胞以刺激ERK磷酸化。
FSTL1的消耗抑制ERK磷酸化，然而，Wnt7a的敲减导致ERK磷酸化的恢复(图24I)，表明Wnt7a在HNSCC中作为EGF介导的ERK磷酸化的抑制剂的作用。然而，同时敲减FSTL1和Wnt7a不会影响ERK的磷酸化(图24I)。总之，所有上述结果表明在HNSCC中分泌的糖蛋白FSTL1与Wnt7a相互作用并拮抗Wnt7a介导的ERK磷酸化的抑制。这允许ERK的磷酸化，其刺激MMP9的表达，导致细胞外基质降解并促进癌细胞的转移(图24J)。
伤口愈合是一种自限性动态事件，其中屏障破坏是短暂的。在伤口修复后，激活的角质形成细胞恢复到静止状态并重新分化以恢复功能性表皮屏障，而癌细胞持续处于激活状态，维持迁移和转移的典型基因表达谱。
许多miRNA在癌症中作为肿瘤抑制因子或癌基因的特定作用是众所周知的。抗迁移miR-198靶向有丝分裂和促运动途径的调节因子并抑制迁移。然而，由于缺陷开关，在HNSCC中，miR-198表达被阻断，导致包括DIAPH1在内的促迁移靶基因的持续表达。DIAPH1在间期微管稳定中的作用是众所周知的，并且在结肠癌细胞中DIAPH1耗尽时观察到癌细胞的转移潜力降低。DIAPH1是EGF调节的肌动蛋白成核剂，与Arp2/3复合物一起，使分支肌动蛋白丝聚合成核，形成薄片状膜突起(称为片状伪足)并驱动极化细胞迁移。然而，作为Arp2/3复合物的竞争性抑制剂和负调节因子的Arpin导致了片状伪足的崩溃，施加严格的制动并限制细胞迁移。在HNSCC中，揭示了多功能DIAPH1的另一个作用，它螯合Arpin，并有利于迁移的定向持续性，从而增强癌的转移(图24J)。
EGF介导的ERK级联的激活调节细胞迁移和侵袭性表型的获得。此外，使用中和抗体抑制MMP9活性损害了EGF诱导的HNSCC侵袭，证实了MMP9在SCC侵袭中的作用。本文公开的数据还证实了EGF在调节MMP9表达中的作用，MMP9是HNSCC的已知预后生物标志物。然而，显示在不存在FSTL1的情况下，EGF驱动的信号传导级联不能上调MMP9，表明FSTL1是MMP9的上游调节因子。已知Wnt7a抑制EGF信号传导，抑制肿瘤细胞增殖和侵袭。在HNSCC中，分泌的糖蛋白FSTL1与Wnt7a相互作用并拮抗Wnt7a介导的ERK磷酸化的抑制，导致MMP9表达(图24J)。
FSTL1在伤口愈合中的功能与其在HNSCC病理学中的作用之间的微妙但关键的界限表明FSTL1表达必须严格调节，允许该蛋白质发挥其生理功能，同时避免持续的不适当表达的有害后果。这强调了调节开关的重要性，其控制miR-198和FSTL1的时间和互斥表达。癌细胞劫持调节开关，关闭miR-198表达，从而允许持续表达促迁移FSTL1和DIAPH1(图24J)。该结果为这一复杂系统增加了另一条证据，强调正常的伤口愈合事件不足以触发肿瘤形成。然而，伤口微环境的异常维持促进细胞迁移、侵袭和转移增加，导致致癌作用。这里显示了缺陷开关的调节，以导致开发治疗策略以治疗HNSCC，改善患者预后。
材料和方法
细胞培养和SCC组织阵列
将HNSCC细胞系(A253、SCC12、SCC13和FaDu)在RM+培养基(3:1DMEM；F12HAMS培养基，其补充有10％FBS、0.5μg/ml氢化可的松、5μg/ml胰岛素和转铁蛋白、13ng/ml三碘代甲状腺素、1％谷氨酰胺、10ng/ml表皮生长因子和青霉素/链霉素)中培养。含有皮肤鳞状细胞癌切片(76个皮肤SCC组织切片，2个与肿瘤相邻的正常切片和2个正常皮肤切片)的组织阵列(SK802a)获自US Biomax。将人包皮真皮成纤维细胞和lenti-X 293T(Clonetech)在补充有10％FCS和青霉素/链霉素的DMEM中培养。HNSCC组织阵列(HN803b)获自US Biomax。5个HNSCC切片对KRT14/KRT5呈阴性，因此对于进一步研究将其排除。将人包皮真皮成纤维细胞和lenti-X 293T(Clontech)在补充有10％FCS和青霉素/链霉素的DMEM中培养。
抗体
本研究中使用的抗体如下。山羊抗FSTL1抗体(#ab11805,Abcam)、兔抗FSTL1抗体(Protein tech)、兔抗DIAPH1抗体(#5486,Cell Signaling)、兔抗KSRP抗体(#A302-22A,Bethyl laboratories)、ms抗KRT14(克隆LLO01)、小鼠抗EGF(R&D systems,克隆10825)、小鼠抗TGF-β1(Novacastra)、兔抗GFP(Covance)、兔抗cMyc(Sigma)。链霉抗生物素蛋白Alexa555、鸡抗山羊Alexa 488和驴抗兔/小鼠Alexa 488/555来自Molecular probes。兔抗Arp3(#4738)、磷酸(#9101)和总ERK抗体(#9102)来自Cell Signaling。兔抗Arpin(#ABT251)购自Merck Millipore。本文使用的其它抗体是小鼠抗LAMC2抗体(#sc25341,Santacruzbiotechnologies)、兔抗PLAU(#ab24121,Abcam)、小鼠抗-TGF-β1(克隆9016,R&D system)、兔抗HuR抗体(#ab85539)、兔抗CSPG4(#ab104535)、小鼠抗cMET(克隆11.1,Wong等,2013)、小鼠抗MMP9(#sc13520,Santa Cruz biotechnologies)。
稳定的敲减和微阵列分析
使用siRNA向导软件(Invitrogen)针对FSTL1/DIAPH1序列的开放阅读框设计shRNA。将shRNA克隆到慢病毒shRNA表达载体(pKAMU)中，其中H1启动子通过RNA聚合酶III驱动shRNA的表达。通过共转染sh对照/shFSTL1/shDIAPH1载体和慢病毒包装质粒混合物(pMDLg/pRRE、pRSV-Rev和pMD2.G)，在Lenti-X 293T细胞(Clontech)中产生三代慢病毒。用编码乱序shRNA的对照慢病毒或针对FSTL1/DIAPH1的shRNA转导HNSCC细胞系。用2μg嘌呤霉素选择具有稳定整合的慢病毒的细胞2周。使用Exiqon miRcury RNA分离试剂盒从细胞中分离总RNA。使用TargetAmp Nano-g Biotin-aRNA标记试剂盒(Epicenter)将250ng总RNA转化为生物素化的cRNA。使用一式三份的样品将750ng生物素化的cRNA与HT-12V4表达珠芯片(Illumina)杂交。根据制造商的方案进行杂交、洗涤和扫描。使用Illumina BeadStudio对提取的数据进行归一化和分析。
Boyden室侵袭试验
通过使用Dharmafect 1转染试剂按照制造商的方案转染50nM的On-target plussmart-pool siRNA(Dharmacon/Thermofischer scientific)，实现FSTL1、DIAPH1、PLAU和LAMC2的瞬时敲减。转染非靶向siRNA作为阴性对照。在BD生物涂层基质胶侵袭测定室中进行体外侵袭测定。转染后两天收获细胞并在没有血清的RM+培养基中接种到上室上。完整的RM+培养基用作下室中的化学引诱剂。接种后20小时，用棉签擦拭膜上方的细胞，将侵袭的细胞固定在甲醇中并用吉姆萨溶液染色。细胞侵袭表示为在三个生物学重复中每个室的六个显微镜视野中侵袭的细胞的百分比。转染的非靶向siRNA中的侵袭细胞数被认为是100％。
器官型侵袭测定和定量
如本领域所述建立器官型测定，稍作修改。简而言之，在冰冷的条件下，将等量的基质胶(#354234BD Biosciences)和大鼠尾胶原蛋白I型(#354236BD Biosciences)与十分之一体积的FCS和10X DMEM混合并通过添加0.1N NaOH将pH调节至中性。将约800μl该溶液加入到millicell悬挂细胞培养插入物中，并置于12孔板(Nunc)中，在37℃固化1小时。将完整的成纤维细胞培养基加入到插入物的顶部和底部，并在37℃放置过夜。将人真皮成纤维细胞(1×105)与SCC细胞系(2.5×105)混合并接种到凝胶上并使其生长浸没在RM+培养基中24小时。第二天将插入物提升至空气液体界面，并将培养物保持在RM-培养基(没有表皮生长因子的RM+培养基)中两周，之后处理器官型凝胶用于组织学。如本领域所述定量角蛋白14阳性细胞的侵袭深度。
免疫组织化学
