CN104449674A - 壳聚糖棒状微晶荧光探针、制备方法及对痕量金属离子的检测方法 - Google Patents
壳聚糖棒状微晶荧光探针、制备方法及对痕量金属离子的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
壳聚糖棒状微晶荧光探针、制备方法及对痕量金属离子的检测方法，涉及材料科学领域。壳聚糖棒状微晶荧光探针的支撑体为壳聚糖棒状微晶，壳聚糖棒状微晶表面修饰异硫氰酸荧光素，其荧光发射光谱为绿色发光带。利用壳聚糖制备壳聚糖棒状微晶，再以壳聚糖棒状微晶作为支撑体，在其表面修饰异硫氰酸荧光素以形成壳聚糖棒状微晶荧光探针。金属离子目标分子可以同壳聚糖棒状微晶荧光探针表面的氨基形成螯合物，此螯合物会使壳聚糖棒状微晶荧光探针中被激发的电子能量转移到金属离子上，产生荧光猝灭效应，实现对金属离子的识别和痕量检测。同时也可以用来检测其它能同氨基结合且有荧光猝灭效应的有机物质，如TNT、2，4-二硝基甲苯等爆炸物和有机农药。
Description
技术领域
本发明涉及材料科学领域，具体是涉及一种壳聚糖棒状微晶荧光探针、制备方法及对痕量金属离子的检测方法。
背景技术
壳聚糖是一种碱性天然多糖生物材料，其结构类似于纤维素，在其线性分子链上存在C3和C6位的羟基和C2位的氨基。同时，由于在酸溶液中质子化作用而带有正电荷，具有较为活泼的化学性质和相容性、安全性、微生物降解性、生物活性等特点，从而广泛的应用于农业、医药、造纸、食品、印染、纺织、日化、环保等领域。壳聚糖分子链上的活性基团可以同羧甲基、酰基、烷基等基团反应产生一系列的壳聚糖衍生物；同时壳聚糖还可以与过渡金属离子发生螯合配位，同丙烯酸等高分子进行接枝共聚，同醛、酮发生希夫碱反应等，这些都为壳聚糖的广泛应用奠定基础。
微晶壳聚糖是壳聚糖一种新的存在形式，特殊的超分子结构是指具有比壳聚糖更为优异的性能。壳聚糖大分子链上羟基、氨基及残余的N-乙酰氨基，它们会形成各种分子内和分子间的氢键，使壳聚糖形成了大分子的二级结构，这种构象有利于晶态形成，并且结晶度较高，有很稳定的物理化学性质。壳聚糖单晶只有在特殊的条件下，比如极稀的溶液缓慢结晶生成。一般环境下，都是以微晶(微纤)的形式存在，且形态多样。其中最为常见的是球晶。微晶壳聚糖对金属离子的吸附、螯合能力更强。其生物降解性也优于一般壳聚糖。
水体环境与人类的生活息息相关，水质的好坏严重影响着人的身体健康。然而对水体内金属离子的分析方法还大多停留在光度法的基础上。这类方法的灵敏度普遍不高，并且操作繁琐，对于水样中的痕量污染物的测定，目前还无能为力。
荧光化学传感器作为一种灵敏度高、选择性好、操作简便的实验装置，近年来在这一方面得到了迅速的发展和应用。荧光化学传感器对金属离子的检测主要基于两方面的原理：一是，具有荧光特性的荧光化合物与被检测物能发生络合生成没有荧光性质的稳定化合物，发生静态荧光猝灭效应；二是，将分子内电荷转移(ICT)荧光体电子给体中的氮原子置于氮杂冠醚环中，金属离子与冠醚的键合时氮原子上电荷密度减小，给电子能力下降，引起ICT光物理和双重荧光改变而被传感，从而实现对金属离子的传感和识别。
