CN114867717A - 杂芳基二氢嘧啶衍生物和治疗乙型肝炎感染的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了可用于在有需要的受试者中治疗HBV感染的化合物，其药物组合物，以及在该受试者中抑制、阻遏或预防HBV感染的方法。

Description

杂芳基二氢嘧啶衍生物和治疗乙型肝炎感染的方法
背景技术
慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是重大的全球健康问题，影响超过5％的世界人口(全球超过3.5亿人，美国有125万人)。
尽管有预防性HBV疫苗可供使用，但慢性HBV感染的负担仍然是重大的未得到满足的全球医学问题，原因是发展中国家大多数地区的治疗选择并不理想，而且新感染率持续不变。目前的治疗不能治愈，并仅限于两类药剂(干扰素α和核苷类似物/病毒聚合酶抑制剂)；抗药性、疗效低和耐受性问题限制了其影响。HBV的治愈率低至少部分归因于用单一抗病毒剂难以完全阻遏病毒产生的事实。然而，持续阻遏HBV DNA减缓了肝脏疾病的进展并有助于预防肝细胞癌。目前HBV感染患者的治疗目标是将血清HBV DNA降至低水平或不可检测水平，并最终减少或预防肝硬化和肝细胞癌的发展。
HBV衣壳蛋白在病毒的生命周期中起着重要的作用。HBV衣壳/核心蛋白形成亚稳病毒颗粒或蛋白质壳，其在细胞间传代期间保护病毒基因组，并还在病毒复制过程中发挥核心作用，包括基因组衣壳化、基因组复制及病毒体形态发生和外出。衣壳结构还对环境提示作出反应，以便在病毒进入后允许不包被。一致地，已经发现衣壳组装和拆卸的适当时机、适当的衣壳稳定性和核心蛋白的功能对于病毒感染性是至关重要的。
本领域需要可增加对病毒产生的阻遏并可治疗、改善或预防HBV感染的治疗剂。将此类治疗剂作为单一疗法或与其他HBV治疗或辅助治疗组合施用至HBV感染患者将导致显著降低的病毒载量、改善的预后、减少的疾病进展和增强的血清转化率。
用于在治疗HBV中使用的杂芳基二氢嘧啶的背景技术包括WO 2015/132276、WO2013/102655、WO 01/68641和WO 99/54326。
发明内容
本文提供了可用于在有需要的受试者中治疗HBV感染的化合物。因此，在一个方面，本文提供了具有式(I)的化合物，
Figure BDA0003695472250000021
包括其氘代异构体、立体异构体或互变异构形式，或其药学上可接受的盐，其中：
R1选自芳基或杂芳基，其各自任选地被选自卤素和C1-C6烷基的一个或多个取代基取代；
R2选自芳基或杂芳基，其各自被R4、R5、和R6取代；
R3是C1-C4烷基；
R4、R5、和R6独立地选自由以下组成的组：H、-OH、-CN、C1-C4烷基、和卤素；
R10选自由以下组成的组：H、和C1-C4烷基；
环B选自由3-8元饱和或不饱和环组成的组，这些环中的每一个任选地包含1、2或3个选自O、N和S的杂原子，并且这些环中的每一个任选地被独立地选自由以下组成的组的一个或多个取代基取代：卤素、＝O、-OH、-CN、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、和羟基C1-C4烷基，其中每个C1-C4烷基任选地被卤素取代；
R7选自由以下组成的组：-SO2-R8、-SO2-Q-R8、-OC(＝O)C1-C6烷基、-C(＝O)OC1-C6烷基-COOH、-C(＝O)NHC1-C6烷基-COOH、-C(＝O)O-Q-COOH、-C(＝O)NH-Q-COOH、-C(＝O)C1-C6烷基、-C(＝O)C1-C6烷基-R8、-NHC1-C6烷基-R8、-C1-C6烷基、-C1-C6烷基-R8、-C1-C6烷氧基C1-C6烷基-R8、-(CH2)p-R8、-(CH2)p-C(R11R12)-R8、和-(CH2)p-Q-R8；
R8选自由以下组成的组：-C1-C6烷基、-C1-C6烷基-COOH、-COOH、和羧酸生物电子等排体；
R11和R12连同它们所附接的碳原子一起形成任选地被R9取代的3-8元饱和环，该3-8元饱和环任选地含有杂原子，该杂原子是N或O；
Q选自由以下组成的组：芳基、杂芳基、和3-8元饱和环，其各自任选地被R9取代，该3-8元饱和环任选地含有杂原子，该杂原子是N或O；
R9选自由以下组成的组：H、-C1-C6烷基、-C1-C6烷氧基C1-C6烷基和-C1-C6烷基羰基；
p是整数0、1、2、3、或4；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在另一个方面，本文提供了药物组合物，该药物组合物包含至少一种具有式I的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
在另一个方面，本文提供了药物组合物，该药物组合物包含至少一种披露的化合物以及药学上可接受的载体。
在另一个方面，本文提供了在有需要的个体中治疗HBV感染或HBV诱发的疾病的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的具有式I的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一个方面，本文提供了在有需要的个体中抑制或减少含HBV DNA颗粒或含HBVRNA颗粒的形成或存在的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的具有式I的化合物或其药学上可接受的盐。
在一个实施例中，本文提供的任何方法可以进一步包括向该个体施用至少一种另外的治疗剂，该另外的治疗剂选自由如本文进一步定义的HBV抑制剂组成的组。
具体实施方式
本文提供了可用于在受试者中治疗和预防HBV感染的化合物，例如具有I的化合物或其药学上可接受的盐。
不受限于任何特定的作用机制，认为这些化合物调节或破坏HBV复制或感染性颗粒产生所必需的HBV组装和其他HBV核心蛋白功能和/或可以破坏HBV衣壳组装，产生具有大大降低的感染性或复制能力的空衣壳。换句话说，本文提供的化合物可以充当衣壳组装调节剂。
本文提供的化合物具有有效的抗病毒活性，表现出有利的代谢特性、组织分布、安全性和药物谱，并适用于人。披露的化合物可以调节(例如，加速、延迟、抑制、破坏或减少)正常病毒衣壳组装或拆卸，结合衣壳或改变细胞多蛋白和前体的代谢。当衣壳蛋白成熟时或在病毒感染期间可以进行调节。披露的化合物可以用于调节HBV cccDNA的活性或特性、或HBV RNA颗粒从感染细胞内产生或释放的方法中。
在一个实施例中，本文所述的化合物适用于单一疗法，并且针对自然或天然HBV株和对当前已知药物具有抗性的HBV株是有效的。在另一个实施例中，本文所述的化合物适用于组合疗法。
定义
下文列出了用于描述本发明的各个术语的定义。除非另外限定于具体的情况，否则无论单独的还是作为一个更大的基团的一部分，这些定义适用于整个说明书和权利要求书中使用的术语。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。通常，本文使用的命名法和细胞培养、分子遗传学、有机化学和肽化学中的实验室程序是本领域众所周知且常用的那些。
如本文所用，冠词“一个/种(a和an)”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)的该冠词的语法宾语。举例来说，“元素(an element)”意指一个元素或多于一个元素。此外，术语“包括(including)”以及其他形式如“包括(include，includes和included)”的使用不是限制性的。
如本文所用，术语“约”将是本领域普通技术人员所理解的，并将在一定程度上根据其使用的上下文而变化。如本文所用，当涉及如量、持续时间等的可测量值时，术语“约”意在涵盖相对于指定值的±20％或±10％(包括±5％、±1％和±0.1％)的变化，因为此类变化适于执行披露的方法。
如本文所用，术语“衣壳组装调节剂”是指破坏或加速或抑制或阻碍或延迟或减少或修饰正常衣壳组装(例如，在成熟期间)或正常衣壳拆卸(例如，在感染期间)或扰动衣壳稳定性从而诱导异常的衣壳形态和功能的化合物。在一个实施例中，衣壳组装调节剂加速衣壳组装或拆卸，从而诱导异常的衣壳形态。在另一个实施例中，衣壳组装调节剂与主要的衣壳组装蛋白(CA)相互作用(例如在活性位点与其结合，在变构位点与其结合，修改或阻碍折叠等)，从而破坏衣壳组装或拆卸。在又另一个实施例中，衣壳组装调节剂引起CA的结构或功能(例如，CA组装、拆卸、与底物结合、折叠成合适构象等的能力)的扰动，这减弱了病毒感染性或对病毒是致命的。
如本文所用，术语“治疗(treatment或treating)”被定义为向患者应用或施用治疗剂，即披露的化合物(单独地或与另一种药剂组合)，或向来自患者的分离的组织或细胞系应用或施用治疗剂(例如，用于诊断或离体应用)，该患者患有HBV感染、HBV感染的症状或患上HBV感染的可能性，目的是治愈、痊愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响HBV感染、HBV感染的症状或患上HBV感染的可能性。基于从药物基因组学领域获得的知识，此类治疗可以特别定制或修改。
如本文所用，术语“预防(prevent或prevention)”意指没有障碍或疾病发展(如果没有发生障碍或疾病)、或没有进一步的障碍或疾病发展(如果已经患上了该障碍或疾病)。还考虑到了预防与障碍或疾病相关的一些或全部症状的能力。
如本文所用，术语“患者”、“个体”或“受试者”是指人或非人哺乳动物。非人类哺乳动物包括例如家畜以及宠物，如绵羊、牛、猪、犬科动物、猫科动物和鼠科哺乳动物。优选地，患者、受试者或个体是人。
如本文所用，术语“有效量”、“药学有效量”和“治疗有效量”是指无毒但足够提供期望的生物学结果的药剂量。该结果可以是疾病体征、症状或原因的减少或减轻，或任何其他期望的生物学系统变化。本领域普通技术人员使用常规实验可以确定任何个体情况下的适当治疗量。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指不消除化合物的生物学活性或特性且相对无毒的材料(如载体或稀释剂)，即该材料可以向个体施用而不会引起不希望的生物学效应或以有害的方式与包含该材料的组合物的任何组分相互作用。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指披露的化合物的衍生物，其中通过将现存的酸或碱部分转化为其盐形式而对母体化合物进行修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基(如胺)的矿物酸盐或有机酸盐；酸性残基(如羧酸)的碱金属盐或有机盐；等。本发明的药学上可接受的盐包括例如从无毒的无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本发明的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，此类盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中或者在两者的混合物中反应来制备；通常，非水性介质像醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。合适的盐的清单见于Remington'sPharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第17版,Mack Publishing Company[马克出版公司],Easton,Pa.[宾夕法尼亚州伊斯顿],1985,第1418页和Journal ofPharmaceutical Science[药物科学杂志],66,2(1977)中，将其各自通过援引以其全文并入本文。
如本文所用，术语“组合物”或“药物组合物”是指可用于本发明的至少一种化合物与药学上可接受的载体的混合物。该药物组合物有助于向患者或受试者施用该化合物。本领域存在多种施用化合物的技术，包括但不限于静脉内、口服、气雾剂、肠胃外、眼部、肺部和局部施用。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或载体，如液体或固体填充剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或囊封材料，这些材料涉及将可用于本发明的化合物在患者体内载运或输送或载运或输送到患者体内，使得它可以发挥预期功能。典型地，此类构建体从身体的一个器官或部分载运或输送到身体的另一个器官或部分。每种载体在与配制品的其他成分(包括可用于本发明的化合物)相容且对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；表面活性剂；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药物配制品中使用的其他无毒相容物质。
如本文所用，“药学上可接受的载体”还包括与可用于本发明的化合物的活性相容并对于患者来说在生理上是可接受的任何和所有的涂层剂、抗细菌剂和抗真菌剂以及吸收延迟剂等。补充活性化合物也可以并入组合物中。“药学上可接受的载体”可以进一步包括可用于本发明的化合物的药学上可接受的盐。可以包括在用于实践本发明的药物组合物中的其他另外成分在本领域是已知的，并描述于例如Remington's PharmaceuticalSciences[雷明顿药物科学](Genaro编辑,Mack Publishing Co.[马克出版公司],1985,Easton,PA[宾夕法尼亚州伊斯顿])，将其通过援引并入本文。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“烷基”本身或作为另一个取代基的一部分意指具有指定碳原子数的直链或支链烃(即，C1-C3烷基意指具有一至三个碳原子的烷基，C1-C4烷基意指具有一至四个碳的烷基)，并且包括直链和支链。实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基。烷基的实施例通常包括但不限于C1-C10烷基，如C1-C6烷基，如C1-C4烷基。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“烯基”本身或作为另一个取代基的一部分意指具有指定碳原子数的、包含至少一个碳碳双键的直链或支链烃(即C2-C4烯基或C2-4烯基意指具有二至四至八个碳原子的烯基，C4-C8烯基或C4-8烯基意指具有四个碳原子的烯基)。烯基的实施例通常包括但不限于C2-C6烯基，如C2-C4烯基，如C2-C3烯基。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“卤基”或“卤素”单独或作为另一个取代基的一部分意指氟、氯、溴或碘原子，优选地氟、氯或溴，更优选地氟或氯。
如本文所用，术语“3-8元饱和环”是指单环非芳族饱和基团，其中形成环的每个原子(即，骨架原子)是碳原子，除非此环含有一个或多个杂原子，如果这样进一步定义的话。3-8元饱和环包括具有3至8个环原子的基团。单环3-8元饱和环包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基。
如本文所用，3-8元饱和环可以任选地含有1、2或3个选自O、N和S的杂原子，并且每个环任选地被一个或多个取代基取代。
如本文所用，术语“芳族”是指具有一个或多个多不饱和环并且具有芳族特征的碳环或杂环，即具有(4n+2)个离域π(pi)电子，其中n是整数。
如本文所用，除非另有说明，否则单独使用或与其他术语组合使用的术语“芳基”意指含有一个或多个环(通常为一个、两个或三个环)的碳环芳族系统，其中此类环可以按悬垂方式附接在一起(如联苯基)，或者可以稠合(如萘)。芳基基团的实例包括苯基、蒽基和萘基。优选实例是苯基(例如，C6-芳基)和联苯基(例如，C12-芳基)。在一些实施例中，芳基基团具有六至十六个碳原子。在一些实施例中，芳基基团具有六至十二个碳原子(例如，C6-C12-芳基)。在一些实施例中，芳基基团具有六个碳原子(例如，C6-芳基)。
如本文所用，术语“杂芳基”或“杂芳族”是指具有芳族特征的杂环。杂芳基取代基可以由碳原子数定义，例如C1-C9-杂芳基指示杂芳基基团中所含的碳原子数而不包括杂原子数。例如，C1-C9-杂芳基将包括另外的一至四个杂原子。多环杂芳基可以包括一个或多个部分饱和的环。杂芳基的非限制性实例包括吡啶基、吡嗪基、嘧啶基(包括例如，2-和4-嘧啶基)、哒嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基(包括例如，2-吡咯基)、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡唑基(包括例如，3-和5-吡唑基)、异噻唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,3,4-三唑基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,3,4-噻二唑基和1,3,4-噁二唑基。
多环杂环和杂芳基的非限制性实例包括吲哚基(包括例如，3-、4-、5-、6-和7-吲哚基)、吲哚啉基、喹啉基、四氢喹啉基、异喹啉基(包括例如，1-和5-异喹啉基)、1,2,3,4-四氢异喹啉基、噌啉基、喹喔啉基(包括例如，2-和5-喹喔啉基)、喹唑啉基、酞嗪基、1,8-萘啶基、1,4-苯并二噁烷基、香豆素、二氢香豆素、1,5-萘啶基、苯并呋喃基(包括例如，3-、4-、5-、6-和7-苯并呋喃基)、2,3-二氢苯并呋喃基、1,2-苯并异噁唑基、苯并噻吩基(包括例如，3-、4-、5-、6-和7-苯并噻吩基)、苯并噁唑基、苯并噻唑基(包括例如，2-苯并噻唑基和5-苯并噻唑基)、嘌呤基、苯并咪唑基(包括例如，2-苯并咪唑基)、苯并三唑基、硫代黄嘌呤基、咔唑基、咔啉基、吖啶基、吡咯双烷基(pyrrolizidinyl)和喹嗪基(quinolizidinyl)。
如本文所用，术语“取代”意指原子或原子基团替换氢作为附接至另一个基团的取代基。
如本文所用，术语“选自……”(例如，“R4选自A、B和C”)应理解为等同于术语“选自由以下组成的组：……”(例如，“R4选自由以下组成的组：A、B和C”)。
一个实施例涉及如本文所定义的具有式(I)的化合物，其中羧酸生物电子等排体为-S(＝O)2(OH)、-P(＝O)(OH)2、-C(＝O)NHOH、C(＝O)NHCN、1,2,4-噁二唑-5(4H)-酮、或3-羟基-4-甲基环丁-3-烯-1,2-二酮。这涉及以下结构：
Figure BDA0003695472250000071
实施例涉及如本文所定义的具有式(I)的化合物，其中环B选自5-7元饱和环，其各自任选地包含一个为N的杂原子，并且其各自任选地被独立地选自由以下组成的组的一个或多个取代基取代：卤素、＝O、-OH、-CN、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、和羟基C1-C4烷基。
实施例涉及具有式(I)的化合物，该化合物选自由满足以下通式的化合物组成的组：
Figure BDA0003695472250000081
实施例涉及如本文所定义的具有式(I)的化合物，其中其中R1选自由以下组成的组：噻唑基、吡啶基、和噁唑基，其各自任选地被选自F和C1-C6烷基的一个或多个取代基取代。
实施例涉及如本文所定义的具有式(I)的化合物，其中R1是噻唑基。
实施例涉及如本文所定义的具有式(I)的化合物，其中R2选自由以下组成的组：苯基、苯硫基、和吡啶基，其各自被R4、R5、和R6取代，其中R4、R5、和R6独立地选自由以下组成的组：H、-OH、-CN、C1-C4烷基、和卤素。
实施例涉及如本文所定义的具有式(I)的化合物，其中R2是被R4、R5、和R6取代的苯基，其中R4、R5、和R6独立地选自由以下组成的组：H、-CN、-CH3、F、Cl和Br。
实施例涉及如本文所定义的具有式(I)的化合物，其中R3是甲基、乙基、丙基、或异丙基。