将五微米组织切片固定在聚赖氨酸涂覆的载玻片(Thermo Scientific)上。将切片在二甲苯中脱石蜡并使用渐降的乙醇浓度再水合，最后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中再水合。通过将载玻片浸入3％过氧化氢和甲醇中30分钟来淬灭内源过氧化物酶。使用具有“靶标回收溶液”、pH 6.0(Dako)的可编程压力锅进行抗原恢复(取决于抗体)。通过在PBS中的10％山羊血清中孵育阻断组织中的非特异性反应性，然后在室温与第一抗体孵育。在与物种匹配的第二HRP标记的聚合物抗体(Dako)孵育之前除去第一抗体。将色原体3,3'-二氨基联苯胺(Dako)用作显色的底物。载玻片在脱水前用苏木精复染，并用DPX(Sigma)固定。对于荧光免疫检测，使用与Alexa 488/555缀合的物种特异性第二抗体代替HRP标记的聚合物抗体。用流动的自来水洗涤切片，用DAPI(100ng/ml)复染，并使用Florsave(Calbiochem)封固剂固定。对于使用山羊第一抗体的实验，用PBS中的5％BSA代替10％山羊血清。在ZeissAxioimager显微镜(对于亮视野成像)或Olympus FluoView FV1000(对于荧光抗体检测)上获得图像。组织阵列中染色强度的定量由两个独立的观察者在视觉上进行。通过平均独立观察，将强度分为负、弱、中等和强。
miRNA原位杂交
将5μm切片在预处理溶液(Panomics)中处理并煮沸，在PBS中洗涤，然后在37℃进行蛋白酶(Panomics)处理。将切片与LNA探针[特异于miR-198/miR-181a的5’-DIG标记的LNA探针或与已知脊椎动物miRNA没有同源性的乱序探针(Exiqon))在杂交缓冲液(Roche)中于51℃孵育4小时。严格洗涤后，切片用10％山羊血清封闭，并进一步与抗DIG碱性磷酸酶(Roche)在4℃孵育过夜。将切片在PBS-T(0.1％)中洗涤，并通过固红(fastred)底物(Panomics)检测miRNA结合的LNA探针。用DAPI复染后，使用FluorSave(Merck)固定载玻片。使用TRITC过滤器用Olympus FluoView FV1000进行图像采集。
体内肺转移测定
从Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME,USA获得六至八周龄的雌性NOD-scidIL2Rgnull近交小鼠，并将其饲养在特定无病原体的动物设施中。给动物喂食经辐照的小鼠食物和高压灭菌的反渗透处理水。所有动物程序均按照机构动物护理和使用委员会(IACUC#120793)批准的方案进行。用胰蛋白酶/EDTA收获组成型表达萤光素酶的A253细胞，其用表达对照shRNA或针对FSTL1或DIAPH1或FSTL1和DIAPH1的组合的shRNA的慢病毒转导。洗涤细胞并以每毫升5×106个细胞的浓度重悬。通过尾静脉向小鼠注射总共0.5×106个细胞，每组使用7只小鼠的组群。通过使用IVIS Spectrum体内成像系统(Xenogen,PerkinElmer,MA,USA)检测24小时后肺中的生物发光来监测细胞的存活和成功注射。在每次成像期间，将每kg体重总共150mg萤光素施用到腹膜腔中。在萤光素注射后9分钟对小鼠成像以确保一致的光子通量。生物发光信号以每秒光子表示并显示为强度图。调整图像显示以在图像中提供最佳对比度和分辨率而不影响定量。采集后，将所有图像归一化为平均效率单位，以相同的发光强度标度显示，并使用Living Image 4软件(Xenogen,Perkin Elmer,MA,USA)进行分析。使用感兴趣的工具区域在肺中测量来自细胞的发光。将该定量作为相对生物发光单位对时间作图。数据表示为平均值±标准偏差(SD)。使用学生t检验方法估计统计学分析。p<0.05的值被解释为显著。注射后30天，使小鼠安乐死，收获肺，固定并加工成FFPE块。使用兔抗人KRT5抗体通过免疫组织化学检测微转移灶中的癌细胞。
酶谱
将20μl细胞培养物上清液上样到含有0.15％明胶的SDS-PAGE上并在其上分析，然后在2.5％Triton x 100中洗涤两次。将凝胶在含有50mM Tris HCl pH 7.4、150mM NaCl和10mM CaCl2的显影剂缓冲液中在37℃浸泡过夜，并通过在0.2％考马斯亮蓝R-250中将凝胶染色1小时、然后在30％甲醇和7％乙酸中进行多轮脱色来显现。通过Image J量化条带强度，并在将值对背景强度归一化后绘图。通过重组MMP9在相同凝胶中的共迁移鉴定MMP9的位置。
DIAPH1相互作用配偶体的生物素-链霉抗生物素蛋白亲和纯化
DIAPH1的全长cDNA(登录号：NM_005219)购自Origene。PCR扩增DIAPH1ORF，并在pTRIPZ载体系统中在N末端与myc标记的BirA克隆为融合蛋白。整个myc-BirA-DIAPH1盒在四环素诱导型启动子系统(Tet-ON)的控制下，用于严格控制融合蛋白表达。对于DIAPH1的生物素化相互作用配偶体的亲和纯化，使用磷酸钙转染方法用20μg质粒DNA转染293T细胞。用嘌呤霉素(2μg/ml)选择细胞，并且转染后72小时对细胞补充多西环素(Dox)(5μg/ml)达24小时以诱导转基因表达。为了诱导相互作用配偶体的生物素化，将50μM生物素加入细胞中并孵育24小时。通过胰蛋白酶消化收获细胞并进行生物素亲和捕获纯化(BioID)(Roux等,2013)。简言之，将细胞在含有50mM Tris Cl(pH 7.4)、500mM NaCl、0.2％SDS和1x蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的缓冲液中裂解。在通过离心澄清细胞碎片后，将裂解物与Dynabead(MyOne Streptavidine C1,Life Technologies)一起孵育过夜。按照如本领域所述的洗涤缓冲液配方除去未结合和非特异性蛋白质。在用50mM Tris Cl(pH7.4)最终洗涤后，将与珠结合的蛋白质进行如下所述的质谱分析。对于BioID方法的初始验证，如上所述将细胞在盖玻片上转染。融合蛋白和生物素化蛋白分别通过兔抗myc和链霉抗生物素蛋白缀合的Alexaflour-555(Invitrogen)检测。
质谱和数据分析
对于质谱分析，按照本领域已知的方案，在珠上消化与链霉抗生物素蛋白珠结合的蛋白质。使用在0.1％甲酸中的2％至80％乙腈的梯度，以～350nL/min的流速分离肽。通过Orbitrap FusionTM TribridTM质谱仪(MS)(ThermoFisher Scientific,San Jose,CA)和proxeon EASY-nLC 1000液相色谱(LC-MS/MS)收集数据。使用Proteome Discoverer(版本1.4.0.288 Thermo Fisher Scientific)和Scaffold 4.1(Proteome Software,Portland,OR)和mascot搜索引擎分析原始数据。(http://www.uniprot.org/uniprot/？query＝Human&sort＝score)。
使用过滤器基于q值以1％错误发现率(FDR)验证肽光谱匹配(PSM)。对于蛋白质鉴定，将具有0.1％肽靶标FDR(严格)和0.5％靶标FDR(松弛)的高可信度数据库搜索和排序肽用于肽过滤。通过Scaffold将鉴定的肽分组成单个蛋白质簇。通过该方法获得的蛋白质列表被进一步筛选。将在没有dox处理但具有生物素的细胞中鉴定的蛋白质、通常在BioID方法中发现的蛋白质和具有小于8％肽覆盖度的蛋白质被从该列表中减去。
BioGRID分析
[http://thebiogrid.org/116338/summary/homo-sapiens/fstl1.html]BioGRID版本3.4.134用于预测FSTL1蛋白的相互作用配偶体。
免疫共沉淀和蛋白质印迹：
通过在培养孔中的RIPA缓冲液中直接裂解细胞，从A253细胞制备总细胞提取物。在5次超声处理的脉冲下裂解细胞，然后在4℃以16,000RCF 10分钟澄清。根据制造商的推荐，使用免疫共沉淀试剂盒(Peirce)进行所选蛋白质的免疫共沉淀分析。与珠结合的蛋白质在Lamelli缓冲液中洗脱，通过10％SDS-PAGE分离并进行蛋白质印迹分析。通过化学发光检测蛋白质。
活细胞成像
将10x103个细胞接种在玻璃底培养皿(Ibidi GmbH)中24小时。将一滴Nucblue活细胞染色剂(Life Technologies；R37605)加入培养基中的细胞中并孵育30分钟。用PBS洗涤细胞并加入新鲜培养基。使用Olympus IX-83 LCI RM 5.17活细胞成像系统跟踪活细胞迁移24小时。使用Imaris 8.1.2软件工具处理和分析数据。
