CN113195499A - 杂芳基二氢嘧啶衍生物和治疗乙型肝炎感染的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了可用于在有需要的受试者中治疗HBV感染的化合物、其药物组合物以及在受试者中抑制、阻遏或预防HBV感染的方法。

Description

杂芳基二氢嘧啶衍生物和治疗乙型肝炎感染的方法
背景技术
慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是重大的全球健康问题，影响超过5％的世界人口(全球超过3.5亿人，美国有125万人)。
尽管有预防性HBV疫苗可供使用，但慢性HBV感染的负担仍然是重大的未得到满足的全球医学问题，原因是发展中国家大多数地区的治疗选择并不理想，而且新感染率持续不变。目前的治疗不能治愈，并仅限于两类药剂(干扰素α和核苷类似物/病毒聚合酶抑制剂)；抗药性、疗效低和耐受性问题限制了其影响。HBV的治愈率低至少部分归因于用单一抗病毒剂难以完全抑制病毒产生的事实。然而，持续抑制HBV DNA减缓了肝脏疾病的进展并有助于预防肝细胞癌。目前HBV感染患者的治疗目标是将血清HBV DNA降至低水平或不可检测水平，并最终减少或预防肝硬化和肝细胞癌的发展。
HBV衣壳蛋白在病毒的生命周期中起着重要的作用。HBV衣壳/核心蛋白形成亚稳病毒颗粒或蛋白质壳，其在细胞间传代期间保护病毒基因组，并还在病毒复制过程中发挥核心作用，包括基因组衣壳化、基因组复制和病毒体形态发生和外出。衣壳结构还对环境提示作出反应，以便在病毒进入后允许不包被。一致地，已经发现衣壳组装和拆卸的适当时机、适当的衣壳稳定性和核心蛋白的功能对于病毒感染性是至关重要的。
本领域需要可增加对病毒产生的抑制并可治疗、改善或预防HBV感染的治疗剂。将此类治疗剂作为单一疗法或与其他HBV治疗或辅助治疗组合施用HBV感染患者将导致显著降低的病毒载量、改善的预后、减少的疾病进展和增强的血清转化率。
用于治疗HBV的杂芳基二氢嘧啶的背景技术包括WO2015/132276、WO 2013/102655和WO 99/54326。
发明内容
本文提供了可用于在有需要的受试者中治疗HBV感染的化合物。因此，一方面，本文提供具有式I的化合物：
Figure BDA0003122494520000021
包括其氘化异构体、立体异构体或互变异构形式，或其药学上可接受的盐，其中：
R1选自由以下组成的组：苯基、苯硫基、吡啶基和吡啶酮基，任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：C1-4烷基、卤素和CN；
R2是C1-4烷基；
R3选自由以下组成的组：噻唑基、吡啶基和噁唑基，任选地被一个或多个选自氟和C1-6烷基的取代基取代；
n是整数0或1；
R4和R5独立地选自由以下组成的组：H和-COOH；
Figure BDA0003122494520000022
(即，X和Y之间的键)是单键或双键；
当X和Y通过单键连接时，X选自由以下组成的组：C(＝S)、C(＝NR6)、C(＝CHR7)和CHR8，且Y是NR9；
当X和Y通过双键连接时，X是C-SR9或C-OR9，且Y是N原子；
Z选自由以下组成的组：CH2和C(＝O)；
R6选自由以下组成的组：CN、C(＝O)CH3和SO2CH3；
R7是CN；
R8是CF3；
R9选自由以下组成的组：H、-C1-6烷基、-C1-6烷基-R10、-C1-6烷氧基-C1-6烷基-R10、-(CH2)p-C(R11R12)-R10和-(CH2)p-Q-R10；
p是整数0、1、2或3；
R11和R12连同它们所附接的碳原子一起形成3至7元饱和环，该饱和环任选地含有杂原子，该杂原子是氧或氮，该氮被H、-C1-6烷基、-C1-6烷氧基-C1-6烷基和-C1-6烷基羰基取代；
Q选自由以下组成的组：芳基、杂芳基和3至7元饱和环，该饱和环任选地含有杂原子，该杂原子是氧或氮，该氮被H、-C1-6烷基、-C1-6烷氧基-C1-6烷基和-C1-6烷基羰基取代；
R10选自-COOH、-C(＝O)NHS(＝O)2-C1-6烷基、四唑基和羧酸生物电子等排体。
在另一个方面，本文提供了药物组合物，该药物组合物包含至少一种具有式I的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
在另一个方面，本文提供了药物组合物，该药物组合物包含至少一种披露的化合物以及药学上可接受的载体。
在另一个方面，本文提供了治疗有需要的个体的HBV感染或HBV诱发的疾病的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的具有式I的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一个方面，本文提供了抑制或减少有需要的个体体内的含HBV DNA颗粒或含HBV RNA颗粒的形成或存在的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的具有式I的化合物或其药学上可接受的盐。
在一个实施例中，本文提供的任何方法可以进一步包括向该个体施用至少一种选自由以下组成的组的另外的治疗剂：如本文进一步定义的HBV抑制剂。
具体实施方式
本文提供了可用于治疗和预防受试者的HBV感染的化合物，例如具有I的化合物或其药学上可接受的盐。
不受限于任何特定的作用机制，认为这些化合物调节或破坏HBV复制或感染性颗粒产生所必需的HBV组装和其他HBV核心蛋白功能和/或可以破坏HBV衣壳组装，产生具有大大降低的感染性或复制能力的空衣壳。换句话说，本文提供的化合物可以充当衣壳组装调节剂。
本文提供的化合物具有有效的抗病毒活性，表现出有利的代谢特性、组织分布、安全性和药物谱，并适用于人类。披露的化合物可以调节(例如，加速、延迟、抑制、破坏或减少)正常病毒衣壳组装或拆卸，结合衣壳或改变细胞多蛋白和前体的代谢。当衣壳蛋白成熟时或在病毒感染期间可以进行调节。披露的化合物可以用于调节HBV cccDNA的活性或特性、或HBV RNA颗粒从感染细胞内产生或释放的方法中。
在一个实施例中，本文所述的化合物适用于单一疗法，并针对自然或天然HBV株和对当前已知药物具有抗性的HBV株是有效的。在另一个实施例中，本文所述的化合物适用于组合疗法。
定义
下文列出了用于描述本发明的各个术语的定义。这些定义适用于如它们在整个说明书和权利要求书中使用的术语，除非在特定情况下另行限制，单独地或作为更大基团的一部分。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。一般而言，本文使用的命名法和细胞培养、分子遗传学、有机化学和肽化学中的实验室程序是本领域众所周知且常用的那些。
如本文所用，冠词“一个/种(a和an)”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)该冠词的语法宾语。举例来说，“一个元素”意指一个元素或多于一个元素。此外，术语“包括(including)”以及其他形式如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。
如本文所用，术语“约”将是本领域普通技术人员所理解的，并将在一定程度上根据其使用的上下文而变化。如本文所用，当涉及如量、持续时间等的可测量值时，术语“约”意在包括相对于指定值的±20％或±10％(包括±5％、±1％和±0.1％)的变化，因为此类变化适于执行披露的方法。
如本文所用，术语“衣壳组装调节剂”是指破坏或加速或抑制或阻碍或延迟或减少或修饰正常衣壳组装(例如，在成熟期间)或正常衣壳拆卸(例如，在感染期间)或扰动衣壳稳定性从而诱导异常的衣壳形态和功能的化合物。在一个实施例中，衣壳组装调节剂加速衣壳组装或拆卸，从而诱导异常的衣壳形态。在另一个实施例中，衣壳组装调节剂与主要的衣壳组装蛋白(CA)相互作用(例如在活性位点与其结合，在变构位点与其结合，修改或阻碍折叠等)，从而破坏衣壳组装或拆卸。在又另一个实施例中，衣壳组装调节剂引起CA的结构或功能(例如，CA组装、拆卸、与底物结合、折叠成合适构象等的能力)的扰动，这减弱了病毒感染性或对病毒是致命的。
如本文所用，术语“治疗(treatment或treating)”被定义为向患者施用或施用治疗剂，即披露的化合物(单独地或与另一种药剂组合)，或向来自患者的分离的组织或细胞系应用或施用治疗剂(例如，用于诊断或离体应用)，该患者患有HBV感染、HBV感染的症状或患上HBV感染的可能性，目的是治愈、痊愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响HBV感染、HBV感染的症状或患上HBV感染的可能性。基于从药物基因组学领域获得的知识，此类治疗可以具体定制或修改。
如本文所用，术语“预防(prevent或prevention)”意指没有障碍或疾病发展(如果没有发生障碍或疾病)、或没有进一步的障碍或疾病发展(如果已经患上了该障碍或疾病)。还考虑到了预防与障碍或疾病相关的一些或全部症状的能力。
如本文所用，术语“患者”、“个体”或“受试者”是指人或非人类哺乳动物。非人类哺乳动物包括例如家畜以及宠物，如绵羊、牛、猪、犬科动物、猫科动物和鼠科哺乳动物。优选地，患者、受试者或个体是人。
如本文所用，术语“有效量”、“药学有效量”和“治疗有效量”是指无毒但足够提供期望的生物学结果的药剂量。该结果可以是疾病征象、症状或原因的减少和/或减轻，或任何其他期望的生物系统变化。本领域普通技术人员使用常规实验可以确定任何个体情况下的适当治疗量。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指不消除化合物的生物学活性或特性且相对无毒的材料(如载体或稀释剂)，即该材料可以向个体施用而不会引起不希望的生物学效应或以有害的方式与包含所述材料的组合物的任何组分相互作用。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指披露的化合物的衍生物，其中通过将现存的酸或碱部分转化为其盐形式而对母体化合物进行修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱金属盐或有机盐；等。本发明的药学上可接受的盐包括例如从无毒的无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本发明的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，此类盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中或者在两者的混合物中反应来制备；通常，非水性介质像醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。合适的盐的清单见于Remington'sPharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第17版,Mack Publishing Company[马克出版公司],伊斯顿,宾夕法尼亚州,1985,第1418页和Journal of Pharmaceutical Science[药物科学杂志],66,2(1977)中，将其各自通过引用以其全部内容并入本文。
如本文所用，术语“组合物”或“药物组合物”是指可用于本发明的至少一种化合物与药学上可接受的载体的混合物。药物组合物有助于将化合物向患者或受试者施用。本领域存在多种施用化合物的技术，包括但不限于静脉内、口服、气雾剂、肠胃外、眼部、肺部和局部施用。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或载体，如液体或固体填充剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或囊封材料，这些材料涉及将可用于本发明的化合物在患者体内载运或输送或载运或输送到患者体内，使得它可以发挥预期功能。典型地，此类构建体从身体的一个器官或部分载运或输送到身体的另一个器官或部分。每种载体在与配制品的其他成分(包括可用于本发明的化合物)相容且对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；表面活性剂；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药物配制品中使用的其他无毒相容物质。
如本文所用，“药学上可接受的载体”还包括与可用于本发明的化合物的活性相容并对于患者来说在生理上是可接受的任何和所有的涂层剂、抗细菌剂和抗真菌剂以及吸收延迟剂等。补充活性化合物也可以掺入组合物中。“药学上可接受的载体”可以进一步包括可用于本发明的化合物的药学上可接受的盐。可以包括在用于实践本发明的药物组合物中的其他另外成分在本领域是已知的，并例如描述于Remington's PharmaceuticalSciences[雷明顿药物科学](Genaro编辑,Mack Publishing Co.[马克出版公司],1985,伊斯顿,宾夕法尼亚州)，将其通过引用并入本文。
如本文所用，除非另有说明，术语“烷基”本身或作为另一个取代基的一部分意指具有指定碳原子数的直链或支链烃(即，C1-C3烷基意指具有一至三个碳原子的烷基，C1-C4烷基意指具有一至四个碳的烷基)，并且包括直链和支链。实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基。烷基的实施例通常包括但不限于C1-C10烷基，如C1-C6烷基，如C1-C4烷基。
如本文所用，除非另有说明，术语“烯基”本身或作为另一个取代基的一部分意指包含至少一个碳碳双键的具有指定碳原子数的直链或支链烃(即，C2-C4烯基或C2-4烯基意指具有二至四至八个碳原子的烯基)。C4-C8烯基或C4-8烯基意指具有四个碳原子的烯基。烯基的实施例通常包括但不限于C2-C6烯基，如C2-C4烯基，如C2-C3烯基。
如本文所用，除非另有说明，术语“卤代”或“卤素”单独或作为另一个取代基的一部分意指氟、氯、溴或碘原子，优选氟、氯或溴，更优选氟或氯。
如本文所用，术语“3-7元饱和环”是指单环非芳族饱和基团，其中形成环的每个原子(即，骨架原子)是碳原子，除非此环含有一个或多个杂原子，如果这样进一步定义的话。3-7元饱和环包括具有3至7个环原子的基团。单环3-7元饱和环包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基。
如本文所用，3-7元饱和环可以任选地包含杂原子，所述杂原子是被H、C1-6烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基取代的氧或氮。
如本文所用，术语“芳族”是指具有一个或多个多不饱和环并具有芳族特征的碳环或杂环，即具有(4n+2)个离域(pi)电子，其中n是整数。
如本文所用，除非另有说明，单独使用或与其他术语组合使用的术语“芳基”意指含有一个或多个环(通常为一个、两个或三个环)的碳环芳族系统，其中此类环可以按悬垂方式附接在一起(如联苯基)，或者可以稠合(如萘)。芳基基团的实例包括苯基、蒽基和萘基。优选实例是苯基(例如，C6-芳基)和联苯基(例如，C12-芳基)。在一些实施例中，芳基基团具有六至十六个碳原子。在一些实施例中，芳基基团具有六至十二个碳原子(例如，C6-C12-芳基)。在一些实施例中，芳基基团具有六个碳原子(例如，C6-芳基)。
如本文所用，术语“杂芳基”或“杂芳族”是指具有芳族特征的杂环。杂芳基取代基可以由碳原子数定义，例如C1-C9-杂芳基指示杂芳基基团中所含的碳原子数而不包括杂原子数。例如，C1-C9-杂芳基将包括另外的一至四个杂原子。多环杂芳基可以包括一个或多个部分饱和的环。杂芳基的非限制性实例包括吡啶基、吡嗪基、嘧啶基(包括例如，2-和4-嘧啶基)、哒嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基(包括例如，2-吡咯基)、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡唑基(包括例如，3-和5-吡唑基)、异噻唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,3,4-三唑基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,3,4-噻二唑基和1,3,4-噁二唑基。
多环杂环和杂芳基的非限制性实例包括吲哚基(包括例如，3-、4-、5-、6-和7-吲哚基)、二氢吲哚基、喹啉基、四氢喹啉基、异喹啉基(包括例如，1-和5-异喹啉基)、1,2,3,4-四氢异喹啉基、噌啉基、喹喔啉基(包括例如，2-和5-喹喔啉基)、喹唑啉基、酞嗪基、1,8-萘啶基、1,4-苯并二噁烷基、香豆素、二氢香豆素、1,5-萘啶基、苯并呋喃基(包括例如，3-、4-、5-、6-和7-苯并呋喃基)、2,3-二氢苯并呋喃基、1,2-苯并异噁唑基、苯并噻吩基(包括例如，3-、4-、5-、6-和7-苯并噻吩基)、苯并噁唑基、苯并噻唑基(包括例如，2-苯并噻唑基和5-苯并噻唑基)、嘌呤基、苯并咪唑基(包括例如，2-苯并咪唑基)、苯并三唑基、硫代黄嘌呤基、咔唑基、咔啉基、吖啶基、双稠吡咯啶基和喹嗪基。
如本文所用，术语“取代”意指原子或原子基团替换氢作为附接至另一个基团的取代基。
如本文所用，术语“选自……”(例如，“R4选自A、B和C”)应理解为等同于术语“选自由以下组成的组：……”(例如，“R4选自由以下组成的组：A、B和C”)。
一个实施例涉及如本文所定义的具有式I的化合物，其中羧酸生物电子等排体为-S(＝O)2(OH)、-P(＝O)(OH)2、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)NHCN、1,2,4-噁二唑-5(4H)-酮或3-羟基-4-甲基环丁-3-烯-1,2-二酮。这涉及以下结构：
Figure BDA0003122494520000101
一个实施例涉及如本文所定义的具有式I的化合物，其中R1是被一个或多个选自卤素和C1-6烷基的取代基取代的苯基。
一个实施例涉及如本文所定义的具有式I的化合物，其中R2是甲基或乙基。
一个实施例涉及如本文所定义的具有式I的化合物，其中R3是噻唑基。
一个实施例涉及如本文所定义的具有式I的化合物，其中R4和R5是H。
一个实施例涉及如本文所定义的具有式I的化合物，其中X是C(＝S)。
一个实施例涉及如本文所定义的具有式I的化合物，其中Z是CH2。
一个实施例涉及如本文所定义的具有式I的化合物，其中R9是C1-6烷基-CO2H、-(CH2)p-C(R11R12)-R10或(CH2)p-Q-R10。
一个实施例涉及如本文所定义的具有式I的化合物，其中Q是苯基，或其中Q是C3-6环烷基，或其中Q是含有氧的3至6元饱和环。
一个实施例涉及如本文所定义的具有式I的化合物，其中R11和R12连同它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基，或者R11和R12与它们附接的碳原子一起形成包含氧的3至6元饱和环。
一个实施例涉及化合物，该化合物选自由满足以下式的化合物组成的组：
Figure BDA0003122494520000111
Figure BDA0003122494520000121
Figure BDA0003122494520000131
Figure BDA0003122494520000141
Figure BDA0003122494520000151
Figure BDA0003122494520000161
Figure BDA0003122494520000171
一个实施例涉及化合物，该化合物选自由满足以下式的化合物组成的组：
Figure BDA0003122494520000172
Figure BDA0003122494520000181
Figure BDA0003122494520000191
Figure BDA0003122494520000201
一个实施例涉及化合物，该化合物选自由满足以下式的化合物组成的组：
Figure BDA0003122494520000211
Figure BDA0003122494520000221
Figure BDA0003122494520000231
Figure BDA0003122494520000241
Figure BDA0003122494520000251
披露的化合物可以具有一个或多个立构中心，并每个立构中心可以独立地以R或S构型存在。对于一些化合物，尽管该化合物本身已经作为单一立体异构体被分裂且为对映异构/非对映异构纯的，但当绝对立体化学尚未确定时，指定中心处的立体化学构型已被指定为“R*”、“S*”。在一个实施例中，本文所述的化合物以光学活性或外消旋形式存在。应当理解，本文所述的化合物包括具有本文所述的治疗上有用的特性的外消旋、光学活性、区域异构和立体异构形式或其组合。
光学活性形式的制备以任何合适的方式实现，包括作为非限制性实例，通过用重结晶技术拆分外消旋形式、由光学活性起始材料合成、手性合成或使用手性固定相的色谱分离。在一个实施例中，一种或多种异构体的混合物用作本文所述的披露的化合物。在另一个实施例中，本文所述的化合物含有一个或多个手性中心。这些化合物通过任何方式制备，包括立体选择性合成、对映体选择性合成或对映体或非对映体混合物的分离。化合物及其异构体的拆分通过任何方式实现，包括作为非限制性实例，化学方法、酶促方法、分步结晶、蒸馏以及色谱法。
当不能确定化合物的绝对R或S立体化学时，可以通过如由色谱柱、洗脱液等确定的具体色谱条件下的色谱法之后的保留时间来确定。
在一个实施例中，披露的化合物可以作为互变异构体存在。所有互变异构体都包括在本文提供的化合物的范围内。
本文所述的化合物还包括同位素标记的化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子序数，但原子质量或质量数不同于自然界中常见的原子质量或质量数的原子替换。适合包含在本文所述化合物中的同位素的实例包括但不限于2H、3H、11C、13C、14C、36Cl、18F、123I、125I、13N、15N、15O、17O、18O、32P和35S。在一个实施例中，同位素标记的化合物可用于药物或底物组织分布研究。在另一个实施例中，用较重的同位素如氘取代提供了较高的代谢稳定性(例如，增加的体内半衰期或降低的剂量需求)。
在又另一个实施例中，用正电子发射同位素如11C、18F、15O和13N取代可用于检查底物受体占据的正电子发射断层成像(PET)研究。同位素标记的化合物通过任何合适的方法或通过使用适当的同位素标记的试剂代替另外使用的未标记的试剂的方法来制备。
在一个实施例中，本文所述的化合物通过其他手段标记，包括但不限于使用发色团或荧光部分、生物发光标记或化学发光标记。
使用本文所述的技术和材料以及本领域技术人员已知的技术合成本文所述的化合物和具有不同取代基的其他相关化合物。用于制备本文所述的化合物的通用方法通过使用适当的试剂和条件来修改，以便引入如本文提供的式中所示的各个部分。
由可从商业来源获得或者使用本文所述的程序制备的化合物开始，使用任何合适的程序合成本文所述的化合物。
本申请的化合物还包括中间体化合物，包括其任何盐，例如
Figure BDA0003122494520000271
Figure BDA0003122494520000281
Figure BDA0003122494520000291
Figure BDA0003122494520000301
方法
本文提供了治疗有需要的个体的HBV感染的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
本文还提供了根除有需要的个体的HBV感染的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
本文提供了减少有需要的个体体内与HBV感染相关的病毒载量的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
另外，本文提供了减少有需要的个体的HBV感染复发的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
本文提供了抑制或减少有需要的个体体内的含HBV DNA颗粒或含HBV RNA颗粒的形成或存在的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
在某些方面，本文所述的方法和/或组合物对于抑制或减少在体外或在体内(例如，在细胞中、在组织中、在器官中(例如，在肝脏中)、在生物体等中)HBV相关颗粒的形成或存在是有效的。HBV相关颗粒可以含有HBV DNA(即，线性和/或共价闭合环状DNA(cccDNA))和/或HBV RNA(即，前基因组RNA和/或亚基因组RNA)。因此，HBV相关颗粒包括含HBV DNA颗粒或含HBV RNA颗粒。
如本文所用，“HPV相关颗粒”是指感染性HBV病毒体(即，丹氏粒)和非感染性HBV亚病毒颗粒(即，HBV丝和/或HBV球)两者。HBV病毒体包含包括表面蛋白的外包膜、包含核心蛋白的核衣壳、至少一种聚合酶蛋白和HBV基因组。HBV丝和HBV球包含HBV表面蛋白，但缺乏核心蛋白、聚合酶和HBV基因组。HBV丝和HBV体也统称为表面抗原(HBsAg)颗粒。HBV球包含中和小HBV表面蛋白。HBV丝还包括中、小和大HBV表面蛋白。
HBV亚病毒颗粒可以包括非颗粒状或分泌型HBeAg，其作为HBV活性复制的标记。
本文提供了减少有需要的个体体内的HBV感染的不良生理影响的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
本文还提供了减少、减缓或抑制有需要的个体的HBV感染的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
本文提供了在有需要的个体体内诱导来自HBV感染的肝损伤逆转的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
本文提供了减少有需要的个体体内的HBV感染的长期抗病毒治疗的生理影响的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
本文提供了预防性地治疗有需要的个体的HBV感染的方法，其中该个体患有潜伏性HBV感染，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
在一个实施例中，该个体是其他治疗类别的HBV药物(例如，HBV聚合酶抑制剂、干扰素、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、文献描述的衣壳组装调节剂、不同或未知机制的抗病毒化合物等或其组合)难治的。在另一个实施例中，与其他治疗类别的HBV药物减少患有HBV感染的个体体内的病毒载量的程度相比，披露的方法以更大的程度或以更快的速度减少该个体体内的病毒载量。
在一个实施例中，与在预防性地治疗有需要的个体的HBV感染中获得相似结果所需的至少一种另外的治疗剂的单独施用相比，披露的化合物或其药学上可接受的盐的施用允许以更低的剂量或频率施用至少一种另外的治疗剂。
在一个实施例中，与选自下组的化合物的施用相比，披露的化合物或其药学上可接受的盐的施用以更大的程度或以更快的速度减少该个体体内的病毒载量，该组由以下组成：HBV聚合酶抑制剂、干扰素、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、不同的衣壳组装调节剂、不同或未知机制的抗病毒化合物及其任何组合。
在一个实施例中，披露的方法减少患有HBV感染的个体体内的病毒载量，从而允许使用较低的剂量或不同方案的组合疗法。
在一个实施例中，与其他类别的HBV药物相比，披露的方法使得病毒突变或病毒抗性的发生率更低，从而允许长期治疗并最小化对治疗方案改变的需要。
在一个实施例中，与选自下组的化合物的施用相比，本发明的化合物或其药学上可接受的盐的施用使得病毒突变或病毒抗性的发生率更低，该组由以下组成：HBV聚合酶抑制剂、干扰素、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、不同的衣壳组装调节剂、不同或未知机制的抗病毒化合物及其组合。
在一个实施例中，披露的方法将从HBV感染至非HBV感染或从可检测HBV病毒载量至不可检测HBV病毒载量的血清转化率提高至超出当前治疗方案的血清转化率。如本文所用，“血清转化”是指产生HBV抗体并变得可检测的时间段。
在一个实施例中，披露的方法增加或正常化或恢复正常健康，引起正常健康的完全恢复，恢复预期寿命，或解决有需要的个体体内的病毒感染。
在一个实施例中，披露的方法消除或减少从HBV感染的细胞释放的HBV RNA颗粒的数量，从而增强、延长或增加披露的化合物的治疗益处。
在一个实施例中，披露的方法根除被HBV感染的个体的HBV，从而避免了长期或终身治疗的需要，或缩短了治疗的持续时间，或允许减少其他抗病毒剂的给药。
在另一个实施例中，披露的方法进一步包括监测或检测受试者的HBV病毒载量，并且其中将该方法进行一段时间，包括直到HBV病毒不可检测为止。
因此，在一个实施例中，本文提供了治疗有需要的个体的HBV感染的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的具有式I的化合物或其药学上可接受的盐。
因此，在一个实施例中，本文提供了治疗有需要的个体的HBV感染的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的具有式I的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一个实施例中，本文提供了治疗有需要的个体的HBV感染的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的表1的化合物或其药学上可接受的盐。
在本文提供的任何方法的一个实施例中，该方法可以进一步包括监测受试者的HBV病毒载量，其中将该方法进行一段时间，使得HBV病毒不可检测。
组合疗法
披露的化合物可以与用于治疗HBV感染、或HBV相关或诱发的疾病、或肝病的一种或多种另外的化合物组合使用。这些另外的化合物可以包含其他披露的化合物和/或已知用于治疗、预防或减少HBV感染的症状或影响、或HBV相关或诱发的疾病的症状或影响、或肝病的症状或影响的化合物。
特别地，一方面提供了包含第一化合物和第二化合物的产品，该第一化合物和第二化合物作为组合制剂用于在有需要的哺乳动物的HBV感染或HBV诱发的疾病的预防或治疗中同时、分开或顺序使用，其中所述第一化合物不同于所述第二化合物，其中所述第一化合物是本申请的化合物或药学上可接受的盐或本申请的药物组合物，且其中所述第二化合物是选自由以下组成的组的另一种HBV抑制剂：HBV复方药物、HBV DNA聚合酶抑制剂、免疫调节剂、toll样受体(TLR)调节剂、干扰素α受体配体、透明质酸酶抑制剂、乙型肝炎表面抗原(HbsAg)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(ipi4)抑制剂、亲环蛋白抑制剂、HBV病毒进入抑制剂、反义寡核苷酸靶向病毒mRNA、短干扰RNA(siRNA)和ddRNAi内切核酸酶调节剂、核糖核苷酸还原酶抑制剂、HBV E抗原抑制剂、共价闭合环状DNA(cccDNA)抑制剂、法尼醇X受体激动剂、HBV抗体、CCR2趋化因子拮抗剂、胸腺肽激动剂、细胞因子、核蛋白调节剂、维甲酸诱导基因1刺激因子、NOD2刺激因子、磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)抑制剂、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)途径抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、重组胸腺肽α-1、布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、KDM抑制剂、HBV复制抑制剂、精氨酸酶抑制剂以及(其他)抗HBV药物。
例如，该一种或多种另外的化合物可以选自干扰素(例如，干扰素α-2a是聚乙二醇化干扰素α-2a(PEGASYS))、核苷或核苷酸或非核苷(酸)聚合酶抑制剂、免疫调节剂(例如，IL-12、IL-18、IFN-α、-β和-γ以及TNF-α等)、TLR激动剂、siRNA和反义寡核苷酸。
在另一个实施例中，披露的化合物和至少一种另外的治疗剂是共配制的。在又另一个实施例中，披露的化合物和至少一种另外的治疗剂是共施用的。
对于本文描述的任何组合疗法，可以使用合适的方法计算协同效应，例如，Sigmoid-Emax方程(Holford和Scheiner,19981,Clin.Pharmacokinet.[临床药物动力学]6:429-453)、Loewe可加性方程(Loewe和Muischnek,1926,Arch.Exp.Pathol Pharmacol.[实验病理学与药理学档案]114:313-326)和median-effect方程(Chou和Talalay,1984,Adv.Enzyme Regul.[酶调控研究进展]22:27-55)。上面提到的每个方程都可以应用于实验数据，以生成相应的图表以帮助评估药物组合的效果。与上述方程相关的对应图表分别是浓度-效应曲线、等效线图曲线和联合指数曲线。
在本文提供的施用组合疗法的任何方法的一个实施例中，该方法可以进一步包括监测或检测受试者的HBV病毒载量，其中将该方法进行一段时间，包括直到使得HBV病毒不可检测的时间为止。
施用/剂量/配制品
在另一个方面，本文提供了药物组合物，该药物组合物包含至少一种披露的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以改变，以便获得对于具体患者、组合物和施用方式有效实现所希望的治疗应答而对该患者无毒的活性成分的量。
特别地，选择的剂量水平将取决于多种因素，包括所利用的具体组合物的活性、施用时间，该化合物的排泄速率，治疗持续时间，与该化合物组合使用的其他药物、化合物或材料，所治疗的患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况和以前病史以及医学领域熟知的类似因素。
在具体实施例中，以便于施用和剂量均一性的剂量单位形式配制化合物。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗受试者的物理上离散的单位；每一单位含有经计算以产生期望的治疗效果的预定量的披露的化合物与所需药物媒介物的结合。本发明的剂量单位形式由以下因素决定并直接取决于以下因素：(a)披露的化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果、和(b)混配/配制用于治疗患者的HBV感染的这种披露的化合物的领域中固有的限制。
在一个实施例中，使用一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体来配制本发明的组合物。在一个实施例中，本发明的药物组合物包含治疗有效量的披露的化合物以及药学上可接受的载体。
在一些实施例中，所披露的化合物的剂量为约1mg至约2,500mg。在一些实施例中，本文所述的组合物中使用的所披露的化合物的剂量小于约10,000mg、或小于约8,000mg、或小于约6,000mg、或小于约5,000mg、或小于约3,000mg、或小于约2,000mg、或小于约1,000mg、或小于约500mg、或小于约200mg、或小于约50mg。类似地，在一些实施例中，如本文所述的第二化合物(即，用于HBV治疗的另一种药物)的剂量小于约1,000mg、或小于约800mg、或小于约600mg、或小于约500mg、或小于约400mg、或小于约300mg、或小于约200mg、或小于约100mg、或小于约50mg、或小于约40mg、或小于约30mg、或小于约25mg、或小于约20mg、或小于约15mg、或小于约10mg、或小于约5mg、或小于约2mg、或小于约1mg、或小于约0.5mg及其任何和所有全部或部分增量。
在一个实施例中，本发明涉及包装的药物组合物，该药物组合物包含容纳治疗有效量的披露的化合物的容器，该化合物是单独的或与第二药剂组合；以及使用该化合物治疗、预防或减少患者的HBV感染的一种或多种症状的说明书。
本发明任何组合物的施用途径包括口服、鼻腔、直肠、阴道内、肠胃外、口腔、舌下或局部。用于本发明的化合物可以配制用于通过任何合适的途径施用，如用于口服或肠胃外，例如经皮、经粘膜(例如，舌下、舌、(经)口腔、(经)尿道、阴道(例如，经阴道和阴道周围)、鼻(内)和(经)直肠)、膀胱内、肺内、十二指肠内、胃内、鞘内、皮下、肌肉内、皮内、动脉内、静脉内、支气管内、吸入和局部施用。
合适的组合物和剂型包括例如片剂、胶囊、囊片、丸剂、胶丸、锭剂、分散剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、珠剂、经皮贴剂、凝胶剂、散剂、丸粒、乳浆剂、糖锭、乳膏、糊剂、膏药、洗剂、圆片、栓剂、用于鼻或口服施用的液体喷雾剂、用于吸入的干粉或雾化配制品、用于膀胱内施用的组合物和配制品等。应该理解，可用于本发明的配制品和组合物不限于本文所述的具体配制品和组合物。
对于口服施用，特别合适的是片剂、糖衣丸、液体、滴剂、栓剂或胶囊、囊片和胶丸。旨在用于口服的组合物可以根据本领域已知的任何方法制备，并且此类组合物可以含有一种或多种选自由以下组成的组的药剂：适合于制造片剂的惰性、无毒的药学赋形剂。此类赋形剂包括例如惰性稀释剂，如乳糖；造粒剂和崩解剂，如玉米淀粉；粘合剂，如淀粉；以及润滑剂，如硬脂酸镁。片剂可以是未包衣的或者它们可以通过已知的技术包衣以精致或延迟活性成分的释放。用于口服的配制品也可以呈现为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性稀释剂混合。
对于肠胃外施用，可以将披露的化合物配制成用于注射或输注，例如静脉内、肌肉内或皮下注射或输注，或用于以推注剂量或连续输注施用。可以使用任选地含有其他配制剂(如悬浮剂、稳定剂或分散剂)的油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液。
本领域的技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文所述的具体程序、实施例、权利要求和实例的许多等效物。此类等效物被认为在本发明的范围内，并由所附的权利要求书涵盖。例如，应当理解，仅仅使用常规实验，使用本领域认可的替代物对于反应条件(包括但不限于反应时间、反应大小/体积)和实验试剂(如溶剂)、催化剂、压力、气氛条件(例如氮气气氛)和还原剂/氧化剂进行修改，在本申请的范围内。
应当理解，无论在本文何处提供数值和范围，这些值和范围所涵盖的所有值和范围都意图被包括在本发明的范围内。此外，落入这些范围内的所有值以及值范围的上限或下限也是本申请所预期的。
术语“包含(comprising)”同义于“包括(including)”或“含有(containing)”，它是开放性的且不排除额外的、未引用的一个或多个元素、成分或方法步骤，而术语“由...组成(consisting of)”是一个封闭性术语，它排除任何额外的元素、步骤或未明确引用的成分。
术语“基本上由……组成”是一个部分开放性术语，它不排除额外的、未引用的一个或多个元素、步骤或成分，只要这些额外的元素、步骤或成分不对本发明的基本特性和新颖特性产生实质性影响。
因此，术语“包含(comprising)”(或“包含(comprise(s))”)包括术语“由……组成(consisting of)”(“由……组成(consist(s)of)”)，以及术语“基本上由……组成(essentially consisting of)”(“基本上由……组成(essentially consist(s)of)”)。因此，本申请中的术语“包含(comprising)”(或“包含(comprise(s))”)意指更特别地涵盖术语“由……组成(consisting of)”(“由……组成(consist(s)of)”)和术语“基本上由……组成(essentially consisting of)”(“基本上由……组成(essentially consist(s)of)”)。
为了帮助本申请书的读者，将说明书分隔为不同的段落或部分。这些分隔不应被视为一段或一部分的实质内容与另一段或另一部分的实质内容脱节。相反，本说明书涵盖了可以考虑的各个部分、段落和句子的所有组合。
本文引用的所有参考文献的每一相关披露内容均通过引用具体并入。以下实例是通过说明的方式而不是通过限制的方式提供的。
实例
现在将参考以下用于其一般制备的说明性合成方案和随后的具体实例来描述可用于本发明方法的示例性化合物。技术人员将认识到，为了获得本文中的各种化合物，可以适当地选择起始材料，使得最终所需的取代基将在有或没有合适的保护下通过反应方案而被携带以产生所需产物。可替代地，可能有必要或希望使用合适的基团代替最终所需的取代基，所述合适的基团可通过反应方案被携带并适当地被所需的取代基代替。除非另有说明，否则变量如上文参考式(I)所定义。反应可以在溶剂的熔点和回流温度之间进行，优选在0℃和溶剂的回流温度之间进行。可以采用常规加热或微波加热来加热反应。反应也可以在高于溶剂的正常回流温度的密封压力容器中进行。
制备实例
除非另有说明，LCMS和NMR均采用以下常用方法之一进行。
LCMS和NMR的通用方法
通用程序A
使用Agilent系统进行LCMS测量，该系统包含具有脱气器的二元泵、自动进样器、柱温箱(设置为40℃，除非另外指出)、以及如在以下对应的方法中所指定的柱。来自该柱的流被分流到MS和UV光谱仪。MS检测器配置有电喷雾电离源。通过以1.06秒/循环从100到1000进行扫描来获取质谱。正电离模式的毛细管电压为3kV，负电离模式的毛细管电压为2.5kV，并且将源温度保持在100℃。使用氮气作为雾化器气体。使用Agilent ChemStation数据系统进行数据采集。
方法1
除了通用程序A之外，还有：通过带有二极管阵列检测器(DAD)的Agilent 1200来进行用于质量控制的反相LCMS，并在Sunfire C18色谱柱(5μm，4.6x 50mm)上以1.5ml/min的流速运行。采用两个流动相(流动相A1：0.02％乙酸铵于水中；流动相A2：0.1％TFA于水中；流动相B1：乙腈)来运行梯度条件：在4.0分钟内从95％A1或A2和5％B至5％A1或A2和95％B。使用1至10μl的进样量。
方法2
除了通用程序A之外，还有：通过带有可变波长检测器(VWD)的Agilent 1260进行用于监测反应的反相LCMS，并在Dikma Diamonsil plus C18柱(5μm，4.6x 30mm)上以2.0ml/min的流速运行。采用两个流动相(流动相A1：H2O+0.02％乙酸铵+5％ACN；流动相A2：H2O+0.1％TFA+5％ACN；流动相B：乙腈)来运行梯度条件：在1.4分钟内从95％A1或A2和5％B至5％A1或A2和95％B。使用1至5μl的进样量。
方法3
除了通用程序A之外，还有：通过Agilent 6120(固定相Sunfire C18 2.5μm，3.0×30mm，流动相：0.01％FA溶液于水中、和ACN，在2.5min内梯度从5％ACN至95％并在95％停留1min)进行用于监测反应的反相LCMS。
通用程序B
使用UPLC(超高效液相色谱法)Acquity(沃特斯公司(Waters))系统进行LCMS测量，该系统包括带有除气器的四元泵、自动进样器、光电二极管阵列检测器(PDA)以及如在以下对应方法中指定的柱，将该柱的温度保持在40℃。来自该柱的流被引至MS检测器。MS检测器配置有电喷雾电离源。通过以0.25秒/循环从100到1000进行扫描来获取质谱。毛细管针电压是3kV并且将源温度保持在120℃。对于正电离模式的锥孔电压是30V，并且对于负电离模式的锥孔电压是30V。使用氮气作为雾化器气体。用Waters-Micromass MassLynx-Openlynx数据系统进行数据采集。
在Waters Acquity BEH(桥联的乙基硅氧烷/二氧化硅杂合物)C18柱(1.7μm，2.1x50mm)上以0.5ml/min的流速执行反相UPLC。采用两个流动相(流动相A：95％(H2O+0.02％乙酸铵+5％ACN)；流动相B：乙腈；流动相C：95％(H2O+0.1％TFA+5％ACN))来运行梯度条件：在1分钟内从95％A或C和5％B至5％A或C和95％B。使用0.5μl的进样量。
通用程序C
使用以下系统进行反相制备，该系统包含两个无除气器的单位泵、UV/Vis检测器以及如在以下对应的方法中所指定的柱。来自该柱的流被分流到UV光谱仪。
方法1
除了通用程序C之外，还有：在带有自动进样器、Xbridge制备型C18 OBD柱(5μm，19x 150mm)的Gilson仪器上以15-20ml/min的流速进行制备型反相LC。采用两个流动相(流动相A1：H2O(0.1％碳酸氢铵)；流动相A2：H2O(氢氧化铵)；流动相A3：H2O(0.1％TFA)；流动相B：乙腈)来运行梯度条件：从95％A1或A2或A3和5％B至20％A1或A2或A3和80％B。使用Trilution LC数据系统进行数据采集。
方法2
除了通用程序C之外，还有：在来自利穗科技有限公司(Lisure Science Ltd)的、带有反相SW-5231C18柱(40-60μm，
Figure BDA0003122494520000411
18g，40g，130g)的自动中压闪蒸分离-紧凑型净化器上以30-100ml/min的流速进行反相制备。采用两个流动相(流动相A1：H2O(0.1％碳酸氢铵)；流动相A2：H2O(氢氧化铵)；流动相A3：H2O(0.1％盐酸)；流动相A4：H2O；流动相B：乙腈)来运行梯度条件：从95％A1或A2或A3或A4和5％B至5％A1或A2或A3或A4和95％B。使用Compact数据系统进行数据采集。
方法3
除了通用程序C之外，还有：在带有自动进样器、Xbridge制备型C18 OBD柱(5um，19*150mm)的Waters仪器上以20ml/min的流速进行制备型反相LC。采用两个流动相(流动相A：H2O(0.1％碳酸氢铵)；流动相B：乙腈)来运行梯度条件：从95％A和5％B至50％A和50％B。使用Waters MassLynx数据系统进行数据采集。
通用程序D
使用以下系统进行手性测量，该系统包含自动进样器、柱温箱(设置在环境温度下，除非另有说明)、二极管阵列检测器(DAD)和如在以下对应的方法中所指定的柱。来自该柱的流被分流到UV光谱仪。使用1.2nm的狭缝宽度，用氘灯从190nm至400nm进行扫描并用钨灯从401nm至800nm进行扫描来获取LC光谱。大赛璐药物手性技术(上海)有限公司(DaicelChiral technologies)的手性chiralpak或chiralcel柱根据不同填充物分为两种类型：1型：IA、IB、IC、ID、IE、IF、IG、IH；2型：AD-H、AS-H、OD-H、OJ-H。
方法1：
除了通用方法D之外，还有：在Agilent 1200或Shimadzu LC-20A上进行手性HPLC，该系统带有具有除气器的四元泵、手性柱(5um，4.6*250mm)，流速为1.0ml/min时用于手性分析，或该系统带有具有除气器的四元泵、手性柱(5um，20*250mm)，流速为10-20ml/min时用于手性制备。流动相是MeOH、EtOH、Hex、IPA等之间的不同比率。使用AgilentChemStation或Shimadzu LabSolutions数据系统进行数据采集。
方法2：
除了通用方法D之外，还有：在带有柱温箱(40℃)的Waters-TharSFC上以2-3ml/min的流速进行手性分析，并且用TharSFC Chrom Scope数据系统进行数据采集。在Waters-SFC-80上以45-60ml/min的流速进行手性制备，并且用Waters-TharSFC SuperChrom数据系统进行数据采集。流动相为CO2和MeOH，EtOH可用作助溶剂。
通用程序E
下面的NMR实验是在环境温度下使用利用内部氘锁并且对于400MHz装备有z梯度、PLUS(2H、1H、BBF)的BBO 400MHz S15mm探头，对于300MHz装备有DUL 300MHz S1 5mm Z梯度(2H、1H、13C)探头的NMR光谱仪进行的。化学位移(δ)以百万分率(ppm)报告。
方法1：
除了通用程序E之外，还有：使用Bruker AvanceⅢ400MHz光谱仪测量NMR实验。
方法2：
除了通用程序E之外，还有：使用Bruker Avance Neo 400MHz光谱仪测量NMR实验。
方法3：
除了通用程序E之外，还有：使用ZKNJ BIXI-1 300MHz光谱仪测量NMR实验。
方法4：
除了通用程序E之外，还有：使用Bruker Ascend 400MHz光谱仪测量NMR实验。
现在将参考以下用于其一般制备的说明性合成方案和随后的具体实例来描述可用于本发明方法的示例性化合物。
通用方案
Figure BDA0003122494520000441
化合物I的制备如以上通用方案所示。
化合物I-1可在碱(如NaOAc)存在下通过醛II、乙酰乙酸盐III和脒IV缩合来制备。使用溴化试剂(如N-溴代琥珀酰亚胺)，由化合物I-1制备化合物I-2。在碱(如三乙胺)存在下偶联化合物I-2和化合物V得到化合物I。
乙基4-(2-氯-3-氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(H1)的制备
Figure BDA0003122494520000442
向2-氯-3-氟苯甲醛(8.8g，55.7mmol)、3-氧代丁酸乙酯(7.24g，55.7mmol)在异丙醇(40mL)中的溶液中添加哌啶(473mg，5.57mmol)和AcOH(334mg，5.57mmol)。在室温搅拌4小时后，在室温经15分钟向混合物中添加噻唑-2-甲亚胺酰胺(6.4g，39mmol)和三乙胺(5.62g，55.7mmol)。将该反应混合物在75℃搅拌12小时。将其冷却至室温，用乙酸乙酯萃取，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝20:1)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物H1(5.45g，由1H NMR得到的纯度为95％，26％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.74min，C17H15ClFN3O2S的计算质量379.1，m/z实测值380.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84-7.80(m,1.7H),7.50(d,J＝3.6Hz,0.3H),7.47(s,0.3H),7.44(d,J＝3.2Hz,0.7H),7.23-7.14(m,2H),7.09-7.01(m,1H),6.27(s,0.7H),6.14(d,J＝2.4Hz,0.3H),4.13-3.98(m,2H),2.57(s,0.7H),2.52(s,2.3H),1.13-1.10(m,3H)。