目前，存在对荧光探针及壳聚糖荧光标记的研究，但这些方法仅仅是制备壳聚糖微粒，采用不同的荧光基团进行荧光标记。具体为：赵佳胤等人通过低分子量的壳聚糖与三聚磷酸钠静电作用制备纳米级壳聚糖微球，并与异硫氰酸酯(FITC)反应制备纳米级壳聚糖微球荧光探针。并讨论了制备的影响因素(分析化学，2006，34(11)：1555-1559.)。范妮采用FITC为荧光标记物，利用碱性条件下壳聚糖氨基中的N原子与FITC中异硫氰基上正电性C原子发生亲核加成反应，使壳聚糖与FITC结合，制备荧光标记的壳聚糖。同时，以海藻酸钙微球为载药基质，在酸性条件下与荧光壳聚糖中氨基进行聚电解质络合反应，使海藻酸钙微球标记上荧光(云南大学学报(自然科学版)，2010.32(1)：77-81.)。余慧等2011年以合成的具有羧基官能团的萘酰亚胺类化合物为荧光团，通过酰氯化法活化其中的羧基，并选用羧甲基壳聚糖(CMCS)为基质材料，以化学键合的方式将荧光团引入到CMCS基体中，得到新型荧光材料萘酰亚胺修饰羧甲基壳聚糖。并发现其荧光对pH值敏感，可望作为pH敏感荧光探针(分析化学，2011，39(3)：409-413.)。辛梅华等于2011年制备N，N-双烷基壳聚糖(DCS)，在十二烷基磺酸钠存在下，把羧甲基接枝到DCS的羟基上，再通过酰胺化反应引入1-芘丁酰肼基团，成功合成了新型油溶性荧光高分子材料N-(O-乙酰基-N，N-双烷基化壳聚糖)-N’-芘丁酰肼(化工进展，2011，30(6)：1290-1295.)。刘璠娜将异硫氰酸荧光素(FITC)接枝到N，N，N-三甲基壳聚糖盐酸盐(TMC)的侧基上，制备荧光标记的壳聚糖衍生物TMC-g-FITC。其水溶液与羧甲基壳聚糖(CMC)水溶液经凝聚复合，制备TMC-g-FITC/CMC纳米粒子荧光探针。(功能材料，2008，39(5)：857-860，863.)。
另外，刘音于2013年先制备CdTe、CdTe/CdS、CdTe/CdS/ZnS水溶性纳米量子点，然后合成新型含咔唑基苯乙烯类荧光染料，然后用其对壳聚糖、叶酸修饰，制备荧光探针，最后对乳腺痛细胞标记，并研究荧光探针光谱性能及标记乳腺痛细胞的光学行为(天津大学博士学位论文，2013.)。李学召2012年由8-醛基-1，3，5，7-四甲基-BODIPY(BD)荧光团修饰壳聚糖制备可溶性和不可溶性壳聚糖荧光探针，以及由壳聚糖单体氨基葡萄糖衍生的小分子荧光分子探针，并研究这三者对Hg2+的检测及吸附效果(大连理工大学硕士学位论文，2012.)。朱旭明等利用荧光物质5(6)-羧-四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺标记壳聚糖，并检测标记后的壳聚糖对大肠埃希菌及金色葡萄球菌的抗菌效果(世界科技研究与发展，2008，30(3)：703-705.)。孟庆涛以水溶性的(L-CS)和高密度的(H-CS)壳聚糖为载体材料，设计合成了荧光分子探针改性的功能材料：H-CS-RB、L/H-CS-Fluo和L/H-CS-Cb。荧光材料H-CS-RB可以在水体系中通过荧光和“显色”的方法选择性地识别Hg2+，检测限可在10PPb以下。水溶性的荧光材料L-CS-Fluo和L-CS-Cb则可在Tris-HCI缓冲溶液中通过荧光淬灭的方式选择性地识别Fe3+，检测限分别为0.2PPm和0.6PPm。同时为了研究荧光材料与重金属离子的作用机理，又合成了由壳聚糖单体氨基葡萄糖衍生的小分子探针：AC-RB、AG-Fluo和AG-Cb，这些小分子探针展现了与荧光材料相同的识别性能。