实施例涉及如本文所定义的具有式(I)的化合物，其中R7选自由以下组成的组：-SO2-Q-R8、-C(＝O)OC1-C6烷基-COOH、-C(＝O)NHC1-C6烷基-COOH、-C(＝O)O-Q-COOH、-C(＝O)NH-Q-COOH、-C(＝O)C1-C6烷基-R8、-NHC1-C6烷基-R8、-C1-C6烷基-R8、-(CH2)p-R8、和-(CH2)p-Q-R8。
实施例涉及如本文所定义的具有式(I)的化合物，其中R8选自由以下组成的组：-C1-C6烷基-COOH、-COOH、-C(＝O)NHS(＝O)2C1-C6烷基、和四唑基。
实施例涉及如本文所定义的具有式(I)的化合物，其中Q选自由以下组成的组：芳基、杂芳基、和3-8元饱和环，其各自任选地被R9取代，该3-8元饱和环任选地含有杂原子，该杂原子是N或O；并且R9选自由以下组成的组：H、-C1-C6烷基。
实施例涉及如本文所定义的具有式(I)的化合物，其中p是整数0、1、或2。
实施例涉及化合物，该化合物选自由满足以下式的化合物组成的组：
Figure BDA0003695472250000091
Figure BDA0003695472250000101
Figure BDA0003695472250000111
Figure BDA0003695472250000121
披露的化合物可以具有一个或多个立构中心，并且每个立构中心可以独立地以R或S构型存在。对于一些化合物，尽管该化合物本身已经作为单一立体异构体被分离且为对映异构/非对映异构纯的，但当绝对立体化学尚未确定时，指定中心处的立体化学构型已被指定为“R*”、“S*”、“*R”或(*S)。在一个实施例中，本文所述的化合物以光学活性或外消旋形式存在。应当理解，本文所述的化合物涵盖具有本文所述的治疗上有用的特性的外消旋、光学活性、区域异构和立体异构形式或其组合。
光学活性形式的制备以任何合适的方式实现，包括作为非限制性实例，通过用重结晶技术拆分外消旋形式、由光学活性起始材料合成、手性合成或使用手性固定相的色谱分离。在一个实施例中，一种或多种异构体的混合物用作本文所述的披露的化合物。在另一个实施例中，本文所述的化合物含有一个或多个手性中心。这些化合物通过任何方式制备，包括立体选择性合成、对映体选择性合成或对映体或非对映体混合物的分离。化合物及其异构体的拆分通过任何方式实现，包括作为非限制性实例，化学方法、酶促方法、分级结晶、蒸馏以及色谱法。
当不能确定化合物的绝对R或S立体化学时，可以通过如由色谱柱、洗脱液等确定的特定色谱条件下的色谱法之后的保留时间来确定。
在一个实施例中，披露的化合物可以作为互变异构体存在。所有互变异构体都包括在本文提供的化合物的范围内。
本文所述的化合物还包括同位素标记的化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子序数，但原子质量或质量数不同于自然界中常见的原子质量或质量数的原子替换。适合包含在本文所述化合物中的同位素的实例包括但不限于2H、3H、11C、13C、14C、36Cl、18F、123I、125I、13N、15N、15O、17O、18O、32P和35S。在一个实施例中，同位素标记的化合物可用于药物或底物组织分布研究。在另一个实施例中，用较重的同位素(如氘)取代得到了较高的代谢稳定性(例如，增加的体内半衰期或降低的剂量需求)。
在又另一个实施例中，用正电子发射同位素(如11C、18F、15O和13N)取代可用于检查底物受体占据的正电子发射断层成像(PET)研究。同位素标记的化合物通过任何合适的方法或通过使用适当的同位素标记的试剂代替另外使用的未标记的试剂的方法来制备。
在一个实施例中，本文所述的化合物通过其他手段标记，包括但不限于使用发色团或荧光部分、生物发光标记或化学发光标记。
使用本文所述的技术和材料以及本领域技术人员已知的技术合成本文所述的化合物和具有不同取代基的其他相关化合物。用于制备本文所述的化合物的通用方法通过使用适当的试剂和条件来修改，以便引入如本文提供的式中所示的各个部分。
由可从商业来源获得或者使用本文所述的程序制备的化合物开始，使用任何合适的程序合成本文所述的化合物。
方法
本文提供了在有需要的个体中治疗HBV感染的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
本文还提供了在有需要的个体中根除HBV感染的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
本文提供了在有需要的个体中减少与HBV感染相关的病毒载量的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
另外，本文提供了在有需要的个体中减少HBV感染复发的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
本文提供了在有需要的个体中抑制或减少含HBV DNA颗粒或含HBV RNA颗粒的形成或存在的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
在某些方面，本文所述的方法和/或组合物对于抑制或减少在体外或在体内(例如，在细胞中、在组织中、在器官中(例如，在肝脏中)、在生物体等中)HBV相关颗粒的形成或存在是有效的。HBV相关颗粒可以含有HBV DNA(即，线性和/或共价闭合环状DNA(cccDNA))和/或HBV RNA(即，前基因组RNA和/或亚基因组RNA)。因此，HBV相关颗粒包括含HBV DNA颗粒或含HBV RNA颗粒。
如本文所用，“HPV相关颗粒”是指感染性HBV病毒体(即，丹氏粒)和非感染性HBV亚病毒颗粒(即，HBV丝和/或HBV球)两者。HBV病毒体包含包括表面蛋白的外包膜、包含核心蛋白的核衣壳、至少一种聚合酶蛋白和HBV基因组。HBV丝和HBV球包含HBV表面蛋白，但缺乏核心蛋白、聚合酶和HBV基因组。HBV丝和HBV球也统称为表面抗原(HBsAg)颗粒。HBV球包含中和小HBV表面蛋白。HBV丝还包括中、小和大HBV表面蛋白。
HBV亚病毒颗粒可以包括非颗粒状或分泌型HBeAg，其作为HBV活性复制的标记。
本文提供了在有需要的个体中减少HBV感染的不良生理影响的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
本文还提供了在有需要的个体中减少、减缓或抑制HBV感染的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
本文提供了在有需要的个体中诱导来自HBV感染的肝损伤逆转的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
本文提供了在有需要的个体中减少HBV感染的长期抗病毒疗法的生理影响的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
本文提供了在有需要的个体中预防性地治疗HBV感染的方法，其中该个体患有潜伏性HBV感染，该方法包括向该个体施用治疗有效量的披露的化合物。
在一个实施例中，该个体是其他治疗类别的HBV药物(例如，HBV聚合酶抑制剂、干扰素、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、文献描述的衣壳组装调节剂、不同或未知机制的抗病毒化合物等或其组合)难治的。在另一个实施例中，与其他治疗类别的HBV药物在患有HBV感染的个体中减少病毒载量的程度相比，披露的方法以更大的程度或以更快的速度在该个体中减少病毒载量。
在一个实施例中，与在有需要的个体中在预防性地治疗HBV感染中获得相似结果所需的至少一种另外的治疗剂的单独施用相比，披露的化合物或其药学上可接受的盐的施用允许以更低的剂量或频率施用至少一种另外的治疗剂。
在一个实施例中，与选自下组的化合物的施用相比，披露的化合物或其药学上可接受的盐的施用以更大的程度或以更快的速度在该个体中减少病毒载量，该组由以下组成：HBV聚合酶抑制剂、干扰素、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、不同的衣壳组装调节剂、不同或未知机制的抗病毒化合物及其任何组合。
在一个实施例中，披露的方法在患有HBV感染的个体中减少病毒载量，从而允许使用较低的剂量或不同方案的组合疗法。
在一个实施例中，与其他类别的HBV药物相比，披露的方法使得病毒突变或病毒抗性的发生率更低，从而允许长期治疗并最小化对治疗方案改变的需要。
在一个实施例中，与选自下组的化合物的施用相比，本发明的化合物或其药学上可接受的盐的施用使得病毒突变或病毒抗性的发生率更低，该组由以下组成：HBV聚合酶抑制剂、干扰素、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、不同的衣壳组装调节剂、不同或未知机制的抗病毒化合物及其组合。
在一个实施例中，披露的方法将从HBV感染至非HBV感染或从可检测HBV病毒载量至不可检测HBV病毒载量的血清转化率提高至超出当前治疗方案的血清转化率。如本文所用，“血清转化”是指产生HBV抗体并变得可检测的时间段。
在一个实施例中，披露的方法增加或正常化或恢复正常健康，引起正常健康的完全恢复，恢复预期寿命，或在有需要的个体中解决病毒感染。
在一个实施例中，披露的方法消除或减少从HBV感染的细胞释放的HBV RNA颗粒的数量，从而增强、延长或增加披露的化合物的治疗益处。
在一个实施例中，披露的方法从被HBV感染的个体中根除HBV，从而避免了长期或终身治疗的需要，或缩短了治疗的持续时间，或允许减少其他抗病毒剂的给药。
在另一个实施例中，披露的方法进一步包括监测或检测受试者的HBV病毒载量，并且其中将该方法进行一段时间，包括直到HBV病毒不可检测为止。
因此，在一个实施例中，本文提供了在有需要的个体中治疗HBV感染的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的具有式I的化合物或其药学上可接受的盐。
因此，在一个实施例中，本文提供了在有需要的个体中治疗HBV感染的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的具有式I的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一个实施例中，本文提供了在有需要的个体中治疗HBV感染的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的表1的化合物或其药学上可接受的盐。
在本文提供的任何方法的一个实施例中，该方法可以进一步包括监测受试者的HBV病毒载量，其中将该方法进行一段时间，使得HBV病毒不可检测。
组合疗法
披露的化合物可以与用于治疗HBV感染、或HBV相关或诱发的疾病、或肝病的一种或多种另外的化合物组合使用。这些另外的化合物可以包含其他披露的化合物和/或已知用于治疗、预防或减少HBV感染、或HBV相关或诱发的疾病、或肝病的症状或影响的化合物。
特别地，在一个方面提供了包含第一化合物和第二化合物的产品，该产品作为组合制剂用于在有需要的哺乳动物的HBV感染或HBV诱发的疾病的预防或治疗中同时、分开或顺序使用，其中所述第一化合物不同于所述第二化合物，其中所述第一化合物是本申请的化合物或药学上可接受的盐或本申请的药物组合物，并且其中所述第二化合物是选自由以下组成的组的另一种HBV抑制剂：HBV复方药物、HBV DNA聚合酶抑制剂、免疫调节剂、toll样受体(TLR)调节剂、干扰素α受体配体、透明质酸酶抑制剂、乙型肝炎表面抗原(HbsAg)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(ipi4)抑制剂、亲环蛋白抑制剂、HBV病毒进入抑制剂、反义寡核苷酸靶向病毒mRNA、短干扰RNA(siRNA)和ddRNAi内切核酸酶调节剂、核糖核苷酸还原酶抑制剂、HBV E抗原抑制剂、共价闭合环状DNA(cccDNA)抑制剂、法尼醇X受体激动剂、HBV抗体、CCR2趋化因子拮抗剂、胸腺肽激动剂、细胞因子、核蛋白调节剂、维甲酸诱导基因1刺激因子、NOD2刺激因子、磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)抑制剂、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)途径抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、重组胸腺肽α-1、布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、KDM抑制剂、HBV复制抑制剂、精氨酸酶抑制剂以及(其他)抗HBV药物。
例如，该一种或多种另外的化合物可以选自干扰素(例如，干扰素α-2a是聚乙二醇化干扰素α-2a(PEGASYS))、核苷或核苷酸或非核苷(酸)聚合酶抑制剂、免疫调节剂(例如，IL-12、IL-18、IFN-α、-β和-γ以及TNF-α等)、TLR激动剂、siRNA和反义寡核苷酸。
在另一个实施例中，披露的化合物和至少一种另外的治疗剂是共配制的。在又另一个实施例中，披露的化合物和至少一种另外的治疗剂是共施用的。
对于本文描述的任何组合疗法，例如可以使用合适的方法计算协同效应，例如，Sigmoid-Emax方程(Holford和Scheiner,19981,Clin.Pharmacokinet.[临床药物动力学]6:429-453)、Loewe可加性方程(Loewe和Muischnek,1926,Arch.Exp.Pathol Pharmacol.[实验病理学与药理学档案]114:313-326)和中值效应方程(Chou和Talalay,1984,Adv.EnzymeRegul.[酶调控研究进展]22:27-55)。上文提到的每个方程都可以应用于实验数据，以生成相应的图表来帮助评估药物组合的效果。与上文提及的方程相关的对应图表分别是浓度-效应曲线、等效线图曲线和联合指数曲线。
在本文提供的施用组合疗法的任何方法的一个实施例中，该方法可以进一步包括监测或检测受试者的HBV病毒载量，其中将该方法进行一段时间，包括直到使得HBV病毒不可检测的时间为止。
施用/剂量/配制品
在另一个方面，本文提供了药物组合物，该药物组合物包含至少一种披露的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以改变，以便获得对于特定患者、组合物和施用方式有效实现期望的治疗应答而对该患者无毒的活性成分的量。
特别地，选择的剂量水平将取决于多种因素，包括所利用的具体化合物的活性、施用时间，该化合物的排泄速率，治疗持续时间，与该化合物组合使用的其他药物、化合物或材料，所治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和以前病史以及医学领域熟知的类似因素。
在特定的实施例中，以便于施用和剂量均一性的剂量单位形式配制化合物。如本文所用，剂量单位形式是指作为针对待治疗的患者的单一剂量适合的物理上离散的单位；每一单位含有经计算以产生期望的治疗效果的预定量的披露的化合物以及所需药物媒介物。本发明的剂量单位形式由以下因素决定并直接取决于以下因素：(a)披露的化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果、和(b)混配/配制用于在患者中治疗HBV感染的这种披露的化合物的领域中固有的限制。
在一个实施例中，使用一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体来配制本发明的组合物。在一个实施例中，本发明的药物组合物包含治疗有效量的披露的化合物以及药学上可接受的载体。
在一些实施例中，披露的化合物的剂量是从约1mg至约2,500mg。在一些实施例中，在本文所述的组合物中使用的披露的化合物的剂量小于约10,000mg、或小于约8,000mg、或小于约6,000mg、或小于约5,000mg、或小于约3,000mg、或小于约2,000mg、或小于约1,000mg、或小于约500mg、或小于约200mg、或小于约50mg。类似地，在一些实施例中，如本文所述的第二化合物(即，用于HBV治疗的另一种药物)的剂量小于约1,000mg、或小于约800mg、或小于约600mg、或小于约500mg、或小于约400mg、或小于约300mg、或小于约200mg、或小于约100mg、或小于约50mg、或小于约40mg、或小于约30mg、或小于约25mg、或小于约20mg、或小于约15mg、或小于约10mg、或小于约5mg、或小于约2mg、或小于约1mg、或小于约0.5mg及其任何和所有全部或部分增量。
在一个实施例中，本发明涉及包装的药物组合物，该药物组合物包含容纳治疗有效量的披露的化合物的容器，该化合物是单独的或与第二药剂组合；以及用于使用该化合物在患者中治疗、预防或减少HBV感染的一种或多种症状的说明书。
本发明任何组合物的施用途径包括口服、鼻腔、直肠、阴道内、肠胃外、口腔、舌下或局部。用于在本发明中使用的化合物可以配制用于通过任何合适的途径施用，如用于口服或肠胃外，例如经皮、经粘膜(例如，舌下、舌、(经)口腔、(经)尿道、阴道(例如，经阴道和阴道周围)、鼻腔(内)和(经)直肠)、膀胱内、肺内、十二指肠内、胃内、鞘内、皮下、肌肉内、皮内、动脉内、静脉内、支气管内、吸入和局部施用。
合适的组合物和剂型包括例如片剂、胶囊、囊片、丸剂、胶丸、锭剂、分散剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、珠剂、经皮贴剂、凝胶剂、散剂、丸粒、乳浆剂、糖锭、乳膏、糊剂、膏药、洗剂、圆片、栓剂、用于鼻腔或口服施用的液体喷雾剂、用于吸入的干粉或雾化配制品、用于膀胱内施用的组合物和配制品等。应该理解，可用于本发明的配制品和组合物不限于本文所述的特定配制品和组合物。
对于口服施用，特别合适的是片剂、糖衣丸、液体、滴剂、栓剂或胶囊、囊片和胶丸。旨在用于口服的组合物可以根据本领域已知的任何方法制备，并且此类组合物可以含有选自由以下组成的组的一种或多种药剂：适合于制造片剂的惰性、无毒的药学赋形剂。此类赋形剂包括例如惰性稀释剂，如乳糖；造粒剂和崩解剂，如玉米淀粉；粘合剂，如淀粉；以及润滑剂，如硬脂酸镁。片剂可以是未包衣的或者它们可以通过已知的技术包衣以求精致或延迟活性成分的释放。用于口服的配制品也可以呈现为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性稀释剂混合。
对于肠胃外施用，可以将披露的化合物配制成用于注射或输注，例如静脉内、肌肉内或皮下注射或输注，或用于以推注剂量或连续输注施用。可以使用任选地含有其他配制剂(如悬浮剂、稳定剂或分散剂)的油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液。
本领域的技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文所述的特定程序、实施例、权利要求和实例的许多等效物。此类等效物被认为在本发明的范围内，并且由所附的权利要求书涵盖。例如，应当理解，仅仅使用常规实验并用本领域认可的替代物对于反应条件(包括但不限于反应时间、反应规模/体积和实验试剂(如溶剂、催化剂、压力、气氛条件(例如氮气气氛)和还原剂/氧化剂))进行修改，在本申请的范围内。
应当理解，无论在本文何处提供值和范围，这些值和范围所涵盖的所有值和范围都意图被涵盖在本发明的范围内。此外，落入这些范围内的所有值以及值范围的上限或下限也是本申请所预期的。
术语“包含(comprising)”同义于“包括(including)”或“含有(containing)”，它是开放性的且不排除额外的、未引用的一个或多个元素、成分或方法步骤，而术语“由……组成(consisting of)”是一个封闭性术语，它排除任何额外的元素、步骤或未明确引用的成分。
术语“基本上由……组成”是一个部分开放性术语，它不排除额外的、未引用的一个或多个元素、步骤或成分，只要这些额外的元素、步骤或成分不对本发明的基本特性和新颖特性产生实质性影响。