乙基4-(2-氯-3-氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(H1)的手性分离
通过手性分离法分离外消旋混合物乙基4-(2-氯-3-氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯H1(5.45g，13.7mmol)(分离条件：柱：Chiralpak IC 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝95:5:0.3，以28mL/min，温度：30℃，波长：254nm)，得到呈黄色固体的H1-A(2.5g，由1HNMR得到的纯度为90％，46％产率，100％ee)和H1-B(2.48g，由1HNMR得到的纯度为90％，46％产率，92.1％ee)。
H1-A：LC-MS(ESI)：RT＝3.886min，C17H15ClFN3O2S的计算质量379.06，m/z实测值380.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IA 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝90:10:0.2，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝7.438min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84-7.80(m,1.7H),7.51-7.44(m,1.3H),7.22-7.14(m,2H),7.09-7.01(m,1H),6.27(s,0.7H),6.14(s,0.3H),4.05-4.00(m,2H),2.57(s,0.7H),2.52(s,2.3H),1.13-1.10(m,3H)。
H1-B：LC-MS(ESI)：RT＝3.887min，C17H15ClFN3O2S的计算质量379.06，m/z实测值380.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IA 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝90:10:0.2，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝6.903min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84-7.80(m,1.7H),7.51-7.43(m,1.3H),7.22-7.14(m,2H),7.09-7.01(m,1H),6.27(s,0.7H),6.14(s,0.3H),4.10-3.98(m,2H),2.57(s,0.7H),2.51(s,2.3H),1.13-1.10(m,3H)。
乙基6-(溴甲基)-4-(2-氯-3-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(H1-1A)(单一对映体)的制备
Figure BDA0003122494520000461
向乙基4-(2-氯-3-氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯H1-A(300mg，90％纯度，0.711mmol)在四氯化碳(5mL)中的溶液中添加N-溴代琥珀酰亚胺(120mg，0.674mmol)。在60℃搅拌1小时后，将反应混合物浓缩，得到残余物，将该残余物通过凝胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝20:1到10:1)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(H1-1A)(240mg，由HNMR得到的纯度为90％，66％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.852min，C17H14BrClFN3O2S的计算质量456.9，m/z实测值457.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.26(s,0.3H),7.84(d,J＝2.8Hz,1H),7.53-7.46(m,1.7H),7.24-7.14(m,2H),7.09-7.01(m,1H),6.26(s,0.3H),6.17(s,0.7H),4.92(d,J＝8.0Hz,1H),4.76(d,J＝11.2Hz,0.3H),4.60(d,J＝8.0Hz,0.7H),4.12(q,J＝7.2Hz,2H),1.14(t,J＝11.2Hz,3H)。
使用相同的程序，制备了以下中间体。
Figure BDA0003122494520000462
Figure BDA0003122494520000471
Figure BDA0003122494520000481
Figure BDA0003122494520000491
Figure BDA0003122494520000501
中间体H2：乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1相同的条件制备中间体H2。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.86(s,0.8H),9.52(d,J＝2.8Hz,0.2H),8.00-7.98(m,0.4H),7.96(d,J＝3.2Hz,0.8H),7.88(d,J＝2.8Hz,0.8H),7.20-7.15(m,1.2H),7.06-6.99(m,1.8H),5.83(s,0.8H),5.73(d,J＝3.2Hz,0.2H),3.99-3.93(m,2H),2.48(s,2.4H),2.45(s,1.2H),2.44(s,1.2H),2.41(s,0.3H),2.40(s,0.3H),2.37(s.0.6H),1.08-1.02(m,3H)。
将中间体H2通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak OJ-H 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝90:10:0.3，以15mL/min；温度30℃；波长：214nm)进行分离，得到呈黄色固体的H2-A和H2-B。
中间体H2-A：手性分析(柱：Chiralpak OJ-H 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝85:15:0.2，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：230nm，RT＝7.251min)。通过以下与报告数据一致的化学拆分，H2-A被明确为绝对S立体化学(J.Med.Chem.[医药化学杂志],2017,60(8),第3352–3371页)。旋光度：[a]D 20-24°(c 0.10，MeOH)。
中间体H2-B：手性分析(柱：Chiralpak OJ-H 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝85:15:0.2，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：230nm，RT＝9.072min)。旋光度：[a]D 20+35°(c 0.10，MeOH)。
中间体H2-1A：(S)-乙基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H2-A制备中间体H2-1A。
LC-MS(ESI)：RT＝1.84min，C18H17BrFN3O2S的计算质量437.0，m/z实测值440.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.22(s,0.5H),7.82(d,J＝3.2Hz,1H),7.53(s,0.4H),7.44(s,0.6H),7.25-7.08(m,2.5H),6.96-6.92(s,1H),5.99(s,0.6H),5.93(s,0.4H),4.92-4.77(m,1.6H),4.67-4.65(m,0.4H),4.13-4.07(m,2H),2.53(s,1.7H),2.41(s,1.3H),1.14(t,J＝7.2Hz,3H)。旋光度：[a]D 20+0.093°(c 0.10，MeOH)。中间体H3：甲基4-(2-氯-4-氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(外消旋)
使用与H1相同的条件制备中间体H3。
LC-MS(ESI)：RT＝1.70min，C16H13ClFN3O2S的计算质量365.04，m/z实测值366.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84-7.83(m,0.9H),7.81-7.80(m,0.8H),7.55-7.50(m,0.6H),7.44-7.43(m,0.7H),7.33-7.26(m,1H),7.13-7.11(m,1H),6.95-6.88(m,1H),6.18(s,0.7H),6.05(s,0.3H),3.63(s,0.8H),3.60(s,2.2H),2.57(s,0.8H),2.51(s,2.2H)。
将外消旋H3(20g，95％纯度，51.9mmol)通过手性制备型HPLC(柱：Chiralpak IG 5μm 30*250mm；流动相：CO2:MeOH＝70:30，以55g/min；柱温：40℃；波长：230nm，背压：100巴)进行分离，得到呈黄色固体的标题化合物H3-A(9.46g，由NMR得到的纯度为95％，47％产率，100％ee)和H3-B(9.5g，由NMR得到的纯度为95％，48％产率，98.0％ee)。
中间体H3-A：LC-MS(ESI)：RT＝1.69min，C16H13ClFN3O2S的计算质量365.0，m/z实测值366.0。手性分析(柱：Chiralpak IA 5μm4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝80:20，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝5.593min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84-7.83(m,1H),7.80(d,J＝2.8Hz,0.7H),7.52-7.50(m,0.5H),7.44(d,J＝2.8Hz,0.7H),7.34-7.30(m,1H),7.15-7.11(m,1H),6.96-6.88(m,1H),6.19(s,0.7H),6.06(d,J＝2.4Hz,0.3H),3.63(s,0.8H),3.60(s,2.2H),2.57(s,0.8H),2.51(s,2.2H)。
中间体H3-B：LC-MS(ESI)：RT＝1.68min，C16H13ClFN3O2S的计算质量365.0，m/z实测值366.0。手性HPLC(柱：Chiralpak IA 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝80:20，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝6.827min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)7.85-7.82(m,1H),7.80(d,J＝3.2Hz,0.7H),7.54-7.50(m,0.5H),7.43(d,J＝3.2Hz,0.7H),7.34-7.30(m,1H),7.14-7.11(m,1H),6.96-6.88(m,1H),6.18(s,0.7H),6.06(d,J＝2.4Hz,0.3H),3.62(s,0.8H),3.60(s,2.2H),2.57(s,0.8H),2.50(s,2.2H)。
中间体H3-1A：甲基6-(溴甲基)-4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H3-A制备中间体H3-1A。
LC-MS(ESI)：RT＝1.802min，C16H12BrClFN3O2S的计算质量442.9，m/z实测值443.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.29(br s,0.3H),7.84(d,J＝3.2Hz,1H),7.59-7.53(m,1.4H),7.47(br s,0.3H),7.41-7.31(m,1H),7.14(d,J＝8.4Hz,1H),6.99-6.90(m,1H),6.18(s,0.3H),6.09(d,J＝2.0Hz,0.7H),4.93(d,J＝8.4Hz,1H),4.74(d,J＝11.2Hz,0.3H),4.58(d,J＝8.4Hz,0.7H),3.67(s,2.1H),3.65(s,0.9H)。中间体H4：甲基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(外消旋)
使用与H1相同的条件制备中间体H4。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.93(d,J＝3.2Hz,0.1H),7.80-7.77(m,1.8H),7.52-7.50(m,0.1H),7.41(d,J＝3.2Hz,0.9H),7.20(br s,0.1H),7.16-7.00(m,2H),6.94-6.87(m,1H),6.00(s,0.9H),5.90(s,0.1H),3.60(s,3H),2.55-2.49(m,5.8H),2.40(br s,0.2H)。
将甲基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯H4(1.30g，95％纯度，3.58mmol)的外消旋混合物通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak AS-H 5μm 30*250mm；流动相：Hex:EtOH＝75:25，以15mL/min；温度：30℃；波长：214nm)进行分离，得到呈黄色油状物的标题化合物(H4-A)(610mg，由1H NMR得到的纯度为95％，44％产率，100％立体纯)和(H4-B)(520mg，由1H NMR得到的纯度为95％，40％产率，97.7％立体纯)。
中间体H4-A：手性分析(柱：Chiralpak AS 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝80:20，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝5.247min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.93(d,J＝2.8Hz,0.1H),7.80(br s,0.9H),7.78(d,J＝2.8Hz,1H),7.52-7.50(m,0.1H),7.41(d,J＝3.2Hz,0.9H),7.10-7.02(m,2H),6.92-6.87(m,1H),6.00(s,0.9H),5.91(s,0.1H),3.61(s,3H),2.55(s,3H),2.53(s,3H)。
中间体H4-B：手性分析(柱：Chiralpak AS 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝80:20，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝9.049min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(d,J＝3.2Hz,2H),7.42(d,J＝2.4Hz,1H),7.10-7.05(m,2H),6.92-6.89(m,1H),5.99(s,1H),3.61(s,3H),2.54(s,3H),2.53(m,3H)。
中间体H4-1B：甲基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H4-B制备中间体H4-1B。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.23(s,1H),7.82(d,J＝3.2Hz,1H),7.53-7.44(m,1H),7.12-7.07(m,2H),6.93(s,1H),5.98-5.94(m,1H),4.89-4.66(m,2H),3.65(s,3H),2.53-2.41(m,3H)。
中间体H5：甲基4-(2-氯-3,4-二氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1相同的条件制备中间体H5。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.08(d,J＝2.8Hz,0.1H),7.98(d,J＝2.8Hz,0.1H),7.93(d,J＝2.8Hz,0.9H),7.72(d,J＝2.8Hz,0.9H),7.26-7.18(m,2H),6.13(s,0.9H),6.09(s,0.1H),3.61(s,3H),2.53(s,3H)。
将外消旋H5(1.10g，2.90mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak IC5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以18mL/min；温度：30℃；波长：214nm)进行分离，得到呈黄色固体的标题化合物H5-A(450mg，41％产率，100％立体纯)和H5-B(450mg，41％产率，99.8％立体纯)。
中间体H5-A：手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝6.457min)。
中间体H5-B：手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝7.641min)。
中间体H5-1A：甲基6-(溴甲基)-4-(2-氯-3,4-二氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H5-A制备中间体H5-1A。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.92(d,J＝3.2Hz,1H),7.80(d,J＝3.2Hz,0.5H),7.70(d,J＝3.2Hz,0.5H),7.32-7.17(m,2H),6.11(s,0.5H),6.09(s,0.5H),4.91(d,J＝10.0Hz,0.5H),4.81(d,J＝10.0Hz,1H),4.57(d,J＝8.4Hz,0.5H),3.64(s,1.5H),3.62(s,1.5H)。
中间体H6：甲基4-(3,4-二氟-2-甲基苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1相同的条件制备中间体H6。
LC-MS(ESI)：RT＝1.58min，C17H15F2N3O2S的计算质量363.3，m/z实测值364.0[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.80-7.78(m,2H),7.42(d,J＝3.2Hz,1H),7.00-6.85(m,2H),5.93(s,1H),3.61(s,3H),2.58(s,1.5H),2.57(s,1.5H),2.53(s,1.5H),2.51(s,1.5H)。
将外消旋H6(1.00g，90％纯度，2.48mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak IH 5μm 30*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以18mL/min；温度：30℃；波长：214nm)进行分离，得到呈黄色固体的所需产物H6-A(400mg，由1H NMR得到的纯度为90％，40％产率，100％立体纯)和H6-B(400mg，由1H NMR得到的纯度为95％，42％产率，99.9％立体纯)。
中间体H6-A：手性分析(柱：Chiralpak IH 5μm 4.6*150mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以1mL/min；温度：30℃；波长：230nm，RT＝4.809min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84(br s,1H),7.78(d,J＝3.2Hz,1H),7.42(d,J＝3.2Hz,1H),6.96-6.86(m,2H),5.93(s,1H),3.61(s,3H),2.57(d,J＝1.6Hz,3H),2.52(s,3H)。
中间体H6-B：手性分析(柱：Chiralpak IH 5μm 4.6*150mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以1mL/min；温度：30℃；波长：230nm，RT＝7.018min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(br s,1H),7.79(d,J＝3.2Hz,1H),7.42(d,J＝3.2Hz,1H),6.97-6.88(m,2H),5.93(s,1H),3.61(s,3H),2.58(d,J＝2.0Hz,3H),2.52(s,3H)。
中间体H6-1B：甲基6-(溴甲基)-4-(3,4-二氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H6-B制备中间体H6-1B。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(s,1H),7.83(d,J＝3.6Hz,1H),7.54-7.45(m,1H),7.00-6.93(m,2H),5.91(s,1H),4.94-4.80(s,21H),3.66(s,3H),2.56-2.45(m,3H)。
中间体H7：乙基4-(2-溴-4-氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1相同的条件制备中间体H7。
LC-MS(ESI)：RT＝3.63min，C17H15BrFN3O2S的计算质量423.0，m/z实测值423.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.95(s,1H),7.97(d,J＝2.8Hz,1H),7.90(d,J＝3.2Hz,1H),7.57-7.54(m,1H),7.37-7.33(m,1H),7.26-7.23(m,1H),5.96(s,0.9H),5.89(s,0.1H),3.93(q,J＝7.2Hz,2H),2.47(s,2.7H),2.39(s,0.3H),1.03(t,J＝7.2Hz,3H)。
将外消旋H7(55.7g，127mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：OZ-H 5μm 30*250nm；流动相：CO2:MeOH(0.1％NH3.H2O)＝70:30，以60mL/min；温度：38℃；波长：254nm)进行分离，得到呈黄色固体的标题化合物H7-A(30.0g，100％纯度，99.2％ee，56％产率)和呈浅棕色油状物的H7-B(27.0g，100％纯度，99.5％ee，50％产率)。
中间体H7-A：LC-MS(ESI)：RT＝1.66min，C17H15BrFN3O2S的计算质量423.0，m/z实测值424.0[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以1mL/min；温度：30℃；波长：230nm，RT＝8.259min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83-7.80(m,1.7H),7.51-7.43(m,1.3H),7.35-7.30(m,2H),6.99-6.94(m,1H),6.17(s,0.7H),6.05(s,0.3H),4.08-4.01(m,2H),2.57(s,0.8H),2.52(s,2.2H),1.13(t,J＝7.2Hz,3H)。旋光度：[a]D 25-36°(c0.30，MeOH)。
中间体H7-B：LC-MS(ESI)：RT＝1.65min，C17H15BrFN3O2S的计算质量423.0，m/z实测值424.0[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以1mL/min；温度：30℃；波长：230nm，RT＝10.485min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)7.85-7.79(m,1.7H),7.57-7.43(m,1.3H),7.35-7.30(m,2H),6.99-6.94(m,1H),6.17(s,0.7H),6.05(s,0.3H),4.11-4.02(m,2H),2.57(s,0.8H),2.51(s,2.2H),1.13(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体H7-1A：乙基4-(2-溴-4-氟苯基)-6-(溴甲基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H7-A制备中间体H7-1A。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.23(br s,0.3H),7.87-7.82(m,1H),7.54-7.53(m,1H),7.51(br s,0.7H),7.45-7.39(m,1H),7.34-7.31(m,1H),7.05-6.98(m,1H),6.18(s,0.3H),6.08(d,J＝2.4Hz,0.7H),5.00-4.92(m,1H),4.75(d,J＝10.8Hz,0.3H),4.59(d,J＝8.4Hz,0.7H),4.14-4.09(m,2H),1.16(t,J＝6.8Hz,3H)。
中间体H8：乙基4-(2-氯-3,4-二氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1相同的条件制备中间体H8。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83-7.81(m,1.8H),7.52-7.44(m,1.2H),7.13-7.10(m,1H),7.08-7.00(m,1H),6.20(s,0.8H),6.08(s,0.2H),4.11-4.00(m,2H),2.57(s,0.5H),2.51(s,2.5H),1.13(t,J＝7.2Hz,3H)。
将外消旋H8(1.00g，2.51mmol)通过手性制备型HPLC(柱：Chiralpak IC 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以18mL/min；温度：30℃；波长：214nm)进行分离，得到呈黄色固体的所需化合物H8-A(353mg，35％产率，98.1％立体纯)和H8-B(321mg，32％产率，99.8％立体纯)。
中间体H8-A：手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝5.901min)。
中间体H8-B：手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝6.914min)。
中间体H8-1：乙基6-(溴甲基)-4-(2-氯-3,4-二氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H8制备中间体H8-1。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.25(s,0.3H),7.85(d,J＝2.8Hz,1H),7.54-7.44(m,1.5H),7.20-7.04(m,2.2H),6.19-6.11(m,1H),4.98-4.95(m,1H),4.74-4.72(m,0.4H),4.58-4.56(m,0.6H),4.13-4.11(m,2H),1.19-1.15(m,3H)。
中间体H8-1A：乙基6-(溴甲基)-4-(2-氯-3,4-二氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H8-A制备中间体H8-1A。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.25(s,0.3H),7.85(d,J＝3.2Hz,1H),7.54(d,J＝3.2Hz,0.6H),7.47-7.45(m,0.9H),7.22-7.00(m,2.2H),6.19(s,0.4H),6.11(d,J＝2.4Hz,0.6H),4.97(d,J＝11.2Hz,0.4H),4.94(d,J＝8.8Hz,0.6H),4.73(d,J＝11.2Hz,0.4H),4.56(d,J＝8.4Hz,0.6H),4.16-4.04(m,2H),1.19-1.13(m,3H)。
中间体H9：乙基4-(3,4-二氟-2-甲基苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1相同的条件制备中间体H9。
LC-MS(ESI)：RT＝1.78min，C18H17F2N3O2S的计算质量377.4，m/z实测值378.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.81-7.76(m,2H),7.42(d,J＝3.2Hz,1H),6.98-6.86(m,2H),5.94(s,1H),4.11-4.00(m,2H),2.58(s,1.5H),2.57(s,1.5H),2.52(s,3H),1.14(t,J＝7.2Hz,3H)。
将外消旋H9(1.20g，90％纯度，2.86mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak IC 5μm 30*250mm；流动相：Hex:IPA＝95:5，以18mL/min；温度：30℃，波长：214nm)进行分离，得到呈黄色固体的所需化合物H9-A(580mg，90％纯度，48％产率，97.8％ee)和呈黄色固体的H9-B(500mg，90％纯度，42％产率，99.4％ee)。
中间体H9-A：手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:IPA＝95:5，以1mL/min；温度：30℃；波长：230nm，RT＝7.550min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79-7.77(m,2H),7.42(d,J＝3.6Hz,1H),7.00-6.88(m,2H),5.94(s,1H),4.08-4.01(m,2H),2.58(s,2.5H),2.55(s,0.5H),2.52(s,3H),1.14(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体H9-B：手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:IPA＝95:5，以1mL/min；温度：30℃；波长：230nm，RT＝8.495min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79-7.75(m,2H),7.42(d,J＝2.8Hz,1H),6.98-6.86(m,2H),5.94(s,1H),4.08-4.00(m,2H),2.58(d,J＝2.0Hz,3H),2.52(s,3H),1.14(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体H9-1A：乙基6-(溴甲基)-4-(3,4-二氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H9-A制备中间体H9-1A。
LC-MS(ESI)：RT＝1.85min，C18H16BrF2N3O2S的计算质量455.0，m/z实测值456.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(d,J＝2.8Hz,1H),7.54(d,J＝2.8Hz,0.4H),7.44(d,J＝2.8Hz,0.6H),7.21-7.06(m,1H),7.02-6.89(m,2H),5.93(s,0.6H),5.87(d,J＝2.0Hz,0.4H),4.93(d,J＝11.6Hz,0.6H),4.81-4.78(m,1H),4.61(d,J＝8.4Hz,0.4H),4.11-4.06(m,2H),2.56(d,J＝2.0Hz,2H),2.45(d,J＝2.0Hz,1H),1.19-1.13(m,3H)。
中间体H9-1B：乙基6-(溴甲基)-4-(3,4-二氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H9-B制备中间体H9-1B。
LC-MS(ESI)：RT＝1.85min，C18H16BrF2N3O2S的计算质量455.0，m/z实测值456.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(d,J＝3.2Hz,1H),7.54-7.44(m,1H),7.20-7.10(m,1H),7.00-6.89(m,2H),5.92-5.88(m,1H),4.91-4.63(m,2H),4.11-4.08(m,2H),2.56(s,2H),2.45(s,1H),1.17-1.14(m,3H)。
中间体H10：甲基4-(2-溴-4-氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1相同的条件制备中间体H10。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.89-7.75(m,1.7H),7.62-7.55(m,0.3H),7.49-7.40(m,1H),7.33-7.29(m,2H),7.00-6.94(m,1H),6.15(s,0.7H),6.03(s,0.3H),3.61(s,3H),2.52(s,3H)。
将外消旋H10(1.80g，90％纯度，3.95mmol)通过手性制备型HPLC(柱：ChiralpakIG 5μm 20mm*250mm；流动相：CO2:MeOH＝75:25，以50g/min；柱温：40℃；波长：230nm，背压：100巴)进行分离，得到呈黄色固体的标题化合物H10-A(850mg，由1H NMR得到的纯度为90％，47％产率，99.6％ee)和H10-B(850mg，由1HNMR得到的纯度为90％，47％产率，99.4％ee)。
中间体H10-A：LC-MS(ESI)：RT＝1.717min，C16H13BrFN3O2S的计算质量409.0，m/z实测值410.0[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IG 5μm 4.6*250mm；流动相：CO2:MeOH＝75:25，以3g/min；温度：40℃；波长：230nm；背压：100巴，RT＝3.92min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87-7.84(m,1H),7.80(d,J＝3.2Hz,0.7H),7.57(br s,0.3H),7.51(d,J＝3.2Hz,0.3H),7.44(d,J＝3.2Hz,0.7H),7.34-7.29(m,2H),7.01-6.93(m,1H),6.16(s,0.7H),6.02(d,J＝2.4Hz,0.3H),3.62(s,1H),3.60(s,2H),2.57(s,1H),2.51(s,2H)。
中间体H10-B：LC-MS(ESI)：RT＝1.713min，C16H13BrFN3O2S的计算质量409.0，m/z实测值410.0[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IG 5μm 4.6*250mm；流动相：CO2:MeOH＝75:25，以3g/min；温度：40℃；波长：230nm；背压：100巴，RT＝4.92min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.88-7.83(m,1H),7.80(d,J＝3.2Hz,0.7H),7.58(br s,0.3H),7.50(d,J＝3.2Hz,0.3H),7.44(d,J＝3.2Hz,0.7H),7.34-7.29(m,2H),7.01-6.93(m,1H),6.16(s,0.7H),6.02(d,J＝2.0Hz,0.3H),3.62(s,1H),3.60(s,2H),2.57(s,1H),2.51(s,2H)。
中间体H10-1A：甲基4-(2-溴-4-氟苯基)-6-(溴甲基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H10-A制备中间体H10-1A。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.85(d,J＝3.2Hz,1H),7.52(d,J＝2.8Hz,1H),7.40-7.36(m,1H),7.34-7.32(m,1H),7.04-6.99(m,1H),6.09(s,1H),4.95(d,J＝9.2Hz,1H),4.63(d,J＝8.4Hz,1H),3.67(s,3H)。
中间体H10-1B：甲基4-(2-溴-4-氟苯基)-6-(溴甲基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H10-B制备中间体H10-1B。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.85(d,J＝3.2Hz,1H),7.60(br s,1H),7.56-7.47(m,1H),7.40-7.37(m,1H),7.34-7.31(m,1H),7.03-6.99(m,1H),6.08(s,1H),4.94(d,J＝9.2Hz,1H),4.64(br s,1H),3.67(s,3H)。
中间体H11：甲基4-(2-氯-3-氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1相同的条件制备中间体H11。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(s,0.8H),7.83(d,J＝2.8Hz,0.3H),7.80(d,J＝2.8Hz,0.7H),7.55(s,0.2H),7.50(d,J＝2.8Hz,0.2H),7.44(d,J＝2.8Hz,0.8H),7.23-7.13(m,2H),7.11-7.00(m,1H),6.25(s,0.8H),6.11(d,J＝1.6Hz,0.2H),3.62(s,0.6H),3.60(s,2.4H),2.58(s,0.6H),2.51(s,2.4H)。
将外消旋H11(3.00g，95％纯度，7.79mmol)通过手性制备型HPLC(柱：ChiralpakIC 5μm 20*250mm，流动相：Hex:IPA:DEA＝90:10:0.3，以18mL/min，温度：30℃，波长：230nm)进行分离，得到呈黄色固体的标题化合物H11-A(820mg，96％纯度，28％产率，100％立体纯)和H11-B(800mg，97％纯度，27％产率，99.2％立体纯)。
中间体H11-A：LC-MS(ESI)：RT＝1.587min，C16H13ClFN3O2S的计算质量365.0，m/z实测值366.0[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:IPA:DEA＝90:10:0.2，以1mL/min；柱温：30℃；波长：254nm，RT＝10.808min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(s,0.7H),7.83(d,J＝3.2Hz,0.2H),7.80(d,J＝2.8Hz,0.8H),7.55(s,0.3H),7.50(d,J＝3.2Hz,0.2H),7.44(d,J＝3.2Hz,0.8H),7.22-7.13(m,2H),7.08-6.99(m,1H),6.25(s,0.8H),6.12(d,J＝2.4Hz,0.2H),3.62(s,1H),3.60(s,2H),2.58(s,1H),2.51(s,2H)。
化合物H11-B：LC-MS(ESI)：RT＝1.584min，C16H13ClFN3O2S的计算质量365.0，m/z实测值366.0[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:IPA:DEA＝90:10:0.2，以1Ll/min；柱温：30℃；波长：254nm，RT＝12.482min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(s,0.7H),7.83(d,J＝3.2Hz,0.3H),7.80(d,J＝3.2Hz,0.7H),7.56(s,0.3H),7.50(d,J＝2.8Hz,0.3H),7.43(d,J＝3.2Hz,0.7H),7.23-7.13(m,2H),7.09-7.00(m,1H),6.25(s,0.8H),6.11(d,J＝2.0Hz,0.2H),3.60(s,3H),2.57(s,0.6H),2.52(s,2.4H)。
H11-1A：甲基6-(溴甲基)-4-(2-氯-3-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H11-A制备H11-1A。
LC-MS(ESI)：RT＝1.695min，C16H12BrClFN3O2S的计算质量442.9，m/z实测值444.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.15-7.91(m,2H),7.41-7.31(m,2H),7.26-7.24(m,1H),6.03(s,1H),4.99-4.68(m,2H),3.56(s,3H)。
H11-1B：甲基6-(溴甲基)-4-(2-氯-3-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H11-B制备H11-1B。
LC-MS(ESI)：RT＝1.77min，C16H12BrClFN3O2S的计算质量442.9，m/z实测值445.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.02-7.93(m,2H),7.41-7.31(m,2H),7.26-7.24(m,1H),6.03(s,1H),4.97-4.58(m,2H),3.56(s,3H)。
H12：乙基4-(2-氯-4-氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1相同的条件制备中间体H12。
LC-MS(ESI)：RT＝1.75min，C17H15ClFN3O2S的计算质量379.1，m/z实测值380.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(d,J＝3.2Hz,0.3H),7.81-7.80(m,1.4H),7.50(d,J＝3.6Hz,0.3H),7.46(br s,0.3H),7.43(d,J＝3.2Hz,0.7H),7.36-7.32(m,1H),7.14-7.11(m,1H),6.94-6.89(m,1H),6.20(s,0.7H),6.08(s,0.3H),4.10-4.01(m,2H),2.57(s,0.7H),2.51(s,2.3H),1.15-1.11(t,J＝7.2Hz,3H)。
将外消旋H12(1.00g，90％纯度，2.37mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak IE 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以10mL/min；温度：30℃；波长：254nm)进行分离，得到呈黄色固体的标题化合物H12-A(400mg，98.1％纯度，44％产率，100％ee)和H12-B(405mg，98.6％纯度，40％产率，99.7％ee)。
中间体H12-A：LC-MS(ESI)：RT＝4.295min，C17H15ClFN3O2S的计算质量379.1，m/z实测值380.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm；RT＝7.663min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(d,J＝3.2Hz,0.3H),7.80(d,J＝2.8Hz,1H),7.50(d,J＝3.2Hz,0.3H),7.43(d,J＝3.2Hz,1H),7.36-7.32(m,1H),7.14-7.11(m,1H),6.94-6.89(m,1H),6.20(s,0.7H),6.08(s,0.3H),4.08-4.01(m,2H),2.57(s,0.8H),2.51(s,2.2H),1.13(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体H12-B：LC-MS(ESI)：RT＝3.578min，C17H15ClFN3O2S的计算质量379.1，m/z实测值380.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm；RT＝9.471min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(d,J＝3.2Hz,0.3H),7.80(d,J＝2.8Hz,1H),7.50(d,J＝3.2Hz,0.3H),7.43(d,J＝3.2Hz,1H),7.36-7.32(m,1H),7.14-7.11(m,1H),6.94-6.89(m,1H),6.20(s,0.7H),6.08(s,0.3H),4.08-4.00(m,2H),2.57(s,0.8H),2.51(s,2.2H),1.13(t,J＝7.2Hz,3H)。
H12-1A：乙基6-(溴甲基)-4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H12-A制备H12-1A。
LC-MS(ESI)：RT＝1.80min，C17H14BrClFN3O2S的计算质量457.0，m/z实测值458.0[M+H]+。
H12-1B：乙基6-(溴甲基)-4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H12-B制备H12-1B。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(s,0.2H),7.85-7.84(d,J＝2.8Hz,1H),7.53-7.39(m,2.6H),7.16-7.13(m,1H),6.97-6.96(m,1H),6.20(s,0.3H),6.12(s,0.7H),4.94-4.92(m,1H),4.76-4.73(m,0.3H),4.60-4.58(m,0.7H),4.15-4.09(m,2H),1.17-1.14(t,J＝6.8Hz,3H)。H13：乙基2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-甲基-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1相同的条件制备中间体H13。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.42(s,1H),7.47-7.43(m,1H),7.21-7.13(m,2H),7.05-7.00(m,1H),6.22(s,1H),4.13(q,J＝7.2Hz,2H),2.65(s,3H),2.48(s,3H),1.17(t,J＝7.2Hz,3H)。
将外消旋H13(500mg，90％纯度，1.16mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak IG 5μm 20*250mm；流动相：CO2:MeOH＝75:25，以55g/min；温度：30℃；波长：230nm，背压：100巴)进行分离，得到呈黄色固体的标题化合物H13-A(140mg，由1H NMR得到的纯度为90％，28％产率，100％立体纯)和H13-B(200mg，由1H NMR得到的纯度为90％，40％产率，96.2％立体纯)。
中间体H13-A：LC-MS(ESI)：RT＝1.75min，C20H18F3N3O2的计算质量389.1，m/z实测值390.2[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IG 5um 4.6*250mm；流动相：CO2:MeOH＝85:15，以3g/min；柱温：40℃；波长：230nm，背压：100巴，RT＝3.15min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.28(s,1H),7.33-7.29(m,1H),7.11-7.04(m,2H),6.94-6.89(m,1H),6.14(s,1H),4.06(q,J＝7.2Hz,2H),2.57(s,3H),2.56(d,J＝2Hz,3H),1.14(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体H13-B：LC-MS(ESI)：RT＝1.75min，C20H18F3N3O2的计算质量389.1，m/z实测值390.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IG 5um 4.6*250mm；流动相：CO2:MeOH＝85:15，以3g/min；柱温：40℃；波长：230nm，背压：100巴，RT＝3.74min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.36(s,1H),7.41-7.37(m,1H),7.17-7.12(m,2H),7.02-6.98(m,1H),6.19(s,1H),4.11(q,J＝7.2Hz,2H),2.62(s,3H),2.48(s,3H),1.16(t,J＝7.2Hz,3H)。