数据驱动分组方法(DDg)：一维数据驱动分组(1DDDg)方法是一种计算和统计方法，用于在线性标度上鉴定最佳表达截止值，其提供存活曲线的最大且最具统计意义的分层。二维数据驱动分组(2D-DDg)方法进一步扩展了1DDg的思想，并评估了基因对在患者预后中的潜在协同效应。简而言之，2D-DDg在每个正交轴(每个代表基因对的一个基因)上鉴定一个表达截止值，其共同可以将患者分层为具有最显著不同的存活曲线的两个亚组。1DDg和2DDg的方法以前用于鉴定和实验验证卵巢癌、乳腺癌的分子特征，以及用于评估胶质母细胞瘤中基因特征的存活意义。
凝胶阻滞测定
如前所述制备用于凝胶阻滞测定的前-miR-198底物。使用快速变化定点诱变试剂盒将存在于前-miR-198序列中的富含U的元件转化为C残基(参见下表中的SEQ ID NO:19和20)。将增加浓度的重组HuR蛋白(0.2、0.4和0.6μM)与野生型或突变体前-miR-198转录物一起在含有30mM Tris HCl(pH 7.4)、5mM MgCl2、50mM KCl、0.5mM DTT、40U/ml RNaseOUT、250μg/ml酵母tRNA和10％甘油的20μl反应缓冲液中孵育。在室温30分钟后，通过6％天然聚丙烯酰胺凝胶电泳分离反应产物。对于竞争性结合测定，在前-miR-198转录物的存在下将0.2μM的KSRP与指定浓度的HuR共孵育。干燥所得凝胶，通过磷光成像使蛋白质RNA复合物和未结合的RNA可视化。
体外转录和翻译
如本领域所述，产生在萤火虫萤光素酶开放阅读框下游含有FSTL1 3’-非翻译区(UTR)的pMIRGLO双萤光素酶。具有T7RNA聚合酶启动子接头的引物(参见序列表的第00176段)用于扩增整个萤光素酶-FSTL1 3’-UTR片段以及Kozak序列。使用表格部分中列出的引物，从pCDH载体(System biosciences)扩增含有copGFP ORF的PCR片段。纯化PCR产物并用Ambion mMessage mMachine试剂盒进行体外转录。对于体外翻译，将500ng纯化的Luc-FSTL1嵌合RNA和200ng GFP RNA添加至30μl兔网织红细胞裂解物、20μM无甲硫氨酸氨基酸混合物、50μCi Easy tag Express 35S蛋白标记混合物和10μg细胞提取物以50μl总体积在30℃保持1小时。在10％SDS-PAGE上分离10μl等分试样的反应混合物，在10％乙酸/40％甲醇中固定，干燥并暴露于磷光成像。
统计分析-将值报告为平均值±标准误差
当比较多个组时，使用双尾学生t检验或单因素方差分析(ANOVA)确定2个样品之间的统计显著性。使用GraphPad InStat 3.0软件(GraphPad Software,Inc.)，用双尾学生t检验确定2个样品之间的统计学显著性。对于组织阵列，如本领域所述进行卡方分析。值被转呈为平均值±标准误差。
序列
序列表：除非另有说明，否则核酸序列以5’至3’方向提供，肽序列根据惯例从N-至C-末端提供。
序列表
<110> 新加坡科技研究局
<120> 皮肤鳞状细胞癌(SCC)中缺陷开关的后果
<130> 9869SG4510
<160> 20
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人微小RNA-198 (miRNA-198) DNA序列
<400> 1
ggtccagagg ggagataggt tc 22
<210> 2
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人微小RNA-198 (miRNA-198)的5'部分
<400> 2
gtccagag 8
<210> 3
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卵泡抑素相关蛋白1 (FSTL1)
<400> 3
Met Trp Lys Arg Trp Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Val Ala Val Ala
1 5 10 15
Trp Val Arg Ala Glu Glu Glu Leu Arg Ser Lys Ser Lys Ile Cys Ala
20 25 30
Asn Val Phe Cys Gly Ala Gly Arg Glu Cys Ala Val Thr Glu Lys Gly
35 40 45
Glu Pro Thr Cys Leu Cys Ile Glu Gln Cys Lys Pro His Lys Arg Pro
50 55 60
Val Cys Gly Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn His Cys Glu Leu His
65 70 75 80
Arg Asp Ala Cys Leu Thr Gly Ser Lys Ile Gln Val Asp Tyr Asp Gly
85 90 95
His Cys Lys Glu Lys Lys Ser Val Ser Pro Ser Ala Ser Pro Val Val
100 105 110
Cys Tyr Gln Ser Asn Arg Asp Glu Leu Arg Arg Arg Ile Ile Gln Trp
115 120 125
Leu Glu Ala Glu Ile Ile Pro Asp Gly Trp Phe Ser Lys Gly Ser Asn
130 135 140
Tyr Ser Glu Ile Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn Phe Asp Asn Gly Asp
145 150 155 160
Ser Arg Leu Asp Ser Ser Glu Phe Leu Lys Phe Val Glu Gln Asn Glu
165 170 175
Thr Ala Ile Asn Ile Thr Thr Tyr Pro Asp Gln Glu Asn Asn Lys Leu
180 185 190
Leu Arg Gly Leu Cys Val Asp Ala Leu Ile Glu Leu Ser Asp Glu Asn
195 200 205
Ala Asp Trp Lys Leu Ser Phe Gln Glu Phe Leu Lys Cys Leu Asn Pro
210 215 220
Ser Phe Asn Pro Pro Glu Lys Lys Cys Ala Leu Glu Asp Glu Thr Tyr
225 230 235 240
Ala Asp Gly Ala Glu Thr Glu Val Asp Cys Asn Arg Cys Val Cys Ala
245 250 255
Cys Gly Asn Trp Val Cys Thr Ala Met Thr Cys Asp Gly Lys Asn Gln
260 265 270
Lys Gly Ala Gln Thr Gln Thr Glu Glu Glu Met Thr Arg Tyr Val Gln
275 280 285
Glu Leu Gln Lys His Gln Glu Thr Ala Glu Lys Thr Lys Arg Val Ser
290 295 300
Thr Lys Glu Ile
305
<210> 4
<211> 1272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白质透明同源物1 (DIAPH1)
<400> 4
Met Glu Pro Pro Gly Gly Ser Leu Gly Pro Gly Arg Gly Thr Arg Asp
1 5 10 15
Lys Lys Lys Gly Arg Ser Pro Asp Glu Leu Pro Ser Ala Gly Gly Asp
20 25 30
Gly Gly Lys Ser Lys Lys Phe Thr Leu Lys Arg Leu Met Ala Asp Glu
35 40 45
Leu Glu Arg Phe Thr Ser Met Arg Ile Lys Lys Glu Lys Glu Lys Pro
50 55 60
Asn Ser Ala His Arg Asn Ser Ser Ala Ser Tyr Gly Asp Asp Pro Thr
65 70 75 80
Ala Gln Ser Leu Gln Asp Val Ser Asp Glu Gln Val Leu Val Leu Phe
85 90 95
Glu Gln Met Leu Leu Asp Met Asn Leu Asn Glu Glu Lys Gln Gln Pro
100 105 110