术语“包含(comprising或comprise(s))”因此包括术语“由……组成(consistingof和consist(s)of)”、以及术语“基本上由……组成(essentially consisting of和essentially consist(s)of)”。因此，本申请中的术语“包含(comprising或comprise(s))”意指更特别地涵盖术语“由……组成(consisting of和consist(s)of)”和术语“基本上由……组成(essentially consisting of和essentially consist(s)of)”。
为了帮助本申请的读者，将说明书分隔为不同的段落或部分。这些分隔不应被视为一段或一部分的实质内容与另一段或另一部分的实质内容脱节。相反，本说明书涵盖了可以考虑的各个部分、段落和句子的所有组合。
本文引用的所有参考文献的每一相关披露内容均通过援引特别地并入。以下实例是通过说明的方式而不是通过限制的方式提供的。
实例
现在将参考以下用于其一般制备的说明性合成方案和随后的具体实例来描述可用于本发明方法的示例性化合物。技术人员将认识到，为了获得本文中的各种化合物，可以适当地选择起始材料，使得最终期望的取代基将在有或没有适当的保护下通过反应方案而被携带以产生期望的产物。可替代地，可能有必要或期望在最终期望的取代基的位置上使用适合的基团，该合适的基团可通过反应方案被携带并适当地被该期望的取代基代替。除非另有说明，否则变量如上文参考式(I)所定义。反应可以在溶剂的熔点和回流温度之间进行，优选在0℃和溶剂的回流温度之间进行。可以采用常规加热或微波加热来加热反应。反应也可以在高于溶剂的正常回流温度的密封压力容器中进行。
制备实例
除非另有说明，否则LCMS和NMR均采用以下通用方法之一进行。
LCMS和NMR的通用方法
通用程序A
使用Agilent系统进行LCMS测量，该系统包含具有脱气器的二元泵、自动进样器、柱温箱(除非另有说明，否则设置为40℃)、以及如在以下对应的方法中所指定的柱。来自该柱的流被分流到MS和UV光谱仪。MS检测器配置有电喷雾电离源。通过以1.06秒/循环从100到1000进行扫描来获取质谱。正电离模式的毛细管电压为3kV，负电离模式的毛细管电压为2.5kV，并且将源温度保持在100℃。使用氮气作为雾化器气体。使用Agilent ChemStation数据系统进行数据采集。
方法1
除了通用程序A之外，还有：通过带有二极管阵列检测器(DAD)的Agilent1200来进行用于质量控制的反相LCMS，并在Sunfire C18柱(5μm，4.6x 50mm)上以1.5ml/min的流速进行。采用了两种流动相(流动相A1：在水中0.02％乙酸铵；流动相A2：在水中0.1％TFA；流动相B1：乙腈)来运行梯度条件：在4.0分钟内从95％A1或A2和5％B至5％A1或A2和95％B。使用1至10μl的进样量。
方法2
除了通用程序A之外，还有：通过带有可变波长检测器(VWD)的Agilent 1260进行用于监测反应的反相LCMS，并在Dikma Diamonsil plus C18柱(5μm，4.6x30mm)上以2.0ml/min的流速进行。采用了两种流动相(流动相A1：H2O+0.02％乙酸铵+5％ACN；流动相A2：H2O+0.1％TFA+5％ACN；流动相B：乙腈)来运行梯度条件：在1.4分钟内从95％A1或A2和5％B至5％A1或A2和95％B。使用1至5μl的进样量。
方法3
除了通用程序A之外，还有：通过Agilent 6120(固定相Sunfire C18 2.5μm，3.0×30mm)进行用于监测反应的反相LCMS。流动相：在水中0.01％FA溶液和ACN，在2.5min内梯度从5％ACN至95％并在95％停留1min。
通用程序B
使用UPLC(超高效液相色谱法)Acquity(沃特斯公司(Waters))系统进行LCMS测量，该系统包括带有脱气器的四元泵、自动进样器、光电二极管阵列检测器(PDA)以及如在以下对应方法中所指定的柱，将该柱的温度保持在40℃。来自该柱的流被引至MS检测器。MS检测器配置有电喷雾电离源。通过以0.25秒/循环从100到1000进行扫描来获取质谱。毛细管针电压是3kV并且源温度保持在120℃。正电离模式的锥孔电压是30V，并且负电离模式的锥孔电压是30V。使用氮气作为雾化器气体。用Waters-Micromass MassLynx-Openlynx数据系统进行数据采集。
在Waters Acquity BEH(桥联的乙基硅氧烷/二氧化硅杂合物)C18柱(1.7μm，2.1x50mm)上以0.5ml/min的流速进行反相UPLC。采用了两种流动相(流动相A：95％(H2O+0.02％乙酸铵+5％ACN)；流动相B：乙腈；流动相C：95％(H2O+0.1％TFA+5％ACN))来运行梯度条件：在1分钟内从95％A或C和5％B至5％A或C和95％B。使用0.5μl的进样量。
通用程序C
使用以下系统进行反相制备，该系统包含两个无脱气器的单位泵、UV/Vis检测器以及如在以下对应的方法中所指定的柱。来自该柱的流被分流到UV光谱仪。
方法1
除了通用程序C之外，还有：在带有自动进样器、Xbridge制备型C18 OBD柱(5μm，19x150mm)的Gilson仪器上以15-20ml/min的流速进行制备型反相LC。采用了两种流动相(流动相A1：H2O(0.1％碳酸氢铵)；流动相A2：H2O(氢氧化铵)；流动相A3：H2O(0.1％TFA)；流动相B：乙腈)来运行梯度条件：从95％A1或A2或A3和5％B至20％A1或A2或A3和80％B。用Trilution LC数据系统进行数据采集。
方法2
除了通用程序C之外，还有：在来自利穗科技有限公司(Lisure Science Ltd.)的、带有反相SW-5231C18柱(40-60μm，
Figure BDA0003695472250000201
18g，40g，130g)的自动中压闪蒸分离-紧凑型纯化器上以30-100ml/min的流速进行反相制备。采用了两种流动相(流动相A1：H2O(0.1％碳酸氢铵)；流动相A2：H2O(氢氧化铵)；流动相A3：H2O(0.1％盐酸)；流动相A4：H2O；流动相B：乙腈)来运行梯度条件：从95％A1或A2或A3或A4和5％B至5％A1或A2或A3或A4和95％B。用Compact数据系统进行数据采集。
方法3
除了通用程序C之外，还有：在带有自动进样器、Xbridge制备型C18 OBD柱(5um，19*150mm)的Waters仪器上以20ml/min的流速进行制备型反相LC。采用了两种流动相(流动相A：H2O(0.1％碳酸氢铵)；流动相B：乙腈)来运行梯度条件：从95％A和5％B至50％A和50％B。用Waters MassLynx数据系统进行数据采集。
通用程序D
使用以下系统进行手性测量，该系统包含自动进样器、柱温箱(除非另有说明，否则设置为环境温度)、二极管阵列检测器(DAD)和如在以下对应的方法中所指定的柱。来自该柱的流被分流到UV光谱仪。使用1.2nm的狭缝宽度，用氘灯从190nm至400nm进行扫描并用钨灯从401nm至800nm进行扫描来获取LC光谱。大赛璐药物手性技术(上海)有限公司(Daicel Chiral technologies(China)Ltd.)的手性chiralpak或chiralcel柱根据不同填充物分为两种类型：类型1：IA、IB、IC、ID、IE、IF、IG、IH；类型2：AD-H、AS-H、OD-H、OJ-H。
方法1：
除了通用程序D之外，还有：在Agilent 1200或Shimadzu LC-20A上进行手性HPLC，该系统带有具有脱气器的四元泵、手性柱(5um，4.6*250mm)，流速为1.0ml/min时用于手性分析，或该系统带有具有脱气器的四元泵、手性柱(5um，20*250mm)，流速为10-20ml/min时用于手性制备。流动相为MeOH、EtOH、Hex、IPA等的不同比例。用Agilent ChemStation数据系统或Shimadzu LabSolutions数据系统进行数据采集。
方法2：
除了通用程序D之外，还有：在带有柱温箱(40℃)的Waters-TharSFC上以2-3ml/min的流速进行手性分析，并且用TharSFC Chrom Scope数据系统进行数据采集。在Waters-SFC-80上以45-60ml/min的流速进行手性制备，并且用Waters-TharSFC SuperChrom数据系统进行数据采集。流动相为CO2和MeOH，EtOH可用作共溶剂。
通用程序E
在环境温度下使用NMR光谱仪进行以下NMR实验，该NMR光谱仪使用内部氘锁并且对于400MHz配备有具有Z-梯度、PLUS(2H，1H，BBF)的BBO 400MHz S1 5mm探头，并且对于300MHz配备有DUL 300MHz S1 5mm Z-梯度(2H，1H，13C)探头。化学位移(δ)以百万分率(ppm)报告。
方法1：
除了通用程序E之外，还有：使用Bruker AvanceⅢ400MHz光谱仪测量NMR实验。
方法2：
除了通用程序E之外，还有：使用Bruker Avance Neo 400MHz光谱仪测量NMR实验。
方法3：
除了通用程序E之外，还有：使用ZKNJ BIXI-1 300MHz光谱仪测量NMR实验。
方法4：
除了通用程序E之外，还有：使用Bruker Ascend 400MHz光谱仪测量NMR实验。
现在将参考以下用于其一般制备的说明性合成方案和随后的具体实例来描述可用于本发明方法的示例性化合物。
通用方案1
Figure BDA0003695472250000221
通用方案2
Figure BDA0003695472250000231
化合物I的制备在以上方案1和方案2中示出。
化合物V可在碱(如NaOAc)的存在下通过醛II、乙酰乙酸盐III和脒IV的缩合来制备(方法A)。化合物VI(其中LG表示离去基团(如溴))可以使用溴化试剂(如N-溴代琥珀酰亚胺)由化合物V来制备(方法B)。在碱(如三乙醇胺)的存在下对化合物VI和化合物VII进行偶联得到化合物I(方法C)。可替代地，化合物V可以进行手性分离以给出其单一立体异构体化合物Va和化合物Vb，化合物VIa可以使用溴化试剂(如N-溴代琥珀酰亚胺)由化合物Va来制备(方法B)。在碱(如三乙醇胺)的存在下对化合物VIa和化合物VII进行偶联得到化合物Ia(方法C)。
方法A：
Figure BDA0003695472250000232
向具有通式III的酮酯(1当量)在溶剂(如乙醇或甲醇)中的溶液中添加具有通式II的醛(1当量)、具有通式IV的甲脒盐酸盐(1当量)和碱如乙酸钠(1-1.2当量)。将混合物升温至70℃-100℃并在氮气气氛下搅拌六小时至过夜。冷却至室温后，将其浓缩至干燥。将残余物从二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，用水、盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩以给出残余物，将该残余物通过硅胶柱色谱法纯化以得到具有通式V的二氢嘧啶产物。当适用时，将具有通式V的二氢嘧啶产物的立体异构体分离并且使用手性色谱法纯化以给出具有通式Va和通式Vb的二氢嘧啶产物。
方法B：
Figure BDA0003695472250000241
在室温和氮气气氛下，向具有通式V或Va的二氢嘧啶(1当量)在溶剂(如四氯化碳)中的溶液中添加溴化试剂(如N-溴代琥珀酰亚胺)(0.9至1.1当量)。将混合物升温至60℃并在氮气气氛下搅拌1小时。冷却至室温后，将其浓缩至干燥。将残余物从二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，用水、盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩以给出残余物，将该残余物通过硅胶柱色谱法纯化以分别得到具有通式VI或VIa的二氢嘧啶产物。
方法C：
Figure BDA0003695472250000251
在室温下，向通式VII(1当量)在溶剂(如二氯甲烷)中的溶液中添加碱(如三乙醇胺)(10当量)。将混合物在35℃下搅拌0.5小时并且然后在氮气氛下添加具有通式VI或VIa的二氢嘧啶(1当量)在溶剂(如二氯甲烷)中的溶液。将混合物升温至40℃并在氮气气氛下搅拌2小时。冷却至0℃后，将反应混合物倒入冰水和盐酸盐水溶液(1.0M)的混合物中。将所得混合物从二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，用水、盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩以给出残余物，将该残余物通过C18柱纯化以分别得到具有通式I或Ia的二氢嘧啶产物。
化学
在下文中说明了用于制备本发明的化合物的几种方法。除非另外指出，否则所有起始材料都从商业供应商获得并且不经进一步纯化而使用。
在下文中，ACN意指乙腈，AcOH意指乙酸，Boc意指叔丁基氧基羰基，Bn意指苄基，calcd.意指计算出的，Cbz意指苄氧基羰基，col.意指柱，conc.意指浓缩，m-CPBA意指3-氯过氧苯甲酸，DAST意指(二乙基氨基)三氟化硫，DCM意指二氯甲烷，DEA意指二乙醇胺，DIEA意指N,N-二异丙基乙胺，DMAP意指4-(二甲基氨基)吡啶，DMF意指二甲基甲酰胺，DMP意指戴斯-马丁过碘烷，EA意指乙酸乙酯，ee意指对映异构体过量，ESI意指电喷雾离子化，HATU意指2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐，Hex意指己烷，HNMR意指1H NMR，HPLC意指高效液相色谱法，IPA意指异丙醇，LC-MS或LCMS意指液相色谱法-质谱法，LDA意指二异丙基氨基锂，Ms意指甲磺酰基，PE意指石油醚，PMB意指4-甲氧基苄基，prep.意指制备型，Prep-HPLC意指制备型HPLC，RT或Rt意指保留时间，(s)或(s)意指固体，sat.意指饱和，TBAF意指四丁基氟化铵，TBS意指叔丁基二甲基甲硅烷基，TEOA意指三乙醇胺，TEA意指三乙胺，THF意指四氢呋喃，T或Temp意指温度，TsCl意指4-甲苯磺酰氯，t-BuOK意指叔丁醇钾，W意指波长。
实例
实例1：
化合物VIa-1：(R*)-乙基6-(溴甲基)-4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
中间体V-1：乙基4-(2-氯-4-氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)(用方法A例示)：
在室温下，向2-氯-4-氟苯甲醛(10.0g，63.1mmol)在乙醇(200mL)中的溶液中添加乙基3-氧代丁酸酯(8.20g，63.1mmol)、噻唑-2-甲脒盐酸盐(10.3g，63.1mmol)和乙酸钠(5.20g，63.1mmol)。将混合物在80℃下搅拌过夜。将其冷却至室温，用乙酸乙酯萃取，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝10:1至1:1)纯化以给出呈黄色固体的标题化合物(14.0g，90％纯度，58％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.75min，C17H15ClFN3O2S的计算质量379.1，m/z实测值380.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(d,J＝3.2Hz,0.3H),7.81-7.80(m,1.4H),7.50(d,J＝3.6Hz,0.3H),7.46(br s,0.3H),7.43(d,J＝3.2Hz,0.7H),7.36-7.32(m,1H),7.14-7.11(m,1H),6.94-6.89(m,1H),6.20(s,0.7H),6.08(s,0.3H),4.10-4.01(m,2H),2.57(s,0.7H),2.51(s,2.3H),1.15-1.11(t,J＝7.2Hz,3H)。
将乙基4-(2-氯-4-氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯V-1的外消旋混合物(1.00g，90％纯度，2.37mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak IE 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以10mL/min；温度：30℃；波长：254nm)分离以给出呈黄色固体的标题化合物Va-1(400mg，98.1％纯度，44％产率，100％ee)和Vb-1(405mg，98.6％纯度，40％产率，99.7％ee)。
中间体Va-1：LC-MS(ESI)：RT＝4.295min，C17H15ClFN3O2S的计算质量379.1，m/z实测值380.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm；RT＝7.663min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(d,J＝3.2Hz,0.3H),7.80(d,J＝2.8Hz,1H),7.50(d,J＝3.2Hz,0.3H),7.43(d,J＝3.2Hz,1H),7.36-7.32(m,1H),7.14-7.11(m,1H),6.94-6.89(m,1H),6.20(s,0.7H),6.08(s,0.3H),4.08-4.01(m,2H),2.57(s,0.8H),2.51(s,2.2H),1.13(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体Vb-1：LC-MS(ESI)：RT＝3.578min，C17H15ClFN3O2S的计算质量379.1，m/z实测值380.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm；RT＝9.471min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(d,J＝3.2Hz,0.3H),7.80(d,J＝2.8Hz,1H),7.50(d,J＝3.2Hz,0.3H),7.43(d,J＝3.2Hz,1H),7.36-7.32(m,1H),7.14-7.11(m,1H),6.94-6.89(m,1H),6.20(s,0.7H),6.08(s,0.3H),4.08-4.00(m,2H),2.57(s,0.8H),2.51(s,2.2H),1.13(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物VIa-1：(R*)-乙基6-(溴甲基)-4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)(用方法B例示)：
向(R*)-乙基4-(2-氯-4-氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯Va-1(200mg，98.1％纯度，0.518mmol)在四氯化碳(15mL)中的溶液中添加N-溴代琥珀酰亚胺(100mg，0.579mmol)。在65℃下搅拌0.5小时后，将反应冷却至室温，用二氯甲烷(20mL)稀释，用水(10mL)洗涤两次，用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并在减压下蒸发以去除溶剂。将残余物通过制备型TLC(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)纯化以给出呈黄色固体的期望的化合物(137mg，98％纯度，57％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.80min，C17H14BrClFN3O2S的计算质量457.0，m/z实测值458.0[M+H]+。