H13-1A：乙基6-(溴甲基)-4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H13-A制备H13-1A。
LC-MS(ESI)：RT＝1.80min，C20H17BrF3N3O2的计算质量467.1，m/z实测值468.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.28(s,1H),7.13-6.86(m,4H),6.07(br s,1H),4.95-4.79(m,2H),4.14-4.04(m,2H),2.57-2.54(m,3H),1.15(t,J＝7.2Hz,3H)。
H13-1B：乙基6-(溴甲基)-4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H13-B制备H13-1B。
LC-MS(ESI)：RT＝1.79min，C20H17BrF3N3O2的计算质量467.1，m/z实测值469.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.72-8.54(m,1H),8.29(s,1H),7.34-7.29(m,1H),7.17-7.00(m,2H),6.94-6.87(m,1H),6.11(br s,0.8H),5.98-5.90(m,0.2H),5.02-4.76(m,2H),4.13-4.04(m,2H),2.62-2.38(m,3H),1.15(t,J＝7.2Hz,3H)。
H14：乙基4-(2-氟-4-甲基苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1相同的条件制备中间体H14。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.88(d,J＝2.8Hz,1H),7.67(d,J＝2.8Hz,1H),7.19(t,J＝8.0Hz,1H),6.90-6.85(m,2H),5.92(s,1H),4.02(q,J＝7.2Hz,2H),2.44(s,3H),2.27(s,3H),1.13(t,J＝7.2Hz,3H)。
将外消旋H14(1.00g，2.78mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：ChiralpakIC 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH＝85:15，以18mL/min；温度：30℃；波长：230nm)进行分离，得到呈黄色固体的标题化合物H14-A(450mg，45％产率，100％立体纯)和H14-B(420mg，42％产率，99.8％立体纯)。
中间体H14-A：手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝85:15，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝7.009min)。
中间体H14-B：手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝85:15，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝8.255min)。
H14-1A：乙基6-(溴甲基)-4-(2-氟-4-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H14-A制备H14-1A。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.92(s,1H),7.80-7.70(m,1H),7.26(t,J＝7.6Hz,1H),6.94-6.89(m,2H),5.92(d,J＝2.0Hz,1H),4.76-4.66(m,1.5H),4.11-4.06(m,2H),2.30(d,J＝1.6Hz,3H),2.00(d,J＝2.8Hz,0.5H),1.28-1.15(m,3H)。
H14-1B：乙基6-(溴甲基)-4-(2-氟-4-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H14-B制备H14-1B。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.92(s,1H),7.78-7.73(m,1H),7.26(t,J＝8.0Hz,1H),6.94-6.90(m,2H),5.93(s,1H),4.74-4.67(m,1.4H),4.09(q,J＝7.2Hz,2H),2.31(s,3H),2.01(s,0.6H),1.25-1.16(m,3H)。
H15：乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-甲基-2-(5-甲基噁唑-4-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1相同的条件制备中间体H15。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.21(s,0.8H),8.94(s,0.2H),8.35(s,1H),7.16-7.06(m,1H),6.99-6.94(m,2H),5.80(s,0.8H),5.67(s,0.2H),3.97-3.94(m,2H),2.46-2.40(m,7H),2.38-2.30(m,2H),1.04(t,J＝7.2Hz,3H)。
将外消旋H15(1.0g，90％纯度，2.460mmol)通过手性制备型HPLC(柱：ChiralpakIF 5μm 20*250mm，流动相：Hex:EtOH＝98:2，以18mL/min，温度：30℃，波长：254nm)进行分离，得到呈黄色固体的标题化合物H15-A(461mg，由1H NMR得到的纯度为95％，46％产率，100％立体纯)和呈黄色固体的H15-B(466mg，由NMR得到的纯度为95％，47％产率，99.0％立体纯)。
中间体H15-A：LC-MS(ESI)：RT＝1.666min，C19H20FN3O3的计算质量357.1，m/z实测值358.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IF 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝98:2，以1mL/min；柱温：30℃；波长：254nm，RT＝10.686min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.66(s,1H),7.51(s,1H),7.09-7.04(m,1H),7.00-6.93(m,1H),6.88(t,J＝8.8Hz,1H),5.98(s,1H),4.07-3.98(m,2H),2.54(s,5H),2.51(s,4H),1.11(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体H15-B：LC-MS(ESI)：RT＝1.666min，C19H20FN3O3的计算质量357.1，m/z实测值358.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IF 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝98:2，以1ml/min；柱温：30℃；波长：254nm，RT＝13.222min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.66(s,1H),7.51(s,1H),7.09-7.04(m,1H),7.00-6.98(m,1H),6.88(t,J＝8.4Hz,1H),5.98(s,1H),4.08-4.01(m,2H),2.55(s,5H),2.51(s,4H),1.11(t,J＝6.8Hz,3H)。
H15-1A：乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-甲基-2-(5-甲基噁唑-4-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H15-A制备H15-1A。
LC-MS(ESI)：RT＝1.757min，C19H19BrFN3O3的计算质量435.0，m/z实测值438.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.67(s,1H),7.17-7.06(m,1H),7.00-6.85(m,2H),5.89(br s,1H),4.75(br s,2H),4.08(q,J＝6.8Hz,2H),2.85-2.70(m,2H),2.64-2.04(m,4H),1.13(t,J＝7.2Hz,3H)。
H15-1B：乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-甲基-2-(5-甲基噁唑-4-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H15-B制备H15-1B。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.13(br s,1H),8.40(s,1H),7.21-7.19(m,2H),7.10-7.03(m,1H),5.74(br s,1H),4.72(br s,2H),4.01(q,J＝7.2Hz,2H),2.75-2.65(m,2H),2.46-2.37(m,4H),1.07(t,J＝7.2Hz,3H)。
H16：甲基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-甲基-2-(5-甲基噁唑-4-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1相同的条件制备中间体H16。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.68(s,1H),7.57(s,1H),7.15-7.05(m,1H),7.00-6.88(m,2H),5.99(s,0.9H),5.87(s,0.1H),3.62(s,3H),2.57(s,6H),2.54(s,3H)。
将外消旋H16(270mg，95％纯度，0.747mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak IF 5μm 20*250mm，流动相：Hex:IPA:DEA＝98:2:0.3，以13mL/min，温度：30℃，波长：214nm)进行分离，得到呈黄色固体的标题化合物H16-A(55mg，99.9％纯度，21％产率，100％立体纯)和H16-B(50mg，99.9％纯度，19％产率，96.1％立体纯)。
H16-A：LC-MS(ESI)：RT＝4.185min，C18H18FN3O3的计算质量343.1，m/z实测值344.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IF 5μm4.6*250mm；流动相：Hex:IPA:DEA＝98:2:0.2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm；RT＝14.108min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.66(s,1H),7.54(s,1H),7.09-7.03(m,1H),6.98-6.96(m,1H),6.91-6.86(m,1H),5.97(s,0.9H),5.85(s,0.1H),3.60(s,3H),2.55(s,6H),2.52(s,3H)。
H16-B：LC-MS(ESI)：RT＝4.186min，C18H18FN3O3的计算质量343.1，m/z实测值344.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IF 5μm4.6*250mm；流动相：Hex:IPA:DEA＝98:2:0.2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm；RT＝17.983min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.66(s,1H),7.60-7.46(br s,1H),7.09-7.04(m,1H),7.00-6.94(m,1H),6.91-6.87(m,1H),5.97(s,1H),3.60(s,3H),2.55(s,5.2H),2.52(s,3.8H)。
H16-1A：甲基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(5-甲基噁唑-4-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H16-1A制备H16-1A。
LC-MS(ESI)：RT＝1.74min，C18H17BrFN3O3的计算质量422.3，m/z实测值424.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.69(s,0.4H),7.66(s,0.6H),7.22-7.12(m,1H),7.09-6.91(m,2H),5.97(s,0.4H),5.86(s,0.6H),4.90(d,J＝11.2Hz,0.4H),4.84(d,J＝11.2Hz,0.4H),4.73(d,J＝8.4Hz,0.6H),4.69(d,J＝8.4Hz,0.6H),3.63(s,3H),2.78(s,1H),2.55-2.54(m,2H),2.39(s,2H),2.19(d,J＝2.4Hz,1H)。
H17：乙基4-(2-氯-4-氟苯基)-6-甲基-2-(5-甲基噁唑-4-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1相同的条件制备中间体H17。
LC-MS(ESI)：RT＝1.779min，C18H17ClFN3O3的计算质量377.0，m/z实测值378.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.31(s,0.8H),8.80(s,0.2H),8.36(s,1H),7.40(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H),7.28(t,J＝7.6Hz,1H),7.17(t,J＝7.6Hz,1H),5.95(s,0.8H),5.87(s,0.2H),3.95(q,J＝7.2Hz,2H),2.68(s,0.5H),2.46-2.30(m,5.5H),1.04(t,J＝7.2Hz,3H)。
将外消旋H17(12.7g，99％纯度，32.9mmol)通过手性制备型HPLC(柱：ChiralpakIF 5μm 20*250mm；流动相：Hex:IPA＝95:5，以20mLl/min；温度：30℃；波长：214nm)进行分离，得到呈黄色固体的标题化合物H17-A(5.28mg，由1H NMR得到的纯度为95％，40％产率，100％立体纯)和H17-B(5.37mg，由1H NMR得到的纯度为95％，41％产率，97.5％立体纯)。
中间体H17-A：LC-MS(ESI)：RT＝3.541min，C18H17ClFN3O3的计算质量377.1，m/z实测值378.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IF 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:IPA＝95:5，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝8.593min)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.28(s,0.8H),8.77(d,J＝3.6Hz,0.2H),8.35(s,0.8H),8.34(s,0.2H),7.39(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),7.27(dd,J＝8.8,6.4Hz,1H),7.19-7.14(m,1H),5.95(s,0.8H),5.86(d,J＝3.2Hz,0.2H),3.94(q,J＝6.8Hz,2H),2.68(s,0.5H),2.46(s,5H),2.37(s,0.5H),1.04(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体H17-B：LC-MS(ESI)：RT＝3.538min，C18H17ClFN3O3的计算质量377.1，m/z实测值378.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IF 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:IPA＝95:5，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝10.412min)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.28(s,0.8H),8.77(d,J＝3.6Hz,0.2H),8.35(s,0.8H),8.34(s,0.2H),7.39(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),7.27(dd,J＝8.8,6.4Hz,1H),7.19-7.16(m,1H),5.95(s,0.8H),5.85(d,J＝3.6Hz,0.2H),3.94(q,J＝6.8Hz,2H),2.68(s,0.5H),2.46(s,5H),2.37(s,0.5H),1.04(t,J＝7.2Hz,3H)。
H17-1A：乙基6-(溴甲基)-4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(5-甲基噁唑-4-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H17-A制备H17-1A。
LC-MS(ESI)：RT＝1.887min，C18H16BrClFN3O3的计算质量455.0、457.0，m/z实测值458.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.05(br s,1H),8.39(s,1H),7.45-7.35(m,2H),7.24-7.20(m,1H),5.92(s,1H),4.73(s,2H),4.06-3.99(m,2H),2.79-2.62(m,3H),1.08(t,J＝7.2Hz,3H)。
H18：甲基4-(2-氯-4-氟苯基)-6-甲基-2-(5-甲基噁唑-4-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1相同的条件制备中间体H18。
LC-MS(ESI)：RT＝1.52min，C17H15ClFN3O3的计算质量363.1，m/z实测值364.0[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.67(s,1H),7.59-7.50(m,0.6H),7.34-7.31(m,0.8H),7.23-7.14(m,0.6H),7.13(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),6.96-6.86(m,1H),6.14(s,0.6H),5.99(s,0.4H),3.60(s,3H),2.72(s,1.2H),2.62-2.51(m,4.8H)。
H18-2：1-叔丁基5-甲基6-(2-氯-4-氟苯基)-4-甲基-2-(5-甲基噁唑-4-基)嘧啶-1,5(6H)-二甲酸酯
通过在50℃用Boc2O和DIPEA处理，由H18制备H18-2。
LC-MS(ESI)：RT＝1.853min，C22H23ClFN3O5的计算质量463.1，m/z实测值464.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.68(s,1H),7.17-7.10(m,2H),6.79(td,J＝8.4,2.4Hz,1H),6.70(s,1H),3.71(s,3H),2.58(s,3H),2.44(s,3H),1.34(s,9H)。
将外消旋H18-2(15.2g，90％纯度，29.5mmol)通过手性制备型HPLC(手性柱：Chiralpak IC 5μm 30*250mm；流动相：Hex:EtOH＝98:2，以30mL/min；温度：30℃；波长：254nm)进行分离，得到呈黄色固体的H18-2A(6.58g，由1H NMR得到的纯度为95％，99.5％ee，46％产率)和呈黄色固体的H18-2B(5.76g，由1H NMR得到的纯度为95％，97.9％ee，40％产率)。
中间体H18-2A：LC-MS(ESI)：RT＝1.72min，C22H23ClFN3O5的计算质量463.1，m/z实测值464.0[M+H]+。手性分析(手性柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝98:2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm；RT＝10.327min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.68(s,1H),7.17-7.10(m,2H),6.79(td,J＝8.0,2.4Hz,1H),6.70(s,1H),3.71(s,3H),2.58(s,3H),2.44(s,3H),1.34(s,9H)。
中间体H18-2B：LC-MS(ESI)：RT＝1.72min，C22H23ClFN3O5的计算质量463.1，m/z实测值464.0[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝98:2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm；RT＝11.793min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.68(s,1H),7.17-7.10(m,2H),6.79(td,J＝8.0,2.4Hz,1H),6.70(s,1H),3.71(s,3H),2.57(s,3H),2.43(s,3H),1.34(s,9H)。
H18-A：甲基4-(2-氯-4-氟苯基)-6-甲基-2-(5-甲基噁唑-4-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
通过用TFA处理，由H18-2A制备H18-A。
LC-MS(ESI)：RT＝1.717min，C17H15ClFN3O3的计算质量363.1，m/z实测值364.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.67(s,1H),7.61-7.52(s,0.7H),7.38-7.28(m,0.6H),7.26-7.22(m,0.7H),7.13(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),6.91-6.85(m,1H),6.14(s,0.7H),5.99(s,0.3H),3.60(s,3H),2.72(s,0.9H),2.64-2.51(m,5.1H)。
H18-1A：甲基6-(溴甲基)-4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(5-甲基噁唑-4-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H18-A制备H18-1A。
LC-MS(ESI)：RT＝1.76min，C17H14BrClFN3O3的计算质量441.0，m/z实测值442.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.68(s,1H),7.40-7.34(m,1H),7.14(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H),6.98-6.94(m,1H),6.02(s,1H),4.89(d,J＝8.4Hz,1H),4.64(d,J＝8.4Hz,1H),3.65(s,3H),2.76(s,3H)。
H19：乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1-氢-4-氘代嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1相同的条件制备中间体H19。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.88(d,J＝3.0Hz,0.3H),7.82(d,J＝3.0Hz,1.7H),7.56(d,J＝3.0Hz,0.3H),7.45(d,J＝3.3Hz,0.7H),7.13-7.08(m,2H),6.97-6.91(m,1H),4.10(q,J＝6.9Hz,2H),2.59(s,3H),2.57(s,3H),1.17(t,J＝7.2Hz,3H)。
将外消旋H19(48.0g，90％纯度，120mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak AS 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝80:20:0.3，以18mL/min；温度：30℃；波长：254nm)进行分离，得到呈黄色固体的所需化合物H19-A(19.0g，由1H NMR得到的纯度为90％，40％产率，100％立体纯)和H19-B(17.8g，由1H NMR得到的纯度为90％，37％产率，99.9％立体纯)。
中间体H19-A：手性分析(柱：Chiralpak OJ-H 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝85:15:0.2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝9.457min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(d,J＝3.6Hz,2H),7.43(s,1H),7.09-7.06(m,2H),6.92-6.88(m,1H),4.06(q,J＝7.2Hz,2H),2.53(s,6H),1.13(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体H19-B：手性分析(柱：Chiralpak OJ-H 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝85:15:0.2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝7.311min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(d,J＝3.2Hz,2H),7.42(s,1H),7.10-7.06(m,2H),6.92-6.88(m,1H),4.06(q,J＝7.2Hz,2H),2.53(s,6H),1.13(t,J＝7.2Hz,3H)。
H19-1B：乙基6-(溴甲基)-4-氘代-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H19-B制备H19-1B。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.20(s,0.6H),7.82(d,J＝2.4Hz,1H),7.53(d,J＝2.8Hz,0.5H),7.44(d,J＝2.8Hz,0.5H),7.23(s,0.4H),7.15-7.08(m,2H),6.97-6.89(m,1H),4.92-4.76(m,1.6H),4.66(d,J＝8.4Hz,0.4H),4.10(q,J＝7.2Hz,2H),2.53(s,1.6H),2.41(s,1.4H),1.14(t,J＝6.8Hz,3H)
H20：乙基4-(6-氟-2-甲基吡啶-3-基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1相同的条件制备中间体H20。
LC-MS(ESI)：RT＝1.42min，C17H17FN4O2S的计算质量360.1，m/z实测值361.3[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(s,1H),7.81(d,J＝3.2Hz,1H),7.60(t,J＝8.0Hz,1H),7.45(d,J＝3.2Hz,1H),6.68(dd,J＝8.4,3.2Hz,1H),5.98(s,1H),4.11-4.03(m,2H),2.80(s,3H),2.53(s,3H),1.15(t,J＝7.2Hz,3H)。
将外消旋H20进行手性分离，得到H20-A和H20-B。
H20-A：LC-MS(ESI)：RT＝1.40min，C17H17FN4O2S的计算质量360.11，m/z实测值361.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(s,1H),7.80(d,J＝3.2Hz,1H),7.60(t,J＝8.0Hz,1H),7.45(d,J＝3.2Hz,1H),6.68(dd,J＝8.4,3.2Hz,1H),5.98(s,1H),4.11-4.03(m,2H),2.80(s,3H),2.53(s,3H),1.15(t,J＝7.2Hz,3H)。手性分析(100％立体纯，Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝70:30，以1mL/min；温度：30℃，波长：254nm，RT＝5.773min)。
H20-B：LC-MS(ESI)：RT＝1.41min，C17H17FN4O2S的计算质量360.11，m/z实测值361.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(s,1H),7.80(d,J＝3.2Hz,1H),7.60(t,J＝8.0Hz,1H),7.45(d,J＝3.2Hz,1H),6.68(dd,J＝8.0,3.2Hz,1H),5.98(s,1H),4.11-4.03(m,2H),2.80(s,3H),2.53(s,3H),1.15(t,J＝6.8Hz,3H)。手性分析(99.9％立体纯，Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝70:30，以1mL/min；温度：30℃，波长：254nm，RT＝6.724min)。
H20-1A：乙基6-(溴甲基)-4-(6-氟-2-甲基吡啶-3-基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
使用与H1-1A相同的条件，由H20-A制备H20-1A。
LC-MS(ESI)：RT＝1.70min，C17H16BrFN4O2S的计算质量438.0，m/z实测值441.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.32-8.18(m,0.4H),7.84(d,J＝3.2Hz,1H),7.73-7.59(m,0.7H),7.54-7.44(m,1H),6.76-6.69(m,1H),5.02-4.85(m,1H),4.79-4.61(m,0.3H),4.16-4.05(m,2H),2.83-2.65(s,3H),1.17(t,J＝7.2Hz,3H)。
氘代-3-氟-2-甲基苯甲醛的制备：
Figure BDA0003122494520000751
甲基3-氟-2-甲基苯甲酸酯：
在室温，向3-氟-2-甲基苯甲酸(50.0g，324mmol)在甲醇(500mL)中的溶液中添加浓硫酸(25mL)。在80℃搅拌过夜后，将混合物冷却至室温，并用乙酸乙酯(400mL)稀释。将混合物用水(200mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液减压浓缩，得到残余物，将该残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝100:1)纯化，得到呈无色油状物的标题化合物(52.1g，由1H NMR得到的纯度为90％，86％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.66-7.64(m,1H),7.18-7.13(m,2H),3.89(s,3H),2.48(d,J＝2.4Hz,3H)。
二氘代(3-氟-2-甲基苯基)甲醇：
在0℃，向甲基3-氟-2-甲基苯甲酸酯(52.1g，90％纯度，279mmol)在四氢呋喃(500mL)中的溶液中缓慢添加氘化铝锂(13.6mg，324mmol)。在室温搅拌过夜后，将混合物用水(25mL)、15％氢氧化钠水溶液(40mL)淬灭，并在0℃用硫酸镁(55g)干燥。搅拌30分钟后，将混合物过滤并将滤液减压浓缩，得到呈无色油状物的标题化合物(49.2g，由1H NMR得到的纯度为80％，99％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.17-7.12(m,2H),6.98-6.93(m,1H),2.24(d,J＝2.4Hz,3H)。
氘代-3-氟-2-甲基苯甲醛：
在室温，向二氘代(3-氟-2-甲基苯基)甲醇(49.2g，80％纯度，277mmol)在二氯甲烷(500mL)中的溶液中缓慢添加1,1-二氢-1,1,1-三乙酰氧基-1,2-苯碘酰-3(1h)-酮(264g，622mmol)。在室温搅拌1小时后，将混合物用硫代硫酸钠和饱和碳酸钠水溶液淬灭。将混合物过滤并将滤液减压浓缩，得到残余物，将该残余物溶解在乙酸乙酯(50mL)中并用水(50mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液减压浓缩，得到残余物，将该残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝100:1)纯化，得到呈无色油状物的标题化合物(44.1g，由1H NMR得到的纯度为85％，97％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.61(d,J＝7.6Hz,1H),7.35-7.24(m,2H),2.58(d,J＝1.6Hz,3H)。
化合物1A：3-(7-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520000761
2,2-二甲基-3-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丙酸(中间体S1)的制备
Figure BDA0003122494520000762
中间体S1-1：1-苄基4-(叔丁基)(S)-2-(羟基甲基)哌嗪-1,4-二甲酸酯
在0℃，在氮气气氛下，向(S)-叔丁基3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸酯(10.0g，46.2mmol)和饱和碳酸氢钠水溶液(64mL)在四氢呋喃(106mL)中的溶液中逐滴添加氯甲酸苄酯(9.16g，53.7mmol)。在室温搅拌过夜后，将混合物减压浓缩以去除四氢呋喃，添加水(50mL)并用乙酸乙酯(50mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝4:1至1:1)纯化，得到呈无色油状物的标题化合物S1-1(14.8g，82％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝2.056min，C18H26N2O5的计算质量350.2，m/z实测值373.1[M+Na]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.43-7.30(m,5H),5.17(d,J＝12.4Hz,1H),5.12(d,J＝12.4Hz,1H),4.31-4.12(m,2H),4.07-3.84(m,2H),3.73-3.50(m,2H),3.15-2.79(m,3H),1.47(s,9H)。
中间体S1-2：1-苄基4-叔丁基2-甲酰基哌嗪-1,4-二甲酸酯(2种对映体的混合物)
在-78℃，向无水二甲亚砜(38.5g，493mmol)在无水二氯甲烷(300mL)中的溶液中逐滴添加草酰二氯(57.8g，455mmol)。在-78℃在氮气气氛下搅拌1.5小时后，逐滴添加(S)-1-苄基4-叔丁基2-(羟基甲基)哌嗪-1,4-二甲酸酯S1-1(28.8g，90％纯度，73.9mmol)在无水二氯甲烷(50mL)中的溶液。将混合物在-78℃搅拌1.5小时，然后添加三乙胺(60.9g，602mmol)。在室温搅拌0.5小时后，将反应混合物用冰水(100mL)稀释，并用1M盐酸水溶液中和至pH 6-7，用二氯甲烷(150mL)萃取三次。将合并的有机相用饱和碳酸氢钠(100mL)和盐水(100mL)洗涤三次，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并蒸发，得到呈浅黄色油状物的标题化合物S1-2(28.8g，89％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.68min，C18H24N2O5的计算质量348.2，m/z实测值293.1[M+H-56]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.60(d,J＝7.2Hz,1H),7.37-7.29(m,5H),5.18(s,1H),5.14(s,1H),4.91-4.51(m,2H),4.07-3.82(m,2H),3.29-3.07(m,2H),3.00-2.79(m,1H),1.44(s,9H)。
中间体S1-3：1-苄基4-叔丁基2-(((3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)氨基)甲基)哌嗪-1,4-二甲酸酯(2种对映体的混合物)
在室温，向乙基3-氨基-2,2-二甲基丙酸酯盐酸盐(17.7g，97.4mmol)在甲醇(200mL)中的溶液中添加三乙胺(9.86g，97.4mmol)。在室温在氮气气氛下搅拌0.5小时后，添加1-苄基4-叔丁基2-甲酰基哌嗪-1,4-二甲酸酯S1-2(29.5g，80％，67.7mmol)在甲醇(100mL)中的溶液并在室温搅拌1小时。然后在0℃添加氰基硼氢化钠(9.84g，157mmol)并将混合物在室温搅拌2小时，用冰水(100mL)淬灭，真空下去除甲醇并用乙酸乙酯(100mL)萃取三次。将合并的有机层经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝8:1至2:1)纯化，得到呈浅黄色油状物的标题化合物S1-3(29.6g，82％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝2.533min，C25H39N3O6的计算质量477.3，m/z实测值478.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39-7.31(m,5H),7.27(s,1H),5.83-5.77(m,0.7H),5.67-5.62(m,0.3H),5.16(s,2H),4.30(t,J＝6.4Hz,2H),3.68(s,3H),2.89(t,J＝7.2Hz,0.5H),2.86(t,J＝6.4Hz,1.5H),2.71-2.62(m,1H),2.46-2.42(m,2H),2.40-2.33(m,2H),2.31(s,1H),2.30(s,2H),2.17-2.12(m,1H),1.92-1.79(m,1H)。
中间体S1-4：叔丁基3-(((3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)氨基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯(2种对映体的混合物)
向1-苄基4-叔丁基2-(((3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)氨基)
甲基)哌嗪-1,4-二甲酸酯S1-3(17.6g，33.2mmol)在乙醇(300mL)中的溶液中添加20％wt氢氧化钯碳(8.0g，11.4mmol)，然后将混合物在60℃在60psi的氢气气氛下搅拌过夜。添加另外的20％氢氧化钯碳(500mg，0.712mmol)并在60℃在60psi的氢气气氛下继续搅拌过夜。然后过滤反应混合物并将滤液减压浓缩，得到呈无色油状物的标题化合物S1-4(11.7g，82％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.362min，C17H33N3O4的计算质量343.2，m/z实测值344.11[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.12(q,J＝7.2Hz,2H),4.02-3.80(m,2H),2.99-2.96(m,1H),2.94-2.81(m,1H),2.74-2.63(m,4H),2.60-2.47(m,3H),1.46(s,9H),1.25(t,J＝7.2Hz,3H),1.19(s,3H),1.17(s,3H)。
中间体S1-5：叔丁基2-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯
在0℃，在氮气气氛下，向叔丁基3-(((3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)氨基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯S1-4(3.70g，8.62mmol)和三乙胺(2.72g，26.9mmol)在二氯甲烷(25mL)中的溶液添加硫光气(1.48g，12.9mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液。在室温搅拌过夜后，将混合物用冰水(20mL)稀释并用二氯甲烷(15mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过C18柱(乙腈:水＝5％至100％)纯化，得到呈白色固体的标题化合物S1-5(2.1g，57％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝2.380min，C18H31N3O4S的计算质量385.2，m/z实测值386.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)4.49-4.45(m,1H),4.16(q,J＝7.2Hz,2H),4.11-4.10(m,1H),4.08-4.00(m,1H),3.94(d,J＝14.4Hz,1H),3.87(d,J＝14.0Hz,1H),3.78-3.69(m,1H),3.60(t,J＝9.6Hz,1H),3.11-3.07(m,1H),3.03-2.99(m,1H),2.92-2.78(m,1H),2.67-2.51(m,1H),1.46(s,9H),1.28(t,J＝7.2Hz,3H),1.25(s,3H),1.24(s,3H)。
将叔丁基2-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯S1-5的外消旋混合物(7.3g，90％，17.0mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak IF 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝80:20:0.3，以15mL/min；温度：30℃；波长：230nm)进行分离，得到呈白色固体的标题化合物S1-5A(4.38g)和呈白色固体的标题化合物S1-5B(1.89g)。
S1-5A：LC-MS(ESI)：RT＝1.74min，C18H31N3O4S的计算质量385.2，m/z实测值386.3[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IF 5μm4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝80:20:0.2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝9.710min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.48-4.46(m,1H),4.28-4.18(m,1H),4.16(q,J＝7.2Hz,2H),4.11-4.00(m,1H),3.94(d,J＝14.0Hz,1H),3.87(d,J＝14.40Hz,1H),3.78-3.679(m,1H),3.610(t,J＝9.6Hz,1H),3.11-3.07(m,1H),3.03-2.97(m,1H),2.92-2.75(m,1H),2.69-2.51(m,1H),1.47(s,9H),1.28(t,J＝7.2Hz,3H),1.25(s,3H),1.24(s,3H)。
S1-5B：LC-MS(ESI)：RT＝1.74min，C18H31N3O4S的计算质量385.2，m/z实测值386.3[M+H]+。手性分析：(柱：Chiralpak IF 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝80:20:0.2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝7.397min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.49-4.46(m,1H),4.33-4.18(m,1H),4.16(q,J＝7.2Hz,2H),4.11-3.99(m,1H),3.94(d,J＝14.4Hz,1H),3.87(d,J＝14.0Hz,1H),3.79-3.69(m,1H),3.60(t,J＝9.6Hz,1H),3.11-3.07(m,1H),3.03-2.97(m,1H),2.92-2.75(m,1H),2.68-2.50(m,1H),1.47(s,9H),1.28(t,J＝7.2Hz,3H),1.25(s,3H),1.24(s,3H)。
中间体S1-6A：3-(7-(叔丁氧基羰基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸
在0℃，在氮气气氛下，向叔丁基2-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯S1-5A(4.38g，10.2mmol)在甲醇(30mL)和水(10mL)中的溶液添加氢氧化钠(1.43g，35.8mmol)。在室温搅拌6小时后，向混合物中添加氢氧化钠(700mg，17.5mmol)并在60℃搅拌4小时。然后将反应用水(20mL)稀释，真空下去除甲醇并用乙酸乙酯(20mL)萃取两次。将合并的水相用饱和柠檬酸水溶液酸化至pH 3-4，用乙酸乙酯(20mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩，得到呈白色固体的标题化合物S1-6A(3.6g，由1H NMR得到的纯度为90％，89％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.612min，C16H27N3O4S的计算质量357.2，m/z实测值358.2[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.47(br s,1H),4.25-4.21(m,1H),4.06-4.02(m,1H),3.95-3.92(m,1H),3.81(d,J＝14.0Hz,1H),3.79-3.74(m,1H),3.73(d,J＝13.6Hz,1H),3.65(t,J＝9.6Hz,1H),3.18-3.13(m,1H),2.99-2.92(m,1H),2.80-2.54(m,2H),1.41(s,9H),1.12(s,3H),1.11(s,3H)。
中间体S1-6B：3-(7-(叔丁氧基羰基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸
在0℃，在氮气气氛下，向叔丁基2-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯S1-5B(810mg，1.89mmol)在甲醇(15mL)和水(5mL)的溶液中添加氢氧化钠(263mg，6.58mmol)。在室温搅拌6小时后，向混合物中添加氢氧化钠(130mg，3.25mmol)并在60℃搅拌4小时。然后将反应用水(10mL)稀释，真空下去除甲醇并用乙酸乙酯(20mL)萃取两次。将合并的水相用饱和柠檬酸水溶液酸化至pH 3-4，用乙酸乙酯(20mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩，得到呈白色固体的标题化合物S1-6B(650mg，87％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.654min，C16H27N3O4S的计算质量357.2，m/z实测值358.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.46(br s,1H),4.25-4.21(m,1H),4.10-4.00(m,1H),3.95-3.92(m,1H),3.81(d,J＝13.6Hz,1H),3.79-3.74(m,1H),3.73(d,J＝14.0Hz,1H),3.65(t,J＝10.0Hz,1H),3.18-3.14(m,1H),2.99-2.92(m,1H),2.80-2.55(m,2H),1.41(s,9H),1.12(s,3H),1.11(s,3H)。
中间体S1-A：2,2-二甲基-3-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丙酸盐酸盐
将3-(7-(叔丁氧基羰基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸S1-6A(3.6g，9.06mmol)添加到在乙酸乙酯中的3M盐酸(50mL，150mmol)中。将该反应在室温在氮气气氛下搅拌5小时，将完成的反应减压浓缩，得到呈白色固体的标题化合物(2.9g，98％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝0.513min，C11H20ClN3O2S的计算质量293.1，m/z实测值258.1[M+H-HCl]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.41(br s,1H),9.62(br s,2H),4.39-4.35(m,1H),4.23-4.13(m,1H),3.82(d,J＝13.6Hz,1H),3.74-3.69(m,2H),3.54-3.39(m,2H),3.33-3.24(m,2H),2.88-2.73(m,2H),1.40(s,3H),1.12(s,3H)。
中间体S1-B：2,2-二甲基-3-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丙酸盐酸盐
将(R)-3-(7-(叔丁氧基羰基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸S1-6B(650mg，1.64mmol)添加到在乙酸乙酯中的3M盐酸中(20mL，60mmol)。将该反应在室温在氮气气氛下搅拌4小时，将完成的反应减压浓缩，得到呈白色固体的标题化合物中间体S1-B(530mg，由1HNMR得到的纯度为90％，99％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝0.82min，C11H20ClN3O2S的计算质量293.1，m/z实测值258.1[M+H-HCl]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.52(br s,1H),9.41(br s,2H),4.40-4.36(m,1H),4.21-4.10(m,1H),3.83(d,J＝14.0Hz,1H),3.74-3.69(m,2H),3.39-3.35(m,2H),3.28-3.24(m,2H),2.91-2.77(m,2H),1.41(s,3H),1.12(s,3H)。
化合物的制备
化合物1A：3-(7-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸
Figure BDA0003122494520000821
向2,2-二甲基-3-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丙酸盐酸盐中间体S1-A(1.87g，5.73mmol)在四氢呋喃(160mL)中的溶液中添加三乙胺(3.4mL，24.5mmol)。将混合物在室温搅拌10分钟，之后添加(S)-乙基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(H2-1A)(2.5g，5.14mmol)。在40℃在氮气气氛下搅拌2.5小时并且然后在室温搅拌过夜后，将混合物过滤并将滤液浓缩且通过C18柱(乙腈:水(+0.05％盐酸)＝45％-50％)纯化，得到呈浅呈黄色固体的所需化合物(1.69g，48％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝8.325min，C29H35FN6O4S2的计算质量614.8，m/z实测值615.2[M+H]+。手性分析：(柱：Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:IPA:TFA＝50:50:0.2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝11.063min)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.45(s,1H),9.58(s,0.9H),9.53(d,J＝3.2Hz,0.1H),8.01-7.92(m,2H),7.21-7.16(m,1H),7.06-7.01(m,2H),5.88(s,0.9H),5.77(d,J＝3.2Hz,0.1H),4.35(d,J＝11.6Hz,0.9H),4.22(d,J＝14Hz,0.1H),4.02-3.88(m,5H),3.81-3.73(m,2H),3.66-3.61(m,1H),3.18-3.12(m,2H),3.06-3.03(m,0.1H),2.95-2.89(m,1.9H),2.45(d,J＝1.6Hz,2.8H),2.39(d,J＝1.6Hz,0.2H),2.27(dt,J＝11.6,3.2Hz,1H),2.07(t,J＝10.8Hz,1H),1.13-1.04(m,9H)。
化合物1B：3-(7-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520000831
在针对化合物1A的条件下使用H2-1A和S1-B制备化合物1B，通过制备型HPLC(柱：Xbridge C18(5μm 19*150mm)，流动相A：水(0.1％碳酸氢铵)，流动相B：乙腈；UV：214nm：流速：15mL/min，梯度：30％-75％(％B))纯化，LC-MS(ESI)：RT＝3.915min，C29H35FN6O4S2的计算质量614.2，m/z实测值615.2[M+H]+。手性分析：(柱：Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:TFA＝70:30:0.2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝19.029min)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.22(br s,1H),9.62(s,1H),8.01-7.99(m,1H),7.94(d,J＝2.8Hz,1H),7.21-7.15(m,1H),7.07-7.02(m,2H),5.89(s,0.9H),5.76(s,0.1H),4.30-4.27(m,1H),4.04-3.89(m,5H),3.82-3.74(m,2H),3.72-3.67(m,1H),3.22-3.17(m,1H),3.14-3.04(m,2H),2.78-2.75(m,1H),2.45(s,3H),2.22-2.12(m,2H),1.14(s,3H),1.13(s,3H),1.05(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物2：3-(3-(氰基亚氨基)-7-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(2种非对映体的混合物)
Figure BDA0003122494520000841
中间体S2的制备：3-(3-(氰基亚氨基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸
Figure BDA0003122494520000851
中间体S2-1：叔丁基3-(氰基亚氨基)-2-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯
向叔丁基3-(((3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)氨基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯S1-4(3.00g，6.99mmol)在1,4-二噁烷(30mL)中的溶液中添加氰基碳亚氨基二硫代二甲酯(1.30g，8.89mmol)。加热至回流且搅拌过夜后，将反应混合物冷却至室温且用水(150mL)稀释。将混合物用乙酸乙酯(50mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩，得到呈黄色油状物的粗产物(4.00g，83％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.62min，C19H31N5O4的计算质量393.2，m/z实测值394.2[M+H]+。
中间体S2-2：3-(7-(叔丁氧基羰基)-3-(氰基亚氨基)六氢咪唑并-[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸
在0℃，向叔丁基3-(氰基亚氨基)-2-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯S2-1(4.68g，6.66mmol)在甲醇(50mL)中的溶液中添加氢氧化钠(1.10g，27.5mmol)在水(20mL)中的溶液。在40℃搅拌过夜后，去除甲醇且用乙酸乙酯(50mL)萃取剩余的水相。分离水层且通过2M盐酸溶液酸化至pH约为3，然后用乙酸乙酯(50mL)萃取两次。将合并的有机层经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩，得到呈白色固体的粗产物(2.60g，86％纯度，91％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.46min，C17H27N5O4的计算质量365.2，m/z实测值366.2[M+H]+。
中间体S2-3：叔丁基3-(氰基亚氨基)-2-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯
在0℃，向3-(7-(叔丁氧基羰基)-3-(氰基亚氨基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸S2-2(2.60g，6.12mmol)和碳酸钾(1.30g，9.41mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(30mL)中的混合物中逐滴添加碘乙烷(1.00g，6.41mmol)。在室温搅拌3小时后，将混合物用水(150mL)稀释，用乙酸乙酯(150mL)萃取两次。将合并的萃取物用盐水(150ml)洗涤两次，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩，得到粗产物，将该粗产物通过C18(乙腈:水＝5％至45％)纯化，得到呈白色固体的标题化合物(2.40g，89％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.60min，C19H31N5O4的计算质量393.2，m/z实测值394.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.64(d,J＝11.6Hz,1H),4.31-3.96(m,4H),3.65-3.52(m,4H),3.11-3.03(m,2H),2.89-2.56(m,2H),1.47(s,9H),1.28(t,J＝7.2Hz,3H),1.22(s,6H)。
中间体S2-4：3-(7-(叔丁氧基羰基)-3-(氰基亚氨基)六氢咪唑并-[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸
在0℃，向叔丁基3-(氰基亚氨基)-2-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯S2-3(500mg，1.14mmol)在甲醇(20mL)中的溶液中添加氢氧化钠(180mg，4.50mmol)在水(10mL)中的溶液。在40℃搅拌过夜后，去除甲醇并用乙酸乙酯(30mL)萃取剩余的水相。分离水相并通过2M盐酸水溶液酸化至pH约为3，用乙酸乙酯(50mL)萃取两次。将合并的萃取物经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩，得到呈白色固体的粗产物(400mg，92％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.21min，C17H27N5O4的计算质量365.2，m/z实测值364.2[M-H]+。
中间体S2：3-(3-(氰基亚氨基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸盐酸盐
将3-(7-(叔丁氧基羰基)-3-(氰基亚氨基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸S2-4(150mg，0.398mmol)在3M盐酸(在乙酸乙酯中)(6mL，18.0mmol)中的混合物在室温搅拌3小时。然后将混合物浓缩，得到呈白色固体的所需产物(120mg，99％产率)。将粗产物直接用于下一步骤。LC-MS(ESI)：RT＝0.87min，C12H20ClN5O2的计算质量301.1，m/z实测值266.2[M+H-HCl]+。
化合物2：3-(3-(氰基亚氨基)-7-((5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(2种非对映体的混合物)
Figure BDA0003122494520000871
向3-(3-(氰基亚氨基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸盐酸盐S2(120mg，0.398mmol)在二氯甲烷(10mL)中的混合物中添加三乙醇胺(300mg，2.01mmol)。在室温搅拌0.5小时后，添加(S)-乙基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(H2-1A)(150mg，0.308mmol)。在室温搅拌过夜后，将反应混合物通过二氯甲烷(50mL)稀释，通过盐水(50mL)洗涤两次，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩，得到残余物，将该残余物通过C18柱(乙腈:水＝5％至45％)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(48mg，97.4％纯度，18％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.677min，C30H35FN8O4S的计算质量622.3，m/z实测值623.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.60-9.52(m,1H),8.01-8.00(m,1H),7.93-7.92(m,1H),7.21-7.15(m,1H),7.06-7.01(m,2H),5.89-5.88(m,1H),4.47-4.36(m,1H),4.04-3.91(m,4H),3.85-3.76(m,1H),3.64-3.43(m,3H),3.22-2.91(m,4H),2.45(s,3H),2.39-2.13(m,2H),1.13-1.04(m,9H)。
化合物3A：3-(7-((6-(2-氯-3-氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520000881
使用与化合物3B相同的条件由H1-1A和中间体S1-B制备化合物3A。
化合物3A：通过制备型HPLC(柱：gilson Xbrige C18(5μm 19*150mm)，流动相A：水(+0.1％碳酸氢铵)，流动相B：乙腈；UV：214nm：流速：15mL/min，梯度：10％-70％(％B))纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(30mg，99.6％纯度，31％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.262min，C28H32ClFN6O4S2的计算质量634.2，m/z实测值635.2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.67(s,1H),8.03(d,J＝3.2Hz,1H),7.95(d,J＝3.2Hz,1H),7.38-7.25(m,3H),6.11(s,0.97H),6.00(s,0.03H),4.31-4.28(m,1H),4.02-3.89(m,5H),3.82-3.74(m,2H),3.72-3.67(m,1H),3.22-3.18(m,1H),3.15-3.04(m,2H),2.81-2.78(m,1H),2.21-2.14(m,2H),1.14(s,6H),1.03(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物3B：3-(7-((6-(2-氯-3-氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520000891
向2,2-二甲基-3-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丙酸盐酸盐中间体S1-A(100mg，0.31mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液中添加三乙醇胺(230mg，1.54mmol)。在40℃搅拌30分钟后，逐滴添加乙基6-(溴甲基)-4-(2-氯-3-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(H1-1A)(157mg，90％纯度，0.279mmol)在二氯甲烷(2mL)中的溶液。在40℃搅拌16小时后，将反应混合物浓缩，得到残余物，将该残余物通过制备型HPLC(柱：Waters Xbridge C18(5μm 19*150mm)，流动相A：水(0.1％碳酸氢铵)，流动相B：乙腈；UV：214nm：流速：15mL/min，梯度：20％-60％(％B))纯化，得到呈黄色固体的标题化合物3B(34.8mg，17.8％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.542min，C28H32ClFN6O4S2的计算质量634.2，m/z实测值635.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.67(br s,1H),8.02(d,J＝3.2Hz,1H),7.94(d,J＝3.2Hz,1H),7.39-7.29(m,2H),7.29-7.24(m,1H),6.10(s,1H),4.35(d,J＝11.6Hz,1H),4.00-3.87(m,5H),3.78(d,J＝14.0Hz,1H),3.74(d,J＝14.0Hz,1H),3.64(t,J＝9.6Hz,1H),3.19-3.12(m,2H),2.95-2.92(m,2H),2.32-2.21(m,1H),2.08(t,J＝10.8Hz,1H),1.12(s,6H),1.05(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物4A：3-(7-((6-(2-氯-4-氟苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520000901
使用与化合物4B相同的条件由中间体S1-B和中间体H3-1A制备化合物4A，且通过制备型HPLC(柱：gilson Xbrige C18(5μm 19*150mm)，流动相A：水(+0.1％碳酸氢铵)，流动相B：乙腈；UV：214nm：流速：15mL/min，梯度：05％-95％(％B))纯化。LC-MS(ESI)：RT＝3.658min，C27H30ClFN6O4S2的计算质量620.1，m/z实测值621.1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.71(br s,0.9H),8.03(d,J＝3.2Hz,1H),8.01(s,0.1H),7.95(d,J＝3.2Hz,1H),7.45-7.39(m,2H),7.17(td,J＝8.4,2.4Hz,1H),6.05(s,0.97H),5.93(s,0.03H),4.30-4.27(m,1H),4.02-3.89(m,3H),3.81-3.67(m,3H),3.52(s,3H),3.22-3.18(m,1H),3.15-3.04(m,2H),2.79-2.76(m,1H),2.22-2.14(m,2H),1.13(s,6H)。
化合物4B：3-(7-((6-(2-氯-4-氟苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520000911
在室温，向2,2-二甲基-3-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丙酸盐酸盐中间体S1-A(80mg，0.250mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液中添加三乙醇胺(184mg，1.23mmol)，并将所得混合物在40℃搅拌30分钟。然后逐滴添加(R)-甲基6-(溴甲基)-4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(H3-1A)(122mg，0.250mmol)在二氯甲烷(2mL)中的溶液。在40℃搅拌16小时后，将反应混合物浓缩，得到残余物，将该残余物通过制备型HPLC(柱：Waters Xbridge C18(5μm 19*150mm)，流动相A：水(0.1％碳酸氢铵)，流动相B：乙腈；UV：214nm：流速：15mL/min，梯度：20％-55％(％B))纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(6.1mg，99.3％纯度，4％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.754min，C27H30ClFN6O4S2的计算质量620.1，m/z实测值621.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.84(d,J＝2.8Hz,1H),7.64(d,J＝3.6Hz,1H),7.31(dd,J＝8.8,6.0Hz,1H),7.12(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),6.97-6.92(m,1H),6.05(s,1H),4.43-4.39(m,1H),4.01-3.93(m,2H),3.84-3.73(m,3H),3.60-3.56(m,1H),3.49(s,3H),3.18-3.11(m,2H),2.87-2.77(m,2H),2.35-2.30(m,1H),2.10-2.04(m,1H),1.13(s,3H),1.12(s,3H)。
化合物5：1-((7-((6-(2-氯-3-氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)环丙烷甲酸(两种非对映体的混合物)
Figure BDA0003122494520000921
中间体S3的制备：
Figure BDA0003122494520000922
中间体S3-1：1-苄基4-叔丁基2-((((1-(乙氧基羰基)环丙基)甲基)氨基)甲基)哌嗪-1,4-二甲酸酯
在室温，向乙基1-(氨基甲基)环丙烷甲酸酯盐酸盐(2.04g，11.4mmol)在乙醇(50mL)中的溶液中添加三乙胺(1.15g，11.4mmol)。在室温在氮气气氛下搅拌0.5小时后，添加1-苄基4-叔丁基2-甲酰基哌嗪-1,4-二甲酸酯S1-2(3.10g，7.56mmol)在乙醇(10mL)中的溶液并在室温搅拌1.5小时。然后在0℃添加氰基硼氢化钠(1.12g，17.8mmol)。在室温搅拌2小时后，将混合物用冰水(15mL)淬灭，然后真空下去除乙醇。将残余物用水(40mL)稀释并用乙酸乙酯(20mL)萃取三次。将合并的有机层经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩，得到残余物，将该残余物通过C18柱(乙腈:水＝65％至95％)纯化，得到呈黄色油状物的标题化合物(2.00g，50％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.767min，C25H37N3O6的计算质量475.3，m/z实测值476.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36-7.32(m,5H),5.14(s,1H),4.27-3.93(m,6H),3.05-2.66(m,7H),1.71(br s,1H),1.46(s,9H),1.23-1.19(m,5H),0.81-0.68(m,2H)。
中间体S3-2：叔丁基3-((((1-(乙氧基羰基)环丙基)-甲基)氨基)-甲基)哌嗪-1-甲酸酯
在氮气气氛下，向1-苄基4-叔丁基2-((((1-(乙氧基羰基)环丙基)-甲基)氨基)甲基)哌嗪-1,4-二甲酸酯(S3-1)(1.80g，3.41mmol)在乙醇(80mL)中的溶液中添加20％氢氧化钯碳(2.00g，2.85mmol)。在50℃在氢气气氛(50psi)下搅拌过夜后，将该混合物冷却至室温。然后将催化剂滤出，并将滤液浓缩，得到呈黄色油状物的所需化合物(1.10g，85％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.374min，C17H31N3O4的计算质量341.2，m/z实测值342.2[M+H]+。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ4.13(q,J＝7.2Hz,2H),3.93-3.90(m,1H),3.00-2.43(m,8H),2.25(brs,2H),1.46(s,9H),1.26-1.21(m,4.6H),0.81-0.77(m,1.4H)。
中间体S3-3：叔丁基2-((1-(乙氧基羰基)环丙基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯
在0℃，在氮气气氛下，向叔丁基3-((((1-(乙氧基羰基)环丙基)甲基)氨基)-甲基)哌嗪-1-甲酸酯(S3-2)(1.10g，2.90mmol)和三乙胺(900mg，8.89mmol)在二氯甲烷(25mL)中的溶液中添加硫光气(550mg，4.78mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液。在室温搅拌过夜后，将混合物用冰水(40mL)稀释并用二氯甲烷(10mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩，得到残余物，将该残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝8:1至2:1)纯化，得到粗化合物，将该粗化合物通过C18柱(乙腈:水＝45％至95％)进一步纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(650mg，53％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.701min，C18H29N3O4S的计算质量383.2，m/z实测值384.2[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ4.44(d,J＝11.6Hz,1H),4.15-4.10(m,4H),3.97(s,2H),3.87-3.82(m,1H),3.78-3.71(m,1H),3.30-3.26(m,1H),3.04-2.98(m,1H),2.86-2.81(m,1H),2.65-2.58(m,1H),1.47(s,9H),1.31(s,2H),1.26-1.19(m,5H)。
中间体S3-3A和S3-3B：
将叔丁基2-((1-(乙氧基羰基)环丙基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯S3-3的外消旋混合物(400mg，0.939mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak ID 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝85:15:0.3，以18mL/min；温度：35℃；波长：214nm)进行分离，得到标题化合物S3-3A(90mg，由1H NMR得到的纯度为90％，23％产率，100％立体纯)和S3-3B(204mg，由1H NMR得到的纯度为90％，51％产率，99.2％立体纯)。
中间体S3-3A：LC-MS(ESI)：RT＝1.71min，C18H29N3O4S的计算质量383.2，m/z实测值384.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IE 5um 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝85:15:0.2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝15.778min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.46-4.43(m,1H),4.26-4.03(m,4H),3.97(s,2H),3.87-3.82(m,1H),3.80-3.68(m,1H),3.31-3.26(m,1H),3.05-2.98(m,1H),2.89-2.78(m,1H),2.69-2.54(m,1H),1.47(s,9H),1.32-1.19(m,7H)。
中间体S3-3B：LC-MS(ESI)：RT＝1.71min，C18H29N3O4S的计算质量383.2，m/z实测值384.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IE 5um 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝85:15:0.2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝18.449min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.46-4.43(m,1H),4.27-4.02(m,4H),3.97(s,2H),3.85-3.82(m,1H),3.78-3.68(m,1H),3.31-3.26(m,1H),3.05-2.98(m,1H),2.92-2.77(m,1H),2.70-2.55(m,1H),1.47(s,9H),1.32-1.19(m,7H)。
中间体S3-4：1-((7-(叔丁氧基羰基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)环丙烷甲酸
在氮气气氛下，向叔丁基2-((1-(乙氧基羰基)环丙基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯(S3-3)(100mg，0.235mmol)在四氢呋喃(1mL)、甲醇(2mL)和水(1mL)中的溶液中添加一水氢氧化锂(40mg，0.953mmol)。在室温搅拌过夜后，将反应在35℃浓缩，得到残余物，将该残余物通过C18柱(乙腈:水＝30％至90％)纯化，得到呈浅呈黄色固体的所需化合物(88mg)。LC-MS(ESI)：RT＝1.24min，C16H25N3O4S的计算质量355.2，m/z实测值356.2[M+H]+。
使用与S3-4相同的条件由S3-3A制备中间体S3-4A。LC-MS(ESI)：RT＝1.21min，C16H25N3O4S的计算质量355.2，m/z实测值356.1[M+H]+。
使用与S3-4相同的条件由S3-3B制备中间体S3-4B。LC-MS(ESI)：RT＝1.24min，C16H25N3O4S的计算质量355.2，m/z实测值356.1[M+H]+。
中间体S3：1-((3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)环丙烷甲酸盐酸盐
在氮气气氛下，向1-((7-(叔丁氧基羰基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)环丙烷甲酸(S3-4)(88mg，0.235mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液中添加在乙酸乙酯中的4M盐酸(2mL，8mmol)。在室温搅拌1小时后，将反应混合物浓缩，得到呈白色固体的标题化合物(63mg，78％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ4.67-4.63(m,0.5H),4.62-4.60(m,0.5H),4.21-4.12(m,1H),3.99-3.88(m,3H),3.59-3.34(m,4H),3.06-2.85(m,2H),1.31-1.26(m,2H),1.18-1.13(m,2H)。
使用与中间体S3相同的条件由S3-4A制备中间体S3A。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.61-12.13(m,1H),10.14-9.27(m,2H),4.37-4.33(m,1H),4.25-4.11(m,1H),3.85-3.78(m,2.4H),3.73-3.65(m,0.6H),3.40-3.29(m,4H),2.87-2.69(m,2H),1.18-1.10(m,2H),1.09-1.02(m,2H)。
使用与中间体S3相同的条件由S3-4B制备中间体S3B。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.77-12.05(m,1H),10.16-9.64(m,2H),4.39-4.32(m,1H),4.26-4.15(m,1H),3.85-3.77(m,2.4H),3.72-3.65(m,0.6H),3.47-3.29(m,4H),2.85-2.70(m,2H),1.16-1.14(m,2H),1.07-1.01(m,2H)。
化合物5：1-((7-((6-(2-氯-3-氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)环丙烷甲酸(两种非对映体的混合物)
Figure BDA0003122494520000961
在氮气气氛下，向乙基6-(溴甲基)-4-(2-氯-3-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(H1-1A)(110mg，0.216mmol)在四氢呋喃(3ml)中的溶液中添加1-((3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)环丙烷甲酸盐酸盐(S3)(63mg，0.194mmol)和三乙胺(110mg，1.09mmol)。在40℃在氮气气氛下搅拌2.5小时并且然后在室温搅拌过夜后，将反应混合物用水(10mL)稀释并且用乙酸乙酯(10mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩，得到残余物，将该残余物通过C18柱(乙腈:水＝40％至70％)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(24.2mg，17％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.723min，C28H30ClFN6O4S2的计算质量632.1，m/z实测值633.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.85(d,J＝3.2Hz,1H),7.64(d,J＝3.2Hz,1H),7.22-7.14(m,2H),7.06-7.02(m,1H),6.13(s,0.4H),6.12(s,0.6H),4.41-4.37(m,0.6H),4.34-4.30(m,0.4H),4.05-3.90(m,4H),3.85-3.70(m,4H),3.34-3.25(m,1.2H),3.18-3.13(m,0.8H),2.99-2.94(m,0.4H),2.87-2.81(m,1H),2.79-2.66(m,0.6H),2.36-2.30(m,0.5H),2.24-2.05(m,1.5H),1.21-1.15(m,2H),1.07-0.99(m,5H)。
化合物6：3-((S)-2-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-6-硫氧代六氢-2H-吡嗪并[1,2-c]嘧啶-7(6H)-基)-2,2-二甲基丙酸
Figure BDA0003122494520000971
中间体S4的制备：
(S)-2,2-二甲基-3-(6-硫氧代六氢-1H-吡嗪并[1,2-c]嘧啶-7(2H,6H,8H)-基)丙酸盐酸盐
Figure BDA0003122494520000981
中间体S4-1：(S)-2-(哌嗪-2-基)乙醇
向(S)-2-(4-苄基哌嗪-2-基)乙醇(1.50g，6.82mmol，目录号477220-33-0)在甲醇(30mL)中的溶液中添加10％wt钯碳(500mg)。将反应混合物在室温在氢气气氛(50psi)下搅拌过夜。然后将其过滤并浓缩，得到呈白色无色油状物的标题化合物(900mg，92％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝0.31min，C6H14N2O的计算质量130.1，m/z实测值131.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.84-3.74(m,1H),3.69-3.66(m,1H),2.99-2.91(m,2.3H),2.84-2.61(m,4.1H),2.55-2.49(m,0.6H),1.70-1.67(m,1H),1.60-1.56(m,1H)。
中间体S4-2：(S)-叔丁基3-(2-羟基乙基)哌嗪-1-甲酸酯
在-10℃，向(S)-2-(哌嗪-2-基)乙醇二盐酸盐S4-1(750mg，3.33mmol)在甲醇(15mL)中的溶液中添加三乙胺(660mg，6.53mmol)和二叔丁基碳酸酯(654mg，3.00mmol)。然后将混合物温热至0℃并搅拌过夜。将混合物蒸发，得到残余物，将该残余物用二氯甲烷(20mL)稀释并用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩，得到呈黄色油状物的标题化合物(800mg，83％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.19min，C11H22N2O3的计算质量230.2，m/z实测值231.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ3.86-3.83(m,2H),3.80-3.77(m,2H),3.58-3.55(m,2H),2.84-2.81(m,1H),2.76-2.73(m,1H),2.65-2.54(m,3H),1.52-1.47(m,2H),1.36(s,9H)。
中间体S4-3：(S)-1-苄基4-叔丁基2-(2-羟基乙基)哌嗪-1,4-二甲酸酯
在0℃，向(S)-叔丁基3-(2-羟基乙基)哌嗪-1-甲酸酯S4-2(800mg，2.78mmol)和碳酸氢钠(2.60g，13.9mmol)在四氢呋喃(10mL)和水(5mL)中的溶液中添加氯甲酸苄酯(709mg，4.17mmol)。在室温搅拌过夜后，将混合物用水(50mL)稀释并用乙酸乙酯(30mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩，得到残余物，将该残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)纯化，得到呈无色油状物的标题化合物(760mg，75％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.58min，C19H28N2O5的计算质量364.2，m/z实测值365.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39-7.32(m,5H),5.16(s,2H),4.36(s,1H),3.95-3.93(m,2H),3.65-3.59(m,1H),3.37-2.83(m,5H),1.87-1.81(m,2H),1.48(s,9H)。
中间体S4-4：(S)-1-苄基4-叔丁基2-(2-氧代乙基)哌嗪-1,4-二甲酸酯
在-78℃，向草酰氯(619mg，4.88mmol)在二氯甲烷(15mL)中的溶液中添加二甲亚砜(533mg，6.83mmol)在二氯甲烷(50mL)中的溶液。在-78℃搅拌1小时后，在-78℃添加(S)-1-苄基4-叔丁基2-(2-羟基乙基)哌嗪-1,4-二甲酸酯S4-3(750mg，1.95mmol)的溶液。在-78℃搅拌3小时后，逐滴添加三乙胺(1.50g，14.6mmol)以淬灭该反应。使反应混合物温热至室温并且用二氯甲烷(30mL)萃取三次。将合并的有机层经无水Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩，得到呈浅黄色油状物的标题化合物(750mg，95％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.59min，C19H26N2O5的计算质量362.2，m/z实测值363.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.74(s,1H),7.39-7.30(m,5H),5.14(s,2H),4.74-4.71(m,1H),4.11-3.97(m,3H),3.05-2.84(m,2H),2.83-2.74(m,2H),2.61-2.57(m,1H),1.46(s,9H)。
中间体S4-5：(S)-1-苄基4-叔丁基2-(2-((3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)氨基)-乙基)哌嗪-1,4-二甲酸酯
在室温，向乙基3-氨基-2,2-二甲基丙酸酯盐酸盐(378mg，2.08mmol)在乙醇(5mL)中的溶液中添加三乙胺(263mg，2.60mmol)。在室温在氮气气氛下搅拌0.5小时后，添加(S)-1-苄基4-叔丁基2-(2-氧代乙基)哌嗪-1,4-二甲酸酯S4-4(750mg，1.86mmol)在乙醇(5mL)中的溶液。将混合物在室温搅拌1小时，然后在0℃添加氰基硼氢化钠(269mg，4.28mmol)。在室温搅拌2小时后，将混合物用冰水(5mL)淬灭，真空下浓缩。将残余物用水(15mL)稀释并且用乙酸乙酯(20mL)萃取三次。将合并的有机层经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩，得到残余物，将该残余物通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇＝30:1)纯化，得到呈无色油状物的标题化合物(600mg，66％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.89min，C26H41N3O6的计算质量491.3，m/z实测值492.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39-7.29(m,5H),5.14(s,2H),4.27-4.13(m,1H),4.12-4.09(q,J＝7.2Hz,2H),4.08-3.94(m,2H),3.06-3.00(m,2H),2.95-2.79(m,2H),2.62-2.57(m,4H),1.75-1.69(m,2H),1.45(s,9H),1.23(t,J＝7.2Hz,3H),1.15(s,6H)。
中间体S4-6：(S)-叔丁基3-(2-((3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)氨基)乙基)哌嗪-1-甲酸酯
在氮气气氛下，向(S)-1-苄基4-叔丁基2-(2-((3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)氨基)乙基)哌嗪-1,4-二甲酸酯S4-5(600mg，1.16mmol)在乙醇(10mL)中的溶液中添加20％氢氧化钯碳(300mg)。在50℃在氢气气氛(60psi)下搅拌过夜后，将混合物冷却至室温。然后将催化剂滤出，并且将滤液浓缩，得到呈黄色油状物的标题化合物(430mg，93％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.66min，C18H35N3O4的计算质量357.3，m/z实测值358.4[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.12(q,J＝7.2Hz,2H),3.92(br s,2H),2.96-2.94(m,1H),2.85-2.78(m,2H),2.75-2.61(m,6H),2.28(br s,2H),1.57-1.51(m,2H),1.46(s,9H),1.25(t,J＝7.2Hz,3H),1.19(s,6H)。
中间体S4-7：(S)-叔丁基7-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-6-硫氧代六氢-1H-吡嗪并[1,2-c]嘧啶-2(6H)-甲酸酯
在0℃，在氮气气氛下，向(S)-叔丁基3-(2-((3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)氨基)乙基)哌嗪-1-甲酸酯S4-6(330mg，90％纯度，0.83mmol)和三乙胺(268mg，2.66mmol)在二氯甲烷(25mL)中的溶液中添加硫光气(153mg，1.33mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液。在室温搅拌过夜后，将混合物用冰水(10mL)稀释并且用二氯甲烷(20mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩，得到残余物，将该残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)纯化，得到呈黄色油状物的标题化合物(135mg，41％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.73min，C19H33N3O4S的计算质量399.2，m/z实测值400.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.42-5.39(m,1H),4.37-4.29(m,2H),4.14(q,J＝6.8Hz,2H),3.97-3.93(m,2H),3.46-3.38(m,1H),3.28-3.25(m,2H),3.07-2.99(m,2H),2.63-2.60(m,1H),2.14-2.09(m,1H),1.75-1.66(m,1H),1.47(s,9H),1.29-1.26(m,9H)。
中间体S4-8：(S)-3-(2-(叔丁氧基羰基)-6-硫氧代六氢-1H-吡嗪并[1,2-c]嘧啶-7(2H,6H,8H)-基)-2,2-二甲基丙酸
在氮气气氛下，向(S)-叔丁基7-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-6-硫氧代六氢-1H-吡嗪并[1,2-c]嘧啶-2(6H)-甲酸酯S4-7(170mg，0.405mmol)在甲醇(3mL)和水(1mL)中的溶液中添加氢氧化钠(51mg，1.28mmol)。在40℃搅拌过夜后，将反应浓缩，得到残余物，将该残余物用水(5mL)稀释并用1N盐酸水溶液酸化至pH约为3。将水相用乙酸乙酯(20mL)萃取三次。将合并的有机层经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩，得到呈黄色固体的所需化合物(130mg，78％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.17min，C17H29N3O4S的计算质量371.2，m/z实测值370.3[M-H]-。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.40-5.37(m,1H),4.40-3.96(m,2H),4.02-3.96(m,2H),3.45-3.40(m,1H),3.37-3.34(m,2H),3.07-3.02(m,2H),2.60(br s,1H),2.18-2.11(m,1H),1.76-1.72(m,1H),1.47(s,9H),1.31(m,6H)。
中间体S4：(S)-2,2-二甲基-3-(6-硫氧代六氢-1H-吡嗪并[1,2-c]嘧啶-7(2H,6H,8H)-基)丙酸盐酸盐