Leu Arg Glu Lys Asp Ile Ile Ile Lys Arg Glu Met Val Ser Gln Tyr
115 120 125
Leu Tyr Thr Ser Lys Ala Gly Met Ser Gln Lys Glu Ser Ser Lys Ser
130 135 140
Ala Met Met Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Ser Gly Leu Arg Asp Met Pro
145 150 155 160
Leu Leu Ser Cys Leu Glu Ser Leu Arg Val Ser Leu Asn Asn Asn Pro
165 170 175
Val Ser Trp Val Gln Thr Phe Gly Ala Glu Gly Leu Ala Ser Leu Leu
180 185 190
Asp Ile Leu Lys Arg Leu His Asp Glu Lys Glu Glu Thr Ala Gly Ser
195 200 205
Tyr Asp Ser Arg Asn Lys His Glu Ile Ile Arg Cys Leu Lys Ala Phe
210 215 220
Met Asn Asn Lys Phe Gly Ile Lys Thr Met Leu Glu Thr Glu Glu Gly
225 230 235 240
Ile Leu Leu Leu Val Arg Ala Met Asp Pro Ala Val Pro Asn Met Met
245 250 255
Ile Asp Ala Ala Lys Leu Leu Ser Ala Leu Cys Ile Leu Pro Gln Pro
260 265 270
Glu Asp Met Asn Glu Arg Val Leu Glu Ala Met Thr Glu Arg Ala Glu
275 280 285
Met Asp Glu Val Glu Arg Phe Gln Pro Leu Leu Asp Gly Leu Lys Ser
290 295 300
Gly Thr Thr Ile Ala Leu Lys Val Gly Cys Leu Gln Leu Ile Asn Ala
305 310 315 320
Leu Ile Thr Pro Ala Glu Glu Leu Asp Phe Arg Val His Ile Arg Ser
325 330 335
Glu Leu Met Arg Leu Gly Leu His Gln Val Leu Gln Asp Leu Arg Glu
340 345 350
Ile Glu Asn Glu Asp Met Arg Val Gln Leu Asn Val Phe Asp Glu Gln
355 360 365
Gly Glu Glu Asp Ser Tyr Asp Leu Lys Gly Arg Leu Asp Asp Ile Arg
370 375 380
Met Glu Met Asp Asp Phe Asn Glu Val Phe Gln Ile Leu Leu Asn Thr
385 390 395 400
Val Lys Asp Ser Lys Ala Glu Pro His Phe Leu Ser Ile Leu Gln His
405 410 415
Leu Leu Leu Val Arg Asn Asp Tyr Glu Ala Arg Pro Gln Tyr Tyr Lys
420 425 430
Leu Ile Glu Glu Cys Ile Ser Gln Ile Val Leu His Lys Asn Gly Ala
435 440 445
Asp Pro Asp Phe Lys Cys Arg His Leu Gln Ile Glu Ile Glu Gly Leu
450 455 460
Ile Asp Gln Met Ile Asp Lys Thr Lys Val Glu Lys Ser Glu Ala Lys
465 470 475 480
Ala Ala Glu Leu Glu Lys Lys Leu Asp Ser Glu Leu Thr Ala Arg His
485 490 495
Glu Leu Gln Val Glu Met Lys Lys Met Glu Ser Asp Phe Glu Gln Lys
500 505 510
Leu Gln Asp Leu Gln Gly Glu Lys Asp Ala Leu His Ser Glu Lys Gln
515 520 525
Gln Ile Ala Thr Glu Lys Gln Asp Leu Glu Ala Glu Val Ser Gln Leu
530 535 540
Thr Gly Glu Val Ala Lys Leu Thr Lys Glu Leu Glu Asp Ala Lys Lys
545 550 555 560
Glu Met Ala Ser Leu Ser Ala Ala Ala Ile Thr Val Pro Pro Ser Val
565 570 575
Pro Ser Arg Ala Pro Val Pro Pro Ala Pro Pro Leu Pro Gly Asp Ser
580 585 590
Gly Thr Ile Ile Pro Pro Pro Pro Ala Pro Gly Asp Ser Thr Thr Pro
595 600 605
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly Gly
610 615 620
Val Cys Ile Ser Ser Pro Pro Ser Leu Pro Gly Gly Thr Ala Ile Ser
625 630 635 640
Pro Pro Pro Pro Leu Ser Gly Asp Ala Thr Ile Pro Pro Pro Pro Pro
645 650 655
Leu Pro Glu Gly Val Gly Ile Pro Ser Pro Ser Ser Leu Pro Gly Gly
660 665 670
Thr Ala Ile Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly Ser Ala Arg Ile Pro
675 680 685
Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly Ser Ala Gly Ile Pro Pro Pro Pro
690 695 700
Pro Pro Leu Pro Gly Glu Ala Gly Met Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu
705 710 715 720
Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Pro Pro Pro Pro Phe Pro Gly Gly Pro
725 730 735
Gly Ile Pro Pro Pro Pro Pro Gly Met Gly Met Pro Pro Pro Pro Pro
740 745 750
Phe Gly Phe Gly Val Pro Ala Ala Pro Val Leu Pro Phe Gly Leu Thr
755 760 765
Pro Lys Lys Leu Tyr Lys Pro Glu Val Gln Leu Arg Arg Pro Asn Trp
770 775 780
Ser Lys Leu Val Ala Glu Asp Leu Ser Gln Asp Cys Phe Trp Thr Lys
785 790 795 800
Val Lys Glu Asp Arg Phe Glu Asn Asn Glu Leu Phe Ala Lys Leu Thr
805 810 815
Leu Thr Phe Ser Ala Gln Thr Lys Thr Ser Lys Ala Lys Lys Asp Gln
820 825 830
Glu Gly Gly Glu Glu Lys Lys Ser Val Gln Lys Lys Lys Val Lys Glu
835 840 845
Leu Lys Val Leu Asp Ser Lys Thr Ala Gln Asn Leu Ser Ile Phe Leu
850 855 860
Gly Ser Phe Arg Met Pro Tyr Gln Glu Ile Lys Asn Val Ile Leu Glu