通过顺序反应联合使用芳基醛(II)、酮酯(III)和甲脒(IV)制备具有通式Va/VIa的二氢嘧啶示于下表1中：
表1：
Figure BDA0003695472250000281
Figure BDA0003695472250000291
中间体V-2：乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
通过利用方法A的类似程序，合成呈黄色固体的标题化合物。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.86(s,0.8H),9.52(d,J＝2.8Hz,0.2H),8.00-7.98(m,0.4H),7.96(d,J＝3.2Hz,0.8H),7.88(d,J＝2.8Hz,0.8H),7.20-7.15(m,1.2H),7.06-6.99(m,1.8H),5.83(s,0.8H),5.73(d,J＝3.2Hz,0.2H),3.99-3.93(m,2H),2.48(s,2.4H),2.45(s,1.2H),2.44(s,1.2H),2.41(s,0.3H),2.40(s,0.3H),2.37(s.0.6H),1.08-1.02(m,3H)。
将中间体V-2通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak OJ-H 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝90:10:0.3，以15mL/min；温度：30℃；波长：214nm)分离以得到呈黄色固体的Va-2和Vb-2。
中间体Va-2：手性分析(柱：Chiralpak OJ-H 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝85:15:0.2，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：230nm，RT＝7.251min)。通过以下与报告数据一致的化学拆分，Va-2被明确为绝对S立体化学(J.Med.Chem.[医药化学杂志],2017,60(8),第3352-3371页)。旋光度：[a]D 20-24°(c 0.10，MeOH)。
中间体Vb-2：手性分析(柱：Chiralpak OJ-H 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝85:15:0.2，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：230nm，RT＝9.072min)。旋光度：[a]D 20+35°(c 0.10，MeOH)。
中间体VIa-2：(S)-乙基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法B的类似程序，从Va-2合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝1.84min，C18H17BrFN3O2S的计算质量437.0，m/z实测值440.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.22(s,0.5H),7.82(d,J＝3.2Hz,1H),7.53(s,0.4H),7.44(s,0.6H),7.25-7.08(m,2.5H),6.96-6.92(s,1H),5.99(s,0.6H),5.93(s,0.4H),4.92-4.77(m,1.6H),4.67-4.65(m,0.4H),4.13-4.07(m,2H),2.53(s,1.7H),2.41(s,1.3H),1.14(t,J＝7.2Hz,3H)。旋光度：[a]D 20+0.093°(c 0.10，MeOH)。
中间体V-3：乙基4-(2-氯-3-氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
通过利用方法A的类似程序，合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝1.74min，C17H15ClFN3O2S的计算质量379.1，m/z实测值380.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84-7.80(m,1.7H),7.50(d,J＝3.6Hz,0.3H),7.47(s,0.3H),7.44(d,J＝3.2Hz,0.7H),7.23-7.14(m,2H),7.09-7.01(m,1H),6.27(s,0.7H),6.14(d,J＝2.4Hz,0.3H),4.13-3.98(m,2H),2.57(s,0.7H),2.52(s,2.3H),1.13-1.10(m,3H)。
将外消旋混合物乙基4-(2-氯-3-氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-
二氢嘧啶-5-甲酸酯V-3(5.45g，95％纯度，13.7mmol)通过手性分离(分离条件：柱：Chiralpak IC 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝95:5:0.3，以28mL/min，温度：30℃，波长：254nm)分离以给出呈黄色固体的标题化合物Va-3(2.5g，由1HNMR得到的纯度为90％，46％产率，100％ee)和Vb-3(2.48g，由1HNMR得到的纯度为90％，46％产率，92.1％ee)。
Va-3：LC-MS(ESI)：RT＝3.886min，C17H15ClFN3O2S的计算质量379.06，m/z实测值380.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IA 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝90:10:0.2，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝7.438min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84-7.80(m,1.7H),7.51-7.44(m,1.3H),7.22-7.14(m,2H),7.09-7.01(m,1H),6.27(s,0.7H),6.14(s,0.3H),4.05-4.00(m,2H),2.57(s,0.7H),2.52(s,2.3H),1.13-1.10(m,3H)。
Vb-3：LC-MS(ESI)：RT＝3.887min，C17H15ClFN3O2S的计算质量379.06，m/z实测值380.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IA 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝90:10:0.2，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝6.903min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84-7.80(m,1.7H),7.51-7.43(m,1.3H),7.22-7.14(m,2H),7.09-7.01(m,1H),6.27(s,0.7H),6.14(s,0.3H),4.10-3.98(m,2H),2.57(s,0.7H),2.51(s,2.3H),1.13-1.10(m,3H)。
中间体VIa-3：(R*)-乙基6-(溴甲基)-4-(2-氯-3-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法B的类似程序，从Va-3合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝1.852min，C17H14BrClFN3O2S的计算质量456.9，m/z实测值457.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.26(s,0.3H),7.84(d,J＝2.8Hz,1H),7.53-7.46(m,1.7H),7.24-7.14(m,2H),7.09-7.01(m,1H),6.26(s,0.3H),6.17(s,0.7H),4.92(d,J＝8.0Hz,1H),4.76(d,J＝11.2Hz,0.3H),4.60(d,J＝8.0Hz,0.7H),4.12(q,J＝7.2Hz,2H),1.14(t,J＝11.2Hz,3H)。
中间体V-4：甲基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
通过利用方法A的类似程序，合成呈黄色固体的标题化合物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.93(d,J＝3.2Hz,0.1H),7.80-7.77(m,1.8H),7.52-7.50(m,0.1H),7.41(d,J＝3.2Hz,0.9H),7.20(br s,0.1H),7.16-7.00(m,2H),6.94-6.87(m,1H),6.00(s,0.9H),5.90(s,0.1H),3.60(s,3H),2.55-2.49(m,5.8H),2.40(br s,0.2H)。
将甲基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯V-4的外消旋混合物(1.30g，95％纯度，3.58mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak AS-H 5μm 30*250mm；流动相：Hex:EtOH＝75:25，以15mL/min；温度：30℃；波长：214nm)分离以得到呈黄色油状物的标题化合物Vb-4(610mg，由1H NMR得到的纯度为95％，44％产率，100％立体纯)和Va-4(520mg，由1H NMR得到的纯度为95％，40％产率，97.7％立体纯)。
中间体Vb-4：手性分析(柱：Chiralpak AS 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝80:20，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝5.247min)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.93(d,J＝2.8Hz,0.1H),7.80(br s,0.9H),7.78(d,J＝2.8Hz,1H),7.52-7.50(m,0.1H),7.41(d,J＝3.2Hz,0.9H),7.10-7.02(m,2H),6.92-6.87(m,1H),6.00(s,0.9H),5.91(s,0.1H),3.61(s,3H),2.55(s,3H),2.53(s,3H)。
中间体Va-4：手性分析(柱：Chiralpak AS 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝80:20，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝9.049min)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(d,J＝3.2Hz,2H),7.42(d,J＝2.4Hz,1H),7.10-7.05(m,2H),6.92-6.89(m,1H),5.99(s,1H),3.61(s,3H),2.54(s,3H),2.53(m,3H)。
中间体VIa-4：(S*)-甲基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法B的类似程序，从Va-4合成呈黄色固体的标题化合物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.23(s,1H),7.82(d,J＝3.2Hz,1H),7.53-7.44(m,1H),7.12-7.07(m,2H),6.93(s,1H),5.98-5.94(m,1H),4.89-4.66(m,2H),3.65(s,3H),2.53-2.41(m,3H)。
中间体V-5：甲基4-(2-氯-4-氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
通过利用方法A的类似程序，合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝1.70min，C16H13ClFN3O2S的计算质量365.04，m/z实测值366.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84-7.83(m,0.9H),7.81-7.80(m,0.8H),7.55-7.50(m,0.6H),7.44-7.43(m,0.7H),7.33-7.26(m,1H),7.13-7.11(m,1H),6.95-6.88(m,1H),6.18(s,0.7H),6.05(s,0.3H),3.63(s,0.8H),3.60(s,2.2H),2.57(s,0.8H),2.51(s,2.2H)。
将甲基4-(2-氯-4-氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯V-5的外消旋混合物(20g，95％纯度，51.9mmol)通过手性制备型HPLC(柱：Chiralpak IG 5μm30*250mm；流动相：CO2:MeOH＝70:30，以55g/min；柱温：40℃；波长：230nm，背压：100巴)分离以得到呈黄色固体的标题化合物Va-5(9.46g，由NMR得到的纯度为95％，47％产率，100％ee)和Vb-5(9.5g，由NMR得到的纯度为95％，48％产率，98.0％ee)。
Va-5：LC-MS(ESI)：RT＝1.69min，C16H13ClFN3O2S的计算质量365.0，m/z实测值366.0。手性分析(柱：Chiralpak IA 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝80:20，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝5.593min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84-7.83(m,1H),7.80(d,J＝2.8Hz,0.7H),7.52-7.50(m,0.5H),7.44(d,J＝2.8Hz,0.7H),7.34-7.30(m,1H),7.15-7.11(m,1H),6.96-6.88(m,1H),6.19(s,0.7H),6.06(d,J＝2.4Hz,0.3H),3.63(s,0.8H),3.60(s,2.2H),2.57(s,0.8H),2.51(s,2.2H)。
Vb-5：LC-MS(ESI)：RT＝1.68min，C16H13ClFN3O2S的计算质量365.0，m/z实测值366.0。手性HPLC(柱：Chiralpak IA 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝80:20，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝6.827min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)7.85-7.82(m,1H),7.80(d,J＝3.2Hz,0.7H),7.54-7.50(m,0.5H),7.43(d,J＝3.2Hz,0.7H),7.34-7.30(m,1H),7.14-7.11(m,1H),6.96-6.88(m,1H),6.18(s,0.7H),6.06(d,J＝2.4Hz,0.3H),3.62(s,0.8H),3.60(s,2.2H),2.57(s,0.8H),2.50(s,2.2H)。
中间体VIa-5：(R*)-甲基6-(溴甲基)-4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法B的类似程序，从Va-5合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝1.802min，C16H12BrClFN3O2S的计算质量442.9，m/z实测值443.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.29(br s,0.3H),7.84(d,J＝3.2Hz,1H),7.59-7.53(m,1.4H),7.47(br s,0.3H),7.41-7.31(m,1H),7.14(d,J＝8.4Hz,1H),6.99-6.90(m,1H),6.18(s,0.3H),6.09(d,J＝2.0Hz,0.7H),4.93(d,J＝8.4Hz,1H),4.74(d,J＝11.2Hz,0.3H),4.58(d,J＝8.4Hz,0.7H),3.67(s,2.1H),3.65(s,0.9H)。
中间体V-6：甲基4-(2-氯-3-氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
通过利用方法A的类似程序，合成呈黄色固体的标题化合物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(s,0.8H),7.83(d,J＝2.8Hz,0.3H),7.80(d,J＝2.8Hz,0.7H),7.55(s,0.2H),7.50(d,J＝2.8Hz,0.2H),7.44(d,J＝2.8Hz,0.8H),7.23-7.13(m,2H),7.11-7.00(m,1H),6.25(s,0.8H),6.11(d,J＝1.6Hz,0.2H),3.62(s,0.6H),3.60(s,2.4H),2.58(s,0.6H),2.51(s,2.4H)。
将甲基4-(2-氯-3-氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯V-6的外消旋混合物(3.00g，95％纯度，7.79mmol)通过手性制备型HPLC(柱：Chiralpak IC 5μm20*250mm，流动相：Hex:IPA:DEA＝90:10:0.3，以18mL/min，温度：30℃，波长：230nm)分离以得到呈黄色固体的标题化合物Va-6(820mg，96％纯度，28％产率，100％立体纯)和Vb-6(800mg，97％纯度，27％产率，99.2％立体纯)。
化合物Va-6：LC-MS(ESI)：RT＝1.587min，C16H13ClFN3O2S的计算质量365.0，m/z实测值366.0[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:IPA:DEA＝90:10:0.2，以1mL/min；柱温：30℃；波长：254nm，RT＝10.808min)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(s,0.7H),7.83(d,J＝3.2Hz,0.2H),7.80(d,J＝2.8Hz,0.8H),7.55(s,0.3H),7.50(d,J＝3.2Hz,0.2H),7.44(d,J＝3.2Hz,0.8H),7.22-7.13(m,2H),7.08-6.99(m,1H),6.25(s,0.8H),6.12(d,J＝2.4Hz,0.2H),3.62(s,1H),3.60(s,2H),2.58(s,1H),2.51(s,2H)。