由于氨基葡萄糖和低分子量壳聚糖(L-CS)良好的水溶性以及生物兼容性，AG-RB、L-CS-Fluo与L-CS-Cb分别成功地实现了对活体细胞内Hg2+和Fe3+的荧光成像。不溶性的荧光材料H-C-RB、H-Cs-Fluo和H-Cs-Cb吸附Hg2+和Fe3+的能力相对于未经荧光探针改性的高密度壳聚糖(H-CS)均提高了近一倍，并且吸附一过程中伴随着材料颜色的明显变化(大连理工大学博士学位论文，2011.)。刘志军通过壳聚糖(CTS)对生物标记著染料(Cy3)反应，制备了壳聚糖支载荧光染料Cy3-CTS，研究了Cy3-CTS的紫外吸收光谱和荧光光谱特性，实验结果表明，Cy3-CTS的紫外吸收特征峰的波长无明显变化，荧光强度明显增强，而且支载后的荧光染料光稳定性良好，初步细胞标记实验显示，Cy3-CTS对脑胶质瘤细胞具有良好的亲和性，并能穿透细胞膜且发出明显荧光(影像科学与光化学，2009，27(4)：307-313.)。杜予民等发明公开了一种新的能用作酸性细胞器检测的水溶性甲壳素pH探针及其制备方法。这种pH探针由水溶性甲壳素接枝9-蒽醛，通过还原胺化生成，其制备方法是将水溶性甲壳素溶解于蒸馏水中，在室温搅拌条件下加入9-蒽醛，然后加入还原剂，经过透析、萃取除去杂质，冷冻干燥，得到pH敏感的荧光探针。这种在中性水溶液中制备的新型荧光量子点，可避免有机溶剂的毒副作用，该荧光探针适合于生物分子的结合，尤其适合于酸性细胞器检测，在细胞识别、生物标记和疾病诊断等领域有广泛的应用前景(中国专利200610125434X)。
通过上述现有技术可以看出，对于制备出壳聚糖棒状微晶荧光探针以及对痕量金属离子具有高选择性、高灵敏性、带有分子识别和检测性能等方面尚未见报道。
发明内容
为了克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明的目的之一在于提供一种对痕量金属离子具有高选择性、高灵敏性、带有分子识别和检测性能的壳聚糖棒状微晶荧光探针。为实现该目的，本发明采用了以下技术方案：
一种壳聚糖棒状微晶荧光探针，其支撑体为壳聚糖棒状微晶，壳聚糖棒状微晶表面修饰异硫氰酸荧光素，其荧光发射光谱为绿色发光带。
其结构式如下所示：
示意结构如下所示：
本发明的另一目的在于提供一种壳聚糖棒状微晶荧光探针的制备方法，为实现该目的，本发明采用了以下技术方案：包括离子诱导法，首先利用壳聚糖制备壳聚糖棒状微晶，再以壳聚糖棒状微晶作为支撑体，在其表面修饰异硫氰酸荧光素以形成壳聚糖棒状微晶荧光探针。
作为本发明的壳聚糖棒状微晶荧光探针的制备方法进一步改进，首先将壳聚糖进行降解，然后依次通过碱凝胶化、酸溶解、碱凝胶化反复处理以提高其结晶度，然后将其与三聚磷酸钠反应制得壳聚糖棒状微晶。
作为本发明的壳聚糖棒状微晶荧光探针的制备方法进一步改进，所述壳聚糖棒状微晶的制备方法为：把1.5g壳聚糖溶解于100ml的3％稀醋酸溶液中，超声分散2h；将5ml的6％过氧化氢逐滴加入壳聚糖-醋酸溶液中，于40℃水浴摇床中恒温降解6h；加入10％氢氧化钠溶液得到白色凝胶，用蒸馏水洗涤至中性；用100ml的3％稀醋酸溶解，陈化1h后加入10％氢氧化钠溶液进行凝胶化处理，用蒸馏水洗涤至中性；如此反复进行4次，然后用3％稀醋酸进行溶解，调节其pH值在4～5，加入1％的三聚磷酸钠溶液20～30ml，以1500r/min的速度磁力搅拌反应1h，洗涤，干燥得壳聚糖棒状微晶。