865 870 875 880
Val Asn Glu Ala Val Leu Thr Glu Ser Met Ile Gln Asn Leu Ile Lys
885 890 895
Gln Met Pro Glu Pro Glu Gln Leu Lys Met Leu Ser Glu Leu Lys Asp
900 905 910
Glu Tyr Asp Asp Leu Ala Glu Ser Glu Gln Phe Gly Val Val Met Gly
915 920 925
Thr Val Pro Arg Leu Arg Pro Arg Leu Asn Ala Ile Leu Phe Lys Leu
930 935 940
Gln Phe Ser Glu Gln Val Glu Asn Ile Lys Pro Glu Ile Val Ser Val
945 950 955 960
Thr Ala Ala Cys Glu Glu Leu Arg Lys Ser Glu Ser Phe Ser Asn Leu
965 970 975
Leu Glu Ile Thr Leu Leu Val Gly Asn Tyr Met Asn Ala Gly Ser Arg
980 985 990
Asn Ala Gly Ala Phe Gly Phe Asn Ile Ser Phe Leu Cys Lys Leu Arg
995 1000 1005
Asp Thr Lys Ser Thr Asp Gln Lys Met Thr Leu Leu His Phe Leu
1010 1015 1020
Ala Glu Leu Cys Glu Asn Asp Tyr Pro Asp Val Leu Lys Phe Pro
1025 1030 1035
Asp Glu Leu Ala His Val Glu Lys Ala Ser Arg Val Ser Ala Glu
1040 1045 1050
Asn Leu Gln Lys Asn Leu Asp Gln Met Lys Lys Gln Ile Ser Asp
1055 1060 1065
Val Glu Arg Asp Val Gln Asn Phe Pro Ala Ala Thr Asp Glu Lys
1070 1075 1080
Asp Lys Phe Val Glu Lys Met Thr Ser Phe Val Lys Asp Ala Gln
1085 1090 1095
Glu Gln Tyr Asn Lys Leu Arg Met Met His Ser Asn Met Glu Thr
1100 1105 1110
Leu Tyr Lys Glu Leu Gly Glu Tyr Phe Leu Phe Asp Pro Lys Lys
1115 1120 1125
Leu Ser Val Glu Glu Phe Phe Met Asp Leu His Asn Phe Arg Asn
1130 1135 1140
Met Phe Leu Gln Ala Val Lys Glu Asn Gln Lys Arg Arg Glu Thr
1145 1150 1155
Glu Glu Lys Met Arg Arg Ala Lys Leu Ala Lys Glu Lys Ala Glu
1160 1165 1170
Lys Glu Arg Leu Glu Lys Gln Gln Lys Arg Glu Gln Leu Ile Asp
1175 1180 1185
Met Asn Ala Glu Gly Asp Glu Thr Gly Val Met Asp Ser Leu Leu
1190 1195 1200
Glu Ala Leu Gln Ser Gly Ala Ala Phe Arg Arg Lys Arg Gly Pro
1205 1210 1215
Arg Gln Ala Asn Arg Lys Ala Gly Cys Ala Val Thr Ser Leu Leu
1220 1225 1230
Ala Ser Glu Leu Thr Lys Asp Asp Ala Met Ala Ala Val Pro Ala
1235 1240 1245
Lys Val Ser Lys Asn Ser Glu Thr Phe Pro Thr Ile Leu Glu Glu
1250 1255 1260
Ala Lys Glu Leu Val Gly Arg Ala Ser
1265 1270
<210> 5
<211> 1193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 层粘连蛋白亚基γ-2 (LAMC2)
<400> 5
Met Pro Ala Leu Trp Leu Gly Cys Cys Leu Cys Phe Ser Leu Leu Leu
1 5 10 15
Pro Ala Ala Arg Ala Thr Ser Arg Arg Glu Val Cys Asp Cys Asn Gly
20 25 30
Lys Ser Arg Gln Cys Ile Phe Asp Arg Glu Leu His Arg Gln Thr Gly
35 40 45
Asn Gly Phe Arg Cys Leu Asn Cys Asn Asp Asn Thr Asp Gly Ile His
50 55 60
Cys Glu Lys Cys Lys Asn Gly Phe Tyr Arg His Arg Glu Arg Asp Arg
65 70 75 80
Cys Leu Pro Cys Asn Cys Asn Ser Lys Gly Ser Leu Ser Ala Arg Cys
85 90 95
Asp Asn Ser Gly Arg Cys Ser Cys Lys Pro Gly Val Thr Gly Ala Arg
100 105 110
Cys Asp Arg Cys Leu Pro Gly Phe His Met Leu Thr Asp Ala Gly Cys
115 120 125
Thr Gln Asp Gln Arg Leu Leu Asp Ser Lys Cys Asp Cys Asp Pro Ala
130 135 140
Gly Ile Ala Gly Pro Cys Asp Ala Gly Arg Cys Val Cys Lys Pro Ala
145 150 155 160
Val Thr Gly Glu Arg Cys Asp Arg Cys Arg Ser Gly Tyr Tyr Asn Leu
165 170 175
Asp Gly Gly Asn Pro Glu Gly Cys Thr Gln Cys Phe Cys Tyr Gly His
180 185 190
Ser Ala Ser Cys Arg Ser Ser Ala Glu Tyr Ser Val His Lys Ile Thr
195 200 205
Ser Thr Phe His Gln Asp Val Asp Gly Trp Lys Ala Val Gln Arg Asn
210 215 220
Gly Ser Pro Ala Lys Leu Gln Trp Ser Gln Arg His Gln Asp Val Phe
225 230 235 240
Ser Ser Ala Gln Arg Leu Asp Pro Val Tyr Phe Val Ala Pro Ala Lys
245 250 255
Phe Leu Gly Asn Gln Gln Val Ser Tyr Gly Gln Ser Leu Ser Phe Asp
260 265 270
Tyr Arg Val Asp Arg Gly Gly Arg His Pro Ser Ala His Asp Val Ile
275 280 285
Leu Glu Gly Ala Gly Leu Arg Ile Thr Ala Pro Leu Met Pro Leu Gly
290 295 300
Lys Thr Leu Pro Cys Gly Leu Thr Lys Thr Tyr Thr Phe Arg Leu Asn
305 310 315 320
Glu His Pro Ser Asn Asn Trp Ser Pro Gln Leu Ser Tyr Phe Glu Tyr
325 330 335
Arg Arg Leu Leu Arg Asn Leu Thr Ala Leu Arg Ile Arg Ala Thr Tyr