化合物Vb-6：LC-MS(ESI)：RT＝1.584min，C16H13ClFN3O2S的计算质量365.0，m/z实测值366.0[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:IPA:DEA＝90:10:0.2，以1Ll/min；柱温：30℃；波长：254nm，RT＝12.482min)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(s,0.7H),7.83(d,J＝3.2Hz,0.3H),7.80(d,J＝3.2Hz,0.7H),7.56(s,0.3H),7.50(d,J＝2.8Hz,0.3H),7.43(d,J＝3.2Hz,0.7H),7.23-7.13(m,2H),7.09-7.00(m,1H),6.25(s,0.8H),6.11(d,J＝2.0Hz,0.2H),3.60(s,3H),2.57(s,0.6H),2.52(s,2.4H)。
中间体VIa-6：(R*)-甲基6-(溴甲基)-4-(2-氯-3-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法B的类似程序，从Va-6合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝1.695min，C16H12BrClFN3O2S的计算质量442.9，m/z实测值444.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.15-7.91(m,2H),7.41-7.31(m,2H),7.26-7.24(m,1H),6.03(s,1H),4.99-4.68(m,2H),3.56(s,3H)。
中间体V-7：甲基4-(3,4-二氟-2-甲基苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
通过利用方法A的类似程序，合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝1.58min，C17H15F2N3O2S的计算质量363.3，m/z实测值364.0[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.80-7.78(m,2H),7.42(d,J＝3.2Hz,1H),7.00-6.85(m,2H),5.93(s,1H),3.61(s,3H),2.58(s,1.5H),2.57(s,1.5H),2.53(s,1.5H),2.51(s,1.5H)。
将甲基4-(3,4-二氟-2-甲基苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯V-7的外消旋混合物(1.00g，90％纯度，2.48mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak IH 5μm 30*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以18mL/min；温度：30℃；波长：214nm)分离以得到呈黄色固体的期望的产物Va-7(400mg，由1H NMR得到的纯度为90％，40％产率，100％立体纯)和Vb-7(400mg，由1H NMR得到的纯度为95％，42％产率，99.9％立体纯)。
中间体Va-7：手性分析(柱：Chiralpak IH 5μm 4.6*150mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以1mL/min；温度：30℃；波长：230nm，RT＝4.809min)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.84(brs,1H),7.78(d,J＝3.2Hz,1H),7.42(d,J＝3.2Hz,1H),6.96-6.86(m,2H),5.93(s,1H),3.61(s,3H),2.57(d,J＝1.6Hz,3H),2.52(s,3H)。
中间体Vb-7：手性分析(柱：Chiralpak IH 5μm 4.6*150mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以1mL/min；温度：30℃；波长：230nm，RT＝7.018min)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(brs,1H),7.79(d,J＝3.2Hz,1H),7.42(d,J＝3.2Hz,1H),6.97-6.88(m,2H),5.93(s,1H),3.61(s,3H),2.58(d,J＝2.0Hz,3H),2.52(s,3H)。
中间体VIb-7：(S*)-甲基6-(溴甲基)-4-(3,4-二氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法B的类似程序，从Vb-7合成呈黄色固体的标题化合物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(s,1H),7.83(d,J＝3.6Hz,1H),7.54-7.45(m,1H),7.00-6.93(m,2H),5.91(s,1H),4.94-4.80(s,21H),3.66(s,3H),2.56-2.45(m,3H)。
中间体V-8：甲基4-(2-氯-3,4-二氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
通过利用方法A的类似程序，合成呈黄色固体的标题化合物。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.08(d,J＝2.8Hz,0.1H),7.98(d,J＝2.8Hz,0.1H),7.93(d,J＝2.8Hz,0.9H),7.72(d,J＝2.8Hz,0.9H),7.26-7.18(m,2H),6.13(s,0.9H),6.09(s,0.1H),3.61(s,3H),2.53(s,3H)。
将外消旋V-8(1.10g，2.90mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：ChiralpakIC 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以18mL/min；温度：30℃；波长：214nm)分离以得到呈黄色固体的标题化合物Va-8(450mg，41％产率，100％立体纯)和Vb-8(450mg，41％产率，99.8％立体纯)。
中间体Va-8：手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝6.457min)。
中间体Vb-8：手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝7.641min)。
中间体VIa-8：(R*)-甲基6-(溴甲基)-4-(2-氯-3,4-二氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法B的类似程序，从Va-8合成呈黄色固体的标题化合物。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.92(d,J＝3.2Hz,1H),7.80(d,J＝3.2Hz,0.5H),7.70(d,J＝3.2Hz,0.5H),7.32-7.17(m,2H),6.11(s,0.5H),6.09(s,0.5H),4.91(d,J＝10.0Hz,0.5H),4.81(d,J＝10.0Hz,1H),4.57(d,J＝8.4Hz,0.5H),3.64(s,1.5H),3.62(s,1.5H)。
中间体V-9：乙基4-(2-氯-3,4-二氟苯基)-6-甲基-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
通过利用方法A的类似程序，合成呈黄色固体的标题化合物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83-7.81(m,1.8H),7.52-7.44(m,1.2H),7.13-7.10(m,1H),7.08-7.00(m,1H),6.20(s,0.8H),6.08(s,0.2H),4.11-4.00(m,2H),2.57(s,0.5H),2.51(s,2.5H),1.13(t,J＝7.2Hz,3H)。
将外消旋V-9(1.00g，2.51mmol)通过手性制备型HPLC(柱：Chiralpak IC5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以18mL/min；温度：30℃；波长：214nm)分离以给出呈黄色固体的期望的化合物Va-9(353mg，35％产率，98.1％立体纯)和Vb-9(321mg，32％产率，99.8％立体纯)。
中间体Va-9：手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝5.901min)。
中间体Vb-9：手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝90:10，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝6.914min)。
中间体VIa-9：(R*)-乙基6-(溴甲基)-4-(2-氯-3,4-二氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法B的类似程序，从Va-9合成呈黄色固体的标题化合物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.25(s,0.3H),7.85(d,J＝3.2Hz,1H),7.54(d,J＝3.2Hz,0.6H),7.47-7.45(m,0.9H),7.22-7.00(m,2.2H),6.19(s,0.4H),6.11(d,J＝2.4Hz,0.6H),4.97(d,J＝11.2Hz,0.4H),4.94(d,J＝8.8Hz,0.6H),4.73(d,J＝11.2Hz,0.4H),4.56(d,J＝8.4Hz,0.6H),4.16-4.04(m,2H),1.19-1.13(m,3H)。
中间体V-10：甲基4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-6-甲基-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
通过利用方法A的类似程序，合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝1.657min，C18H13ClF3N3O2的计算质量395.1，m/z实测值396.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.43(d,J＝2.4Hz,1H),7.71-7.65(m,1H),7.45(dd,J＝8.4Hz,6.4Hz,1H),7.21(dd,J＝8.8Hz,2.4Hz,1H),7.04(dt,J＝8.4Hz,2.4Hz,1H),6.16(s,1H),3.59(s,3H),2.48(s,3H)。
中间体Va-10和Vb-10：
(R*)-甲基4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-6-甲基-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)和
(S*)-甲基4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-6-甲基-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
将甲基4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-6-甲基-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯V-10的外消旋混合物(1.2g，95％纯度，2.88mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak AS-H 5um 20*250mm；流动相：Hex:EtOH＝80:20，以18mL/min；温度：40℃；波长：214nm)分离以给出呈黄色固体的Va-10(550mg，由1H NMR得到的纯度为95％，46％产率，100％立体纯)和Vb-10(530mg，由1H NMR得到的纯度为95％，44％产率，99.8％立体纯)。
中间体Va-10：LC-MS(ESI)：RT＝1.692min，C18H13ClF3N3O2的计算质量395.1，m/z实测值396.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak AS-H，5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝80:20，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm；RT＝4.952min)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.43(s,1H),7.70-7.66(m,1H),7.46-7.43(m,1H),7.19(d,J＝7.2Hz,1H),7.04(t,J＝8.0Hz,1H),6.16(s,1H),3.59(s,3H),2.48(s,3H)。
中间体Vb-10：LC-MS(ESI)：RT＝1.692min，C18H13ClF3N3O2的计算质量395.1，m/z实测值396.1[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak AS-H，5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝80:20，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm；RT＝7.598min)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.43(d,J＝2.4Hz,1H),7.71-7.65(m,1H),7.45(dd,J＝8.4Hz,6.4Hz,1H),7.21(dd,J＝8.8Hz,2.4Hz,1H),7.04(dt,J＝8.4Hz,2.4Hz,1H),6.16(s,1H),3.59(s,3H),2.48(s,3H)。
中间体VIa-10：(R*)-甲基6-(溴甲基)-4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法B的类似程序，从Va-10合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝1.808min，C18H12BrClF3N3O2的计算质量473.0，m/z实测值474.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.47(d,J＝2.4Hz,1H),7.75-7.70(m,1H),7.54(dd,J＝8.8Hz,6.4Hz,1H),7.28(dd,J＝8.8Hz,2.8Hz,1H),7.12-7.07(m,1H),6.19(s,1H),4.92(d,J＝9.6Hz,1H),4.75(d,J＝9.6Hz,1H),3.68(s,3H)。
中间体VIb-10：(S*)-甲基6-(溴甲基)-4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法B的类似程序，从Vb-10合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝1.802min，C18H12BrClF3N3O2的计算质量473.0，m/z实测值474.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.47(d,J＝2.4Hz,1H),7.75-7.70(m,1H),7.55(dd,J＝10.0Hz,8.8Hz,1H),7.28(dd,J＝8.8Hz,2.8Hz,1H),7.12-7.07(m,1H),6.19(s,1H),4.92(d,J＝9.6Hz,1H),4.75(d,J＝9.2Hz,1H),3.68(s,3H)。
化合物I-1A：3-((4aR*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-4-氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000381
中间体I-1-2：(反式)-叔丁基3-溴-4-(2-羟基乙氧基)吡咯烷-1-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在0℃氮气下，向叔丁基2,5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸酯I-1-1(23g，136mmol)在乙二醇(100mL)中的溶液中添加N-溴代琥珀酰亚胺(25g，140mmol)。在室温下在氮气气氛下搅拌过夜后，将混合物倒入水(200mL)中并用乙酸乙酯(300mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(300mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)纯化以给出呈无色油状物的标题化合物(35g，由1H NMR得到的纯度为90％，70％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.30(s,1H),4.16-4.15(m,1H),3.96-3.92(m,1H),3.87-3.61(m,6H),3.52-3.43(m,1H),2.05(br s,1H),1.47(s,9H)。
中间体I-1-3：(反式)-叔丁基3-溴-4-(2-(甲苯磺酰基氧基)乙氧基)吡咯烷-1-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在0℃下，向(反式)-叔丁基3-溴-4-(2-羟基乙氧基)吡咯烷-1-甲酸酯I-1-2(26.3g，90％纯度，76.3mmol)和三乙胺(24g，237mmol)在二氯甲烷(150mL)中的溶液中添加甲苯磺酰氯(15g，78.7mmol)。在室温下搅拌过夜后，将混合物倒入水(200mL)中并用乙酸乙酯(300mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(300mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)纯化以给出呈无色油状物的标题化合物(30g，由1H NMR得到的纯度为90％，76％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79(d,J＝8.0Hz,2H),7.35(d,J＝8.0Hz,2H),4.15-4.11(m,3H),4.08-4.04(m,1H),3.86-3.68(m,5H),3.35(t,J＝12.0Hz,1H),2.46(s,3H),1.47(s,9H)。
中间体I-1-4：(顺式)-叔丁基4-苄基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
