CN105586390A - 一种用于乳腺癌预后判断的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于乳腺癌预后判断和术后治疗反应预测的试剂盒。发明人找到5个与病人生存预后有明显相关的miRNA（miR-205，miR-320a，miR-665，miR-188-5p，miR-198），其中2个miRNA是保护性的，3个miRNA是危险性的。使用这5个miRNA分子标签把病人区分为高风险和低风险，通过生存分析比较两组之间的总生存，发现高风险组和低风险组之间总生存的差异有显著性。（p=0.001）。可以有效地指导乳腺癌的临床治疗，对预后高风险的患者提前进行适当的辅助治疗，以提高患者的生存质量，同时避免对低风险患者进行不必要的治疗。

Description

一种用于乳腺癌预后判断的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种肿瘤预后和化疗反应判断的试剂盒，特别涉及一种用于乳腺癌预后判断的试剂盒。

背景技术

全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。美国8名妇女一生中就会有1人患乳腺癌。中国不是乳腺癌的高发国家，但不宜乐观，近年我国乳腺癌发病率的增长速度却高出高发国家1～2个百分点。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的2009年乳腺癌发病数据显示：全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位，女性乳腺癌发病率(粗率)全国合计为42.55/10万，城市为51.91/10万，农村为23.12/10万。乳腺癌已成为当前社会的重大公共卫生问题。

有效地预后判断是乳腺癌有效治疗和提高患者生存质量的关键所在，但是现有的分期系统对乳腺癌的预后指导意义不够，尚不能很好地指导个性化用药，导致了不少病人的治疗失败，从而降低了患者的生存质量和生存率。因此，寻找其他指导预后的检测方法或手段对制定合适的乳腺癌个体化治疗有着非常重要的意义。

RNA包括编码蛋白的mRNA和非编码RNA，其中非编码RNA除了管家RNA，如转运RNA、核糖体RNA、核仁RNA等以外，还存在着一大类具有多种生物学功能的RNA。例如，miRNA、siRNA、piRNA和长链非编码RNA，它们参与了RNA的转录和翻译调控、蛋白的结构和功能调控等过程，是近年的研究热点。其中，对miRNA来源、生成和功能已有较深入的认识：miRNA基因是由RNA聚合酶Ⅱ在核内转录生成长度可达数千个碱基的初级转录本pri-miRNA，由Drosha酶和DGCR8构成的复合物进行加工，形成长度约为70个碱基，含有两个3’端突出的发卡结构前体pre-miRNA。被转运进胞浆后，pre-miRNA被Dicer切割并释放出miRNA。由miRNA介导的沉默复合体RISC通过与靶基因的3’UTR上的识别序列结合，介导靶基因mRNA降解或翻译抑制。

miRNA参与调控了生命活动中一系列重要过程，包括细胞凋亡、增殖、分化等。同样其表达改变亦可引起人类疾病包括肿瘤等的发生。同时也由于miRNA具有高度的保守性、时序性和组织特异性，因此那些在肿瘤中表达发生改变的miRNA可以作为肿瘤诊断和预后评估的标志物，同时也可作为肿瘤治疗的靶点。

近年来研究发现了单个或一组miRNA可以作为许多肿瘤的预后标志物，比如肝癌中miR-26a/b、肠癌中miR-21、肺癌中5个miRNA构成的signature等。这为寻找新的肿瘤预后判断标记物提供了新的方向，日益受到人们的关注。

在乳腺癌的预后判断中，使用单个或一组miRNA作为预后的标志物具有巨大的开发和应用前景。然而，众所周知，组织中的miRNA种类繁多，又存在众多个体差异，导致难以发现具有较好预后判断效果的单个或一组miRNA。这也正是鉴定和寻找肿瘤预后判断标志物的难点所在。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于乳腺癌预后判断和化疗反应预测的试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于乳腺癌预后判断的试剂盒，该试剂盒含有定量miRNA中的hsa-miR-205-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-665、hsa-miR-188-5p和hsa-miR-198表达量的试剂。