在氮气气氛下，向(S)-3-(2-(叔丁氧基羰基)-6-硫氧代六氢-1H-吡嗪并[1,2-c]嘧啶-7(2H,6H,8H)-基)-2,2-二甲基丙酸S4-8(130mg，0.315mmol)在1,4-二噁烷(2mL)中的溶液中添加在1,4-二噁烷(2mL)中的4M盐酸。在室温在氮气气氛下搅拌2小时后，将反应混合物浓缩，得到呈黄色固体的标题化合物(102mg，95％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.56-5.52(m,1H),4.26(d,J＝14.0Hz,1H),4.16(d,J＝14.0Hz,1H),3.78-3.72(m,1H),3.40-3.36(m,1H),3.34-3.27(m,3H),3.17-3.13(m,1H),3.06-2.99(m,1H),2.82-2.76(t,J＝12.4Hz,1H),2.20-2.14(m,1H),1.74-1.65(m,1H),1.16(s,3H),1.15(s,3H)。化合物6：3-((S)-2-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-6-硫氧代六氢-1H-吡嗪并[1,2-c]嘧啶-7(2H,6H,8H)-基)-2,2-二甲基丙酸
Figure BDA0003122494520001021
在氮气气氛下，向(S)-乙基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(H2-1A)(106mg，0.205mmol)在四氢呋喃(3ml)中的溶液中添加(S)-2,2-二甲基-3-(6-硫氧代六氢-1H-吡嗪并[1,2-c]嘧啶-7(2H,6H,8H)-基)丙酸盐酸盐S4(70mg，0.205mmol)和三乙胺(80mg，0.792mmol)。在40℃在氮气气氛下搅拌2小时后，将反应混合物用水(10mL)稀释并且用乙酸乙酯(10mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩，得到残余物，将该残余物通过制备型HPLC(柱：Waters Xbrige C18(5μm 19*150mm)，流动相A：水(0.1％碳酸氢铵)，流动相B：乙腈；UV：214nm：流速：15mL/min，梯度：20％-50％(％B))纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(30mg，98.5％纯度，23％产率，99.6％立体纯)。LC-MS(ESI)：RT＝3.764min，C30H37FN6O4S2的计算质量628.2，m/z实测值629.3[M+H]+。手性HPLC(柱：Chiralpak IE,5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:TFA＝60:40:0.2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm；RT＝8.668min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.54(s,1H),7.81(d,J＝3.2Hz,1H),7.41(d,J＝3.2Hz,1H),7.08-7.02(m,1H),6.99-6.97(m,1H),6.90(t,J＝8.4Hz,1H),6.02(s,1H),5.50-5.47(m,1H),4.38-4.35(m,2H),4.09-4.02(m,3H),3.89(d,J＝16.8Hz,1H),3.72-3.65(m,1H),3.41-3.38(m,2H),3.26-3.21(m,1H),2.91-2.88(m,1H),2.80-2.77(m,1H),2.55(s,3H),2.41(t,J＝9.2Hz,1H),2.29(t,J＝10.8Hz,1H),2.18-2.13(m,1H),1.82-1.78(m,1H),1.33(s,6H),1.12(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物6A：3-((R)-2-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-6-硫氧代六氢-2H-吡嗪并[1,2-c]嘧啶-7(6H)-基)-2,2-二甲基丙酸
Figure BDA0003122494520001031
中间体S4A的制备：
Figure BDA0003122494520001041
中间体S4A-1：(R)-甲基4-(苄基(2-乙氧基-2-氧代乙基)氨基)-3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代丁酸酯
在0℃，向(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-甲氧基-4-氧代丁酸(10g，40.4mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(80mL)中的溶液中添加2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(16.9g，44.4mmol)、N,N-二异丙基乙胺(7.84g，60.7mmol)和2-(苄基氨基)乙酸乙酯(8.6g，44.5mmol)。在室温搅拌过夜后，将混合物倒入水(200mL)中，并用乙酸乙酯(100mL)萃取两次。将合并的有机层用水(100mL)和盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝20:1至5:1)纯化，得到呈无色油状物的标题化合物(17.3g，由1H NMR得到的纯度为95％，96％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.66min，C21H30N2O7的计算质量422.2，m/z实测值423.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37-7.25(m,4.4H),7.20-7.16(m,0.6H),5.51(d,J＝9.2Hz,0.6H),5.43(d,J＝10.0Hz,0.4H),5.20-5.12(m,0.6H),4.87-4.83(m,1H),4.74(d,J＝14.8Hz,0.4H),4.63(d,J＝16.4Hz,0.6H),4.57(d,J＝14.8Hz,0.4H),4.33-4.28(m,0.4H),4.20-4.05(m,3H),3.86-3.82(m,0.6H),3.70(s,1.8H),3.69(s,1.2H),2.87-2.80(m,1H),2.73-2.66(m,1H),1.43(s,3.6H),1.34(s,5.4H),1.28-1.22(m,3H)。
中间体中间体S4A-2：(R)-甲基2-(4-苄基-3,6-二氧代哌嗪-2-基)乙酸酯
在0℃，向(R)-甲基4-(苄基(2-乙氧基-2-氧代乙基)氨基)-3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代丁酸酯中间体S4A-1(17g，95％纯度，38.2mmol)在二氯甲烷(169mL)中的溶液中逐滴添加三氟乙酸(34mL)。在室温搅拌1小时后，将混合物减压浓缩，得到残余物，将该残余物溶解在甲醇(169mL)中。将所得溶液用三乙胺碱化至pH约为8。在室温搅拌过夜后，将反应混合物减压浓缩，以除去挥发性物质。将残余物溶解在二氯甲烷(200mL)中，用水(100mL)洗涤三次。将有机层经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇＝50:1至10:1)纯化，得到呈黄色油状物的标题化合物(10g，由1H NMR得到的纯度为95％，90％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.26min，C14H16N2O4的计算质量276.1，m/z实测值277.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37-7.23(m,5H),4.60(s,2H),4.39(d,J＝6.0Hz,1H),3.91(d,J＝17.6Hz,1H),3.82(d,J＝17.6Hz,1H),3.68(s,3H),3.06(d,J＝3.6Hz,0.4H),3.02(d,J＝3.6Hz,0.6H),2.90(d,J＝7.6Hz,0.6H),2.86(d,J＝7.6Hz,0.4H)。
中间体S4A-3：(R)-2-(4-苄基哌嗪-2-基)乙醇
在0℃，经1小时向(R)-甲基2-(4-苄基-3,6-二氧代哌嗪-2-基)乙酸酯中间体S4A-2(9g，95％纯度，30.9mmol)在四氢呋喃(250mL)中的溶液中分批添加氢化铝锂(9.8g，258mmol)。在80℃搅拌过夜后，将反应混合物冷却至0℃并用10％氯化铵水溶液(9mL)淬灭。将所得的混合物过滤，并将滤液减压浓缩，得到残余物。将残余物溶解在二氯甲烷(200mL)中，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液减压浓缩，得到呈黄色油状物的标题化合物(5.4g，由1H NMR得到的纯度为90％，71％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.12min，C13H20N2O的计算质量220.2，m/z实测值221.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.32-7.23(m,5H),3.60-3.59(m,2H),3.55-3.48(m,2H),2.93-2.73(m,5H),2.07(dt,J＝11.2Hz,3.6Hz,1H),1.80(t,J＝10.8Hz,1H),1.63-1.48(m,2H)。
类似于中间体S4制备中间体S4A。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.43(br s,1H),9.08(s,2H),5.41-5.38(m,1H),4.27(d,J＝13.6Hz,1H),4.16(d,J＝14.0Hz,1H),3.80-3.72(m,1H),3.27-3.16(m,5H),2.93-2.82(m,2H),2.18-2.08(m,1H),1.74-1.66(m,1H),1.16(s,6H)。
类似于化合物6制备化合物6A。LC-MS(ESI)：RT＝3.601min，C30H37FN6O4S2的计算质量628.2，m/z实测值629.3[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:TFA＝60:40:0.2，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝10.549min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.51(s,1H),7.81(d,J＝3.2Hz,1H),7.42(d,J＝3.2Hz,1H),7.10-7.05(m,1H),7.00-6.98(m,1H),6.91(t,J＝8.8Hz,1H),6.01(s,1H),5.57-5.53(m,1H),4.37(s,2H),4.10-3.98(m,3H),3.91(d,J＝17.2Hz,1H),3.69-3.62(m,1H),3.37-3.35(m,2H),3.29-3.22(m,1H),2.96-2.93(m,1H),2.78-2.75(m,1H),2.58-2.52(m,4H),2.18-2.05(m,2H),1.76-1.68(m,1H),1.33(s,6H),1.12(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物7：3-(3-(氰基亚甲基)-7-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(2种非对映体的混合物)
Figure BDA0003122494520001061
中间体S5的制备：
Figure BDA0003122494520001071
中间体S5-1：乙基2-氰基亚氨酰乙酸酯盐酸盐
在0℃，向丙二腈(3.00g，45.4mmol)和乙醇(2.09g，45.4mmol)在二乙醚(15mL)中的溶液中添加在二乙醚中的6M盐酸(10mL，60mmol)。在0℃搅拌0.5小时后，将混合物温热至室温并且在室温搅拌过夜。将其过滤，并将滤饼用冷却的二乙醚(20mL)洗涤两次，然后悬浮于二乙醚(20mL)中，并再次过滤，然后干燥，得到呈白色固体的标题化合物(6.13g，由1HNMR得到的纯度为70％，64％产率)，将其不经进一步纯化而用于下一步骤。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.20-4.14(m,2H),4.03(s,2H),1.24-1.20(m,3H)。
中间体S5-2：叔丁基3-(氰基亚甲基)-2-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯
向乙基2-氰基亚氨酰乙酸酯盐酸盐S5-1(710mg，3.345mmol)和三乙胺(450mg，4.447mmol)在乙腈(20mL)中的溶液中添加叔丁基3-(((2,2-二甲基-3-氧代-3-丙氧基丙基)氨基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯S1-4(500mg，1.17mmol)。在50℃搅拌过夜后，将混合物浓缩，得到残余物，将该残余物用乙酸乙酯(15mL)稀释，用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液在真空中浓缩，得到残余物，将该残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)纯化，得到呈黄色油状物的标题化合物(244mg，48％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.52min，C20H32N4O4的计算质量392.2，m/z实测值396.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)4.57(d,J＝12.0Hz,0.6H),4.29-4.22(m,0.4H),4.18-4.00(m,3.4H),3.90-3.87(m,0.6H),3.46-3.34(m,2.4H),3.21-2.81(m,5.6H),2.71-2.58(m,1H),1.47(s,9H),1.31-1.26(m,6H),1.21(s,3H)。
中间体S5-3：乙基3-(3-(氰基亚甲基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸酯盐酸盐
在0℃，向叔丁基3-(氰基亚甲基)-2-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯S5-2(123mg，0.282mmol)在二氯甲烷(1mL)中的溶液中添加在二乙醚中的6M盐酸(3mL，18mmol)。在室温搅拌2小时后，将反应混合物浓缩，得到呈黄色固体的标题化合物(96mg，99％产率)，将其不经进一步纯化而用于下一步骤。LC-MS(ESI)：RT＝0.95min，C15H25ClN4O2的计算质量328.2，m/z实测值293.4[M-HCl+H]+。
中间体S5：(4S)-乙基6-((3-(氰基亚甲基)-2-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-基)甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
在室温，向乙基3-(3-(氰基亚甲基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸酯盐酸盐S5-3(96mg，0.280mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中的溶液中添加(S)-乙基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(H2-1A)(100mg，0.205mmol)、N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(225mg，1.74mmol)。在室温搅拌3小时后，将混合物倒入水(20mL)中，用乙酸乙酯(20mL)萃取两次。将合并的有机层用水(10mL)、盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩，得到残余物，将该残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚:丙酮＝10:1至5:1)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(71mg，48％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.84min，C33H40FN7O4S的计算质量649.3，m/z实测值650.2[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)9.48-9.43(m,1H),7.82(d,J＝2.8Hz,1H),7.43(d,J＝3.2Hz,1H),7.12-7.06(m,1H),6.99-6.97(m,1H),6.93-6.88(m,1H),6.05-6.01(m,1H),4.72-4.60(m,0.6H),4.18-3.87(m,6.4H),3.76-3.58(m,1H),3.46-3.30(m,2H),3.21-3.02(m,2.6H),2.97-2.70(m,3H),2.59-2.50(m,3.4H),2.48-2.31(m,1H),2.22-2.15(m,1H),1.33-1.21(m,9H),1.12(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物7：3-(3-(氰基亚甲基)-7-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(2种非对映体的混合物)
Figure BDA0003122494520001091
向(4S)-乙基6-((3-(氰基亚甲基)-2-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-基)甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯S5(71mg，0.079mmol)在乙醇(0.9mL)和水(0.3mL)中的溶液中添加一水氢氧化锂(19mg，0.453mmol)。在室温搅拌过夜后，将混合物浓缩并且用水(15mL)稀释，用0.1M盐酸水溶液调节至pH约为5-6，用乙酸乙酯(20mL)萃取两次。将合并的有机层浓缩，得到残余物，将该残余物通过制备型HPLC(柱：Waters Xbrige C18(5μm 19*150mm)，流动相A：水(0.1％氢氧化铵)，流动相B：乙腈；UV：214nm：流速：15mL/min，梯度：15％-45％(％B))纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(4.9mg，93.6％纯度，8％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.554min，C31H36FN7O4S的计算质量621.3，m/z实测值621.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)12.26(brs,1H),9.59-9.51(m,1H),8.04-7.92(m,2H),7.22-7.15(m,1H),7.06-7.01(m,2H),5.88(s,1H),4.47(d,J＝12.8Hz,0.6H),4.04-3.91(m,4.4H),3.75(s,0.6H),3.62-3.50(m,1.4H),3.43-3.37(m,2H),3.24-3.17(m,2H),2.99-2.90(m,3H),2.45(s,3H),2.39-2.33(m,1H),2.14-2.04(m,1H),1.18-1.04(m,9H)。
化合物8：(S)-3-(3-(乙酰亚氨基)-7-((5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(2种非对映体的混合物)
Figure BDA0003122494520001101
中间体S6的制备
Figure BDA0003122494520001102
中间体S6-1：叔丁基2-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-3-亚氨基六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯氢溴酸盐
在室温，向叔丁基3-(((3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)氨基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯S1-4(1.6g，4.19mmol)在二氯甲烷(2mL)中的混合物中逐滴添加溴化氰(666mg，6.29mmol)在二氯甲烷(2mL)中的溶液。在室温搅拌过夜后，将混合物过滤，并将残余物用石油醚洗涤。将滤饼减压浓缩，得到呈白色固体的标题化合物(1.61g，77％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.732min，C18H32N4O4的计算质量368.2，m/z实测值369.2[M+H]+。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.37(s,2H),4.14(q,J＝6.9Hz,3H),4.00-3.90(m,2H),3.87-3.71(m,1H),3.64(t,J＝9.6Hz,1H),3.56-3.45(m,2H),3.20-3.05(m,2H),2.95-2.67(m,1H),1.44(s,9H),1.25(t,J＝6.9Hz,3H),1.20(s,6H)。
中间体S6-2：叔丁基3-(乙酰亚氨基)-2-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯
在室温，向叔丁基2-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-3-亚氨基六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯氢溴酸盐S6-1(245mg，0.436mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三乙胺(140mg，1.38mmol)和乙酰氯(35mg，0.446mmol)。在室温搅拌1小时后，将混合物倒入水(30mL)中并且用二氯甲烷(30mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经无水Na2SO4(固体)干燥，过滤并在真空中浓缩，得到呈棕色油状物的标题化合物(190mg，96％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.460min，C20H34N4O5的计算质量410.3，m/z实测值411.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.42-4.34(m,1H),4.18-4.13(m,4H),3.99-3.92(m,2H),3.65-3.55(m,2H),3.31-3.19(m,2H),2.99-2.75(m,2H),2.35(s,3H),1.46(s,9H),1.30-1.24(m,9H)。
中间体S6-3：叔丁基3-(乙酰亚氨基)-2-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯
将叔丁基3-(乙酰亚氨基)-2-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯S6-2(190mg，0.417mmol)在四氢呋喃(3mL)和甲醇(3mL)中的混合物添加至一水氢氧化锂(40mg，0.953mmol)在水(1mL)中的溶液中。将反应混合物在室温在氮气气氛下搅拌1小时。然后将该反应混合物用0.5M盐酸水溶液酸化至pH＝5。将混合物用乙酸乙酯(15mL)萃取三次，并且将合并的有机层在真空中浓缩，得到呈黄色油状物的标题化合物(120mg，56％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.068min，C18H30N4O5的计算质量382.2，m/z实测值383.2[M+H]+。
中间体S6：3-(3-(乙酰亚氨基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸盐酸盐
在室温，将叔丁基3-(乙酰亚氨基)-2-(3-乙氧基-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯S6-3(120mg，0.235mmol)在3M盐酸(在1,4-二噁烷中)(7mL，21mmol)中的溶液搅拌30分钟。将混合物在真空中浓缩，得到呈棕色固体的标题化合物(80mg，90％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝0.226min，C13H22N4O3的计算质量282.2，m/z实测值283.2[M+H]+。
化合物8：(S)-3-(3-(乙酰亚氨基)-7-((5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(2种非对映体的混合物)
Figure BDA0003122494520001121
在室温，向3-(3-(乙酰亚氨基)六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸盐酸盐S6(60mg，0.159mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(150mg，1.16mmol)和(S)-乙基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(H2-1A)(65mg，0.141mmol)。在室温搅拌过夜后，将混合物浓缩并且通过C18柱(乙腈:水＝5％至95％)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(6.7mg，95.1％纯度，7％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.522min，C31H38FN7O5S的计算质量639.3，m/z实测值640.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.82-7.81(m,1H),7.62(d,J＝3.2Hz,1H),7.04-6.98(m,2H),6.85-6.80(m,1H),5.87(s,0.3H),5.86(s,0.7H),4.15-4.03(m,2H),3.95(q,J＝7.2Hz,2H),3.87-3.71(m,2H),3.55-3.42(m,2H),3.36-3.28(m,3H),3.10-3.03(m,0.5H),2.95-2.88(m,1.5H),2.45-2.36(m,4H),2.26-2.20(m,1H),1.99(s,2H),1.97(s,1H),2.11-2.11(m,2H),1.09(s,4H),1.02(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物9A：1-((7-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)环丙烷甲酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001131
在氮气气氛下，向(S)-乙基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(H2-1A)(90mg，0.185mmol)在四氢呋喃(4ml)中的溶液中添加1-((3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)环丙烷甲酸盐酸盐S3-A(56mg，0.173mmol)和三乙胺(133mg，0.891mmol)。在40℃在氮气气氛下搅拌2.5小时并且然后在室温搅拌过夜后，将反应混合物用水(10mL)稀释并且用乙酸乙酯(10mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩，得到残余物，该残余物通过C18柱(乙腈:水＝40％至70％)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(19mg，16％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.924min，C29H33FN6O4S2的计算质量612.2，m/z实测值613.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.81(d,J＝3.2Hz,1H),7.61(d,J＝3.2Hz,1H),7.05-6.98(m,2H),6.84-6.80(m,1H),5.87(s,1H),4.32-4.29(m,1H),4.03-3.92(m,4H),3.89-3.79(m,4H),3.37-3.31(m,1H),3.16-3.13(m,1H),2.96-2.93(m,1H),2.67-2.64(m,1H),2.41(s,3H),2.22-2.13(m,2H),1.08-1.07(m,2H),1.02(t,J＝6.8Hz,3H),0.87-0.86(m,2H)。
化合物9B：1-((7-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)环丙烷甲酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001141
在与9A相同的条件下由中间体H2-1A和S3-B制备这种化合物。LC-MS(ESI)：RT＝3.890min，C29H33FN6O4S2的计算质量612.2，m/z实测值613.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.94(d,J＝3.2Hz,1H),7.73(d,J＝3.2Hz,1H),7.18-7.10(m,2H),6.96-6.92(m,1H),5.99(s,1H),4.52-4.49(m,1H),4.15-4.03(m,4H),3.97-3.89(m,3H),3.88-3.81(m,1H),3.41-3.36(m,1H),3.32-3.27(m,1H),3.01-2.88(m,2H),2.52(s,3H),2.48-2.41(m,1H),2.19-2.13(m,1H),1.22-1.19(m,2H),1.13(t,J＝7.2Hz,3H),1.03-0.94(m,2H)。
化合物10B：3-(-7-((6-(3-氟-2-甲基苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001151
在室温，向甲基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(H4-1B)(100mg，90％纯度，0.212mmol)在二氯甲烷(6mL)中的溶液中添加2,2-二甲基-3-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丙酸盐酸盐S1-A(69mg，90％纯度，0.211mmol)和三乙醇胺(348mg，2.33mmol)。在室温搅拌过夜后，将混合物用乙酸乙酯(30mL)稀释并且用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液减压浓缩，得到残余物，将该残余物通过制备型HPLC(柱：Xtimate C18(10μm 50*250mm)；流动相A：水(0.1％碳酸氢铵)，流动相B：乙腈；UV：254nm：流速：15mL/min，梯度：20％-60％(％B))纯化，得到呈黄色固体的所需产物(42mg，98.7％纯度，33％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.762min，C28H33FN6O4S2的计算质量600.7，m/z实测值601.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.95(d,J＝3.2Hz,1H),7.74(d,J＝3.2Hz,1H),7.18-7.08(m,2H),6.96-6.92(m,1H),5.98(s,1H),4.54-4.51(m,1H),4.13-4.04(m,2H),3.96-3.84(m,3H),3.70(t,J＝10.4Hz,1H),3.62(s,3H),3.30-3.25(m,2H),2.98-2.96(m,1H),2.90-2.87(m,1H),2.53(d,J＝2.0Hz,3H),2.49-2.42(m,1H),2.18(t,J＝10.8Hz,1H),1.22(s,3H),1.21(s,3H)。
化合物11A：3-(7-((6-(2-氯-3,4-二氟苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001161
向2,2-二甲基-3-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丙酸盐酸盐S1-A(50mg，0.153mmol)在四氢呋喃(5mL)中的溶液中添加三乙胺(60mg，0.593mmol)。搅拌5分钟后，添加甲基6-(溴甲基)-4-(2-氯-3,4-二氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(H5-1A)(82mg，0.161mmol)。将混合物在40℃搅拌2.5小时，然后用1M盐酸水溶液酸化至pH＝3并且用乙酸乙酯(10mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩，得到残余物，将该残余物通过制备型HPLC(柱：Gilson Xbrige C18(5μm 19*150mm)；流动相：A：水(+0.1％碳酸氢铵)，流动相B：乙腈；UV：214nm：流速：15mL/min，梯度：20％-60％(％B)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(32.0mg，28％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.512min，C27H29ClF2N6O4S2的计算质量638.1，m/z实测值639.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.94(d,J＝3.2Hz,1H),7.74(d,J＝3.2Hz,1H),7.23-7.20(m,2H),6.15(s,1H),4.52-4.49(m,1H),4.11-3.83(m,5H),3.68(t,J＝9.6Hz,1H),3.59(s,3H),3.30-3.21(m,2H),2.96-2.87(m,2H),2.43(td,J＝11.6,3.2Hz,1H),2.17(t,J＝11.2Hz,1H),1.22(s,3H),1.21(s,3H)。
化合物12B：3-(7-((6-(3,4-二氟-2-甲基苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001171
在室温，向甲基6-(溴甲基)-4-(3,4-二氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(H6-1B)(100mg，90％纯度，0.203mmol)在二氯甲烷(6mL)中的溶液中添加2,2-二甲基-3-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丙酸盐酸盐中间体S1-A(66mg，90％纯度，0.203mmol)和三乙醇胺(334mg，2.24mmol)。在室温搅拌过夜后，将混合物溶解在乙酸乙酯(30mL)中并且用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液减压浓缩，得到残余物，将该残余物通过制备型HPLC(柱：Xtimate C18(10μm 50*250mm)；流动相A：水(0.1％碳酸氢铵)，流动相B：乙腈；UV：254nm：流速：15mL/min，梯度：30％-80％(％B))纯化，得到呈黄色固体的所需产物(18mg，14％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.474min，C28H32F2N6O4S2的计算质量618.7，m/z实测值619.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.95(d,J＝3.2Hz,1H),7.74(d,J＝3.2Hz,1H),7.05-7.02(m,2H),5.93(s,1H),4.54-4.51(m,1H),4.14-4.03(m,2H),3.96(s,0.6H),3.91(s,0.4H),3.88-3.83(m,3H),3.70(t,J＝10.0Hz,1H),3.62(s,3H),3.29-3.25(m,2H),2.98-2.95(m,1H),2.88-2.86(m,1H),2.57(d,J＝2.4Hz,3H),2.49-2.42(m,1H),2.18(t,J＝10.8Hz,1H),1.21(s,3H),1.19(s,3H)。
化合物13A：3-(7-((6-(2-溴-4-氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001181
在室温，向2,2-二甲基-3-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丙酸盐酸盐中间体S1-A(100mg，0.306mmol)在四氢呋喃(10mL)中的溶液中添加三乙胺(149mg，1.48mmol)和乙基4-(2-溴-4-氟苯基)-6-(溴甲基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(H7-1A)(200mg，0.358mmol)。在室温在氮气气氛下加热过夜后，将反应混合物用水(20mL)缓慢淬灭并且用乙酸乙酯(20mL)萃取三次。将分离的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物，将该残余物通过制备型HPLC(柱：watersXbrigeC18(5μm 19*150mm)，流动相A：水(0.1％碳酸氢铵)，流动相B：乙腈；UV：214nm：流速：15mL/min，梯度：20％-60％(％B))纯化，得到呈黄色固体的所需产物(70mg，29％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.865min，C28H32BrFN6O4S2的计算质量678.1，m/z实测值679.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.63(br s,1H),8.03(d,J＝2.8Hz,1H),7.95(d,J＝2.8Hz,1H),7.59-7.56(m,1H),7.42-7.39(m,1H),7.26-7.22(m,1H),6.03(s,1H),4.36(d,J＝14.4Hz,1H),4.00-3.93(m,5H),3.77(d,J＝2.8Hz,2H),3.64(t,J＝10.0Hz,1H),3.18-3.13(m,2H),2.96-2.91(m,2H),2.29-2.24(m,1.6H),2.10-2.05(m,1.4H),1.13(s,6H),1.05(t,J＝6.8Hz,3H)。
化合物14：3-(7-((6-(2-氯-3,4-二氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(2种非对映体的混合物)
Figure BDA0003122494520001191
在室温，向乙基6-(溴甲基)-4-(2-氯-3,4-二氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯H8-1(95mg，0.199mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加2,2-二甲基-3-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丙酸盐酸盐S1-A(58mg，0.197mmol)、三乙醇胺(90mg，0.604mmol)。在40℃搅拌过夜后，将混合物减压浓缩，得到残余物，将该残余物通过C18柱(乙腈:水＝20％至40％)纯化，得到呈黄色固体的所需化合物(34.6mg，98.8％纯度，26％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.747min，C28H31ClF2N6O4S2的计算质量652.2，m/z实测值653.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.94(d,J＝2.8Hz,1H),7.74(d,J＝3.2Hz,1H),7.24-7.20(m,2H),6.17(s,0.5H),6.16(s,0.5H),4.52-4.42(m,1H),4.13-4.00(m,4H),3.94-3.86(m,3H),3.77-3.66(m,1H),3.30-3.22(m,2H),3.05-2.78(m,2H),2.45-2.40(m,0.5H),2.32-2.27(m,1H),2.19-2.14(m,0.5H),1.23-1.21(m,6H),1.12(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物14A：3-(7-((6-(2-氯-3,4-二氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001201
在与化合物14相同的条件下由H8-1A和S1-A制备这种化合物，并且通过C18柱(乙腈:水＝20％至40％)纯化，得到呈黄色固体的所需化合物(19.9mg，97.1％纯度，17％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.481min，C28H31ClF2N6O4S2的计算质量652.2，m/z实测值653.2[M+H]+。1HNMR(400MHz,CD3OD)δ7.94(d,J＝3.2Hz,1H),7.74(d,J＝2.8Hz,1H),7.24-7.21(m,2H),6.16(s,1H),4.52-4.48(m,1H),4.11-4.01(m,4H),3.94-3.80(m,3H),3.71-3.66(m,1H),3.30-3.22(m,2H),2.96-2.87(m,2H),2.45-2.39(m,1H),2.19-2.14(m,1H),1.21(s,6H),1.12(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物15A：3-(7-((6-(3,4-二氟-2-甲基苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001211
在40℃，向乙基6-(溴甲基)-4-(3,4-二氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯H9-1A(100mg，0.197mmol)在四氢呋喃(4mL)中的溶液中添加2,2-二甲基-3-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丙酸盐酸盐S1-A(74mg，0.227mmol)和三乙胺(0.14mL，0.97mmol)，持续2小时。然后在室温搅拌过夜，将混合物溶解在乙酸乙酯(10mL)中并用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液减压浓缩，得到残余物，将该残余物通过制备型HPLC(分离条件：柱：Xtimate C18,10μm 50mm*250mm；流动相：乙腈：水(0.1％碳酸氢铵)＝30％-80％，以15mL/min；温度：35℃；波长：254nm)纯化，得到呈黄色固体的所需产物(31mg，97.9％纯度，24％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.710min，C29H34F2N6O4S2的计算质量632.7，m/z实测值633.7[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.95(d,J＝2.8Hz,1H),7.74(d,J＝3.2Hz,1H),7.10-7.00(m,2H),5.94(s,1H),4.53(d,J＝14.8Hz,1H),4.14-4.02(m,4H),3.97-3.87(m,3H),3.70(t,J＝10.0Hz,1H),3.30-3.23(m,2H),2.98(d,J＝11.2Hz,1H),2.89(d,J＝6.8Hz,1H),2.58(s,1.5H),2.57(s,1.5H),2.45(td,J＝11.2,3.6Hz,1H),2.18(t,J＝10.0Hz,1H),1.24(s,3H),1.23(s,3H),1.15(t,J＝6.8Hz,3H)。
化合物15B：3-(7-((6-(3,4-二氟-2-甲基苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001221
使用与化合物15A相同的条件，由H9-1B和S1-A制备这种化合物，并通过制备型HPLC(分离条件：柱：Xtimate C18,10μm 50mm*250mm；流动相：乙腈：水(0.1％碳酸氢铵)＝30％-80％，以15mL/min；温度：35℃；波长：254nm)纯化，得到呈黄色固体的所需产物(30mg，98.2％纯度，24％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.539min，C29H34F2N6O4S2的计算质量632.7，m/z实测值633.7[M+H]+。1HNMR(400MHz,CD3OD)δ7.93(d,J＝3.2Hz,1H),7.73(d,J＝2.8Hz,1H),7.07-6.97(m,2H),5.92(s,1H),4.53(d,J＝14.4Hz,1H),4.14-4.03(m,4H),3.93-3.88(m,3H),3.75(t,J＝9.6Hz,1H),3.29-3.25(m,2H),3.04(d,J＝10.0Hz,1H),2.78(d,J＝11.2Hz,1H),2.55(s,3H),2.34-2.24(m,2H),1.24(s,3H),1.23(s,3H),1.13(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物16A：3-(7-((6-(2-溴-4-氟苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001231
在室温，向2,2-二甲基-3-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丙酸盐酸盐S1-A(126mg，0.386mmol)在四氢呋喃(5mL)中的溶液中添加三乙胺(195mg，1.93mmol)和甲基4-(2-溴-4-氟苯基)-6-(溴甲基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯H10-1A(210mg，0.386mmol)。在室温在氮气气氛下搅拌过夜后，将反应混合物用水(20mL)缓慢淬灭并且用乙酸乙酯(20mL)萃取三次。将分离的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物，将该残余物通过C18柱(乙腈:水(0.1％碳酸氢铵)＝05％至95％)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(33mg，99.7％纯度，13％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.095min，C27H30BrFN6O4S2的计算质量664.1，m/z实测值665.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.98-7.90(m,1H),7.78-7.70(m,1H),7.46-7.36(m,2H),7.14-7.04(m,1H),6.14(s,1H),4.53-4.48(m,1H),4.11-4.02(m,2H),3.94-3.85(m,3H),3.68(t,J＝9.6Hz,1H),3.59(s,3H),3.24-3.15(m,2H),2.98-2.86(m,2H),2.48-2.41(m,1H),2.23-2.15(m,1H),1.23(s,6H)。
化合物16B：3-(7-((6-(2-溴-4-氟苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001241