将(反式)-叔丁基3-溴-4-(2-(甲苯磺酰基氧基)乙氧基)吡咯烷-1-甲酸酯I-1-3(30g，90％纯度，58.1mmol)和苄胺(20g，187mmol)在1-甲基-2-吡咯烷酮(100mL)中的混合物在140℃下搅拌过夜。冷却至室温后，将混合物倒入水(500mL)中并用乙酸乙酯(300mL)萃取三次。将合并的有机层用水(500mL)洗涤三次，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)纯化以给出呈黄色油状物的标题化合物(15.7g，由1H NMR得到的纯度为90％，76％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.35-7.27(m,5H),4.04-3.99(m,1H),3.87-3.82(m,1H),3.70-3.57(m,4H),3.46-3.22(m,4H),2.78-2.68(m,1H),2.49-2.44(m,1H),1.47-1.44(m,9H)。
中间体I-1-5：(顺式)-叔丁基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
向(顺式)-叔丁基4-苄基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯I-1-4(15.7g，90％纯度，44.37mmol)在甲醇(100mL)中的溶液中添加10％wt.钯炭(5.0g)。在50℃下在氢气气氛(50psi)下搅拌过夜后，将混合物过滤。将滤液浓缩以给出呈无色油状物的标题化合物(10.0g，由1H NMR得到的纯度为90％，89％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.96(s,1H),3.84(dt,J＝11.2Hz,2.4Hz,1H),3.58-3.52(m,2H),3.48-3.36(m,4H),3.16-3.09(m,1H),2.67(dt,J＝13.2Hz,2.4Hz,1H),1.45(s,9H)。
中间体I-1-6：(顺式)-4-苄基6-叔丁基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4,6-二甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在0℃下，向(顺式)-叔丁基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯I-1-5(10g，90％纯度，39.4mmol)和N,N-二异丙基-乙胺(15.0g，116mmol)在二氯甲烷(100mL)中的溶液中添加氯甲酸苄酯(10.0g，170mmol)。在室温下搅拌4小时后，将混合物倒入水(100mL)中并用二氯甲烷(200mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(500mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)纯化以给出呈黄色油状物的标题化合物(15.4g，由1H NMR得到的纯度为90％，97％产率)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.42(s,5H),5.21(s,2H),4.64-4.44(m,1H),4.02-3.06(m,9H),1.51(s,9H)。
中间体I-1-7：(顺式)-苄基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
将(顺式)-4-苄基6-叔丁基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4,6-二甲酸酯I-1-6(5.1g，90％纯度，12.7mmol)在乙酸乙酯(20mL)中的2M盐酸盐中的溶液在室温下搅拌2小时。将混合物倒入饱和碳酸钠水溶液(20mL)中并用乙酸乙酯(20mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩以给出呈黄色油状物的标题化合物(3.3g，由1H NMR得到的纯度为90％，89％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39-7.30(m,5H),5.19-5.11(m,2H),4.38-4.30(m,1H),3.90-3.46(m,5H),3.26-2.87(m,4H)。
中间体I-1-9：(顺式)-苄基6-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
将(顺式)-苄基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯I-1-7(1.0g，90％纯度，3.43mmol)和4-甲氧基苄基2,2-二甲基-3-氧代丙酸酯I-1-8(1.0g，3.81mmol，90％纯度)在1,2-二氯乙烷(10mL)中的溶液在30℃下搅拌0.5小时，然后添加氰基硼氢化钠(600mg，9.55mmol)。在30℃下搅拌过夜后，将混合物倒入水(20mL)中并用二氯甲烷(30mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过C18柱(乙腈:水＝30％至60％)纯化以给出标题化合物(600mg，由1H NMR得到的纯度为90％，32％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38-7.23(m,7H),6.89-6.83(m,2H),5.18-5.00(m,4H),4.35-4.17(m,1H),3.86-3.69(m,6H),3.47-3.40(m,1H),3.26-3.20(m,1H),3.16-2.53(m,6H),1.15(s,6H)。
中间体I-1-9A和I-1-9B：
(4aR*,7aS*)-苄基6-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯(单一立体异构体)和
(4aS*,7aR*)-苄基6-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯(单一立体异构体)
将(顺式)-苄基6-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯I-1-9的混合物(3g，90％纯度，5.60mmol)通过手性制备型HPLC(柱：Chiralpak IF 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH＝70:30，以18mL/min；温度：30℃；波长：214nm)分离以给出呈黄色油状物的标题化合物I-1-9A(1.2g，由1H NMR得到的纯度为95％，42％产率，100％立体纯)和I-1-9B(1.1g，由1H NMR得到的纯度为95％，38％产率，97.6％立体纯)。
中间体I-1-9A：手性分析(柱：Chiralpak IF 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝70:30，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm；RT＝8.127min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38-7.23(m,7H),6.89-6.83(m,2H),5.15-5.00(m,4H),4.32-4.20(m,1H),3.87-3.69(m,6H),3.47-3.42(m,1H),3.26-3.22(m,1H),3.13-2.53(m,6H),1.15(s,6H)。
中间体I-1-9B：手性分析(柱：Chiralpak IF 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝70:30，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm；RT＝9.391min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38-7.23(m,7H),6.89-6.83(m,2H),5.18-5.00(m,4H),4.32-4.18(m,1H),3.86-3.79(m,6H),3.47-3.40(m,1H),3.26-3.22(m,1H),3.16-3.28(m,2H),2.81-2.53(m,4H),1.15(s,6H)。
中间体：3-((4aR*,7aS*)-六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
在30℃下在氢气囊下，将(4aR*,7aS*)-苄基6-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯I-1-9A(1.2g，95％纯度，2.36mmol)和10％wt.钯炭(600mg)在甲醇(20mL)中的混合物搅拌过夜。将混合物过滤并将滤液浓缩以给出呈黄色固体的粗的标题化合物(477mg，由1H NMR得到的纯度为95％，84％产率)。将粗的标题化合物(200mg，95％纯度)用甲醇(5滴)和乙腈(5mL)的溶液研磨。将黄色固体通过过滤收集，以给出呈黄色固体的纯的标题化合物(100mg，99.4％纯度，18％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝7.443min，C11H20N2O3的计算质量228.1，m/z实测值229.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.99-3.92(m,1H),3.84-3.81(m,1H),3.55-3.46(m,2H),3.32-3.19(m,2H),3.12-2.98(m,2H),2.94-2.84(m,2H),2.79-2.67(m,2H),1.23(s,3H),1.21(s,3H)。
化合物I-1A：3-((4aR*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-4-氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
向3-((4aR*,7aS*)-六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸I-1-10A(70mg，90％纯度，0.276mmol)和三乙醇胺(100mg，0.934mmol)在1,2-二氯乙烷(5mL)中的溶液中添加(R*)-乙基6-(溴甲基)-4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯VIa-1(100mg，95％纯度，0.207mmol)。在30℃下在氮气气氛下搅拌过夜后，将混合物用水(10mL)淬灭并用二氯甲烷(20mL)萃取三次。然后将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过C18柱(乙腈:水＝5％至50％)纯化以给出呈黄色固体的标题化合物(70mg，97.8％纯度，40％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝3.811min，C28H33ClFN5O5S的计算质量605.2，m/z实测值606.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.13(br s,1H),9.63(s,1H),8.01(d,J＝3.2Hz,1H),7.94(d,J＝3.2Hz,1H),7.43-7.38(m,2H),7.20-7.15(m,1H),6.05(s,1H),4.07-3.93(m,5H),3.86-3.83(m,1H),3.59-3.53(m,1H),3.14-3.05(m,2H),2.81-2.67(m,5H),2.56-2.51(m,2H),1.07-1.02(m,9H)。
化合物I-2A：4-((4aR*,7aS*)-4-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基-4-氧代丁酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000421
Figure BDA0003695472250000431
中间体I-1-6A和I-1-6B：
(4aR*,7aS*)-4-苄基6-叔丁基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4,6-二甲酸酯(单一立体异构体)和
(4aS*,7aR*)-4-苄基6-叔丁基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4,6-二甲酸酯(单一立体异构体)
将(顺式)-4-苄基6-叔丁基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4,6-二甲酸酯I-1-6的混合物(8.0g，20.97mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak IC5um 20*250mm；流动相：CO2:IPA＝75:25，以50g/min；温度：40℃；波长：214nm)分离以给出呈黄色油状物的I-1-6A(4.0g，95％纯度，50％产率，100％立体纯)和I-1-6B(4.0g，95％纯度，50％产率，99.4％立体纯)。
中间体I-1-6A：LC-MS(ESI)：RT＝3.731min，C19H26N2O5的计算质量362.2，m/z实测值263.1[M+H-100]+。手性分析(柱：Chiralpak IC，5μm 4.6*250mm；流动相：CO2:IPA＝75:25，以3.0g/min；温度：40℃；波长：214nm；背压：100巴，RT＝4.31min)。
中间体I-1-6B：LC-MS(ESI)：RT＝3.727min，C19H26N2O5的计算质量362.2，m/z实测值263.2[M+H-100]+。手性分析(柱：Chiralpak IC，5μm 4.6*250mm；流动相：CO2:IPA＝75:25，以3.0g/min；温度：40℃；波长：214nm；背压：100巴，RT＝7.08min)。
中间体I-1-7A：(4aR*,7aS*)-苄基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯盐酸盐(单一立体异构体)
在室温下在氮气气氛下，将(4aR*,7aS*)-4-苄基6-叔丁基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4,6-二甲酸酯I-1-6A(400mg，95％纯度，1.05mmol)在乙酸乙酯(16mL)中的4M盐酸盐中的溶液搅拌1小时。然后将混合物浓缩以给出呈白色固体的标题化合物(340mg，由1HNMR得到的纯度为90％，98％产率)。LC-MS(ESI)：RT＝1.30min，C14H18N2O3的计算质量262.1，m/z实测值263.0[M+H]+。
1H NMR(400MHz,D2O)δ7.48(s,5H),5.23(s,2H),4.92-4.69(m,1H),4.25(s,1H),4.01-3.79(m,2H),3.67-3.52(m,4H),3.42-3.36(m,1H),3.30-3.17(m,1H)。
中间体I-2-1A：4-((4aR*,7aS*)-4-((苄基氧基)羰基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基-4-氧代丁酸(单一立体异构体)
在氮气气氛下，向(4aR*,7aS*)-苄基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯盐酸盐I-1-7A(340mg，90％纯度，1.02mmol)在四氢呋喃(10mL)中的溶液中添加3,3-二甲基二氢呋喃-2,5-二酮(160mg，1.25mmol)和三乙胺(310mg，3.06mmol)。在30℃下搅拌过夜后，将混合物用乙酸乙酯(20mL)稀释并用水(40mL)洗涤。将水层用乙酸乙酯(10mL)萃取三次。然后将合并的有机层经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过C18柱(乙腈:水＝50％至85％)纯化以给出呈黄色油状物的标题化合物(340mg，由1H NMR得到的纯度为95％，81％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝1.31min，C20H26N2O6的计算质量390.2，m/z实测值391.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.37-7.33(m,5H),5.22-5.11(m,2H),4.62-4.58(m,0.5H),4.52-4.45(m,0.5H),4.04-3.39(m,8H),3.22-3.11(m,1H),2.63-2.43(m,2H),1.31-1.30(m,6H)。
中间体I-2-2A：4-((4aR*,7aS*)-六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基-4-氧代丁酸(单一立体异构体)
在氮气气氛下，向4-((4aR*,7aS*)-4-((苄基氧基)羰基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基-4-氧代丁酸I-2-1A(100mg，95％纯度，0.243mmol)在甲醇(20mL)中的溶液中添加20％wt.氢氧化钯炭(30mg)。在30℃下在氢气囊下搅拌过夜后，将混合物冷却至室温并过滤。将滤液浓缩以给出呈黄色油状物的标题化合物(50mg，由1H NMR得到的纯度为90％，72％产率)，将其不经进一步纯化而直接用于下一步骤。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.30(s,0.4H),4.15(s,0.6H),3.90-3.87(m,1H),3.77-3.31(m,6H),3.22-3.13(m,0.5H),3.01-2.93(m,0.5H),2.74-2.61(m,1H),2.52-2.39(m,2H),1.29-1.23(m,6H)。
化合物I-2A：4-((4aR*,7aS*)-4-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基-4-氧代丁酸(单一立体异构体)
向(S)-乙基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯VIa-2(100mg，95％纯度，0.217mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液中添加4-((4aR*,7aS*)-六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基-4-氧代丁酸I-2-2A(70mg，90％纯度，0.246mmol)和N,N-二异丙基乙胺(80mg，0.782mmol)。在30℃下在氮气气氛下搅拌过夜后，将混合物用乙酸乙酯(20mL)稀释并用水(30mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过制备型HPLC(柱：X-bridge C18(5um 19*150mm)；流动相A：水(+0.1％碳酸氢铵)，流动相B：乙腈，UV：214nm，流速：15mL/min，梯度：15％-70％(％B))纯化以给出粗产物，将其通过C18柱(乙腈:水(+0.1％盐酸盐)＝50％至65％)进一步纯化以给出呈黄色固体的标题化合物(55mg，98.7％纯度，41％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝3.318min，C30H36FN5O6S的计算质量613.2，m/z实测值614.3[M+H]+。1HNMR(400MHz,CD3OD)δ7.97(d,J＝3.2Hz,0.5H),7.94(d,J＝2.8Hz,0.5H),7.76(dd,J＝7.6Hz,2.8Hz,1H),7.20-7.09(m,2H),6.97-6.92(m,1H),5.97(d,J＝8.4Hz,1H),4.33(brs,0.5H),4.29-4.19(m,1.5H),4.13-3.96(m,4H),3.87-3.77(m,2H),3.72-3.44(m,4H),3.04-2.91(m,1H),2.72-2.66(m,1.4H),2.64-2.55(m,1H),2.55-2.51(m,3.6H),1.26(d,J＝7.2Hz,3H),1.21(s,1.4H),1.18-1.14(m,4.6H)。