发明人为了寻找与乳腺癌病人生存预后相关的miRNA，用COX风险回归分析得到了训练组样本中各个miRNA与病人总生存之间的关系，找出5个与病人生存预后有明显相关的miRNA(miR-205，miR-320a，miR-665，miR-188-5p，miR-198)，其中2个miRNA是保护性的，3个miRNA是风险性的。使用这个miRNA分子标签把病人区分为高风险和低风险，通过生存分析比较两组之间的总生存，发现高风险组和低风险组之间总生存的差异有显著性。(p＝0.001)。

为了验证这个结果，在检验组中，使用训练组中同样的风险评分公式计算风险评分，然后用与训练组中同样的中位数把他们分为高风险组与低风险组，同样通过生存分析比较两组之间的总生存，高风险组和低风险组之间总生存差异也具有统计学意义(p＝0.004)。

另外，在由外院样本形成的独立组中，此结果也再次得到验证，高风险和低风险组之间总生存差异也具有统计学意义(p＝0.002)在对病人术后辅助治疗的分析中发现，术后不需要进行辅助治疗的病人可被本申请的miRNA分子标签区分为高低风险组后，高低风险组的生存有明显区别，高风险组总生存低于低风险组(p<0.001)，提示在未行辅助治疗的病人中高风险的病人需要给予术后辅助治疗，这样将提高患者的生存时间。在已行术后辅助化疗的病人当中，使用miRNA分子标签也可将病人区分为高低风险组，这两组的生存有明显区别，高风险组总生存明显低于低风险组(p<0.001)，提示在已行辅助化疗的病人中高风险的病人需要加强术后的辅助治疗或改用更有效的治疗方案，以提高患者的生存。

基于此，本发明的技术方案可以有效地指导乳腺癌的临床治疗，对预后高风险的患者提前进行适当的辅助治疗，以提高患者的生存质量，同时避免对低风险患者进行不必要的治疗。

附图说明

图1是乳腺癌miRNA的芯片扫描结果图；

图2是5个所挑选的miRNA的实时荧光定量PCR结果与芯片结果的相关性分析结果图；

图3是不同组患者根据5miRNA分子标签所计算得出的风险分数分为高风险组及低风险组，对两组的总生存(OS)及无病生存(DFS)进行Kaplan-Meier曲线分析的结果；

图4是术后病人根据5miRNA分子标签所计算得出风险分数分为高风险组及低风险组，对两组的总生存(OS)及无病生存(DFS)进行Kaplan-Meier曲线分析的结果。

具体实施方式

乳腺癌预后判断相关miRNA的发现：

首先从中山大学附属肿瘤医院保存的本院422例乳腺癌石蜡切片及31例正常乳腺石蜡切片中提取总RNA，用nanodrop检测RNA浓度及质量，以备后期进行miRNA芯片试验。422例患者被随机地分为训练组和检验组，其基本情况如表1所示。另外，为了进一步检验是否在不同的人群中miRNA分子标签都有相同的预测能力，收集到了来自广州医科大学附属第一医院的161例乳腺癌组织形成独立组(基本情况如表1)。

表1.训练组、验证组、独立组中病例的临床资料特征

数据为平均值(标准差)or数量(％)，除非另外标明.*χ²检验或者Fisher’s精确检验.Student’st检验.

根据miRbase18.0数据库中的1921个人类microRNA序列，采用文献(RNA2007；13:151-9)描述的原则，成功设计出1849个人的microRNA探针，然后点制芯片，采用1个miRNA探针两个复点的点片方式，将1849个microRNA探针点制在玻片上。通过本实验室的miRNA芯片平台，检测上述422例乳腺癌组织及31例正常乳腺组织中miRNA的表达；采用Cy5红色荧光素标记样本，通过单通道检测，一张microarray检测一个样本，荧光信号的强弱表示miRNA在不同样本中的表达量的变化，如图1。

芯片扫描结果用GenePix软件读取芯片数据，利用BRB软件将microRNA芯片的原始值减去背景值的干扰，平均两个复点之间的数据，同时进行log2的数据转换。然后利用quantile软件进行芯片数据的标准化以用于后续的分析。首先，在训练组通过COX风险回归分析从芯片检测的1849个miRNA中找到20个与病人总生存有关的miRNA(如表2)，再从中挑选出一个由5个miRNA组合的miRNA分子标签(如表3)来预测病人预后及指导治疗。

表2.20个与病人生存预后有关的miRNA.