作为本发明的壳聚糖棒状微晶荧光探针的制备方法进一步改进，在壳聚糖棒状微晶表面修饰异硫氰酸荧光素的方法为：将制备的壳聚糖棒状微晶分散在50mL的无水乙醇中，加入氨水调节pH值为7，再称取0.002g的异硫氰酸荧光素加入到溶液中，以750rpm的转速在磁力搅拌器上搅拌反应8h，洗涤，干燥得壳聚糖棒状微晶荧光探针。
作为本发明的壳聚糖棒状微晶荧光探针的制备方法进一步改进，所述壳聚糖棒状微晶荧光探针的粒径可控，可以通过调节壳聚糖与三聚磷酸钠之间的质量比以及调节碱凝胶化-酸溶解反复处理的次数来加以控制。
本发明的目的之三在于提供一种利用壳聚糖棒状微晶荧光探针对痕量金属离子的检测方法，为实现该目的，本发明采用了以下技术方案：该壳聚糖棒状微晶荧光探针的表面带有羟基、氨基和异硫氰酸荧光素，在壳聚糖棒状微晶荧光探针中加入金属离子后，其表面的氨基和羟基可进一步与金属离子目标分子作用，使其表面富电子的氨基作为电子供体同缺电子的金属离子受体之间通过电荷转移作用形成螯合物，此螯合物通过荧光共振能量转移可以使壳聚糖棒状微晶荧光探针发生荧光猝灭，利用荧光强度的改变，实现对痕量或超痕量金属离子的检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果表现在：
1)、本发明首次利用合成的壳聚糖棒状微晶作为支撑体，利用其表面富含氨基的特性，修饰荧光素5(6)-异硫氰酸(Fluorescein 5(6)-isothiocyanate，FITC)，形成壳聚糖棒状微晶荧光探针，并首次将壳聚糖棒状微晶荧光探针用于对痕量金属离子的识别与检测。当在壳聚糖棒状微晶荧光探针中加入金属离子后，壳聚糖棒状微晶荧光探针分子会与金属离子发生螯合作用，被激发的电子与金属离子发生分子内电子的转移，被激发的电子能量转移到金属离子上，而不通过发射电子回到基态，所以金属离子对壳聚糖棒状微晶荧光探针会产生荧光猝灭效应，从而实现对痕量金属离子的检测。
2)、本发明的壳聚糖棒状微晶荧光探针，能够对金属离子高选择性、高灵敏性痕量检测。例如，加入一定量的金属离子目标分子可以同壳聚糖棒状微晶荧光探针表面的氨基形成螯合物，此螯合物会使壳聚糖棒状微晶荧光探针中被激发的电子能量转移到金属离子上，产生荧光猝灭效应，通过荧光强度下降，实现对金属离子的识别和痕量检测，特别是Cu2+、Fe3+、Ni2+、pb2+、Zn2+。同时也可以用来检测其它能同氨基结合且有荧光猝灭效应的有机物质，如TNT、2，4-二硝基甲苯(2，4-dinitrotoluene，DNT)等爆炸物和有机农药。因此，本发明的壳聚糖棒状微晶荧光探针，使用范围比较广泛。
3)、本发明的壳聚糖棒状微晶荧光探针，与传统的固体薄膜化学传感器相比较，壳聚糖棒状微晶荧光探针化学传感器具有较大的比表面积，对金属离子螯合能力更强，高选择性，高敏感性，提高金属离子痕量检测的精度和效率。
4)、本发明的壳聚糖棒状微晶荧光探针还具有如下优点：①容易合成壳聚糖棒状微晶荧光探针，高的荧光量子效率，相对较低成本；②对不同金属离子其螯合能力不同，具有高选择性，高敏感性；③表面容易接枝共聚有机官能团；④发射光带容易调节。