化合物I-3A：(S)-3-((4aR*,7aR*)-4-((5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-7-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000451
中间体I-3-1A和I-3-1B：
(4aR*,7aR*)-苄基6-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-7-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯(单一立体异构体)和(4aS*,7aS*)-苄基6-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯(单一立体异构体)
在室温下，向(4aR*,7aS*)-苄基6-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯I-1-9A(500mg，90％纯度，0.933mmol)在乙酸乙酯(3mL)和水(3mL)中的溶液中添加高碘酸钠(400mg，1.87mmol)和氯化钌(III)(35mg，0.169mmol)。在室温下搅拌1小时后，将反应混合物用水(10mL)稀释并用乙酸乙酯(10mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩。将残余物通过C18柱(乙腈:水＝50％至80％)纯化以给出呈浅黄色油状物的混合化合物(500mg)，将其通过手性制备型HPLC(柱：Chiralpak IE 5μm 30*250mm；流动相：Hex:EtOH＝40:60，以30mL/min；温度：35℃；波长：230nm)分离以给出呈浅黄色油状物的I-3-1A(230mg，由1H NMR得到的纯度为90％，46％产率，100％立体纯)和I-3-1B(140mg，由1H NMR得到的纯度为90％，28％产率，100％立体纯)。
中间体I-3-1A：LC-MS(ESI)：RT＝1.68min，C27H32N2O7的计算质量496.2，m/z实测值497.5[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝40:60，以1mL/min；温度：30℃；波长：214nm，RT＝12.719min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.41-7.28(m,7H),6.84(d,J＝8.8Hz,2H),5.18(d,J＝12.4Hz,1H),5.15(d,J＝12.4Hz,1H),5.10-5.07(m,1H),5.02-4.99(m,1H),4.41-4.26(m,1H),3.95-3.85(m,2.3H),3.79(s,3H),3.76-3.71(m,0.7H),3.60(d,J＝13.6Hz,1H),3.45(td,11.6,2.8Hz,1H),3.38(d,J＝13.6Hz,1H),3.31-3.16(m,2H),3.08-2.91(m,1H),1.20(s,6H)。
中间体I-3-1B：LC-MS(ESI)：RT＝1.68min，C27H32N2O7的计算质量496.2，m/z实测值497.5[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IE 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝40:60，以1mL/min；温度：30℃；波长：214nm，RT＝10.808min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37-7.29(m,7H),6.90-6.86(m,2H),5.25-5.15(m,2H),5.11-5.03(m,2H),4.74(d,J＝4.4Hz,0.5H),4.54(d,J＝4.4Hz,0.5H),4.02-3.96(m,1H),3.88-3.84(m,1H),3.81(s,1.5H),3.80(s,1.5H),3.79-3.73(m,1H),3.70-3.62(m,1H),3.49-3.42(m,1H),3.39-3.29(m,2H),3.06-3.04(m,1H),3.01-2.90(m,1H),1.22-1.18(m,6H)。
中间体I-3-2A：2,2-二甲基-3-((4aR*,7aR*)-7-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)丙酸(单一立体异构体)
在室温下，向(4aR*,7aR*)-苄基6-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-7-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯I-3-1A(200mg，90％纯度，0.362mmol)在甲醇(4mL)中的溶液中添加10％活性炭载钯(50mg，0.47mmol)。在室温下在氢气囊下搅拌1小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤。将滤液浓缩以得到呈浅黄色油状物的标题化合物(80mg，由1H NMR得到的纯度为90％，82％产率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.17(d,J＝4.4Hz,1H),3.51-3.47(m,2H),3.40-3.30(m,3H),3.17-3.13(m,1H),2.88(d,J＝9.2Hz,1H),2.68-2.56(m,2H),1.10(s,3H),1.04(s,3H)。
化合物I-3A：(S)-3-((4aR*,7aR*)-4-((5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-7-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
向(S)-乙基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯VIa-2(115mg，95％纯度，0.249mmol)在二氯甲烷(4mL)中的溶液中添加三乙醇胺(112mg，0.751mmol)和2,2-二甲基-3-((4aR*,7aR*)-7-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)丙酸I-3-2A(60mg，0.25mmol)。在40℃下在氮气气氛下搅拌过夜后，将反应混合物冷却至室温，用水(30mL)稀释并用乙酸乙酯(30mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩以给出残余物，将其通过C18柱(乙腈:水＝40％至70％)纯化以给出呈黄色固体的标题化合物(47mg，99.1％纯度，31％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝3.323min，C29H34FN5O6S的计算质量599.2，m/z实测值600.3[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.50(s,1H),7.80(d,J＝3.2Hz,1H),7.41(d,J＝3.2Hz,1H),7.13-7.05(m,2H),6.93-6.88(m,1H),6.02(s,1H),4.39(d,J＝5.2Hz,1H),4.33(d,J＝16.4Hz,1H),4.12-4.00(m,2H),3.82-3.76(m,3H),3.72-3.62(m,2H),3.40-3.36(m,1H),3.27(d,J＝14.0Hz,1H),3.21-3.19(m,1H),2.59-2.54(m,1H),1.51(s,3H),2.48-2.42(m,1H),1.31(s,3H),1.28(s,3H),1.12(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物I-3B：(S)-3-((4aS*,7aS*)-4-((5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000481
中间体I-3-2B：2,2-二甲基-3-((4aS*,7aS*)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)丙酸(单一立体异构体)
在室温下，向(4aS*,7aS*)-苄基6-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯I-3-1B(140mg，90％纯度，0.254mmol)在2-丙醇(2mL)和四氢呋喃(2mL)中的溶液中添加氢氧化钯(50mg，0.036mmol)。在50℃下在氢气气氛(气囊)下搅拌1小时后，将反应混合物过滤并浓缩以得到呈浅黄色油状物的标题化合物(60mg，由1H NMR得到的纯度为30％，29％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.14-4.12(m,1H),3.67-3.49(m,4H),3.30-3.18(m,2H),2.78-2.72(m,1H),2.68-2.65(m,1H),2.52-2.48(m,1H),1.23(s,3H),1.19(s,3H)。
化合物I-3B：(S)-3-((4aS*,7aS*)-4-((5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
向(S)-乙基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯VIa-2(37mg，90％纯度，0.076mmol)在二氯甲烷(4mL)中的溶液中添加三乙醇胺(34mg，0.228mmol)和2,2-二甲基-3-((4aS*,7aS*)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)丙酸I-3-2B(60mg，30％纯度，0.074mmol)。在40℃下在氮气气氛下搅拌过夜后，将反应混合物冷却至室温，用水(30mL)稀释并用乙酸乙酯(30mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩以给出残余物，将其通过C18柱(乙腈:水＝40％至70％)纯化以给出呈黄色固体的标题化合物(18.4mg，95.9％纯度，39％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝3.509min，C29H34FN5O6S的计算质量599.2，m/z实测值600.3[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.48(s,1H),7.83(d,J＝3.2Hz,1H),7.41(d,J＝3.2Hz,1H),7.10-7.03(m,1H),6.99-6.97(m,1H),6.91-6.87(m,1H),6.01(s,1H),4.65(d,J＝17.6Hz,1H),4.54(d,J＝17.6Hz,1H),4.29-4.26(m,1H),4.11-4.03(m,2H),3.89-3.76(m,2H),3.63-3.55(m,2H),3.44(d,J＝3.6Hz,1H),3.39-3.36(m,2H),2.96-2.90(m,1H),2.57(s,1H),2.54(s,3H),1.26(s,3H),1.23(s,3H),1.15(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物I-4E：(S)-乙基6-(((顺式)-6-乙酰基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
Figure BDA0003695472250000491
中间体I-4-1：(顺式)-苄基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯盐酸盐(2种立体异构体的混合物)
将(顺式)-4-苄基6-叔丁基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4,6-二甲酸酯I-1-6(250mg，90％纯度，0.621mmol)在乙酸乙酯(2mL)中的4M盐酸盐中的溶液在室温下搅拌0.5小时。将混合物在减压下浓缩以给出呈紫色固体的标题化合物(180mg，97％产率)，将其不经进一步纯化而直接用于下一步骤。
LC-MS(ESI)：RT＝1.31min，C14H18N2O3的计算质量262.1，m/z实测值263.0[M+H]+。
中间体I-4-2：(顺式)-苄基6-乙酰基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
向(顺式)-苄基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯盐酸盐I-4-1(180mg，0.602mmol)在二氯甲烷(2mL)中的悬浮液中添加三乙胺(95mg，0.941mmol)。将混合物在室温下搅拌15分钟，然后添加乙酸酐(94mg，0.922mmol)。在室温下搅拌1小时后，将混合物倒入水(10ml)中并用二氯甲烷(5mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇＝20:1)纯化以得到呈紫色油状物的标题化合物(165mg，由1H NMR得到的纯度为90％，81％产率)。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.37-7.33(m,5H),5.22-5.09(m,2H),4.62-4.41(m,1H),4.04-3.47(m,8H),3.25-3.07(m,1H),2.05-2.02(m,3H)。
中间体I-4-3：1-((顺式)-六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)乙烯酮(2种立体异构体的混合物)
向(顺式)-苄基6-乙酰基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯I-4-2(165mg，90％纯度，0.488mmol)在甲醇(5mL)中的溶液中添加10％wt.钯炭(50mg)。在30℃下在氢气气氛下搅拌2小时后，将混合物过滤。将滤液浓缩以给出呈无色油状物的标题化合物(80mg，由1H NMR得到的纯度为90％，87％产率)，将其不经进一步纯化而直接用于下一步骤。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.09-4.07(m,0.5H),3.98(t,J＝4.0Hz,0.5H),3.86(t,J＝2.8Hz,0.5H),3.83(t,J＝2.8Hz,0.5H),3.75(t,J＝9.6Hz,0.5H),3.67-3.52(m,4.5H),3.48-3.43(m,1H),3.16-3.09(m,1H),2.73-2.68(m,1H),2.08-2.06(m,3H)。
化合物I-4E：(S)-乙基6-(((顺式)-6-乙酰基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在室温下，向1-((顺式)-六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)乙酮I-4-3(50mg，90％纯度，0.264mmol)和(S)-乙基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯VIa-2(93mg，95％纯度，0.202mmol)在二氯甲烷(2mL)中的溶液中添加三乙醇胺(119mg，0.798mmol)。在30℃下在氮气气氛下搅拌3小时后，将混合物浓缩并通过C18柱(乙腈:水＝25％至70％)纯化以给出呈黄色固体的标题化合物(60mg，99.7％纯度，56％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝3.851min，C26H30FN5O4S的计算质量527.2，m/z实测值528.3[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.52-9.37(m,1H),7.87-7.77(m,1H),7.46-7.40(m,1H),7.11-7.02(m,1H),6.96-6.94(m,1H),6.90-6.86(m,1H),6.06-5.95(m,1H),4.38-4.14(m,2H),4.11-3.87(m,4H),3.86-3.39(m,6H),3.03-2.81(m,1H),2.85-2.58(m,0.5H),2.55(s,3H),2.50-2.38(m,0.5H),2.10-1.99(m,3H),1.17-1.07(m,3H)。
化合物I-5：3-((顺式)-4-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)环戊烷甲酸(8种立体异构体的混合物)
Figure BDA0003695472250000511
中间体I-5-1：(顺式)-叔丁基4-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在室温下，向(S)-乙基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯VIa-2(100mg，95％纯度，0.217mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中添加(顺式)-叔丁基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯I-1-5(72mg，0.284mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.2mL，1.21mmol)。在室温下搅拌过夜后，将混合物通过C18柱(乙腈:水＝10％至100％)纯化以给出呈黄色固体的标题化合物(130mg，由1H NMR得到的纯度为90％，92％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.57-9.51(m,1H),7.83-7.82(m,1H),7.43(s,1H),7.08-6.89(m,3H),6.03-6.02(m,1H),4.37-3.79(m,7H),3.65-3.29(m,5H),3.02-2.82(m,1H),2.60-2.55(m,3.3H),2.43-2.40(m,0.7H),1.46-1.43(m,9H),1.14-1.13(m,3H)。