*Cox风险回归分析.

表3、5个miRNA分子标签细节表

*Cox风险回归分析

为了验证芯片数据的可靠性，使用实时荧光定量PCR技术进行验证。发明人选择了5miRNA分子标签内的2个下调miRNA(hsa-miR-205-5p、hsa-miR-320a)和另外3个上调的miRNA(hsa-miR-665、hsa-miR-188-5p和hsa-miR-198)，在62例乳腺癌标本和24例正常乳腺标本中进行了实验，实验结果如图2所示。图中的结果显示了Pearson相关系数(r)，p值以及最佳拟合线。这5个miRNA的实时荧光定量PCR实验结果与miRNA芯片实验结果高度相关，说明芯片检测的结果是准确和可靠的。

在鉴定出来的5个与病人生存预后有明显相关的miRNA(miR-205，miR-320a，miR-665，miR-188-5p，miR-198)中，2个miRNA为保护性的，3个miRNA为风险性的。用风险评分公式计算出训练组中这5个miRNA组成的分子标签的风险评分，风险分数模型如下：风险分数＝∑iwi·xi(wi表示第i个miRNA的权重，xi表示第i个miRNA的表达值)，即风险分数＝(-0.305×miR-205-5p的表达值)+(-0.174×miR-320a的表达值)+(0.628×miR-665的表达值)+(0.278×miR-188-5p的表达值)+(0.428×miR-198的表达值)。基于公式赋予每个病人一个风险分数，以中位风险分数为界，大于中位风险分数为高风险病人，小于中位风险分数为低风险病人，通过生存分析比较两组之间的总生存，发现高风险组和低风险组之间总生存的差异有显著性(p＝0.001)(如图3A，训练组中病人根据风险分数分为高风险组及低风险组的OS及DFS的K-M分析)，图3A所示，Kaplan-Meier曲线分析可以得低风险组的病人的总生存和无病生存明显好于高风险组病人。

为了验证上述结果，我们在检验组中，使用训练组中同样的风险评分公式计算每个病人的风险分数，然后用与训练组中同样的中位数把他们分为高风险组与低风险组，同样通过生存分析比较两组之间的总生存，高风险组和低风险组之间总生存差异也具有统计学意义(p＝0.004)(如图3B，检验组中病人根据风险分数分为高风险组及低风险组的OS及DFS的K-M分析)。如图3B所示，Kaplan-Meier曲线分析可以得到与训练组和检验组相同的结果，即低风险组的病人的总生存和无病生存明显好于高风险组病人。在训练组和检验组两组病人合并后，高风险和低风险组病人的生存差异更为明显(p<0.001)(如图3C，训练组和检验组合并后，病人根据风险分数分为高风险组及低风险组的OS及DFS的K-M分析)。

最后，为了进一步检验是否在不同的病人群体中5miRNA分子标签都有相同的预测能力，收集到了来自广州医科大学附属第一医院的161例乳腺癌组织，并通过实时荧光定量PCR检测表3中5个miRNA的表达水平。实时荧光定量PCR的结果用2^-ΔΔCT的形式转换后用于计算新的Cox回归系数及建立新的数学公式计算每一个病人的风险分数。新的公式为：风险分数＝(-0.34×miR-205-5p的表达值)+(-0.408×miR-320a的表达值)+(0.262×miR-665的表达值)+(0.084×miR-188-5p的表达值)+(0.185×miR-198的表达值)。在外院样本形成的独立组中，此结果也再次得到验证，高风险和低风险组之间总生存差异也具有统计学意义(p＝0.002)(如图3C，独立组中病人根据风险分数分为高风险组及低风险组的OS及DFS的K-M分析)。