340 345 350
Gly Glu Tyr Ser Thr Gly Tyr Ile Asp Asn Val Thr Leu Ile Ser Ala
355 360 365
Arg Pro Val Ser Gly Ala Pro Ala Pro Trp Val Glu Gln Cys Ile Cys
370 375 380
Pro Val Gly Tyr Lys Gly Gln Phe Cys Gln Asp Cys Ala Ser Gly Tyr
385 390 395 400
Lys Arg Asp Ser Ala Arg Leu Gly Pro Phe Gly Thr Cys Ile Pro Cys
405 410 415
Asn Cys Gln Gly Gly Gly Ala Cys Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Tyr
420 425 430
Ser Gly Asp Glu Asn Pro Asp Ile Glu Cys Ala Asp Cys Pro Ile Gly
435 440 445
Phe Tyr Asn Asp Pro His Asp Pro Arg Ser Cys Lys Pro Cys Pro Cys
450 455 460
His Asn Gly Phe Ser Cys Ser Val Met Pro Glu Thr Glu Glu Val Val
465 470 475 480
Cys Asn Asn Cys Pro Pro Gly Val Thr Gly Ala Arg Cys Glu Leu Cys
485 490 495
Ala Asp Gly Tyr Phe Gly Asp Pro Phe Gly Glu His Gly Pro Val Arg
500 505 510
Pro Cys Gln Pro Cys Gln Cys Asn Asn Asn Val Asp Pro Ser Ala Ser
515 520 525
Gly Asn Cys Asp Arg Leu Thr Gly Arg Cys Leu Lys Cys Ile His Asn
530 535 540
Thr Ala Gly Ile Tyr Cys Asp Gln Cys Lys Ala Gly Tyr Phe Gly Asp
545 550 555 560
Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ala Asp Lys Cys Arg Ala Cys Asn Cys Asn
565 570 575
Pro Met Gly Ser Glu Pro Val Gly Cys Arg Ser Asp Gly Thr Cys Val
580 585 590
Cys Lys Pro Gly Phe Gly Gly Pro Asn Cys Glu His Gly Ala Phe Ser
595 600 605
Cys Pro Ala Cys Tyr Asn Gln Val Lys Ile Gln Met Asp Gln Phe Met
610 615 620
Gln Gln Leu Gln Arg Met Glu Ala Leu Ile Ser Lys Ala Gln Gly Gly
625 630 635 640
Asp Gly Val Val Pro Asp Thr Glu Leu Glu Gly Arg Met Gln Gln Ala
645 650 655
Glu Gln Ala Leu Gln Asp Ile Leu Arg Asp Ala Gln Ile Ser Glu Gly
660 665 670
Ala Ser Arg Ser Leu Gly Leu Gln Leu Ala Lys Val Arg Ser Gln Glu
675 680 685
Asn Ser Tyr Gln Ser Arg Leu Asp Asp Leu Lys Met Thr Val Glu Arg
690 695 700
Val Arg Ala Leu Gly Ser Gln Tyr Gln Asn Arg Val Arg Asp Thr His
705 710 715 720
Arg Leu Ile Thr Gln Met Gln Leu Ser Leu Ala Glu Ser Glu Ala Ser
725 730 735
Leu Gly Asn Thr Asn Ile Pro Ala Ser Asp His Tyr Val Gly Pro Asn
740 745 750
Gly Phe Lys Ser Leu Ala Gln Glu Ala Thr Arg Leu Ala Glu Ser His
755 760 765
Val Glu Ser Ala Ser Asn Met Glu Gln Leu Thr Arg Glu Thr Glu Asp
770 775 780
Tyr Ser Lys Gln Ala Leu Ser Leu Val Arg Lys Ala Leu His Glu Gly
785 790 795 800
Val Gly Ser Gly Ser Gly Ser Pro Asp Gly Ala Val Val Gln Gly Leu
805 810 815
Val Glu Lys Leu Glu Lys Thr Lys Ser Leu Ala Gln Gln Leu Thr Arg
820 825 830
Glu Ala Thr Gln Ala Glu Ile Glu Ala Asp Arg Ser Tyr Gln His Ser
835 840 845
Leu Arg Leu Leu Asp Ser Val Ser Arg Leu Gln Gly Val Ser Asp Gln
850 855 860
Ser Phe Gln Val Glu Glu Ala Lys Arg Ile Lys Gln Lys Ala Asp Ser
865 870 875 880
Leu Ser Ser Leu Val Thr Arg His Met Asp Glu Phe Lys Arg Thr Gln
885 890 895
Lys Asn Leu Gly Asn Trp Lys Glu Glu Ala Gln Gln Leu Leu Gln Asn
900 905 910
Gly Lys Ser Gly Arg Glu Lys Ser Asp Gln Leu Leu Ser Arg Ala Asn
915 920 925
Leu Ala Lys Ser Arg Ala Gln Glu Ala Leu Ser Met Gly Asn Ala Thr
930 935 940
Phe Tyr Glu Val Glu Ser Ile Leu Lys Asn Leu Arg Glu Phe Asp Leu
945 950 955 960
Gln Val Asp Asn Arg Lys Ala Glu Ala Glu Glu Ala Met Lys Arg Leu
965 970 975
Ser Tyr Ile Ser Gln Lys Val Ser Asp Ala Ser Asp Lys Thr Gln Gln
980 985 990
Ala Glu Arg Ala Leu Gly Ser Ala Ala Ala Asp Ala Gln Arg Ala Lys
995 1000 1005
Asn Gly Ala Gly Glu Ala Leu Glu Ile Ser Ser Glu Ile Glu Gln
1010 1015 1020
Glu Ile Gly Ser Leu Asn Leu Glu Ala Asn Val Thr Ala Asp Gly
1025 1030 1035
Ala Leu Ala Met Glu Lys Gly Leu Ala Ser Leu Lys Ser Glu Met
1040 1045 1050
Arg Glu Val Glu Gly Glu Leu Glu Arg Lys Glu Leu Glu Phe Asp
1055 1060 1065
Thr Asn Met Asp Ala Val Gln Met Val Ile Thr Glu Ala Gln Lys
1070 1075 1080
Val Asp Thr Arg Ala Lys Asn Ala Gly Val Thr Ile Gln Asp Thr
1085 1090 1095
Leu Asn Thr Leu Asp Gly Leu Leu His Leu Met Asp Gln Pro Leu
1100 1105 1110