5)、本发明的壳聚糖棒状微晶荧光探针的制备方法，通过反复壳聚糖酸溶解-碱凝胶化处理-酸再溶解等过程处理，为壳聚糖微分子提供了最大程度的相互接触和有序排列，从而可以得到较高的结晶度。在酸性溶液中，壳聚糖分子中的氨基质子化，使其带上高密度的正电荷，通过反复处理可以使正电荷密度增加，促使其与带负电荷的磷酸根离子发生分子内和分子间的交联反应，对其结构进行固化。同时，其对金属离子的吸附、螯合能力更强。其生物降解性也优于一般壳聚糖。
6)、本发明的壳聚糖棒状微晶荧光探针的制备方法，制备的粒径可控的壳聚糖棒状微晶荧光探针可以通过调节壳聚糖与三聚磷酸钠之间的质量比、壳聚糖分子量及改变壳聚糖酸溶解-碱凝胶化处理-酸再溶解过程反复次数等来加以实现。
附图说明
图1是壳聚糖棒状微晶荧光探针的制备路线图。
图2是壳聚糖棒状微晶扫描电镜图，图2a和图2b为不同位置的电镜图。
图3是壳聚糖棒状微晶(CS)及壳聚糖棒状微晶荧光探针(CS-FITC)的红外光谱图。
图4是壳聚糖棒状微晶(CS)、纯染料(FITC)、壳聚糖棒状微晶荧光探针(CS-FITC)的紫外-可见吸收光谱图。
图5是壳聚糖棒状微晶荧光探针归一化紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱图。插图1表示的是壳聚糖棒状微晶的照片，插图2表示的是纯染料FITC的照片，插图3表示的是壳聚糖棒状微晶荧光探针在365nm紫外灯下的照片。
图6是壳聚糖棒状微晶荧光探针分别对Cu2+、Fe3+、Ni2+、pb2+、Zn2+的检测限检测图及Stern-Volmer方程图。
具体实施方式
壳聚糖棒状微晶荧光探针的制备路线图如图1所示，具体操作步骤如下：
步骤①、壳聚糖棒状微晶的制备(离子诱导法)
把1.5g壳聚糖溶解于100ml的3％(体积百分比，下同)稀醋酸溶液中，超声分散2h；将5ml的6％(体积百分比)过氧化氢逐滴加入壳聚糖-醋酸溶液中，于40℃水浴摇床中恒温降解6h；加入10％(质量百分比，下同)氢氧化钠溶液得到白色凝胶，用蒸馏水洗涤至中性；用100ml的3％稀醋酸溶解，陈化1h后加入10％氢氧化钠溶液进行凝胶化处理，用蒸馏水洗涤至中性；如此反复进行4次，然后用3％稀醋酸进行溶解，调节其pH值在4～5，加入1％(质量百分比)的三聚磷酸钠溶液25ml，以1500r/min的速度磁力搅拌反应1h，洗涤，干燥得壳聚糖棒状微晶。图2是该壳聚糖棒状微晶扫描电镜图，通过图2可以看出其呈现棒状结构，微晶形状比较规则，排列也较整齐。
步骤②、壳聚糖棒状微晶表面修饰荧光
将上述制备的壳聚糖棒状微晶分散在50mL的无水乙醇中，加入氨水调节pH值为7，再称取0.002g的异硫氰酸荧光素加入到溶液中，以750rpm的转速在磁力搅拌器上搅拌反应8h，洗涤，干燥得壳聚糖棒状微晶荧光探针。
图3是壳聚糖棒状微晶(CS)及壳聚糖棒状微晶荧光探针(CS-FITC)的红外光谱图，由谱图CS知，3360-3480cm-1为O-H键和N-H键伸缩振动耦合而增宽的多重吸收峰，2870cm-1左右是C-H键伸缩振动吸收带，1647cm-1左右是酰胺弯曲振动吸收带，1600cm-1左右为氨基伸缩振动吸收带，1324cm-1左右是羟基特征吸收带，894cm-1与1154cm-1左右是壳聚糖糖基特征吸收带。由谱图CS-FITC知在3431cm-1波长处出现了N-H的伸缩振动吸收峰，说明壳聚糖上的氨基并没有被破坏。通过红外光谱图还可以看出，荧光素与壳聚糖的结合主要是发生在壳聚糖分子链上的氨基。