为了证实5-miRNA是独立的预后因素，我们在本院得到的422例乳腺癌病人中(训练组+检验组)对5-miRNA分子标签及临床指标进行了Cox回归分析。首先进行了单因素Cox回归分析，如表4中可知，5-miRNA分子标签及TNM分期和三阴乳腺癌对于预测乳腺癌患者的总生存及无病生存均为非常重要的预测指标。然后，采用了多因素Cox回归分析，如表4所示，证实了5-miRNA及TNM分期和三阴乳腺癌对于总生存及无病生存均为独立的预后因素(如表4)。

表4.5miRNA分子标签及与生存有关临床资料的多因素生存分析

在对病人术后辅助治疗的分析中发现：

1)术后未行辅助治疗的病人当中，采用鉴定的miRNA分子标签将病人区分为高低风险组后，高风险组总生存低于低风险组(p<0.001)(如图4A，未进行术后辅助治疗病人根据风险分数分为高风险组及低风险组的OS及DFS的K-M分析)，提示在未行辅助治疗的病人中高风险的病人需要给予适当的术后辅助治疗，将可提高患者生存；

2)在已行术后辅助化疗的病人当中，使用miRNA分子标签区分为高低风险组后，高低风险组的生存有明显区别，高风险组总生存明显比低风险组差(p<0.001)(如图4B，进行术后辅助化疗的病人根据风险分数分为高风险组及低风险组的OS及DFS的K-M分析)，提示在已行辅助化疗的病人中高风险的病人需要加强术后的辅助治疗或给予不同的治疗方案，以提高患者生存；

3)接下来对于术后辅助放疗的分析中发现，伴有1-2个淋巴结转移的病人中，全部未行术后辅助放疗，这部分病人使用发现的5miRNA分子标签分为高风险和低风险组后，高风险组的总生存明显低于低风险组(p＝0.003)(如图4C，转移淋巴结为1到2个之间的病人根据风险分数分为高风险组及低风险组的OS及DFS的K-M分析)，提示转移淋巴结在1到2个之间的病人中，如果5miRNA分子标签为高风险的话，应该对病人进行术后辅助放疗，以提高病人生存；

4)在转移淋巴结在3个的病人中，这部分病人使用5miRNA分子标签分为高风险和低风险组后，高风险组的总生存明显低于低风险组(p＝0.01)(如图4D，转移淋巴结为3个的病人根据风险分数分为高风险组及低风险组的OS及DFS的K-M分析)，提示在转移淋巴结为3个的高风险病人中，应调整放疗方案(加大术后放疗剂量或更多的疗程)或调整术后辅助化疗方案(采用新的化疗方案或给予更多的疗程)，将提高病人的生存时间。

Claims (7)

1.检测试剂作为乳腺癌病人预后判断和术后辅助治疗反应预测试剂的应用，所述检测试剂含有定量miRNAhsa-miR-205-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-665、miR-188-5p、hsa-miR-188-5p和hsa-miR-198表达量的试剂中的至少一种试剂。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测试剂含有定量miRNAhsa-miR-205-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-665、miR-188-5p、hsa-miR-188-5p和hsa-miR-198表达量的试剂中的至少两种试剂。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：判断乳腺癌预后风险的计算方法为：风险分数=∑iwi·xi，式中wi表示第i个miRNA的权重，xi表示第i个miRNA的表达值。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：miRNA的权重根据COX风险回归分析计算得到。

5.一种用于乳腺癌预后判断的试剂盒，含有定量miRNAhsa-miR-205-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-665、hsa-miR-188-5p和hsa-miR-198表达量的试剂中的至少一种试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有定量miRNAhsa-miR-205-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-665、hsa-miR-188-5p和hsa-miR-198表达量的试剂中的至少两种试剂。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有定量miRNAhsa-miR-205-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-665、hsa-miR-188-5p和hsa-miR-198表达量的试剂。