Ser Val Asp Glu Glu Gly Leu Val Leu Leu Glu Gln Lys Leu Ser
1115 1120 1125
Arg Ala Lys Thr Gln Ile Asn Ser Gln Leu Arg Pro Met Met Ser
1130 1135 1140
Glu Leu Glu Glu Arg Ala Arg Gln Gln Arg Gly His Leu His Leu
1145 1150 1155
Leu Glu Thr Ser Ile Asp Gly Ile Leu Ala Asp Val Lys Asn Leu
1160 1165 1170
Glu Asn Ile Arg Asp Asn Leu Pro Pro Gly Cys Tyr Asn Thr Gln
1175 1180 1185
Ala Leu Glu Gln Gln
1190
<210> 6
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)
<400> 6
Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Val Leu Val Val Ser
1 5 10 15
Asp Ser Lys Gly Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp
20 25 30
Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile
35 40 45
His Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile
50 55 60
Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly
65 70 75 80
Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser
85 90 95
Ala Thr Val Leu Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu
100 105 110
Gln Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg
115 120 125
Arg Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln
130 135 140
Glu Cys Met Val His Asp Cys Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser Pro
145 150 155 160
Pro Glu Glu Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg
165 170 175
Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp
180 185 190
Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val
195 200 205
Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His
210 215 220
Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly
225 230 235 240
Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val
245 250 255
Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His
260 265 270
His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys
275 280 285
Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr
290 295 300
Asn Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys
305 310 315 320
Glu Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val
325 330 335
Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly
340 345 350
Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys
355 360 365
Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu
370 375 380
Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys
385 390 395 400
Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu
405 410 415
Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu
420 425 430
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA序列FSTL1
<400> 7
cggatactat tgatgaataa 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA序列LAMC2
<400> 8
agaatcctga cattgagtgt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA序列DIAPH1
<400> 9
ctgcatgtga ggagttacgt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA序列PLAU
<400> 10
aattctaccg actatctcta 20
<210> 11
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前-miR-198 WT探针的序列
<400> 11
tcattggtcc agaggggaga taggttcctg tgatttttcc ttcttctcta tagaataaat 60
ga 62
<210> 12
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前-miR-198 WT探针的序列
<400> 12
tcattggtcc agaggggaga taggttcctg tgaccccccc ttcttctcta tagaataaat 60
ga 62
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 萤光素酶T7正向引物(结合在pMIRGLO中萤光素酶UG上游的9对碱基对。包括Kozak序列)
<400> 13
taatacgact cactataggg aaagccacca tggaagatgc c 41
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FSTL1 3' UTR反向引物(结合FSTL1 3'UTR中的2617位)
<400> 14
ccgaaaagga agaatcagga g 21
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CopGFP起始T7F引物
<400> 15
taatacgact cactataggg ctagacgcca ccatggagag c 41
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CopGFP终止R
<400> 16
gtcgacttag cgagatccgg tg 22
<210> 17
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人微小RNA-198 (miRNA-198) - RNA序列
<400> 17
gguccagagg ggagauaggu uc 22