图4是壳聚糖棒状微晶(CS)、纯染料(FITC)、壳聚糖棒状微晶荧光探针(CS-FITC)的紫外-可见吸收光谱图，通过谱图可以看到纯染料FITC在可见区440nm和500nm之间有两个不太明显的吸收峰。而FITC-CS棒状微晶是在可见区502nm处仅有一个较强的吸收峰，同时在440nm和500nm之间的两个吸收峰消失，并且可见峰的位置也发生了移动，是FITC和CS通过硫代酰胺键(-NH-CS-NH-)链接，其中未参与成键的氮原子(N)和硫原子(S)中的n电子从键合轨道跃迁到反键轨道π*，同时硫代酰胺键中的双键中的成键轨道中π电子有可能跃迁到反键轨道π*，使FITC分子中n-π*吸收带的可见吸收峰增强并向长波方向移动，从而表现出FITC中加入CS共价耦联后在502nm处产生强的吸收峰。同时也可以看到FITC-CS微晶的在可见区502nm处出现了吸收峰，由于壳聚糖微晶在紫外可见是没有吸收峰的，所以可以判断在可见区502nh处出现的吸收峰就是FITC通过共价耦联到壳聚糖上的峰，因此，可以断定FITC共价耦联到壳聚糖上，成功制备了FITC-CS微晶。
图5是壳聚糖棒状微晶荧光探针归一化紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱图。插图1表示的是壳聚糖棒状微晶的照片，插图2表示的是纯染料FITC的照片，插图3表示的是壳聚糖棒状微晶荧光探针在365nm紫外灯下的照片。FITC-CS微晶表现了一种绿色的荧光发射，最大发射峰在527nm处(激发波长是476nm)。它的最大发射波长基本上等同于纯染料的最大发射波长。此外，在365nm波长的紫外灯激发下，可以看到在修饰了荧光染料的壳聚糖棒状微晶溶液显示了很强的荧光颜色。纳米粒子FITC-CS显示的亮绿色同最大发射光谱数据相一致(527nm)。
为了测定壳聚糖棒状微晶荧光探针对不同金属离子的荧光光谱，首先用10ml容量瓶精确配置硝酸镍、硝酸铅、乙酸铜、乙酸锌、三氯化铁溶液其浓度分别为1.0×10-2mol·L-1、1.0×10-3mol·L-1、1.0×10-4mol·L-1、1.0×10-5mol·L-1、1.0×10-6mol·L-1、1.0×10-7mol·L-1、1.0×10-8mol·L-1、1.0×10-9mol·L-1，配制的方法为逐步稀释法。
荧光光谱测定使用的壳聚糖棒状微晶荧光探针的浓度是2mg·mL-1，首先测定壳聚糖棒状微晶荧光探针的荧光光谱，然后将20μL的FITC-CS纳米粒子加到荧光光谱石英比色皿中，把2mL的已知浓度的目标分析物注射到比色皿中以获取稳态荧光光谱。壳聚糖棒状微晶探针分子内发生n→π*电子的跃迁，被激发的电子无辐射跃迁回到基态发出荧光。当在壳聚糖棒状微晶探针中加入金属离子后，壳聚糖棒状微晶探针分子会与金属离子发生螯合作用，被激发的电子与金属离子发生分子内电子的转移，被激发的电子能量转移到金属离子上，而不通过发射电子回到基态，所以金属离子对壳聚糖棒状微晶探针会产生荧光猝灭效应，从而实现对金属离子的痕量检测。
图6是壳聚糖棒状微晶荧光探针分别对Cu2+、Fe3+、Ni2+、pb2+、Zn2+的检测限检测图及Stern-Volmer方程图，通过Stern-Volmer方程图，其对Cu2+、Fe3+、Ni2+、pb2+、Zn2+的检测限分别为10-8M、10-8M、10-6M、10-6M和10-5M。