在与化合物16A相同的条件下由H10-1B和S1-A制备这种化合物，并通过制备型HPLC(柱：sunfire C18(5μm 19*150mm)，流动相A：水(0.1％三氟乙酸)，流动相B：乙腈；UV：214nm：流速：15mL/min，梯度：35％-45％(％B))纯化，得到产物，将该产物通过C18柱(乙腈:水(0.1％碳酸氢铵)＝05％至95％)进一步纯化，得到黄色固体的标题化合物(47mg，99.4％纯度，18％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.096min，C27H30BrFN6O4S2的计算质量664.1，m/z实测值665.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.94(d,J＝3.6Hz,1H),7.73(d,J＝3.2Hz,1H),7.42-7.38(m,2H),7.10-7.06(m,1H),6.14(s,1H),4.46-4.42(m,1H),4.12-4.03(m,2H),3.92-3.85(m,3H),3.75(t,J＝10.0Hz,1H),3.59(s,3H),3.28-3.25(m,2H),3.06-3.03(m,1H),2.81-2.74(m,1H),2.33-2.26(m,2H),1.23(s,3H),1.22(s,3H)。
化合物17：2-((7-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)丁酸(非对映体的混合物)
Figure BDA0003122494520001251
中间体S7的制备：
Figure BDA0003122494520001252
中间体S7-1：1-苄基4-叔丁基2-(((2-(乙氧基羰基)丁基)氨基)-甲基)哌嗪-1,4-二甲酸酯
将1-苄基4-叔丁基2-甲酰基哌嗪-1,4-二甲酸酯(中间体S1-2)(1.10g，3.16mmol)、乙基2-(氨基甲基)丁酸酯盐酸盐(528mg，3.16mmol)和三乙胺(638mg，6.32mmol)在二氯甲烷(20mL)中混合物在室温搅拌30分钟。然后添加三乙酰氧基硼氢化钠(2.01g，9.48mmol)。在40℃搅拌过夜后，将反应混合物用二氯甲烷(20mL)稀释，并用水(10mL)洗涤，浓缩，得到残留物，将该残留物通过C18柱(乙腈:水＝30％至90％)纯化，得到呈黄色油状物的标题化合物(800mg，60％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.37-7.29(m,5H),5.12-5.04(m,2H),4.08-3.76(m,6H),3.31(s,1H),2.91-2.66(m,6H),2.37-2.31(m,1H),1.45-1.42(m,11H),1.17-1.14(m,3H),0.80(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体S7-2：叔丁基3-(((2-(乙氧基羰基)丁基)氨基)-甲基)哌嗪-1-甲酸酯
向1-苄基4-叔丁基2-(((2-(乙氧基羰基)丁基)氨基)甲基)哌嗪-1,4-二甲酸酯(中间体S7-1)(800mg，1.68mmol)在甲醇(60mL)的溶液中添加氢氧化钯(400mg，2.86mmol)。在50℃在氢气气氛(气球)下搅拌过夜后，将反应混合物过滤。将滤液浓缩，得到呈无色油状物的标题化合物(330mg，57％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.09-4.04(m,2H),3.79-3.70(m,2H),2.82-2.80(m,1H),2.69-2.64(m,2H),2.59-2.55(m,1H),2.47-2.33(m,6H),2.03-1.97(m,1H),1.83-1.67(m,1H),1.51-1.44(m,2H),1.40(s,9H),1.18(t,J＝6.8Hz,3H),0.83(t,J＝7.6Hz,3H)。
中间体S7-3：叔丁基2-(2-(乙氧基羰基)丁基)-3-硫氧代六氢-咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯
将硫光气(150mg，1.30mmol)在二氯甲烷(2mL)中的溶液逐滴添加到叔丁基3-(((2-(乙氧基羰基)丁基)氨基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯(中间体S7-2)(300mg，0.87mmol)和三乙胺(309mg，3.06mmol)在二氯甲烷(20mL)中的混合物中。在-10℃在氮气气氛下搅拌30分钟然后在35℃搅拌过夜后，将反应混合物用冰水(20mL)稀释并且用二氯甲烷(20mL)萃取两次。将合并的萃取物用水(20mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩，得到残余物，将该残余物通过C18柱(乙腈:水＝30％至70％)纯化，得到呈黄色油状物的标题化合物(140mg，42％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.778min，C18H31N3O4S的计算质量385.2，m/z实测值386.2[M+H]+。
中间体S7-4：2-((7-(叔丁氧基羰基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)丁酸
向叔丁基2-(2-(乙氧基羰基)丁基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯(中间体S7-3)(140mg，0.363mmol)在四氢呋喃(10mL)和水(10mL)中的溶液中添加一水氢氧化锂(31mg，0.738mmol)。在室温搅拌过夜后，将反应混合物浓缩，得到残余物，将该残余物通过C18柱(乙腈:水＝5％至50％)纯化，得到呈黄色油状物的标题化合物(100mg，77％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.233min，C16H27N3O4S的计算质量357.2，m/z实测值358.2[M+H]+。
中间体S7：2-((3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)丁酸盐酸盐
将2-((7-(叔丁氧基羰基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)丁酸(中间体S7-4)(100mg，0.280mmol)在4N盐酸盐(在乙酸乙酯中)(10mL)中的溶液在室温搅拌1小时。然后将混合物减压浓缩，得到呈白色固体的标题化合物(80mg，100％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝0.439min，C11H20ClN3O2S的计算质量293.1，m/z实测值258.2[M-HCl+H]+。
化合物17：2-((7-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)丁酸(非对映体的混合物)
Figure BDA0003122494520001271
向2-((3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)丁酸盐酸盐(中间体S7)(80mg，0.280mmol)在四氢呋喃(15mL)中的溶液中添加三乙胺(126mg，1.25mmol)。搅拌5分钟后，添加(S)-乙基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(H2-1A)(110mg，0.251mmol)。在40℃搅拌过夜后，将混合物浓缩，得到残余物，将该残余物通过C18柱(乙腈:水＝20％至70％)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(12.1mg，95.1％纯度，8％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.652min，C29H35FN6O4S2的计算质量614.2，m/z实测值615.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.83-7.82(m,1H),7.62(d,J＝3.2Hz,1H),7.04-6.98(m,2H),6.85-6.80(m,1H),5.87(d,J＝2.0Hz,1H),4.40-4.29(m,1H),4.03-3.92(m,4H),3.84-3.65(m,4H),3.56-3.28(m,1H),3.20-3.14(m,1H),2.96-2.66(m,3H),2.41(s,3H),2.36-2.07(m,2H),1.51-1.47(m,2H),1.02(t,J＝7.2Hz,3H),0.91-0.86(m,3H)。
化合物18B：1-((7-((6-(2-氯-3-氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)环丙烷-1-甲酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001281
在氮气气氛下，向乙基6-(溴甲基)-4-(2-氯-3-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(H1-1A)(60mg，90％纯度，0.118mmol)在四氢呋喃(4mL)中的溶液中添加中间体S3-B(49mg，90％纯度，0.151mmol)和三乙胺(87mg，0.583mmol)。在40℃在氮气气氛下搅拌2.5小时并且然后在室温搅拌过夜后，将反应混合物用水(10mL)稀释并且用乙酸乙酯(10mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩，得到残余物，将该残余物通过C18柱(乙腈:水＝40％至70％)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(21mg，97.5％纯度，27.5％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.580min，C28H30ClFN6O4S2的计算质量632.1，m/z实测值633.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.84(d,J＝2.8Hz,1H),7.64(d,J＝2.8Hz,1H),7.22-7.13(m,2H),7.06-7.01(m,1H),6.12(s,1H),4.40-4.37(m,1H),4.01-3.92(m,4H),3.90-3.71(m,4H),3.30-3.25(m,1H),3.20-3.16(m,1H),2.86-2.80(m,2H),2.36-2.29(m,1H),2.10-2.05(m,1H),1.15-1.09(m,2H),1.03-0.96(m,5H)。
化合物19A和19B：(反式)-7-((6-(2-氯-3-氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-2-甲基-3-硫氧代八氢-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-甲酸(单一异构体)
Figure BDA0003122494520001291
中间体S9的制备：
Figure BDA0003122494520001292
中间体S9-1：(反式)-二乙基2,3-二溴代琥珀酸酯
在0℃，向马来酸二乙酯(10.8g，60mmol)在四氯甲烷(200mL)中的溶液中添加溴(10.66g，66.0mmol)。在室温在氮气气氛下搅拌过夜后，将反应混合物用冰水(100mL)稀释，用二氯甲烷(100mL)萃取三次。将合并的有机层用饱和亚硫酸钠水溶液(50mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩，得到呈无色油状物的粗化合物(16.4g，82％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.75(s,2H),4.23-4.18(m,4H),1.27-1.23(m,6H)。
中间体S9-2：(反式)-二乙基1,4-二苄基哌嗪-2,3-二甲酸酯
在40℃，向(反式)-二乙基2,3-二溴代琥珀酸酯(中间体S9-1)(20.0g，57.0mmol)在甲苯(60mL)中的溶液中逐滴添加N1,N2-二苄基乙烷-1,2-二胺(14.0g，57.0mmol)和三乙胺(11.7g，114mmol)。在80℃搅拌过夜后，使混合物冷却至室温，用水(300mL)稀释，用乙酸乙酯(100mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩，得到残余物，将该残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝100:1至50:1)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(7.50g，32％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.30-7.20(m,10H),4.25-4.13(m,4H),3.92(s,4H),3.89(s,2H),3.29(d,J＝7.2Hz,2H),2.53(d,J＝7.2Hz,2H),1.23(t,J＝6.8Hz,6H)。
中间体S9-3：(反式)-1,4-二-叔丁基2,3-二乙基哌嗪-1,2,3,4-四甲酸酯
向(反式)-二乙基1,4-二苄基哌嗪-2,3-二甲酸酯(中间体S9-2)(18.0g，41.0mmol)在四氢呋喃(200mL)中的溶液中添加二碳酸二叔丁酯(27.1g，123mmol)和20％wt的氢氧化钯炭(5.0g)。将反应混合物在室温在氢气气氛(50psi)下搅拌过夜。将混合物通过硅藻土垫过滤。将滤液浓缩，得到残余物，将该残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝50:1至8:1)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(14.0g，80％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ5.24-5.19(m,2H),4.27-4.14(m,4H),3.78-3.67(m,2H),3.05-2.94(m,1H),2.87-2.80(m,1H),1.40(s,9H),1.38(s,9H),1.23-1.16(m,6H)。
中间体S9-4：(反式)-1,4-双(叔丁氧基羰基)-3-(乙氧基羰基)-哌嗪-2-甲酸
在55℃，向(反式)-1,4-二叔丁基2,3-二乙基哌嗪-1,2,3,4-四甲酸酯(中间体S9-3)(5.66g，12.9mmol)在乙醇(25mL)中的溶液中逐滴添加氢氧化钠(700g，16.7mmol)在水(8mL)中的溶液。在55℃搅拌2小时后，使混合物冷却至室温，浓缩以去除乙醇，并用2M盐酸水溶液(约20mL)酸化至pH 5。将混合物用乙酸乙酯(100mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩，得到残余物，将该残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝10:1至5:1)纯化，得到呈白色固体的标题化合物(2.70g，52％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.49(br s,1H),5.19-5.08(m,2H),4.26-4.13(m,2H),3.81-3.64(m,2H),3.08-2.81(m,2H),1.40(s,9H),1.37(s,9H),1.23-1.16(m,3H)。中间体S9-5：(反式)-1,4-二-叔丁基2-乙基3-(羟基甲基)哌嗪-1,2,4-三甲酸酯
在0℃，向(反式)-1,4-双(叔丁氧基羰基)-3-(乙氧基羰基)哌嗪-2-甲酸(中间体S9-4)(2.37g，5.89mmol)在四氢呋喃(20mL)中的溶液中逐滴添加在四氢呋喃中的1M硼烷-四氢呋喃络合物(14.1mL，14.1mmmol)。在室温在氮气气氛下搅拌过夜后，将反应混合物用1M盐酸水溶液(约10mL)酸化至pH 3，用二氯甲烷(100mL)萃取三次。将合并的有机层用饱和亚硫酸钠水溶液(50mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩，得到残余物，将该残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝10:1至2:1)纯化，得到呈白色固体的标题化合物(1.60g，70％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ5.17-5.12(m,1H),4.71(d,J＝13.6Hz,1H),4.58-4.45(m,1H),4.22-4.02(m,2H),3.78-3.71(m,2H),3.67-3.47(m,1H),3.42-3.34(m,1H),3.14-2.81(m,2H),1.41-1.36(m,18H),1.23-1.16(m,3H)。
中间体S9-6：(反式)-1,4-二-叔丁基2-乙基3-甲酰基哌嗪-1,2,4-三甲酸酯
在-70℃，向草酰氯(0.38mL)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中逐滴添加二甲亚砜(695mg，8.80mmol)在二氯甲烷(2mL)中的溶液。在此温度搅拌1小时后，在-70℃，将反应混合物逐滴添加到(反式)-1,4-二-叔丁基2-乙基3-(羟基甲基)哌嗪-1,2,4-三甲酸盐(中间体S9-5)(800mg，2.00mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中间体。在此温度搅拌2小时后，在-70℃，将反应混合物用三乙胺(1.64g，16.0mmol)淬灭，然后在室温搅拌1小时。将混合物用水(50mL)稀释并用二氯甲烷(20mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩，得到呈黄色油状物的粗化合物(550mg，71％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.61-9.57(m,1H),5.38-5.28(m,1H),5.19-5.09(m,1H),4.25-4.14(m,2H),3.83-3.57(m,2H),3.01-2.73(m,2H),1.41-1.37(m,18H),1.27-1.17(m,3H)。
中间体S9-7：(反式)-1,4-二-叔丁基2-乙基3-((甲基氨基)甲基)-哌嗪-1,2,4-三甲酸酯
向(反式)-1,4-二-叔丁基2-乙基3-甲酰基哌嗪-1,2,4-三甲酸酯(中间体S9-6)(2.44g，6.00mmol)在二氯甲烷(30mL)中的溶液中添加甲胺盐酸盐(620mg，9.00mmol)、NaBH(OAc)3(3.28g，15.0mmol)和两滴乙酸。将反应混合物在室温搅拌5小时，并用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)淬灭。将混合物用二氯甲烷(30mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩，得到残余物，将该残余物通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇＝30:1)纯化，得到呈黄色油状物的标题化合物(450mg，19％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.79-4.72(m,1H),4.63-4.48(m,1H),4.20-4.05(m,2H),3.75-3.63(m,2H),3.05-2.80(m,2H),2.75-2.66(m,1H),2.51(s,2H),2.33-2.32(m,3H),1.41-1.36(m,18H),1.36-1.19(m,3H)。
中间体S9-8：(反式)-1,4-二-叔丁基2-乙基3-((甲基((4-硝基苯氧基)硫代羰基)氨基)甲基)哌嗪-1,2,4-三甲酸酯
向(反式)-1,4-二-叔丁基2-乙基3-((甲基氨基)甲基)哌嗪-1,2,4-三甲酸酯(中间体S9-7)(1.00g，90％纯度，2.24mmol)在二氯甲烷(8mL)中的溶液中添加邻-(4-硝基苯基)硫代氯甲酸酯(1.10g，90％纯度，4.55mmol)和N,N-二异丙基乙胺(873mg，6.75mmol)。在40℃搅拌过夜后，将反应混合物冷却至室温，用冰水(15mL)淬灭并用二氯甲烷(20mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(15mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩，得到残余物，将该残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝10:1至4:1)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(1.45g，由1H NMR得到的纯度为90％，99％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.30-8.26(m,2H),7.35-7.29(m,0.5H),7.25-7.21(m,1.5H),5.38-5.18(m,1H),4.71-4.50(m,1H),4.35-4.15(m,3H),4.06-3.85(m,3H),3.60-3.41(m,3H),3.31-2.99(m,2H),1.50-1.45(m,18H),1.31-1.26(m,3H)。
中间体S9：(反式)-乙基2-甲基-3-硫氧代八氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-甲酸酯
向(反式)-1,4-二-叔丁基2-乙基3-((甲基((4-硝基苯氧基)硫代羰基)氨基)甲基)哌嗪-1,2,4-三甲酸酯(中间体S9-8)(158mg，90％纯度，0.244mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液中添加三氟乙酸(2mL)。将混合物在室温搅拌1小时。然后将混合物浓缩以去除三氟乙酸，得到残余物，将该残余物溶解在二氯甲烷(5mL)中。在溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(95mg，0.735mmol)。在40℃搅拌5小时后，将反应混合物冷却至室温，用水(10mL)稀释并用乙酸乙酯(10mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩，得到残余物，将该残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(68mg，由1H NMR得到的纯度为85％，97％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.080min，C10H17N3O2S的计算质量243.1，m/z实测值244.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.45-4.41(m,1H),4.24(q,J＝7.2Hz,2H),3.84-3.72(m,2H),3.50-3.46(m,1H),3.29(d,J＝9.2Hz,1H),3.17(s,3H),3.13-3.09(m,1H),3.00(td,J＝12.4,3.2Hz,1H),2.80(td,J＝12.4,3.2Hz,1H),1.31(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体S9的手性分离：
Figure BDA0003122494520001341
中间体S9-9：(反式)-7-叔丁基8-乙基2-甲基-3-硫氧代六氢-咪唑并[1,5-a]吡嗪-7,8(1H)-二甲酸盐
LC-MS(ESI)：RT＝1.58min，C15H25N3O4S的计算质量343.2，m/z实测值288.0[M+H-56]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.18-4.10(m,4H),3.90-3.64(m,3H),3.59-3.55(m,1H),3.49-3.44(m,1H),3.26-3.14(m,1H),3.01(s,3H),1.37(s,9H),1.23-1.18(m,3H)。
将外消旋中间体S9-9(1.30g，90％纯度，3.57mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak IG 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH＝80:20，以18mL/min；温度：30℃；波长：230nm)进行分离，得到呈黄色固体的标题化合物中间体S9-9A(600mg，由1H NMR得到的纯度为90％，46％产率，100％立体纯)和中间体S9-9B(610mg，由1H NMR得到的纯度为90％，47％产率，98.8％立体纯)。
中间体中间体S9-9A：LC-MS(ESI)：RT＝1.57min，C15H25N3O4S的计算质量343.2，m/z实测值288.0[M+H-56]+。手性分析(柱：Chiralpak IG 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝70:30，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝11.731min)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ4.29-4.02(m,5H),3.86-3.75(m,2H),3.66-3.58(m,2H),3.47-3.27(m,1H),3.16(s,3H),1.44(s,9H),1.29(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体中间体S9-9B：LC-MS(ESI)：RT＝1.57min，C15H25N3O4S的计算质量343.2，m/z实测值288.0[M+H-56]+。手性分析(柱：Chiralpak IG 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝70:30，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝14.006min)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ4.28-4.03(m,5H),3.92-3.69(m,2H),3.66-3.50(m,2H),3.42-3.28(m,1H),3.15(s,3H),1.44(s,9H),1.29(t,J＝7.2Hz,3H)。
通过用在EA中的4M HCl溶液处理，分别从中间体S9-9A和S9-9B得到中间体S9-A和S9-B。除去挥发物，并且将残余物直接用于下一步反应。
化合物19A-1和19B-1：(反式)-7-((6-(2-氯-3-氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-2-甲基-3-硫氧代八氢-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-甲酸
Figure BDA0003122494520001351
类似于化合物18B，通过将H1-1A与中间体S9-A和S9-B偶联来制备化合物19A-1和19B-1。
化合物19A-1：LC-MS(ESI)：RT＝1.84min，C27H30ClFN6O4S2的计算质量620.1，m/z实测值620.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.77(s,1H),7.84(d,J＝3.2Hz,1H),7.44(d,J＝3.2Hz,1H),7.19-7.13(m,2H),7.05-7.01(m,1H),6.29(s,1H),4.45-4.41(m,1H),4.35-4.25(m,3H),4.06-3.98(m,3H),3.69-3.64(m,2H),3.56-3.51(m,1H),3.30-3.23(m,2H),3.19(s,3H),2.82-2.79(m,1H),2.53-2.46(m,1H),1.31(t,J＝7.2Hz,3H),1.11(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物19B-1：LC-MS(ESI)：RT＝1.83min，C27H30ClFN6O4S2的计算质量620.1，m/z实测值620.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.77(s,1H),7.86(d,J＝3.2Hz,1H),7.43(d,J＝3.2Hz,1H),7.19-7.11(m,2H),7.07-7.00(m,1H),6.25(s,1H),4.54-4.51(m,1H),4.25-4.13(m,3H),4.06-3.97(m,3H),3.77(d,J＝17.6Hz,1H),3.65(t,J＝10.4Hz,1H),3.54-3.50(m,1H),3.35-3.28(m,1H),3.25-3.22(m,1H),3.19(s,3H),2.93-2.91(m,1H),2.64-2.57(m,1H),1.20(t,J＝7.2Hz,3H),1.10(t,J＝7.2Hz,3H)。
通过在室温用在THF/MeOH中的LiOH处理化合物19A-1和19B-1来获得化合物19A和19B。
化合物19A：LC-MS(ESI)：RT＝3.624min，C25H26ClFN6O4S2的计算质量592.1，m/z实测值593.1。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.97(d,J＝3.2Hz,1H),7.75(d,J＝3.2Hz,1H),7.34-7.27(m,2H),7.18-7.12(m,1H),6.25(s,1H),4.40-4.37(m,1H),4.28(d,J＝16.8Hz,1H),4.10-4.02(m,3H),3.90(d,J＝16.8Hz,1H),3.79-3.75(m,1H),3.70-3.66(m,1H),3.32-3.28(m,1H),3.21-3.11(m,1H),3.15(s,3H),2.91-2.88(m,1H),2.54-2.47(m,1H),1.13(t,J＝6.8Hz,3H)。
化合物19B：LC-MS(ESI)：RT＝3.620min，C25H26ClFN6O4S2的计算质量592.1，m/z实测值593.2。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.95(d,J＝3.2Hz,1H),7.73(d,J＝3.2Hz,1H),7.35-7.29(m,2H),7.18-7.13(m,1H),6.21(s,1H),4.45-4.41(m,1H),4.22(d,J＝16.8Hz,1H),4.08-4.02(m,3H),3.92(d,J＝16.8Hz,1H),3.76(t,J＝10.4Hz,1H),3.68-3.64(m,1H),3.32-3.28(m,1H),3.19-3.18(m,1H),3.16(s,3H),3.06-3.03(m,1H),2.64-2.57(m,1H),1.12(t,J＝6.8Hz,3H)。
化合物20A：3-(7-((6-(2-氯-3-氟苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001361
类似于化合物18B，通过中间体H11-1A和S1-A制备化合物20A。LC-MS(ESI)：RT＝3.511min，C27H30ClFN6O4S2的计算质量620.1，m/z实测值621.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.02(d,J＝3.2Hz,1H),7.95(d,J＝3.2Hz,1H),7.39-7.29(m,2H),7.24-7.22(m,1H),6.09(s,1H),4.35(d,J＝12.4Hz,1H),3.99(d,J＝16.8Hz,1H),3.94-3.87(m,2H),3.79(d,J＝14.0Hz,1H),3.74(d,J＝14.0Hz,1H),3.64(t,J＝9.6Hz,1H),3.52(s,3H),3.18-3.12(m,2H),2.97-2.88(m,2H),2.35-2.24(m,1H),2.09(t,J＝10.8Hz,1H),1.12(s,6H)。
化合物21A：3-(7-((6-(2-氯-4-氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001371
类似于化合物18B，通过中间体H12-1A和S1-A制备化合物21A。LC-MS(ESI)：RT＝3.522min，C28H32ClFN6O4S2的计算质量634.2，m/z实测值635.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.96(d,J＝2.8Hz,1H),7.76(d,J＝3.2Hz,1H),7.46-7.43(m,1H),7.25-7.22(m,1H),7.09-7.04(m,1H),6.18(s,1H),4.54-4.51(m,1H),4.13(s,0.4H),4.08-4.02(m,3.6H),3.95(s,0.6H),3.93-3.85(m,2.4H),3.72-3.68(m,1H),3.36-3.23(m,2H),2.99-2.90(m,2H),2.47-2.40(m,1H),2.21-2.15(m,1H),1.24(s,6H),1.16(t,J＝6.8Hz,3H)。
化合物22A：3-(7-((2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001381
类似于化合物18B，通过中间体H13-1A和S1-A制备化合物22A。LC-MS(ESI)：RT＝3.642min，C31H35F3N6O4S的计算质量644.2，m/z实测值645.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.52(d,J＝2.0Hz,1H),7.75-7.70(m,1H),7.17-7.08(m,2H),6.97-6.92(m,1H),6.06(s,1H),4.52(d,J＝13.6Hz,1H),4.19-4.06(m,4H),3.96-3.86(m,3H),3.72(t,J＝10.0Hz,1H),3.28-3.24(m,2H),2.98(d,J＝11.6Hz,1H),2.89(d,J＝11.2Hz,1H),2.54(s,3H),2.46(td,J＝12.0,3.2Hz,1H),2.15(t,J＝11.2Hz,1H),1.25(s,3H),1.24(s,3H),1.16(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物23：4-(7-((5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)苯甲酸(非对映体的混合物)
Figure BDA0003122494520001391
中间体S10的制备：
Figure BDA0003122494520001392
中间体S10-1：叔丁基4-苄基-3-(((4-(甲氧基羰基)苯基)氨基)-甲基)哌嗪-1-甲酸酯
在室温，在氮气气氛下，将(S)-叔丁基4-苄基-3-甲酰基哌嗪-1-甲酸酯(2g，90％纯度，5.91mmol)和4-氨基苯甲酸甲酯(900mg，5.95mmol)在甲醇(50mL)中的溶液搅拌16小时。在0℃添加氰基硼氢化钠(700mg，11.1mmol)后，将混合物在室温搅拌2小时。然后将混合物用冰水(100mL)淬灭并用乙酸乙酯(60mL)萃取三次。将合并的有机层经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝8:1至2:1)纯化，得到呈浅黄色油状物的标题化合物(2g，纯度78％，60％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.90min，C25H33N3O4的计算质量439.2，m/z实测值440.1[M+H]+。
中间体S10-2：叔丁基3-(((4-(甲氧基羰基)苯基)氨基)甲基)-哌嗪-1-甲酸酯
在室温，向叔丁基4-苄基-3-(((4-(甲氧基羰基)苯基)氨基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯(中间体S10-2)(2g，78％纯度，3.55mmol)在甲醇(40mL)中的溶液中添加乙酸钯(II)(100mg)和活性碳酸盐(500mg)。在40℃在60psi的氢气气氛下搅拌过夜后，将混合物过滤。将滤液浓缩，得到呈黄色油状物的标题化合物(2g，56％纯度，90％产率)，将其不经纯化直接用于下一步。LC-MS(ESI)：RT＝1.51min，C18H27N3O4的计算质量349.2，m/z实测值350.0[M+H]+。
中间体S10-3：叔丁基2-(4-(甲氧基羰基)苯基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯
在0℃，向叔丁基3-(((4-(甲氧基羰基)苯基)氨基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯(中间S10-2)(2g，56％纯度，3.21mmol)在二氯甲烷(25mL)中的溶液中添加三乙胺(1g，9.88mmol)和硫光气(550mg，4.78mmol)。在0℃搅拌1小时后，将反应混合物用水(80mL)淬灭，并用二氯甲烷(50mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(150mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过C18(乙腈:水＝68％至75％)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(500mg，94％纯度，37％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.68min，C19H25N3O4S的计算质量391.2，m/z实测值392.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.08-8.04(m,2H),7.77-7.73(m,2H),4.63-4.59(m,1H),4.42-4.31(m,1H),4.17-4.14(m,1H),4.03-3.98(m,1H),3.91(s,3H),3.77-3.71(m,2H),3.12-3.05(m,1H),2.97-2.89(m,1H),2.82-2.71(m,1H),1.50(s,9H)。
中间体S10-4：4-(7-(叔丁氧基羰基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)苯甲酸
在0℃，在氮气气氛下，向叔丁基2-(4-(甲氧基羰基)苯基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯(中间体S10-3)(100mg，94％纯度，0.24mmol)在甲醇(3mL)和水(2mL)中的溶液中添加氢氧化钠(50mg，1.25mmol)。在35℃搅拌16小时后，将混合物冷却并减压浓缩，得到残余物，将该残余物用水(20mL)稀释。将所得混合物用2M盐酸水溶液(1mL)酸化至pH约为5，并用乙酸乙酯(30mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩，得到呈黄色固体的标题化合物(75mg，83％产率)，将其不经进一步纯化而直接用于下一步。LC-MS(ESI)：RT＝1.25min，C18H23N3O4S的计算质量377.1，m/z实测值378.0[M+H]+。
中间体S10：4-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)苯甲酸盐酸盐
将4-(7-(叔丁氧基羰基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)苯甲酸(中间体S10-4)(75mg，0.199mmol)在4M盐酸(在1,4-二噁烷中)(5mL)中的溶液在25℃搅拌3小时。将反应混合物浓缩，得到呈白色固体的标题化合物(50mg，由1H NMR得到的纯度为90％，72％产率)，将其不经纯化直接用于下一步。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.30(s,2H),7.96(d,J＝8.8Hz,2H),7.85(d,J＝8.8Hz,2H),4.59-4.51(m,1H),4.37-4.25(m,2H),3.98-3.94(m,1H),3.52-3.48(m,2H),3.42-3.40(m,1H),3.12-3.04(m,1H),3.01-2.95(m,1H)。
化合物23：4-(7-((5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)苯甲酸(非对映体的混合物)
Figure BDA0003122494520001411
类似于化合物18B，由中间体H2-1A和S10制备化合物23。LC-MS(ESI)：RT＝3.457min，C31H31FN6O4S2的计算质量634.2，m/z实测值635.2[M+H]+。手性分析(柱：ChiralpakIA 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:TFA:DEA＝50:50:0.1:0.1，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝9.145min(R，9.7445％)，11.813min(S，90.2555％))。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.93-7.90(m,2H),7.84(d,J＝2.8Hz,1H),7.72-7.68(m,2H),7.64-7.63(m,1H),7.09-7.00(m,2H),6.86-6.81(m,1H),5.88(s,1H),4.57-4.53(m,1H),4.16-4.05(m,3H),3.96(q,J＝7.2Hz,2H),3.88(d,J＝17.2Hz,1H),3.73-3.69(m,1H),3.31-3.25(m,1H),2.98-2.95(m,2H),2.49-2.39(m,4H),2.25-2.20(m,1H),1.03(t,J＝6.8Hz,3H)。
化合物24A和24B：(1S,3R)-3-(7-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)环戊烷甲酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001421
中间体S11的制备：
Figure BDA0003122494520001431
中间体S11-1：(1S,3R)-甲基3-((叔丁氧基羰基)氨基)环戊烷-甲酸酯
在室温，向(1S,3R)-3-((叔丁氧基羰基)氨基)环戊烷甲酸(700mg，由HNMR得到的纯度为95％，2.90mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液中添加碳酸钾(605mg，4.38mmol)，然后添加碘甲烷(500mg，3.52mmol)。搅拌过夜后，将混合物用乙酸乙酯(40mL)稀释，并用水(30mL)洗涤两次，用盐水(30mL)洗涤两次，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并减压浓缩，得到呈白色固体的所需产物(700mg，由HNMR得到的纯度为95％，94％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.00-4.88(m,1H),4.06-4.00(m,1H),3.69(s,3H),2.87-2.80(m,1H),2.25-2.18(m,1H),1.97-1.89(m,3H),1.74-1.65(m,1.5H),1.58-1.56(m,0.5H),1.44(s,9H)。
中间体S11-2：(1S,3R)-甲基3-氨基环戊烷甲酸酯盐酸盐
在0℃，在氮气气氛下，向(1S,3R)-3-((叔丁氧基羰基)氨基)环戊烷-甲酸酯(中间体S11-1)(700mg，95％纯度，2.73mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加在二乙醚中的6M盐酸(10mL)。在室温搅拌16小时后，将反应混合物减压浓缩，得到呈白色固体的标题化合物(540mg，由HNMR得到的纯度为90％，99％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.31(br s,3H),3.62(s,3H),3.46-3.43(m,1H),2.90-2.81(m,1H),2.29-2.22(m,1H),1.97-1.85(m,3H),1.80-1.64(m,2H)。
中间体S11-3：1-苄基4-叔丁基2-((((1R,3S)-3-(甲氧基羰基)环戊基)氨基)甲基)哌嗪-1,4-二甲酸酯
在室温，向(1S,3R)-甲基3-氨基环戊烷甲酸酯盐酸盐(中间体S11-2)(540mg，90％纯度，2.71mmol)在甲醇(10mL)中的溶液中添加三乙胺(295mg，2.92mmol)。在室温在氮气气氛下搅拌0.5小时后，添加1-苄基4-叔丁基2-甲酰基哌嗪-1,4-二甲酸酯(中间体S1-2)(750mg，1.94mmol)在甲醇(10mL)中的溶液并在室温搅拌1小时。然后在0℃添加氰基硼氢化钠(283mg，4.50mmol)并将混合物在室温搅拌4小时，用冰水(20mL)淬灭，真空下去除甲醇并用乙酸乙酯(30mL)萃取三次。将合并的有机层经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液减压浓缩，得到残余物，将该残余物通过C18柱(乙腈:水＝60％至70％)纯化，得到呈浅黄色油状物的标题化合物(640mg，由HNMR得到的纯度为95％，66％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36-7.34(m,5H),5.19-5.10(m,2H),4.10-3.92(m,4H),3.66(s,3H),3.05-2.68(m,8H),2.15-1.81(m,5H),1.46(s,9H)。
中间体S11-4：叔丁基3-((((1R,3S)-3-(甲氧基羰基)-环戊基)氨基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯
向1-苄基4-叔丁基2-((((1R,3S)-3-(甲氧基羰基)环戊基)氨基)甲基)哌嗪-1,4-二甲酸酯(中间体S11-3)(640mg，95％纯度，1.28mmol)在甲醇(10mL)中的溶液中添加20％氢氧化钯炭(370mg，2.64mmol)。在60℃在氢气气氛(60psi)下搅拌3天后，将混合物过滤并将滤液减压浓缩，得到呈无色油状物的标题化合物(380mg，由HNMR得到的纯度90％，78％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.77-3.69(m,2H),3.59(s,3H),3.43-3.24(m,4H),3.03-2.98(m,1H),2.84-2.73(m,3H),2.47-2.36(m,4H),2.09-2.04(m,1H),1.82-1.72(m,3H),1.54-1.49(m,1H),1.39(s,9H)。
中间体S11-5：叔丁基2-((1R,3S)-3-(甲氧基羰基)环戊基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯
在0℃，在氮气气氛下，向叔丁基3-((((1R,3S)-3-(甲氧基羰基)-环戊基)氨基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯(中间体S11-4)(380mg，90％纯度，1.00mmol)和三乙胺(320mg，3.16mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液中添加硫光气(180mg，1.57mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液。在室温搅拌过夜后，将混合物用冰水(10mL)稀释并且用二氯甲烷(20mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液减压浓缩，得到残余物，将该残余物通过C18柱(乙腈:水＝80％至90％)纯化，得到呈棕色固体的标题化合物(285mg，由HNMR得到的纯度为90％，67％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.14-5.10(m,1H),4.52-4.47(m,1H),4.33-3.88(m,4H),3.69(s,3H),3.23-3.14(m,1H),3.00-2.86(m,4H),2.68-2.61(m,1H),2.24-2.19(m,1H),1.99-1.91(m,4H),1.47(s,9H)。
将外消旋中间体S11-5(405mg，90％纯度，0.950mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak IE 5μm 20*250mm；流动相：Hex:IPA＝70:30，以18mL/min；柱温：30℃；波长：254nm)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物中间体S11-5A(120mg，由HNMR得到的纯度为90％，30％产率，100％立体纯)和中间体S11-5B(130mg，由HNMR得到的纯度为90％，32％产率，98.3％立体纯)。