<210> 18
<211> 8
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人微小RNA-198 (miRNA-198) - 种子序列
<400> 18
guccagag 8
<210> 19
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前-miR-198 WT
<400> 19
tcattggtcc agaggggaga taggttcctg tgatttttcc ttcttctcta tagaataaat 60
ga 62
<210> 20
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前-miR-198 Mut
<400> 20
tcattggtcc agaggggaga taggttcctg tgaccccccc ttcttctcta tagaataaat 60
ga 62

Claims (27)

1.一种治疗癌的方法，其中所述方法包括施用：
i)一种或多种包含以下序列或由以下序列组成的寡核苷酸：miR-198的序列(SEQ IDNO:1)、其功能部分或其组合；和/或
ii)至少一种降低任何一种或多种下列靶蛋白表达的寡核苷酸：卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)或尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述miR-198的功能部分包含5’GTCCAGAG 3’(SEQID NO:2)或由其组成。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白具有选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6及其组合组成的组的氨基酸序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中ii)中的一种或多种寡核苷酸选自由siRNA、shRNA和RNAi组成的组。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述一种或多种寡核苷酸是shRNA。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述一种或多种siRNA包含选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10组成的组的序列。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸是未经修饰的，或用一种或多种选自由以下组成的组的化学基团修饰：2’O-甲氧基、硫代磷酸酯、锁核酸和胆固醇。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌选自由以下组成的组：上皮癌、腺癌、鳞状细胞癌、腺鳞状细胞癌、间变性癌、大细胞癌、小细胞癌、基底细胞肿瘤、基底细胞癌、肝细胞癌、腺样囊性癌、肾细胞癌、粘液表皮样肿瘤、囊性肿瘤、粘液性肿瘤和胆管癌。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述癌是皮肤鳞状细胞癌或头颈部鳞状细胞癌。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种寡核苷酸待彼此同时或分开或顺序施用。
11.一种确定受试者中癌的存在的方法，其中所述方法包括：
检测从受试者获得的样品中miR-198的存在；和/或
检测所述样品中至少一种或多种靶蛋白的存在；和
将检测到的miR-198水平与对照样品中检测到的miR-198水平进行比较；和/或
将检测到的所述至少一种或多种靶蛋白的水平与所述对照样品中检测到的所述至少一种或多种靶蛋白的水平进行比较，
其中所述至少一种或多种靶蛋白选自由卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)、尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)及其组合组成的组。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一种或多种靶蛋白是FSTL1。
13.根据权利要求11所述的方法，其中与所述对照样品相比，存在增加水平的卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)和尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)表明所述样品中存在癌细胞。
14.根据权利要求11所述的方法，其中增加水平的FSTL1的存在表明所述样品中存在癌细胞。
15.一种确定受试者中癌的存在的方法，其中所述方法包括：
a.检测样品中miR-198的存在；和
b.将检测到的miR-198水平与对照样品中检测到的miR-198水平进行比较；和/或
c.检测所述样品中至少一种或多种生物标志物的存在；和
d.将检测到的所述至少一种或多种生物标志物的水平与所述对照样品中检测到的所述至少一种或多种生物标志物的水平进行比较；
其中所述至少一种或多种生物标志物选自由miR-181a、表皮生长因子(EGF)和表皮生长因子受体(EGFR)或其组合组成的组。
16.根据权利要求11-15中任一项所述的方法，其中与所述对照样品相比，存在降低水平的miR-198表明存在癌细胞。
17.根据权利要求15所述的方法，其中存在增加水平的miR-181a、EGF和EGFR表明所述样品中存在癌细胞。
18.根据权利要求11-17中任一项所述的方法，其中所述对照样品是从无癌受试者获得的样品。
19.根据权利要求1中定义的至少一种或多种寡核苷酸在制备用于治疗癌的药物中的用途。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述一种或多种寡核苷酸是针对一种或多种下列靶标的shRNA和/或siRNA：编码FSTL1的基因、编码DIAPH1的基因、编码LAMC2的基因和编码PLAU的基因。
21.根据权利要求19或20所述的用途，其中所述siRNA序列选自由SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10及其组合组成的组。
22.一种药物组合物，其包含至少一种或多种根据权利要求1所定义的寡核苷酸。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述一种或多种寡核苷酸是miR-198。
24.根据权利要求22和23所述的组合物，其中所述一种或多种寡核苷酸是针对一种或多种下列靶标的shRNA和/或siRNA：编码FSTL1的基因、编码DIAPH1的基因、编码LAMC2的基因、编码PLAU的基因。
25.根据权利要求22-24所述的组合物，其中所述siRNA序列选自由SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10及其组合组成的组。
26.一种治疗癌的方法，其中所述方法包括施用一种或多种包含miR-198的序列(SEQID NO:1)、其功能部分或其组合或者由miR-198的序列(SEQ ID NO:1)、其功能部分或其组合组成的寡核苷酸以及任何一种或多种下列靶蛋白的表达抑制剂：卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)或尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)；其中所述表达抑制剂选自由siRNA、shRNA和RNAi组成的组。
27.一种使用靶向一种或多种以下蛋白质的表达的siRNA和/或shRNA治疗癌的方法：卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1；SEQ ID NO:3)、蛋白质透明同源物1(DIAPH1；SEQ ID NO:4)、层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2；SEQ ID NO:5)和尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU；SEQ ID NO:6)。
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