Claims (9)
1.一种壳聚糖棒状微晶荧光探针，其支撑体为壳聚糖棒状微晶，壳聚糖棒状微晶表面修饰异硫氰酸荧光素，其荧光发射光谱为绿色发光带；
其结构式如下所示：
其示意结构如下所示：
2.一种如权利要求1所述壳聚糖棒状微晶荧光探针的制备方法，包括离子诱导法，其特征在于：首先利用壳聚糖制备壳聚糖棒状微晶，再以壳聚糖棒状微晶作为支撑体，在其表面修饰异硫氰酸荧光素以形成壳聚糖棒状微晶荧光探针。
3.根据权利要求2所述的壳聚糖棒状微晶荧光探针的制备方法，其特征在于：首先将壳聚糖进行降解，然后依次通过碱凝胶化、酸溶解、碱凝胶化反复处理以提高其结晶度，然后将其与三聚磷酸钠反应制得壳聚糖棒状微晶。
4.根据权利要求3所述的壳聚糖棒状微晶荧光探针的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖棒状微晶的制备方法为：
把1.5g壳聚糖溶解于100ml的3％稀醋酸溶液中，超声分散2h；将5ml的6％过氧化氢逐滴加入壳聚糖-醋酸溶液中，于40℃水浴摇床中恒温降解6h；
加入10％氢氧化钠溶液得到白色凝胶，用蒸馏水洗涤至中性；
用100ml的3％稀醋酸溶解，陈化1h后加入10％氢氧化钠溶液进行凝胶化处理，用蒸馏水洗涤至中性；
如此反复进行4次，然后用3％稀醋酸进行溶解，调节其pH值在4～5，加入1％的三聚磷酸钠溶液20～30ml，以1500r/min的速度磁力搅拌反应1h，洗涤，干燥得壳聚糖棒状微晶。
5.根据权利要求4所述的壳聚糖棒状微晶荧光探针的制备方法，其特征在于：在壳聚糖棒状微晶表面修饰异硫氰酸荧光素的方法为：将制备的壳聚糖棒状微晶分散在50mL的无水乙醇中，加入氨水调节pH值为7，再称取0.002g的异硫氰酸荧光素加入到溶液中，以750rpm的转速在磁力搅拌器上搅拌反应8h，洗涤，干燥得壳聚糖棒状微晶荧光探针。
6.根据权利要求4或5所述的壳聚糖棒状微晶荧光探针的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖棒状微晶荧光探针的粒径可控，可以通过调节壳聚糖与三聚磷酸钠之间的质量比以及调节碱凝胶化-酸溶解反复处理的次数来加以控制。
7.一种权利要求1所述壳聚糖棒状微晶荧光探针在硝基芳烃类爆炸物、有机农药以及金属离子检测中的应用，检测机理基于荧光共振能量转移原理。
8.一种利用权利要求1所述壳聚糖棒状微晶荧光探针对痕量金属离子的检测方法，其特征在于：该壳聚糖棒状微晶荧光探针的表面带有羟基、氨基和异硫氰酸荧光素，在壳聚糖棒状微晶荧光探针中加入金属离子后，其表面的氨基和羟基可进一步与金属离子目标分子作用，使其表面富电子的氨基作为电子供体同缺电子的金属离子受体之间通过电荷转移作用形成螯合物，此螯合物通过荧光共振能量转移可以使壳聚糖棒状微晶荧光探针发生荧光猝灭，利用荧光强度的改变，实现对痕量或超痕量金属离子的检测。
9.根据权利要求8所述的利用壳聚糖棒状微晶荧光探针对痕量金属离子的检测方法，其特征在于：所述金属离子为Cu2+、Fe3+、Ni2+、Pb2+、Zn2+。
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