中间体S11-5A：LC-MS(ESI)：RT＝1.63min，C18H29N3O4S的计算质量383.2，m/z实测值384.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：HEX:IPA＝70:30，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝14.668min)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.15-5.09(m,1H),4.51-4.47(m,1H),4.27-4.05(m,2H),3.77-3.73(m,1.3H),3.70(s,3H),3.66-3.64(m,0.7H),3.24-3.19(m,1H),3.03-2.86(m,3H),2.69-2.59(m,1H),2.26-2.19(m,1H),1.99-1.91(m,3H),1.85-1.77(m,1H),1.69-1.65(m,1H),1.47(s,9H)。
中间体S11-5B：LC-MS(ESI)：RT＝1.63min，C18H29N3O4S的计算质量383.2，m/z实测值384.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：HEX:IPA＝70:30，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝17.029min)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.14-5.10(m,1H),4.51-4.47(m,1H),4.23-4.01(m,2H),3.77-3.73(m,2H),3.69(s,3H),3.17-3.14(m,1H),3.02-2.86(m,3H),2.68-2.59(m,1H),2.25-2.18(m,1H),2.00-1.93(m,3H),1.85-1.79(m,1H),1.69-1.65(m,1H),1.47(s,9H)。
中间体S11-6A：(1S,3R)-3-(7-(叔丁氧基羰基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)环戊烷甲酸
在0℃，向叔丁基2-((1R,3S)-3-(甲氧基羰基)环戊基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯(中间体S11-5A)(120mg，90％纯度，0.282mmol)在四氢呋喃(1mL)和甲醇(1mL)中的溶液中添加在水(1mL)中的氢氧化钠(30mg，0.75mmol)。在室温搅拌5小时后，将混合物用水(5mL)稀释，用1M盐酸水溶液酸化至pH4-5，并用乙酸乙酯(10mL)萃取两次。将合并的有机层经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液减压浓缩，得到呈白色固体的标题化合物(110mg，由HNMR得到的纯度为90％，95％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.17-5.09(m,1H),4.51-4.47(m,1H),4.25-4.04(m,2H),3.81-3.64(m,2H),3.22-3.18(m,1H),3.04-2.82(m,3H),2.68-2.59(m,1H),2.30-2.23(m,1H),2.02-1.95(m,3H),1.85-1.81(m,1H),1.68-1.65(m,1H),1.48(s,9H)。
类似于中间体S11-6A，由中间体S11-5B制备中间体S11-6B。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.18-5.09(m,1H),4.51-4.47(m,1H),4.25-4.01(m,2H),3.76-3.70(m,2H),3.16-3.12(m,1H),3.03-2.90(m,3H),2.67-2.59(m,1H),2.29-2.22(m,1H),2.04-1.95(m,3H),1.84-1.81(m,1H),1.70-1.66(m,1H),1.48(s,9H)。
中间体S11A：(1S,3R)-3-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)环戊烷甲酸盐酸盐
在0℃，在氮气气氛下，向(1S,3R)-3-(7-(叔丁氧基羰基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)环戊烷甲酸(中间体S11-6A)(110mg，90％纯度，0.268mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液中添加在二乙醚中的6M盐酸(3mL)。在室温搅拌16小时后，将反应混合物减压浓缩，得到呈白色固体的标题化合物(90mg，由HNMR得到的纯度为90％，99％产率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.58-9.41(m,2H),4.87-4.82(m,1H),4.41-4.37(m,1H),4.19-4.13(m,1H),3.76-3.71(m,1H),3.37-3.27(m,4H),2.88-2.76(m,3H),2.07-2.00(m,1H),1.86-1.73(m,4H),1.66-1.60(m,1H)。
类似于中间体S11A，由中间体S11-6B制备中间体S11B。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.63-9.45(m,2H),4.87-4.83(m,1H),4.41-4.37(m,1H),4.23-4.13(m,1H),3.78-3.73(m,1H),3.37-3.27(m,4H),2.89-2.75(m,3H),2.06-1.99(m,1H),1.87-1.72(m,4H),1.67-1.62(m,1H)。
分别由中间体H2-1A和中间体S11-A和S11B制备化合物24A和24B。
24A：LC-MS(ESI)：RT＝3.986min，C30H35FN6O4S2的计算质量626.2，m/z实测值627.2[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IA 5μm4.6*250mm；流动相：HEX:EtOH:TFA＝70:30:0.2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝8.161min)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.83(d,J＝3.2Hz,1H),7.62(d,J＝3.2Hz,1H),7.06-6.98(m,2H),6.85-6.81(m,1H),5.87(s,1H),4.99-4.90(m,1H),4.37-4.33(m,1H),4.04-3.92(m,4H),3.84-3.80(m,1H),3.69-3.64(m,1H),3.27-3.24(m,1H),3.18-3.13(m,1H),3.00-2.96(m,1H),2.80-2.67(m,2H),2.41(s,3H),2.25-2.16(m,2H),2.12-2.05(m,1H),1.90-1.75(m,4H),1.67-1.62(m,1H),1.04(t,J＝6.8Hz,3H)。
24B：LC-MS(ESI)：RT＝3.468min，C30H35FN6O4S2的计算质量626.2，m/z实测值627.2[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IA 5μm4.6*250mm；流动相：HEX:EtOH:TFA＝70:30:0.2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝9.890min)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.95(d,J＝3.2Hz,1H),7.74(d,J＝2.8Hz,1H),7.17-7.10(m,2H),6.97-6.93(m,1H),5.99(s,1H),5.09-5.03(m,1H),4.56-4.53(m,1H),4.15-4.04(m,4H),3.96-3.92(m,1H),3.78-3.73(m,1H),3.31-3.24(m,2H),2.99-2.84(m,3H),2.53(s,3H),2.49-2.43(m,1H),2.20-2.14(m,2H),2.00-1.95(m,2H),1.90-1.83(m,2H),1.77-1.72(m,1H),1.16(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物24C和24D：(1R,3S)-3-(7-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)环戊烷甲酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001481
类似于化合物24A和24B地制备化合物24C和24D。
化合物24C：LC-MS(ESI)：RT＝3.512min，C30H35FN6O4S2的计算质量626.2，m/z实测值627.3[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:TFA＝50:50:0.2，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝10.315min)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.89(d,J＝3.2Hz,1H),7.68(d,J＝3.2Hz,1H),7.13-7.04(m,2H),6.91-6.87(m,1H),5.93(s,1H),5.04-4.95(m,1H),4.51-4.47(m,1H),4.10-3.98(m,4H),3.88(d,J＝16.8Hz,1H),3.66(t,J＝10.0Hz,1H),3.25-3.21(m,2H),2.94-2.77(m,3H),2.47(s,1.5H),2.46(s,1.5H),2.44-2.37(m,1H),2.17-2.10(m,2H),1.94-1.63(m,5H),1.08(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物24D：LC-MS(ESI)：RT＝3.735min，C30H35FN6O4S2的计算质量626.2，m/z实测值627.3[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:TFA＝50:50:0.2，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝8.320min)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.88(d,J＝3.2Hz,1H),7.67(d,J＝3.2Hz,1H),7.12-7.04(m,2H),6.91-6.86(m,1H),5.93(s,1H),5.05-4.96(m,1H),4.42-4.39(m,1H),4.10-3.98(m,4H),3.88(d,J＝17.2Hz,1H),3.77(t,J＝10.0Hz,1H),3.24-3.19(m,2H),3.06-3.02(m,1H),2.85-2.73(m,2H),2.46(s,1.5H),2.45(s,1.5H),2.30-2.21(m,2H),2.17-2.10(m,1H),1.96-1.66(m,5H),1.08(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物25A：3-(7-((5-(乙氧基羰基)-6-(2-氟-4-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001491
类似于化合物18B，由中间体H14-1A和S1-A制备化合物25A。LC-MS(ESI)：RT＝3.825min，C29H35FN6O4S2的计算质量614.2，m/z实测值615.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.59(s,1H),8.01(d,J＝3.2Hz,1H),7.93(d,J＝3.2Hz,1H),7.19(t,J＝8.4Hz,1H),6.99-6.94(m,2H),5.88(s,1H),4.37-4.34(m,1H),3.99-3.93(m,3H),3.86-3.82(m,2H),3.75-3.72(m,1H),3.66-3.59(m,2H),3.24-3.12(m,2H),2.92-2.90(m,1H),2.79-2.76(m,1H),2.27-2.21(m,4H),2.03(t,J＝11.2Hz,1H),1.07(t,J＝7.2Hz,3H),0.99-0.90(m,6H)。
化合物26A：3-(7-((5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(5-甲基噁唑-4-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001501
类似于化合物18B，由中间体H15-1A和S1-A制备化合物26A。LC-MS(ESI)：RT＝3.732min，C30H37FN6O5S的计算质量612.2，m/z实测值613.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.35(br s,1H),9.37(s,0.9H),8.92(s,0.1H),8.36(s,1H),7.19-7.13(m,1H),7.03-6.95(m,2H),5.85(s,0.9H),5.70(s,0.1H),4.35(d,J＝11.6Hz,1H),4.04-3.90(m,5H),3.77(d,J＝1.6Hz,2H),3.62(t,J＝10.4Hz,1H),3.18-3.10(m,2H),2.92(d,J＝10.4Hz,1H),2.84(d,J＝13.6Hz,1H),2.51(s,3H),2.47(d,J＝2.8Hz,3H),2.29(td,J＝17.2,8.8Hz,1H),2.06(t,J＝11.2Hz,1H),1.13(s,3H),1.12(s,3H),1.06(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物27A和27B：3-(-7-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001511
中间体S12的制备：2-甲基-3-((S)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丙酸盐酸盐
Figure BDA0003122494520001512
中间体S12-1：叔丁基2-甲基-3-氧代丙酸酯
在-78℃，向丙酸叔丁酯(14.1g，108mmol)在四氢呋喃(500mL)中的搅拌溶液中添加2M二异丙基氨基锂在四氢呋喃中的溶液(65.5mL，130mmol)。在-78℃搅拌30分钟后，添加甲酸乙酯(25.2g，340mmol)。在-78℃再搅拌30分钟后，将混合物温热至室温。搅拌过夜后，将反应混合物用冷水(200mL)淬灭并用乙酸乙酯(300mL)萃取两次。然后将水层用1M盐酸水溶液酸化至pH 4-5，用二乙醚(500mL)萃取两次。将合并的有机层经Na2SO4(固体)干燥，过滤，将滤液减压浓缩，得到残余物，将该残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝10:1至8:1)纯化，得到呈棕色油状物的标题化合物(醛形式和烯醇形式的混合物)(12.2g，由1HNMR得到的纯度为30％，21％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.46(d,J＝12.4Hz,0.5H),9.76(d,J＝1.6Hz,0.5H),6.97-6.94(m,0.5H),3.32-3.27(m,0.5H),1.49(s,9H),1.30(d,J＝7.2Hz,3H)。
中间体S12-2：(2R)-1-苄基4-叔丁基2-(((3-(叔丁氧基)-2-甲基-3-氧代丙基)氨基)甲基)哌嗪-1,4-二甲酸酯
在室温，在(R)-叔丁基3-(氨基甲基)-4-苄基哌嗪-1-甲酸酯(1.0g，95％纯度，2.72mmol)、叔丁基2-甲基-3-氧代丙酸酯(中间体S12-2)(2.0g，40％纯度，6.15mmol)和
Figure BDA0003122494520001521
分子筛(2g)混合物在甲醇(30mL)中的溶液中添加乙酸(500mg，8.33mmol)。在室温在氮气气氛下搅拌1小时后，在0℃添加氰基硼氢化钠(2.0g，31.8mmol)，并将混合物在室温搅拌4小时，用冰水(30mL)淬灭，真空下除去甲醇并用乙酸乙酯(50mL)萃取三次。将合并的有机层经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液减压浓缩，得到残余物，将该残余物通过C18柱(乙腈:水＝60％至70％)纯化，得到呈浅黄色油状物的标题化合物(1.2g，由1H NMR得到的纯度为90％，81％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38-7.29(m,5H),5.15-5.11(m,2H),4.34-3.79(m,4.4H),3.07-2.39(m,8.6H),1.46(s,9H),1.43(s,9H),1.07(d,J＝6.4Hz,3H)。
中间体S12-3：(3R)-叔丁基3-(((3-(叔丁氧基)-2-甲基-3-氧代丙基)氨基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯
向(R)-1-苄基4-叔丁基2-(((3-(叔丁氧基)-2-甲基-3-氧代丙基)氨基)甲基)哌嗪-1,4-二甲酸酯(中间体S12-2)(1.2g，90％纯度，2.20mmol)在甲醇(20mL)中的溶液中添加10％wt钯/活性炭(600mg，0.564mmol)。在50℃在氢气气氛(60psi)下搅拌16小时后，将反应混合物过滤。将滤液减压浓缩，得到呈黄色油状物的标题化合物(650mg，27％纯度，22％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.06-3.81(m,1.6H),3.65-3.55(m,0.4H),3.48-3.26(m,0.6H),3.08-2.44(m,10.4H),2.29-2.04(m,1H),1.45(s,18H),1.10(dd,J＝6.8,2.0Hz,3H)。
中间体S12-4：(8aS)-叔丁基2-(3-(叔丁氧基)-2-甲基-3-氧代丙基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯
在0℃，在氮气气氛下，向(3R)-叔丁基3-(((3-(叔丁氧基)-2-甲基-3-氧代丙基)氨基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯(中间体S12-3)(650mg，27％纯度，0.491mmol)和三乙胺(400mg，3.95mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液中添加硫光气(200mg，1.74mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液。在室温搅拌过夜后，将混合物用冰水(20mL)稀释并用二氯甲烷(100mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液减压浓缩，得到残余物，将该残余物通过C18柱(乙腈:水＝70％至80％)纯化，得到呈棕色油状物的标题化合物(100mg，由1H NMR得到的纯度为98％，50％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)4.46(d,J＝11.6Hz,1H),4.21-4.02(m,2H),3.79-3.65(m,4H),3.29-3.16(m,1H),3.04-2.97(m,1H),2.91-2.77(m,2H),2.67-2.52(m,1H),1.47(s,9H),1.45(s,9H),1.17(d,J＝6.8,3H)。
将外消旋中间体S12-4(150mg，95％纯度，0.357mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak IC 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH＝85:15，以18mL/min；温度：35℃；波长：230nm)进行分离，得到呈黄色固体的标题化合物中间体S12-4A(35mg，由1H NMR得到的纯度为98％，24％产率，100％立体纯)和中间体S12-4B(35mg，由1H NMR得到的纯度为98％，24％产率，99.6％立体纯)。
中间体S12-4A：LC-MS(ESI)：RT＝1.845min，C19H33N3O4S的计算质量399.2，m/z实测值400.2[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝85:15，以1mL/min；波长：254nm，RT＝8.929min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.46(d,J＝11.2Hz,1H),4.29-3.99(m,2H),3.85-3.65(m,4H),3.29-3.14(m,1H),3.04-2.97(m,1H),2.88-2.75(m,2H),2.70-2.53(m,1H),1.47(s,9H),1.45(s,9H),1.16(d,J＝6.8Hz,3H)。
中间体S12-4B：LC-MS(ESI)：RT＝1.833min，C19H33N3O4S的计算质量399.2，m/z实测值400.2[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝85:15，以1mL/min；波长：254nm，RT＝10.189min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.46(d,J＝13.2Hz,1H),4.27-3.95(m,2H),3.84-3.64(m,4H),3.29-3.23(m,1H),3.04-2.98(m,1H),2.91-2.76(m,2H),2.67-2.52(m,1H),1.47(s,9H),1.45(s,9H),1.16(d,J＝7.2Hz,3H)。
中间体S12：2-甲基-3-((S)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丙酸盐酸盐
在0℃，向(S)-叔丁基2-(3-(叔丁氧基)-2-甲基-3-氧代丙基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯(中间体S12-4)(100mg，90％纯度，0.225mmol)的溶液中添加在乙酸乙酯中的5M盐酸(3.5mL，17.5mmol)。在室温在氮气气氛下搅拌1小时后，将反应混合物减压浓缩，得到呈黄色固体的标题化合物(65mg，由1H NMR得到的纯度为90％，90％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝0.22min和0.26min，C10H18ClN3O2S的计算质量279.1，m/z实测值244.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.30(br s,2H),4.38-3.34(m,1H),4.19-4.09(m,1H),3.79-3.68(m,2H),3.65-3.54(m,1H),3.43-3.38(m,4H),2.56-2.76(m,3H),1.06(d,J＝6.8Hz,3H)。
分别由中间体S12-4A和中间体S12-4B制备中间体S12-A和S12-B。
中间体S12-A：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.78(br s,2H),4.39-4.30(m,1H),4.27-4.17(m,1H),3.80-3.70(m,2H),3.62-3.56(m,1H),3.44-3.31(m,2H),3.30-3.23(m,2H),2.86-2.73(m,3H),1.06-1.02(m,3H)。
中间体S12-B：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.78(br s,2H),4.39-4.30(m,1H),4.27-4.17(m,1H),3.80-3.70(m,2H),3.62-3.56(m,1H),3.44-3.31(m,2H),3.30-3.23(m,2H),2.86-2.73(m,3H),1.10-1.02(m,3H)。
分别由中间体H2-1A和S12-A和S12-B制备化合物27A和27B。
27A：LC-MS(ESI)：RT＝3.695min，C28H33FN6O4S2的计算质量600.2，m/z实测值601.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.83(d,J＝3.2Hz,1H),7.62(d,J＝3.6Hz,1H),7.08-6.98(m,2H),6.83(t,J＝9.2Hz,1H),5.87(s,1H),4.38(d,J＝12.8Hz,1H),4.03-3.92(m,4H),3.82(d,J＝16.8Hz,1H),3.75-3.66(m,2H),3.59-3.54(m,1H),3.18-3.11(m,2H),2.88-2.72(m,3H),2.41(s,3H),2.34(t,J＝11.6Hz,1H),2.08(t,J＝11.2Hz,1H),1.06-1.00(m,6H)。
27B：LC-MS(ESI)：RT＝3.278min，C28H33FN6O4S2的计算质量600.2，m/z实测值601.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.83(d,J＝3.2Hz,1H),7.61(d,J＝3.6Hz,1H),7.08-6.96(m,2H),6.85-6.80(m,1H),5.87(s,1H),4.38(d,J＝11.6Hz,1H),4.01-3.92(m,4H),3.88-3.78(m,2H),3.54(t,J＝10.0Hz,1H),3.38-3.31(m,2H),3.16-3.15(m,1H),2.84-2.81(m,1H),2.74-2.72(m,1H),2.64-2.54(m,1H),2.41(s,3H),2.37-2.31(m,1H),2.11(t,J＝10.8Hz,1H),1.06-1.00(m,6H)。
化合物28：4-(7-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丁酸(非对映体的混合物)
Figure BDA0003122494520001551
中间体S14的制备：2,2-二甲基-4-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丁酸
Figure BDA0003122494520001561
中间体S14-1：叔丁基2-(4-乙氧基-3,3-二甲基-4-氧代丁基)-3-氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯
在0℃，在氮气气氛下，向叔丁基3-氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯(482mg，2.00mmol)在四氢呋喃(15mL)和N,N-二甲基甲酰胺(15mL)中的溶液中添加60％wt氢化钠(在矿物油中)(160mg，4.00mmol)。在室温搅拌30分钟后，添加乙基4-溴-2,2-二甲基丁酸酯(540mg，2.42mmol)。在室温搅拌2天后，将反应混合物减压浓缩，得到残余物，将该残余物用乙酸乙酯(30mL)稀释，用水(10mL)洗涤三次，用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝20:1至2:1)纯化，得到呈无色油状物的标题化合物(160mg，21％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.60min，C19H33N3O5的计算质量383.2，m/z实测值384.4[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.12(q,J＝7.2Hz,2H),3.99(br s,1H),3.81-3.78(m,1H),3.54(br s,1H),3.44-3.40(m,1H),3.21-3.17(m,2H),2.94-2.91(m,1H),2.85-2.60(m,3H),1.77-1.72(m,2H),1.47(s,9H),1.26(t,J＝7.2Hz,3H),1.22(s,6H)。
中间体S14-2：叔丁基2-(4-乙氧基-3,3-二甲基-4-氧代丁基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯
向叔丁基2-(4-乙氧基-3,3-二甲基-4-氧代丁基)-3-氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯(中间体S14-1)(160mg，0.418mmol)在甲苯(15mL)中的溶液中添加劳氏试剂(101mg，0.250mmol)。在110℃搅拌4小时后，将反应混合物通过饱和碳酸氢钠溶液(10mL)淬灭，用乙酸乙酯(30mL)稀释。将有机层分离并用水(10mL)、盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液减压浓缩，得到残余物，将该残余物通过制备型TLC(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)纯化，得到呈无色油状物的所需化合物(69mg，3％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.73min，C19H33N3O4S的计算质量399.2，m/z实测值400.2[M+H]+。
中间体S14-3：4-(7-(叔丁氧基羰基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丁酸
向叔丁基2-(4-乙氧基-3,3-二甲基-4-氧代丁基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯(中间体S14-2)(50mg，0.125mmol)在甲醇(2.5mL)和水(0.7mL)中的溶液中添加氢氧化钠(40mg，1.00mmol)。在50℃搅拌过夜后，将反应混合物减压浓缩。将所得残余物用1N盐酸水溶液酸化至pH约为4。然后将其用乙酸乙酯(20mL)稀释，用水(10mL)洗涤三次并用盐水(10mL)洗涤两次，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液减压浓缩，得到呈无色油状物的标题化合物(44mg，90％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.32min，C17H29N3O4S的计算质量371.2，m/z实测值372.1[M+H]+。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ4.50-4.04(m,3.4H),3.85-3.69(m,3.6H),3.31-3.21(m,1H),3.08-2.76(m,3H),2.09-1.81(m,2H),1.51(s,9H),1.33(s,6H)。
中间体S14：2,2-二甲基-4-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丁酸盐酸盐
向4-(7-(叔丁氧基羰基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丁酸(中间体S14-3)(44mg，0.118mmol)在1,4-二噁烷(1mL)中的溶液中添加在1,4-二噁烷中的4N盐酸(3mL)。在室温搅拌1.5小时后，将混合物减压浓缩，得到呈无色油状物的标题化合物(37mg，90％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝0.31min，C12H22ClN3O2S的计算质量271.2，m/z实测值272.0[M-HCl+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ4.56-4.51(m,1H),4.11-4.04(m,1H),3.39-3.25(m,4H),3.22-3.21(m,4H),2.96-2.84(m,2H),1.79-1.67(m,2H),1.15(s,6H)。
类似于化合物18B，由中间体H2-1A和S14制备化合物28。
LC-MS(ESI)：RT＝3.612min，C30H37FN6O4S2的计算质量628.3，m/z实测值629.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.83-7.82(m,1H),7.62(d,J＝3.2Hz,1H),7.06-6.98(m,2H),6.85-6.80(m,1H),5.88(s,1H),4.38-4.28(m,1H),4.06-3.79(m,5H),3.69-3.51(m,3H),3.21-3.13(m,1H),2.98-2.66(m,2H),2.41(s,3H),2.36-1.68(m,5H),1.20-1.13(m,5H),1.02(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物29B：1-((7-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)环丁烷-1-甲酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001581
中间体S15的制备：1-((3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)环丁烷-1-甲酸
Figure BDA0003122494520001591
中间体S15-1：乙基1-氰基环丁烷-1-甲酸酯
在0℃，向氰基乙酸乙酯(10.0g，88.4mmol)在丙酮(200mL)中的溶液中添加1,3-二溴丙烷(17.0g，84.2mmol)和碳酸钾(30.0g，217mmol)。在56℃搅拌过夜后，将混合物过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)纯化，得到呈白色固体的标题化合物(7.00g，由1H NMR得到的纯度为90％，47％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.27(q,J＝7.2Hz,2H),2.76-2.66(m,2H),2.64-2.59(m,2H),2.34-2.24(m,1H),2.22-2.11(m,1H),1.34(t,J＝7.2Hz,3H)
中间体S15-2：乙基1-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)环丁烷-甲酸酯
在室温，向乙基1-氰基环丁烷甲酸酯(中间体S15-1)(2.00g，90％纯度，11.8mmol)在乙醇(10mL)中的溶液中添加二碳酸二叔丁酯(5.20g，23.8mmol)、三乙胺(3.60g，35.6mmol)和拉尼镍(2.00g，22.8mmol)。在40℃在氢气气氛(50Psi)下搅拌4小时后，将反应混合物过滤并将滤液浓缩并通过硅胶色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)纯化，得到呈黄色油状物的标题化合物(2.30g，从1HNMR测得的纯度为90％，68％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.92(s,1H),4.17(q,J＝7.2Hz,2H),3.49(d,J＝6.4Hz,2H),2.43-2.36(m,2H),2.09-1.90(m,4H),1.44(s,9H),1.29(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体S15-3：乙基1-(氨基甲基)环丁烷甲酸酯盐酸盐
在氮气气氛下，向乙基1-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)环丁烷甲酸酯(中间体S15-2)(2.30g，90％纯度，8.04mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加在乙酸乙酯中的4M盐酸(10mL，40mmol)。在室温在氮气气氛下搅拌1小时后，将反应混合物浓缩，得到呈白色固体的标题化合物(1.50g，由1H NMR得到的纯度为90％，87％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.33(s,3H),4.13(q,J＝7.2Hz,2H),3.16(s,2H),2.36-2.28(m,2H),2.16-2.09(m,2H),2.04-1.83(m,2H),1.23(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体S15-4：1-苄基4-叔丁基2-((((1-(乙氧基羰基)环丁基)甲基)氨基)甲基)哌嗪-1,4-二甲酸酯
在室温，向乙基1-(氨基甲基)环丙烷甲酸酯盐酸盐(中间体S15-3)(1.00g，90％纯度，4.65mmol)在甲醇(10mL)中的溶液中添加三乙胺(306mg，3.02mmol)。将反应混合物搅拌0.5小时，然后在室温添加1-苄基4-叔丁基2-甲酰基哌嗪-1,4-二甲酸酯(中间体S1-2)(1.30g，90％纯度，3.35mmol)。在室温在氮气气氛下搅拌1小时后，在0℃添加氰基硼氢化钠(528mg，8.40mmol)。然后将混合物在室温搅拌2小时，用冰水(20mL)淬灭，在减压下除去甲醇，并用乙酸乙酯(20mL)萃取三次。将合并的有机层经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过C18柱(乙腈:水＝05％至95％)纯化，得到浅黄色油状物的标题化合物(1.00g，由1H NMR得到的纯度为90％，55％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.88min，C26H39N3O6的计算质量489.3，m/z实测值490.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37-7.30(m,5H),5.14(d,J＝12.4Hz,1H),5.12(d,J＝12.4Hz,1H),4.28-4.09(m,4H),4.05-3.82(m,2H),3.03-2.83(m,5H),2.79-2.73(m,2H),2.43-2.30(m,2H),1.89(br s,4H),1.45(s,9H),1.28-1.22(m,3H)。
中间体S15-5：叔丁基3-((((1-(乙氧基羰基)环丙基)甲基)-氨基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯
在室温，向1-苄基4-叔丁基2-((((1-(乙氧基羰基)环丁基)甲基)氨基)甲基)哌嗪-1,4-二甲酸酯(中间体S15-4)(1.00g，90％纯度，1.84mmol)在乙醇(10mL)中的溶液中添加10％wt氢氧化钯炭(600mg，0.427mmol)。在室温在氢气气氛(气球)下搅拌过夜后，将反应混合物过滤并浓缩，得到呈浅黄色油状物的标题化合物(690mg，由1H NMR得到的纯度为90％，95％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.15(q,J＝7.2Hz,2H),3.99-3.75(m,2H),3.00-2.87(m,4H),2.80-2.67(m,3H),2.60-2.36(m,4H),1.99-1.86(m,4H),1.45(s,9H),1.26(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体S15-6：叔丁基2-((1-(乙氧基羰基)环丁基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯
在0℃，在氮气气氛下，向叔丁基3-((((1-(乙氧基羰基)环丙基)甲基)-氨基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯(中间体S15-5)(690mg，90％纯度，1.75mmol)和三乙胺(530mg，5.24mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加硫光气(301mg，2.62mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液。在室温搅拌过夜后，将混合物用冰水(10mL)稀释并用二氯甲烷(10mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝8:1至2:1)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(360mg，由1HNMR得到的纯度为90％，47％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.75min，C19H31N3O4S的计算质量397.2，m/z实测值398.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.48-4.43(m,1H),4.21-4.05(m,6H),3.74-3.68(m,1H),3.60-3.53(m,1H),3.07-2.97(m,2H),2.87-2.84(m,1H),2.74-2.49(m,1H),2.45-2.38(m,2H),2.17-2.08(m,3H),1.98-1.86(m,1H),1.47(s,9H),1.31-1.22(m,3H)。
将外消旋中间体S15-6(360mg，90％纯度，0.815mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak IG 5μm 20*250mm；流动相：CO2:MeOH＝80:20，以50g/min；温度：30℃；波长：230nm，背压：100巴)进行分离，得到呈黄色固体的中间体S15-6A(118mg，由1H NMR得到的纯度为90％，33％产率，99.6％立体纯)和中间体S15-6B(130mg，由1H NMR得到的纯度为90％，36％产率，97.7％立体纯)。
中间体S15-6A：LC-MS(ESI)：RT＝1.75min，C19H31N3O4S的计算质量397.2，m/z实测值398.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IG 5μm 4.6*250mm；流动相：CO2:MeOH＝80:20，以3g/min；温度：40℃；波长：230nm，背压：100巴，RT＝4.09min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.49-4.45(m,1H),4.23-3.98(m,6H),3.77-3.68(m,1H),3.56(t,J＝9.6Hz,1H),3.07-2.99(m,2H),2.87-2.76(m,1H),2.64-2.53(m,1H),2.47-2.38(m,2H),2.17-2.06(m,3H),1.98-1.89(m,1H),1.47(s,9H),1.29(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体S15-6B：LC-MS(ESI)：RT＝1.75min，C19H31N3O4S的计算质量397.2，m/z实测值398.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IG 5μm 4.6*250mm；流动相：CO2:MeOH＝80:20，以3g/min；温度：40℃；波长：230nm，背压：100巴，RT＝5.35min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.48-4.45(m,1H),4.23-4.04(m,6H),3.78-3.68(m,1H),3.56(t,J＝9.6Hz,1H),3.07-2.98(m,2H),2.92-2.76(m,1H),2.65-2.51(m,1H),2.46-2.38(m,2H),2.16-2.06(m,3H),1.98-1.91(m,1H),1.47(s,9H),1.31-1.26(m,3H)。
中间体S15-7：1-((7-(叔丁氧基羰基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)环丁烷甲酸
在氮气气氛下，向叔丁基2-((1-(乙氧基羰基)环丙基)甲基)-3-硫氧代-六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯(中间体S15-6)(110mg，90％纯度，0.249mmol)在四氢呋喃(2mL)、甲醇(3mL)和水(2mL)中的溶液中添加一水氢氧化锂(31mg，0.739mmol)。在室温搅拌过夜后，将反应混合物用1M盐酸水溶液(10mL)酸化至pH＝5，并用乙酸乙酯(15mL)萃取三次。将合并的有机层经无水Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩，得到呈浅黄色固体的所需化合物(88mg，72％纯度，69％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.26min，C17H27N3O4S的计算质量369.2，m/z实测值370.1[M+H]+。
由中间体中间体S15-6B制备中间体S15-7。
LC-MS(ESI)：RT＝1.19min，C17H27N3O4S的计算质量369.2，m/z实测值370.0[M+H]+。
中间体S15：1-((3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)环丁烷甲酸盐酸盐
在氮气气氛下，向1-((7-(叔丁氧基羰基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)甲基)环丁烷甲酸(中间体S15-7)(88mg，72％纯度，0.171mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液中添加在乙酸乙酯中的4M盐酸(2mL，8mmol)。在室温在氮气气氛下搅拌1小时后，将反应混合物浓缩，得到呈白色固体的标题化合物(58mg，由1H NMR得到的纯度为90％，99％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ4.59-4.55(m,1H),4.09-3.99(m,3H),3.70-3.63(m,1H),3.34-3.25(m,3H),2.95-2.89(m,1H),2.82(d,J＝16.0Hz,1H),2.70(d,J＝16.0Hz,1H),2.37-2.27(m,2H),2.09-1.97(m,3H),1.86-1.77(m,1H)。
由中间体S15-7B制备中间体S15-B。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ4.59-4.55(m,1H),4.09-3.98(m,3H),3.68-3.63(m,1H),3.34-3.24(m,3H),2.95-2.88(m,1H),2.85-2.78(m,2H),2.37-2.28(m,2H),2.09-1.97(m,3H),1.86-1.76(m,1H)。
类似于化合物18B，由中间体H2-1A和S15-B制备化合物29B。
LC-MS(ESI)：RT＝3.692min，C30H35FN6O4S2的计算质量626.2，m/z实测值627.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.94(d,J＝3.2Hz,1H),7.74(d,J＝3.2Hz,1H),7.18-7.10(m,2H),6.97-6.92(m,1H),5.98(s,1H),4.54-4.51(m,1H),4.16-4.01(m,6H),3.93(d,J＝16.8Hz,1H),3.68-3.63(m,1H),3.32-3.28(m,1H),3.23-3.19(m,1H),2.99-2.96(m,1H),2.89-2.85(m,1H),2.52(s,3H),2.48-2.35(m,3H),2.19-2.05(m,4H),1.94-1.82(m,1H),1.14(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物30A：3-(7-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-3-甲基丁酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001641
中间体S15的制备：乙基3-甲基-3-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丁酸酯
Figure BDA0003122494520001642
中间体S15-1：(S)-叔丁基4-苄基-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸酯
向(S)-叔丁基3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸酯(5.0g，23.1mmol)在乙腈(50mL)中的溶液中添加三乙胺(6.4mL，46.0mmol)和苄基溴(3.3mL，27.8mmol)。在80℃在氮气气氛下搅拌过夜后，将混合物浓缩并通过硅胶色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝4:1至2:1)纯化，得到呈白色固体的标题化合物(4.2g，由HNMR得到的纯度为95％，56％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.60min，C17H26N2O3的计算质量306.2，m/z实测值307.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.35-7.28(m,5H),4.02(d,J＝13.2Hz,1H),3.87(dd,J＝11.6,5.6Hz,1H),3.69(dd,J＝13.6,3.2Hz,1H),3.60-3.51(m,2H),3.42(d,J＝13.2Hz,1H),3.38-3.32(m,1H),3.22-3.11(m,1H),2.80-2.74(m,1H),2.63-2.54(m,1H),2.31-2.25(m,1H),1.46(s,9H)。
中间体S15-2：叔丁基4-苄基-3-甲酰基哌嗪-1-甲酸酯
在-78℃，向草酰氯(3.3mL，39.0mmol)在二氯甲烷(50mL)中的溶液中逐滴添加二甲亚砜(3.7mL，52.1mmol)。将混合物在-78℃搅拌15分钟，然后逐滴添加(S)-叔丁基4-苄基-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸酯(中间体S15-1)(4.2g，95％纯度，13.0mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液。在-78℃搅拌1.5小时后，添加三乙胺(11mL，79.1mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液。将混合物在-78℃搅拌30分钟并温热至室温再持续30分钟。将混合物用水(30mL)淬灭，并用二氯甲烷(50mL)萃取两次。将合并的有机层经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩，得到呈黄色油状物的粗标题化合物(4.3g，由HNMR得到的纯度为90％，98％产率)，将其无需进一步纯化而直接用于下一步骤。LC-MS(ESI)：RT＝1.74min，C17H24N2O3的计算质量304.2，m/z实测值305.0[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.67(d,J＝2.4Hz,1H),7.34-7.28(m,5H),3.90(d,J＝13.2Hz,1H),3.65(dd,J＝13.2,4.0Hz,1H),3.58(d,J＝13.2Hz,1H),3.54-3.46(m,2H),3.32-3.28(m,1H),3.11-3.00(m,1H),2.96-2.91(m,1H),2.34-2.27(m,1H),1.45(s,9H)。
中间体S15-3：叔丁基4-苄基-3-(((4-乙氧基-2-甲基-4-氧代丁烷-2-基)氨基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯
在室温，向乙基3-氨基-3-甲基丁酸酯盐酸盐(1.0g，5.51mmol)在甲醇(25mL)中的溶液中添加三乙胺(0.8mL，5.74mmol)。在室温搅拌0.5小时后，添加叔丁基4-苄基-3-甲酰基哌嗪-1-甲酸酯(中间体S15-2)(1.5g，90％产率，4.44mmol)在甲醇(5mL)中的溶液并在30℃搅拌3小时。然后在0℃添加氰基硼氢化钠(0.5g，7.96mmol)并将混合物在室温搅拌1小时。然后将混合物用水(10mL)淬灭，真空下去除甲醇并用乙酸乙酯(20mL)萃取两次。将合并的有机层经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩，得到残余物，将该残余物通过硅胶色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝3:1至1:1)纯化，得到呈浅黄色油状物的标题化合物(1.5g，由HNMR得到的纯度90％，70％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.89min，C24H39N3O4的计算质量433.3，m/z实测值433.9[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.35-7.29(m,4H),7.26-7.22(m,1H),4.10(q,J＝7.2Hz,2H),4.03-3.95(m,1H),3.74-3.57(m,1H),3.51-3.35(m,3H),3.25-3.12(m,1H),2.80-2.65(m,3H),2.46-2.37(m,3H),2.25-2.11(m,1H),1.45(s,9H),1.24(t,J＝7.2Hz,3H),1.15(s,6H)。
中间体S15-4：叔丁基3-(((4-乙氧基-2-甲基-4-氧代丁烷-2-基)氨基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯
向叔丁基4-苄基-3-(((4-乙氧基-2-甲基-4-氧代丁烷-2-基)氨基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯(中间体S15-3)(1.5g，90％纯度，3.11mmol)在甲醇(30mL)中的溶液中添加20％氢氧化钯/活性炭(0.5g)。在60℃在氢气气氛(60psi)下搅拌过夜后，将混合物过滤并将滤液浓缩，得到呈无色油状物的标题化合物(1g，由HNMR得到的纯度为90％，84％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.13(q,J＝7.2Hz,2H),3.76-3.61(m,3H),3.03-2.94(m,2H),2.73-2.62(m,3H),2.52-2.45(m,1H),2.41-2.37(m,1H),2.02(s,1H),1.46(s,9H),1.26(t,J＝7.2Hz,3H),1.16(s,6H)。
中间体S15-5：叔丁基2-(4-乙氧基-2-二甲基-4-氧代丁烷-2-基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯
在0℃，向叔丁基3-(((4-乙氧基-2-甲基-4-氧代丁烷-2-基)氨基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯(中间体S15-4)(1.0g，90％纯度，2.62mmol)和三乙胺(1mL，7.19mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液中添加硫光气(0.3mL，3.91mmol)。在0℃搅拌1小时后，将混合物用水(10mL)淬灭。将混合物用二氯甲烷(20mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩，得到残余物，将该残余物通过C18柱(乙腈:水＝70％至85％)纯化，得到呈浅黄色油状物的标题化合物(400mg，由HNMR得到的纯度为95％，38％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.72min，C18H31N3O4S的计算质量385.2，m/z实测值386.0[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ4.25(d,J＝10.0Hz,1H),4.22-4.07(m,4H),3.89(t,J＝9.6H,1H),3.77(d,J＝12.4Hz,1H),3.68-3.61(m,1H),3.43(dd,J＝9.6,7.2Hz,1H),3.34(d,J＝12.4Hz,1H),2.91-2.85(m,2H),2.73-2.61(m,1H),1.65(s,3H),1.61(s,3H),1.47(s,9H),1.24(t,J＝7.2Hz,3H)。
将部分外消旋中间体S15-5(160mg，95％纯度，0.394mmol，比例：3.7:1)通过手性制备型HPLC(柱：Chiralpak IG 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH＝70:30，以18mL/min；温度：30℃；波长：254nm)进行分离，得到无色油状物的中间体S15-5A(110mg，由HNMR得到的纯度为95％，69％产率，100％ee)。LC-MS(ESI)：RT＝1.73min，C18H31N3O4S的计算质量385.2，m/z实测值386.0[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IG 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝70:30，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝7.995min)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ4.52(d,J＝10.4Hz,1H),4.27-4.01(m,4H),3.89(t,J＝9.6Hz,1H),3.77(d,J＝18.8Hz,1H),3.68-3.60(m,1H),3.43(dd,J＝9.6,7.2Hz,1H),3.34(d,J＝16.0Hz,1H),2.91-2.85(m,2H),2.74-2.62(m,1H),1.65(s,3H),1.61(s,3H),1.47(s,9H),1.24(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体S15：乙基3-甲基-3-(3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)丁酸酯盐酸盐
将叔丁基2-(4-乙氧基-2-甲基-4-氧代丁烷-2-基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-甲酸酯(中间体S15-5)(80mg，95％纯度，0.197mmol)在4M盐酸(在乙酸乙酯中)(5mL)中的溶液在室温搅拌1小时。将混合物浓缩，得到呈白色固体的标题化合物(60mg，98％纯度，93％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.295min，C13H23N3O2S的计算质量285.2，m/z实测值286.2[M+H]+。
由中间体S15-5A制备中间体S15-A。
LC-MS(ESI)：RT＝1.38min，C13H23N3O2S的计算质量285.2，m/z实测值286.0[M+H]+。
化合物30A-1：乙基(4S)-6-((2-(4-乙氧基-2-甲基-4-氧代丁烷-2-基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-7(1H)-基)甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯
Figure BDA0003122494520001681
类似于化合物18B，由中间体H2-1A和S15-A制备化合物30A-1。LC-MS(ESI)：RT＝1.99min，C31H39FN6O4S2的计算质量642.3，m/z实测值643.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.55(s,1H),7.82(d,J＝3.2Hz,1H),7.42(d,J＝2.8Hz,1H),7.10-7.05(m,1H),6.99-6.97(m,1H),6.93-6.88(m,1H),6.01(s,1H),4.63(d,J＝14.2Hz,1H),4.14-3.99(m,5H),3.92-3.85(m,3H),3.70(d,J＝16.4Hz,1H),3.47-3.39(m,2H),3.23-3.16(m,1H),2.86(d,J＝14.4Hz,1H),2.75(d,J＝11.2Hz,1H),2.55(s,1.5H),2.54(s,1.5H),2.51-2.47(m,1H),2.24(t,J＝10.4Hz,1H),1.64(s,3H),1.61(s,3H),1.26(t,J＝7.2Hz,3H),1.12(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物30A：3-(7-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-3-甲基丁酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001691
在0℃，向化合物30A-1(70mg，95％纯度，0.103mmol)在四氢呋喃(0.4mL)、甲醇(0.4mL)和水(0.2mL)中的溶液中添加一水氢氧化锂(15mg，0.357mmol)。在室温搅拌3小时后，将混合物用1M盐酸水溶液酸化至pH 5-6，并通过C18柱(乙腈:水＝40％至65％)纯化，得到呈黄色固体的标题化合物(25mg，99.1纯度，39％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝3.484min，C29H35FN6O4S2的计算质量614.2，m/z实测值615.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.9(d,J＝3.2Hz,1H),7.74(d,J＝3.2Hz,1H),7.19-7.10(m,2H),6.97-6.93(m,1H),5.99(s,1H),4.58(d,J＝14.4Hz,1H),4.14-4.04(m,3H),3.95-3.91(m,3H),3.71(d,J＝16.4Hz,1H),3.53-3.49(m,1H),3.40-3.36(m,1H),3.17(td,J＝12.0,3.2Hz,1H),2.94(d,J＝11.4Hz,1H),2.84(d,J＝10.4Hz,1H),2.53(s,1.5H),2.52(s,1.5H),2.44(td,J＝12.0,3.2Hz,1H),2.25-2.18(m,1H),1.66(s,3H),1.63(s,3H),1.14(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物31A：3-(7-((6-(3-氟-2-甲基苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(5-甲基噁唑-4-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001701
类似于化合物18B，由中间体H16-1A和S1-A制备这种化合物。LC-MS(ESI)：RT＝8.057min，C29H35FN6O5S的计算质量598.2，m/z实测值599.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.04(s,1H),7.17-7.10(m,1H),7.01(d,J＝7.6Hz,1H),6.93(t,J＝9.0Hz,1H),5.97(s,1H),4.50(d,J＝13.2Hz,1H),4.15-4.08(m,2H),3.95-3.85(m,3H),3.70(t,J＝9.6Hz,1H),3.62(s,3H),3.30-3.24(m,2H),2.97-2.94(m,1H),2.88-2.85(m,1H),2.53(s,3H),2.51(s,3H),2.50-2.42(m,1H),2.17(t,J＝10.8Hz,1H),1.24(s,3H),1.23(s,3H)。
化合物32A和32B：3-(7-((5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(5-甲基噁唑-4-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2-甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001702
类似于化合物27A，分别由中间体H15-1A以及S12-A和S12-B制备化合物32A和32B。
化合物32A：LC-MS(ESI)：RT＝3.546min，C29H35FN6O5S的计算质量598.7，m/z实测值599.3[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:TFA＝70:30:0.2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝15.665min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.28(br s,1H),7.69(s,1H),7.09-7.03(m,1H),6.93-6.88(m,2H),6.00(s,1H),4.51(d,J＝12.8Hz,1H),4.16(d,J＝17.2Hz,1H),4.08-3.99(m,3H),3.91-3.84(m,2H),3.79-3.66(m,2H),3.31-3.25(m,1H),3.20-3.15(m,1H),3.08-3.03(m,1H),2.92-2.89(m,1H),2.84-2.81(m,1H),2.54(s,6H),2.52-2.49(m,1H),2.19(t,J＝11.2Hz,1H),1.26(s,1.5H),1.24(s,1.5H),1.11(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物32B：LC-MS(ESI)：RT＝3.699min，C29H35FN6O5S的计算质量598.7，m/z实测值599.3[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:TFA＝70:30:0.2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝21.466min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.28(br s,1H),7.68(s,1H),7.09-7.03(m,1H),6.93-6.87(m,2H),5.99(s,1H),4.53(d,J＝12.8Hz,1H),4.15(d,J＝17.2Hz,1H),4.07-3.99(m,3H),3.90-3.76(m,3H),3.67(t,J＝9.6Hz,1H),3.34-3.25(m,2H),3.09-3.04(m,1H),2.89(d,J＝10.4Hz,1H),2.78(d,J＝10.8Hz,1H),2.54(s,6H),2.53-2.49(m,1H),2.17(t,J＝12.0Hz,1H),1.25(d,J＝6.8Hz,3H),1.11(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物33A：3-(7-((6-(2-氯-4-氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(5-甲基噁唑-4-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001721
类似于化合物18B，由中间体H17-1A和S1-A制备这种化合物。LC-MS(ESI)：RT＝8.716min，C29H34ClFN6O5S的计算质量632.2，m/z实测值633.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.28(br s,1H),9.42(s,1H),8.38(s,1H),7.41(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),7.31(dd,J＝8.8,6.4Hz,1H),7.16(td,J＝8.4,2.4Hz,1H),6.00(s,0.96H),5.89(s,0.04H),4.35(d,J＝11.6Hz,1H),4.02-3.89(m,5H),3.76(s,2H),3.63(t,J＝9.6Hz,1H),3.18-3.10(m,2H),2.93-2.68(m,2H),2.51(s,3H),2.28(td,J＝11.2,2.8Hz,1H),2.07(t,J＝10.8Hz,1H),1.12(s,6H),1.05(t,J＝7.6Hz,3H)。
化合物34A：3-(7-((6-(2-氯-4-氟苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(5-甲基噁唑-4-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001722
类似于类似于化合物18B，由中间体H18-1A和S1-A制备这种化合物。LC-MS(ESI)：RT＝9.350min，C28H32ClFN6O5S的计算质量618.2，m/z实测值619.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.46(s,1H),8.37(s,1H),7.41(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),7.29(dd,J＝8.8,6.4Hz,1H),7.15(td,J＝8.4,2.4Hz,1H),5.99(s,1H),4.35(d,J＝12.0Hz,1H),4.03-3.90(m,3H),3.80-3.73(m,2H),3.63(t,J＝10.0Hz,1H),3.52(s,3H),3.18-3.10(m,2H),2.93-2.84(m,2H),2.52(s,3H),2.32-2.26(m,1H),2.08(t,J＝10.8Hz,1H),1.12(s,6H)。
化合物35A和35B：7-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-2-甲基-3-硫氧代八氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-甲酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001731
类似于化合物19A，分别由中间体H2-1A以及S9-A和S9-B制备化合物35A和35B。
化合物35A：LC-MS(ESI)：RT＝3.340min，C26H29FN6O4S2的计算质量572.2，m/z实测值573.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.88(d,J＝3.2Hz,1H),7.67(d,J＝3.2Hz,1H),7.12-7.05(m,2H),6.90-6.84(m,1H),5.91(s,1H),4.32-4.28(m,1H),4.21(d,J＝17.2Hz,1H),4.04-3.94(m,3H),3.81(d,J＝16.8Hz,1H),3.73-3.66(m,1H),3.63-3.57(m,1H),3.21-3.19(m,1H),3.12-3.10(m,1H),3.07(s,3H),2.82-2.80(m,1H),2.44(s,3H),2.41-2.35(m,1H),1.06(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物35B：LC-MS(ESI)：RT＝3.321min，C26H29FN6O4S2的计算质量572.2，m/z实测值573.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.94(d,J＝3.2Hz,1H),7.73(d,J＝3.2Hz,1H),7.21-7.13(m,2H),6.97-6.93(m,1H),5.96(s,1H),4.45-4.42(m,1H),4.23(d,J＝16.4Hz,1H),4.12-4.03(m,3H),3.92(d,J＝16.4Hz,1H),3.79-3.74(m,1H),3.69-3.65(m,1H),3.30-3.26(m,1H),3.19-3.16(m,1H),3.15(s,3H),3.08-3.05(m,1H),2.67-2.58(m,1H),2.52(s,3H),1.13(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物36B：3-(7-((6-氘代-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001741
类似于化合物18B，由中间体H19-1B和S1-A制备这种化合物。LC-MS(ESI)：RT＝3.311min，C29H34DFN6O4S2的计算质量611.2，m/z实测值616.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.95(d,J＝3.2Hz,1H),7.74(d,J＝3.2Hz,1H),7.18-7.11(m,2H),6.97-6.93(m,1H),4.53(dd,J＝13.2,1.6Hz,1H),4.14-4.04(m,4H),3.97-3.85(m,3H),3.70(t,J＝10.4Hz,1H),3.37-3.30(m,1H),3.28-3.24(m,1H),2.98(d,J＝11.2Hz,1H),2.90(dd,J＝11.2,2.8Hz,1H),2.53(s,3H),2.45(td,J＝12.0,3.6Hz,1H),2.8(t,J＝10.8Hz,1H),1.24(s,3H),1.23(s,3H),1.14(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物37：3-(7-((5-(乙氧基羰基)-6-(6-氟-2-甲基吡啶-3-基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-3-硫氧代六氢咪唑并[1,5-b]吡嗪-2(3H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一对映体)
Figure BDA0003122494520001751
类似于化合物18B，由中间体H20-1A和S1-A制备这种化合物。LC-MS(ESI)：RT＝3.409min，C28H34FN7O4S2的计算质量615.2，m/z实测值616.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.94(d,J＝3.2Hz,1H),7.80-7.74(m,2H),6.85(dd,J＝8.0,2.4Hz,1H),5.95(s,1H),4.53-4.49(m,1H),4.13-4.04(m,4H),3.95-3.83(m,3H),3.71-3.66(m,1H),3.35-3.34(m,0.6H),3.28-3.22(m,1.4H),2.97-2.87(m,2H),2.75(s,3H),2.47-2.40(m,1H),2.20-2.14(m,1H),1.23(s,3H),1.22(s,3H),1.14(t,J＝7.2Hz,3H)。
选择GLS4(WO 2008154817，实例5；Bioorganic&Medicinal Chemistry[生物有机化学与医药化学],2017,25,1042-1056，化合物8n)作为参考1；选择另一个化合物(WO2015132276，实例76)作为参考2。两种参考化合物的化学结构如下所示。
Figure BDA0003122494520001752
实例1：HepG2.2.15细胞中的抗病毒测定
材料和设备
1)细胞系
HepG2.2.15(该HepG2.2.15细胞系可以通过转染HepG2细胞系产生，如Sells,Chen和Acs 1987(Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]84:1005-1009)所述的，并且该HepG2细胞系可以从
Figure BDA0003122494520001761
在编号HB-8065TM下获得)。
2)试剂
DMEM/F12(英杰公司(INVITROGEN)-11330032)
FBS(GIBCO公司-10099-141)
二甲亚砜(DMSO)(西格玛公司(SIGMA)-D2650)
青霉素-链霉素溶液(HYCLONE公司-SV30010)
NEAA(英杰公司-1114050)
L-谷氨酰胺(英杰公司-25030081)
遗传霉素选择性抗生素(G418，500mg/ml)(英杰公司-10131027)
胰蛋白酶消化液(英杰公司-25300062)
CCK8(BIOLOTE公司-35004)
QIAamp 96DNA血液试剂盒(12)(凯杰公司(QIAGEN)-51162)
FastStart通用探针Mast Mix(罗氏公司(ROCHE)-04914058001)
3)耗材
96孔细胞培养板(科斯塔公司(COSTAR)-3599)
Micro Amp Optical 96孔反应板(应用生物系统公司(APPLIED BIOSYSTEMS)-4306737)
Micro Amp Optical 384孔反应板(应用生物系统公司)
4)设备
读板器(分子设备公司(MOLECULAR DEVICES)，SPECTRAMAX M2e)
离心机(贝克曼公司(BECKMAN)，ALLEGRA-X15R)
实时PCR系统(应用生物系统公司，QUANTSTUDIO 6)
实时PCR系统(应用生物系统公司，7900HT)
方法
1)抗HBV活性和细胞毒性测定
将HepG2.2.15细胞以40,000个细胞/孔和5,000个细胞/孔的密度铺到96孔板中的2％FBS培养基中，分别用于HBV抑制剂活性和细胞毒性测定。在37℃、5％CO2下孵育过夜后，将细胞用含有化合物的培养基处理6天(处理3天后更新培养基和化合物)。将每种化合物在一式三份的8种不同浓度的1:3连续稀释液中进行测试。针对抗HBV活性测定，该化合物的最高浓度是10uM或1uM，针对细胞毒性测定，其最高浓度是100uM。
通过CCK-8测定法来测定细胞活力。化合物处理6天后，将20μlCCK-8试剂添加至细胞毒性测定板中的每个孔中。将细胞培养板在37℃、5％CO2中孵育2.5h。测量450nm波长处的吸光度和630nm波长处的吸光度(后者为参考吸光度)。
通过定量实时聚合酶链式反应(qPCR)评估化合物诱导的HBV DNA水平的变化。简言之，根据手册使用QIAamp 96DNA血液试剂盒提取培养基中的HBV DNA，然后使用下表1中的引物和探针通过实时PCR测定来定量。
表1
Figure BDA0003122494520001771
2)数据分析
通过GRAPHPAD PRISM软件计算EC50和CC50值。如果DMSO对照的CV％低于15％并且参考化合物显示预期的活性或细胞毒性，则认为此批实验的数据是合格的。
结果：参见下表2。
表2
Figure BDA0003122494520001781
如表2所示的效能数据，所有这些化合物都显示出对HBV HepG2.2.15细胞的高效体外活性。
实例2：测试化合物在人肝细胞中的代谢稳定性
材料和试剂：参见下表3。
表3
Figure BDA0003122494520001791
研究设计
1.将冷冻保存的人肝细胞在37℃水浴中解冻并且用预热的孵育培养基稀释至1×10^6个活细胞/mL的工作细胞密度。
2.将198μL预热的肝细胞悬液掺有2μL 100μM化合物或参考化合物(维拉帕米)，在96孔板中的最终浓度为1.0μM。在37℃、900rpm下孵育该板。所有的孵育都将单独进行。
3.在0、15、30、60、90和120分钟的时间点收集25μL等分试样的孔内容物。通过添加6倍体积的内标冷乙腈来停止反应。
4.在3,220g下离心25分钟后，将100μL等分试样的上清液与100μL超纯H2O混合，然后用于LC-MS/MS分析。
数据分析
所有计算均使用Microsoft Excel进行。从提取的离子色谱图确定峰面积。通过亲本消失百分比对比时间曲线的回归分析，确定亲本化合物的体外半衰期(t1/2)。
体外半衰期(体外t1/2)由斜率值k确定：
体外t1/2＝0.693/k
使用以下方程将体外t1/2(以min计)转化为体外固有清除率(体外CLint，以μL/min/10^6个细胞计)：
体外CLint＝kV/N
V＝孵育体积(0.2mL)；
N＝每孔肝细胞数(0.2×10^6个细胞)。
使用以下方程将体外t1/2(以min计)转化为按比例增加的固有清除率(CLint(肝脏)，以mL/min/kg计)：
CLint(肝脏)＝kV/N×换算系数
表4.以下列出了用于体内固有清除率预测的换算系数：
Figure BDA0003122494520001801
测定中将包括对照化合物维拉帕米。不在规定限度内的化合物的任何值将被拒绝，并将重复实验。
结果
表5：人肝细胞中化合物的代谢稳定性的结果总结
Figure BDA0003122494520001802
肝细胞的代谢稳定性测试已成为用于体外评估药物和其他外源物的肝代谢和毒性的“金标准”。如表5所示的人肝细胞稳定性数据，当与参考1和参考2相比时，化合物1A、3B和4B显示改善了人肝细胞中的代谢稳定性。
实例3：体外评估冷冻保存的人肝细胞中的细胞色素P450(Cyp450)诱导
材料：参见下表6。
表6
Figure BDA0003122494520001811
设备：
Infinite 200PRO酶标仪，帝肯公司(Tecan)
7500QPCR系统，应用生物系统公司。
研究设计
人肝细胞的制备和铺板
1.将冷冻保存的人肝细胞在37℃水浴中解冻并且通过铺板培养基稀释至0.55×10^6个细胞/mL的接种密度。
2.转移100μL到胶原蛋白I包被的96孔板的每个孔中。将一个或多个板放置到培养箱中并在37℃孵育4-6小时。
3.孵育后，观察细胞形态，摇晃一个或多个板以使碎片松动，并且更换培养基。将板放置到培养箱中并孵育18小时。
与一种或多种测试化合物一起孵育
1.用37℃制备的孵育培养基制备将测试化合物和阳性对照诱导剂稀释至各自的工作浓度(表11)。处理组中的DMSO的最终浓度为0.1％。制备在DMSO中的25mM氯丙嗪并用孵育培养基稀释1000倍作为细胞毒性对照。
表11：测试化合物和阳性对照诱导剂浓度
Figure BDA0003122494520001821
2.从培养箱中取出肝细胞板。观察细胞形态。用125μL的毒性对照、DMSO对照、诱导剂或测试品溶液(每种一式三份)替换适当孔中的培养基。
3.24小时和48小时后，从培养箱中取出肝细胞板并且观察细胞形态。用从DMSO储备液中新稀释的测试品更新培养基。将板放回培养箱。
3.细胞活力评估
处理72小时候，将孵育培养基温热至37℃。从培养箱中取出一个或多个孵育板。观察细胞形态。通过CellTiter-FluorTM细胞活力测定试剂盒评估细胞活力。
4.mRNA的制备和RT-PCR
1.使用Cells-to-Ct试剂盒制备并测量mRNA。将DNA酶添加到裂解溶液中。
2.将15μL样品裂解液添加到35μL逆转录预混液(含有2×RT缓冲液，20×RT酶混合物和无核酸酶水)中，使最终的反应体积为50μL。
3.分别地，为CYP3A4制备了PCR混合物，该混合物含有CYP特异性探针组，也为作为内源对照基因的ACTB制备了PCR混合物。典型的PCR混合物包含TaqMan通用预混液(2×)、Taqman基因表达测定探针(20×，CYP，标记的FAM)、Taqman基因表达测定探针(20×，ACTB，标记的VIC)和无RNA酶水。
4.将4μL cDNA样品或不含细胞裂解液的RT混合物(阴性对照)添加到PCR混合物中，使最终体积为20μL。标准曲线模板是由相应的利福平在最高浓度下诱导的样品的cDNA样品混合物的3倍连续稀释液制备的。
5.将反应在应用生物系统公司的实时PCR系统(AB 7500型)上分析。每个PCR重复进行三次。
数据分析
所有计算均使用Microsoft Excel进行。
1)细胞活力
细胞活力百分比(％)＝(I(样品)-I(背景))/(I(媒介物)-I(背景))×100
式中“I”意指荧光强度。
2)mRNA定量
为了测定mRNA水平，每个孔中的mRNA含量表示为2Ct(ACTB)-Ct(CYP)。
诱导倍数＝mRNA(诱导的)/mRNA(媒介物)
3)调整的阳性对照百分比通过以下确定：
％阳性对照＝[(测试品的诱导倍数)/(阳性对照的诱导倍数)]*100
结果
表7：基于mRNA水平测定的测试化合物对CYP3A4的诱导潜力
Figure BDA0003122494520001831
细胞色素P450(CYP450)酶的诱导与临床药物-药物相互作用的患病率增加相关而且可能导致治疗失败。CYP3A4是迄今为止最丰富的同种型，并且主要负责所有市售药物中与CYP450相关的代谢。化合物1A的CYP诱导活性远小于媒介物对照的两倍，远小于CYP3A4同种型的阳性对照的20％。与化合物参考2相比，化合物1A证实没有CYP诱导作用，因此没有CYP诱导责任。
实例4：在雄性C57BL/6小鼠中经由静脉内和口服施用的化合物的药代动力学和组织分布研究。
材料与方法
使用体重范围为20-25g的雄性C57BL/6小鼠(华富康公司(Hua Fu Kang)，中国)。使动物禁食过夜且在给药后自由取食4小时。
将测试化合物(校正因子：1.00)溶解在20％羟基丙基-β-环糊精(HP-β-CD)中，静脉内(IV)配制品的最终浓度为1mg/ml，口服(PO)配制品的最终浓度为0.5mg/ml。将静脉内配制品以2ml/kg给药以获得2mg/kg的剂量。将口服配制品以10ml/kg给药以获得5mg/kg的最终剂量。
分别于静脉内剂量施用后7min、20min、1h、2h、4h、8h和24h采集血液样品。分别于口服剂量施用后30min、1h、2h、4h、8h、12h和24h采集血液和肝脏样品。
在每个时间点将大约0.020mL血液收集到含有K3-EDTA的BD采血管中。将样品立即放置在熔化的冰上，并且在4℃以约4000x g离心5分钟后获得血浆。分析前将血浆样品通过磷酸调节至pH 3-4并储存在-75±15℃。整个过程在1小时内完成。
在选定的时间点采集肝脏样品，并且在分析前立刻将含有组织样品的小管在液氮中速冻并保持在-75±15℃。在分析前，将所有肝脏样品进行称重并且按肝脏重量(g)与磷酸溶液体积(mL)的1:4的比例用磷酸溶液(pH至3-4)均质化。
使用LC-MS/MS法分析血浆和肝脏样品。血浆的定量下限(LLOQ)为1.0ng/ml，肝脏的定量下限为2.5ng/g。将使用“线性上调对数下调(Linear up log down)”法则的非房室分析用于所有数据。使用PhoenixTM专业版(版本6.1)进行限制性药代动力学分析。
结果：血浆PK结果参见下表8，且PO肝脏PK结果参见表9。
Figure BDA0003122494520001861
小鼠体内PK研究对于确保候选药物具有合适的PK特性是至关重要的，这些PK特性可以在临床前药理学和安全性研究中进行评估。与化合物参考1和参考2相比较，化合物1A和3B在血浆中显示出慢得多的清除率、剂量归一化的AUC高出3倍以上而且生物利用度增加，并且在肝脏中显示出剂量归一化的Cmax和剂量归一化的AUCinf大大增加。
实例5：在雄性SD大鼠中在静脉内和口服施用后测试化合物的药代动力学研究
材料与方法
使用体重范围为250-300g的雄性SD大鼠(斯贝福实验动物科技有限公司(Si BeiFu Laboratory Animal Technology Co.Ltd)，中国)。使动物禁食过夜且在给药后自由取食4小时。
将测试化合物(校正因子：1.00)溶解在20％羟基丙基-β-环糊精(HP-β-CD)中，静脉内(IV)配制品的最终浓度为1mg/ml，口服(PO)配制品的最终浓度为0.5mg/ml。
将静脉内配制品以2ml/kg给药以获得2mg/kg的剂量。将口服配制品以10ml/kg给药以获得5mg/kg的最终剂量。
分别于静脉内剂量施用后5min、15min和30min、1h、2h、4h、8h和24h采集血液样品。分别于口服剂量施用后15min和30min、1h、2h、4h、8h、12和24h采集血液样品。
在每个时间点将大约0.20mL血液收集到含有氟化钠(NaF)、草酸钾(KoX)和K3-EDTA的BD采血管中。将样品立即放置在熔化的冰上，并且在4℃以约4000x g离心5分钟后获得血浆。分析前将血浆样品通过磷酸调节至pH 3-4并储存在-75±15℃。整个过程在1小时内完成。
使用LC-MS/MS法分析血浆样品。血浆的定量下限(LLOQ)是1.0ng/ml。
将使用“线性上调对数下调”法则的非房室分析用于所有数据。使用PhoenixTM专业版(版本6.1)进行限制性药代动力学分析。
结果：血浆PK结果参见下表10。
Figure BDA0003122494520001891
大鼠体内PK研究对于确保候选药物具有适当的PK特性是至关重要的，这些PK特性可以在临床前药理学和安全性研究中进行评估。与参考2化合物相比较，化合物1A、3B和4B显示出慢得多的清除率、剂量归一化的AUC(AUCinf/剂量)高出两倍以上而且生物利用度(F(％))增加(或相等)。
序列表
<110> 詹森药业有限公司
强生（中国）投资有限公司（Johnson & Johnson (China) Investment Ltd.）
<120> 杂芳基二氢嘧啶衍生物和治疗乙型肝炎感染的方法
<130> JCN6003
<160> 3
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 1
gtgtctgcgg cgttttatca 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 2
gacaaacggg caacatacct t 21
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 3
cctctkcatc ctgctgctat gcctcatc 28

Claims (20)

1.一种具有式(I)的化合物
Figure FDA0003122494510000011
包括其氘化异构体、立体异构体或互变异构形式，或其药学上可接受的盐，其中：
R1选自由以下组成的组：苯基、苯硫基、吡啶基和吡啶酮基，任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：C1-4烷基、卤素和CN；
R2是C1-4烷基；
R3选自由以下组成的组：噻唑基、吡啶基和噁唑基，任选地被一个或多个选自氟和C1-6烷基的取代基取代；
n是整数0或1；
R4和R5独立地选自H和-COOH；
Figure FDA0003122494510000012
是单键或双键；
当X和Y通过单键连接时，X选自由以下组成的组：C(＝S)、C(＝NR6)、C(＝CHR7)和CHR8，且Y是NR9；
当X和Y通过双键连接时，X是C-SR9或C-OR9，且Y是N原子；
Z选自由以下组成的组：CH2和C(＝O)；
R6选自由以下组成的组：CN、C(＝O)CH3和SO2CH3；
R7是CN；
R8是CF3；
R9选自由以下组成的组：H、-C1-6烷基、-C1-6烷基-R10、-C1-6烷氧基-C1-6烷基-R10、-(CH2)p-C(R11R12)-R10和-(CH2)p-Q-R10；
p是整数0、1、2或3；
R11和R12连同它们所附接的碳原子一起形成3至7元饱和环，该饱和环任选地含有杂原子，该杂原子是氧或氮，该氮被H、-C1-6烷基、-C1-6烷氧基-C1-6烷基和-C1-6烷基羰基取代；
Q选自由以下组成的组：芳基、杂芳基和3至7元饱和环，该饱和环任选地含有杂原子，该杂原子是氧或氮，该氮被H、-C1-6烷基、-C1-6烷氧基-C1-6烷基和-C1-6烷基羰基取代；
R10选自-COOH、-C(＝O)NHS(＝O)2-C1-6烷基、四唑基和羧酸生物电子等排体。
2.如权利要求1所述的化合物，其中该羧酸生物电子等排体为-S(＝O)2(OH)、-P(＝O)(OH)2、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)NHCN、1,2,4-噁二唑-5(4H)-酮和3-羟基-4-甲基环丁-3-烯-1,2-二酮。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其中R1是被一个或多个选自卤素和C1-6烷基的取代基取代的苯基。
4.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R2是甲基或乙基。
5.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R3是噻唑基。
6.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R4和R5是H。
7.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X是C(＝S)。
8.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Z是CH2。
9.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R9是-C1-6烷基-CO2H、-(CH2)p-C(R11R12)-R10或-(CH2)p-Q-R10。
10.如任一前述权利要求所述的化合物，其中Q是苯基。
11.如权利要求1至9中任一项所述的化合物，其中Q是C3-6环烷基，或R11和R12连同它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基。
12.如权利要求1至9中任一项所述的化合物，其中Q是含有氧的3至6元饱和环，或R11和R12连同它们所附接的碳原子一起形成含有氧的3至6元饱和环。
13.如权利要求1所述的化合物，其选自由具有以下式的化合物组成的组：
Figure FDA0003122494510000031
Figure FDA0003122494510000041
Figure FDA0003122494510000051
Figure FDA0003122494510000061
Figure FDA0003122494510000071
Figure FDA0003122494510000081
Figure FDA0003122494510000091
14.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1-13中任一项所述的化合物并进一步包含至少一种药学上可接受的载体。
15.如权利要求1-13中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，或如权利要求15所述的药物组合物，用作药物。
16.如权利要求1-13中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，或如权利要求14所述的药物组合物，用于在预防或治疗有需要的哺乳动物的HBV感染或HBV诱发的疾病中使用。
17.如权利要求1-13中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，或如权利要求14所述的药物组合物，用于在预防或治疗慢性乙型肝炎中使用。
18.一种产品，该产品包含第一化合物和第二化合物，该第一化合物和第二化合物作为组合制剂用于在有需要的哺乳动物的HBV感染或HBV诱发的疾病的预防或治疗中同时、分开或顺序使用，其中所述第一化合物不同于所述第二化合物，其中所述第一化合物是如权利要求1-13中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐或如权利要求14所述的药物组合物，并且其中所述第二化合物是选自由以下组成的组的另一种HBV抑制剂：HBV复方药物、HBVDNA聚合酶抑制剂、免疫调节剂、toll样(TLR)受体调节剂、干扰素α受体配体、透明质酸酶抑制剂、乙型肝炎表面抗原(HbsAg)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(ipi4)抑制剂、亲环蛋白抑制剂、HBV病毒进入抑制剂、反义寡核苷酸靶向病毒mRNA、短干扰RNA(siRNA)和ddRNAi内切核酸酶调节剂、核糖核苷酸还原酶抑制剂、HBV E抗原抑制剂、共价闭合环状DNA(cccDNA)抑制剂、法尼醇X受体激动剂、HBV抗体、CCR2趋化因子拮抗剂、胸腺肽激动剂、细胞因子、核蛋白调节剂、维甲酸诱导基因1刺激因子、NOD2刺激因子、磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)抑制剂、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)途径抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、重组胸腺肽α-1、布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、KDM抑制剂、HBV复制抑制剂、精氨酸酶抑制剂以及抗HBV药物。
19.一种用于制备如权利要求1至12所述的化合物的方法，该方法包括如下步骤：
a.以下各项的缩合：具有式(II)的醛，其中式(II)为
Figure FDA0003122494510000101
具有式(III)的乙酰乙酸盐，其中式(III)为
Figure FDA0003122494510000102
以及具有式(IV)的脒，其中式(IV)为
Figure FDA0003122494510000103
在碱的存在下，该碱优选NaOAc，以形成根据式(I-1)的化合物：
Figure FDA0003122494510000104
b.具有式(I-1)的化合物的溴化，该溴化剂优选N-溴代琥珀酰亚胺，以形成根据式(I-2)的化合物，其中式(I-2)为
Figure FDA0003122494510000111
c.具有式(I-2)的化合物与具有式(V)的化合物的偶联，其中式(V)为
Figure FDA0003122494510000112
在碱的存在下，该碱优选三乙胺，以形成根据式(I)的化合物。
20.一种化合物，其选自由具有下式的化合物组成的组，包括其任何盐：
Figure FDA0003122494510000113
Figure FDA0003122494510000121
Figure FDA0003122494510000131
Figure FDA0003122494510000141
Figure FDA0003122494510000151
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