中间体I-5-2：(S)-乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-(((顺式)-六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯盐酸盐(2种立体异构体的混合物)
将(顺式)-叔丁基4-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯I-5-1(130mg，90％纯度，0.2mmol)在乙酸乙酯(10mL)中的4M盐酸盐中的溶液在室温下搅拌3小时。将混合物浓缩以给出呈黄色固体的标题化合物(110mg，85％纯度，84％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝1.598min，C24H28FN5O3S的计算质量485.2，m/z实测值486.2[M+H]+。
中间体I-5-3：(4S)-乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-(((顺式)-6-(3-(甲氧基羰基)环戊基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(8种立体异构体的混合物)
在室温下，向(S)-乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-(((顺式)-六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯盐酸盐I-5-2(50mg，85％纯度，0.076mmol)在甲醇(5mL)中的溶液中添加三乙胺(0.05mL，0.359mmol)。将混合物在室温下搅拌30分钟，然后添加甲基3-氧代环戊烷甲酸酯(21mg，95％纯度，0.14mmol)。在60℃下搅拌2小时后，将混合物冷却至室温，然后添加乙酸(0.2mL)和氰基硼氢化钠(12mg，0.191mmol)。在35℃下在氮气气氛下搅拌过夜后，将所得混合物用水(30mL)淬灭并用乙酸乙酯(20mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过C18柱(乙腈:水＝10％至90％)纯化以给出呈黄色固体的标题化合物(30mg，由1H NMR得到的纯度为90％，58％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝1.908min，C31H38FN5O5S的计算质量611.3，m/z实测值612.3[M+H]+。1HNMR(400MHz,CD3OD)δ8.36-8.23(m,2H),7.38-7.31(m,2H),7.14-7.09(m,1H),6.25-6.18(m,1H),4.40-4.26(m,2H),4.14-4.12(m,3H),4.06-3.99(m,2H),3.93-3.79(m,3H),3.71-3.69(m,3H),3.63-3.56(m,1H),3.24-3.19(m,3H),3.14-3.08(m,1H),3.04-2.94(m,1H),2.88-2.75(m,1H),2.50(s,3H),2.29-2.17(m,1.3H),2.11-2.00(m,2.7H),1.92-1.80(m,1H),1.17-1.07(m,3H)。
化合物I-5：3-((顺式)-4-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)环戊烷甲酸(8种立体异构体的混合物)
在室温下，向(4S)-乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-(((顺式)-6-(3-(甲氧基羰基)环戊基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯I-5-3(30mg，90％纯度，0.044mmol)在甲醇(3mL)和四氢呋喃(3mL)中的溶液中添加氢氧化锂一水合物(9mg，0.214mmol)在水(1mL)中的溶液。在室温下搅拌2小时后，将反应混合物用水(5mL)稀释并用1M盐酸盐水溶液酸化至pH＝2。然后将混合物用乙酸乙酯(15mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过C18柱(乙腈:水＝10％至90％)纯化以给出呈黄色固体的标题化合物(12mg，97.1％纯度，44％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝3.342min、3.474min，C30H36FN5O5S的计算质量597.2，m/z实测值598.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.93(d,J＝3.2Hz,1H),7.73(d,J＝3.2Hz,1H),7.17-7.07(m,2H),6.96-6.91(m,1H),5.99(s,0.5H),5.97(s,0.5H),4.35-4.21(m,2H),4.09-3.99(m,3.3H),3.94-3.89(m,0.7H),3.82-3.77(m,2H),3.70-3.63(m,1H),3.58-3.35(m,3H),3.25-3.14(m,1H),3.05-2.79(m,2H),2.68-2.65(m,0.5H),2.51-2.44(m,3.5H),2.34-2.24(m,0.4H),2.17-1.95(m,4.6H),1.87-1.75(m,0.7H),1.64-1.55(m,0.3H),1.13(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物I-6A：3-((4aR*,7aS*)-4-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000531
在室温下，向3-((4aR*,7aS*)-六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸I-1-10A(105mg，80％纯度，0.317mmol)和三乙醇胺(485mg，3.25mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加(S)-乙基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯VIa-2(150mg，95％纯度，0.325mmol)。在室温下搅拌16小时后，将混合物在减压下浓缩以给出残余物，将其通过C18柱(乙腈:水(+0.1％碳酸氢铵)＝05％至80％)纯化以给出呈黄色固体的标题化合物(116.1mg，98.6％纯度，60％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝3.745min，C29H36FN5O5S的计算质量585.2，m/z实测值586.3[M+H]+。1HNMR(400MHz,CD3OD)δ7.92(d,J＝3.2Hz,1H),7.73(d,J＝3.2Hz,1H),7.16-7.07(m,2H),6.95-6.91(m,1H),5.96(s,1H),4.30(d,J＝16.4Hz,1H),4.25(d,J＝2.0Hz,1H),4.08-3.98(m,4H),3.89-3.79(m,2H),3.77-3.71(m,1H),3.44(s,2H),3.39-3.32(m,1H),3.24(d,J＝13.2Hz,1H),3.14(d,J＝13.2Hz,1H),3.03(td,J＝12.0,2.8Hz,1H),2.68(d,J＝11.6Hz,1H),2.51(s,3H),1.28(s,3H),1.20(s,3H),1.12(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物I-7F：(S)-(顺式)-乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-((6-(甲基磺酰基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
Figure BDA0003695472250000541
中间体I-7-1：(顺式)-苄基6-(甲基磺酰基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在室温下，向(顺式)-苄基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯I-1-7(140mg，90％纯度，0.480mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液中添加甲磺酰氯(65mg,0.567mmol)和三乙胺(166mg，1.64mmol)。在室温下搅拌过夜后，将混合物溶解在二氯甲烷(30mL)中并用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩以给出残余物，将其通过C18柱(乙腈:水＝05％至95％)纯化以给出呈白色油状物的标题化合物(130mg，68％产率，由LCMS得到的纯度为85％)。
LC-MS(ESI)：RT＝1.47min，C15H20N2O5S的计算质量340.1，实测值341.0[M+H]+。
中间体I-7-2：(顺式)-6-(甲基磺酰基)八氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪(2种立体异构体的混合物)
向(顺式)-苄基6-(甲基磺酰基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯I-7-1(130mg，85％纯度，0.325mmol)在甲醇(15mL)中的溶液中添加10％wt.活性炭载钯(17mg，0.16mmol)。在30℃下在氢气气氛(气囊)下搅拌过夜后，将混合物通过硅藻土垫过滤。将滤液在减压下浓缩以给出呈无色油状物的标题化合物(65mg，由1H NMR得到的纯度为95％，92％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.98(t,J＝3.2Hz,1H),3.86-3.82(m,1H),3.60-3.49(m,4H),3.42-3.37(m,2H),3.13-3.07(m,1H),2.87(s,3H),2.71-2.67(m,1H)。
化合物I-7F：(S)-(顺式)-乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-((6-(甲基磺酰基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
从化合物I-7-2和VIa-2转化而来。通过利用方法C的类似程序，合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝3.914min，C25H30FN5O5S2的计算质量564.2，实测值564.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.94(d,J＝2.8Hz,1H),7.74(d,J＝3.2Hz,1H),7.16-7.09(m,2H),6.95(t,J＝8.4Hz,1H),6.00(s,0.5H),5.98(s,0.5H),4.31-4.19(m,2H),4.11-4.05(m,3H),4.00-3.90(m,1.5H),3.81(t,J＝11.2Hz,1H),3.71-3.65(m,1.5H),3.58-3.49(m,2H),3.45-3.41(m,2H),3.02(td,J＝11.6,3.2Hz,0.5H),2.92(s,1.5H),2.91(s,1.5H),2.66(d,J＝12.0Hz,0.5H),2.53(s,3H),1.15(t,J＝5.2Hz,3H)。
化合物I-8F：2-((顺式)-4-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)噻唑-5-甲酸(2种立体异构体的混合物)
Figure BDA0003695472250000551
中间体I-8-1：(顺式)-苄基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯盐酸盐(2种立体异构体的混合物)
在氮气气氛下，向(顺式)-4-苄基6-叔丁基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4,6-二甲酸酯I-1-6(460mg，90％纯度，1.14mmol)在乙酸乙酯(2mL)中的溶液中添加在乙酸乙酯(5mL)中的4.0M盐酸盐。在室温下搅拌2小时后，将混合物浓缩以给出呈白色固体的标题化合物(380mg，由1H NMR得到的纯度为90％，99％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝1.108min，C14H19ClN2O3的计算质量298.1，m/z实测值263.1[M-HCl+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.45(s,1H),9.18(s,1H),7.38-7.33(m,5H),5.14(s,2H),4.61-4.55(m,1H),4.07(s,1H),3.92-3.86(m,1H),3.70-3.67(m,1H),3.53-3.50(m,1H),3.47-3.42(m,1H),3.39-3.32(m,2H),3.23-3.19(m,2H)。
中间体I-8-2：(顺式)-苄基6-(5-(甲氧基羰基)噻唑-2-基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在室温下，向(顺式)-苄基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯盐酸盐I-8-1(380mg，90％纯度，1.14mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中添加碳酸钾(438mg，3.18mmol)、2-溴-5-(甲氧基甲基)噻唑(315mg，1.52mmol)。在70℃下在氮气气氛下搅拌过夜后，将混合物用水(20mL)稀释并用二氯甲烷(20mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩以给出残余物，将其通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝10:1至5:1)纯化以给出呈黄色油状物的标题化合物(360mg，由1H NMR得到的纯度为90％，70％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝1.127min，C19H21N3O5S的计算质量403.1，m/z实测值404.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.89(s,1H),7.40-7.35(m,5H),5.18-5.17(m,2H),4.75-4.63(m,1H),4.12(s,1H),3.99-3.89(m,2H),3.83(s,3H),3.76-3.69(m,3H),3.59-3.53(m,2H),3.26-3.10(m,1H)。
中间体I-8-3：(顺式)-甲基2-六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)噻唑-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在室温下，向(顺式)-苄基6-(5-(甲氧基羰基)噻唑-2-基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯I-8-2(120mg，90％纯度，0.267mmol)在甲醇(4mL)中的溶液中添加10％wt.钯炭(285mg，0.267mmol)。在室温下在氢气气氛气囊下搅拌过夜后，将混合物通过硅藻土垫过滤。将滤液在减压下浓缩以给出呈黄色油状物的标题化合物(70mg，由
1H NMR得到的纯度为90％，88％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.90(s,1H),4.15-4.13(m,1H),3.88-3.85(m,1H),3.83(s,3H),3.79-3.75(m,1H),3.70-3.64(m,3H),3.60-3.57(m,1H),3.53-3.48(m,1H),3.19-3.11(m,1H),2.74-2.71(m,1H)。
中间体I-8-4：(顺式)-2-六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)噻唑-5-甲酸(2种立体异构体的混合物)
在室温下在氮气气氛下，向(顺式)-甲基2-六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)噻唑-5-甲酸酯I-8-3(70mg，90％纯度，0.23mmol)在甲醇(1mL)中的溶液中添加在水(1mL)中的氢氧化钠(19mg，0.48mmol)。在室温下搅拌2小时后，将混合物用水(10mL)稀释并用乙酸乙酯(10mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩以给出呈黄色固体的标题化合物(50mg，由1H NMR得到的纯度为90％，75％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝0.258min，C10H13N3O3S的计算质量255.1，m/z实测值256.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.77(s,1H),10.29(s,1H),7.81(s,1H),4.45-4.43(m,1H),4.09-4.08(m,1H),3.94-3.79(m,4H),3.70-3.66(m,1H),3.50-3.47(m,1H),3.30-3.25(m,1H),3.07-3.04(m,1H)。
化合物I-8F：2-((顺式)-4-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)噻唑-5-甲酸(2种立体异构体的混合物)
从化合物I-8-4和VIa-2转化而来。通过利用方法C的类似程序，合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝3.597min，C28H29FN6O5S2的计算质量612.2，m/z实测值613.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.93-7.91(m,1H),7.72-7.70(m,2H),7.18-7.09(m,2H),6.95-6.88(m,1H),5.98(s,0.6H),5.96(s,0.4H),4.42-4.36(m,1.6H),4.35-4.29(m,0.4H),4.25-4.07(m,3H),4.02-3.95(m,1H),3.94-3.81(m,2H),3.79-3.75(m,1H),3.74-3.65(m,2H),3.60-3.55(m,1H),3.01-2.90(m,1H),2.70(d,J＝10.0Hz,0.4H),2.57(d,J＝12.0Hz,0.6H),2.50(s,3H),1.15(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物I-9F：(4aS*,7aR*)-(S)-3-((4-((5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)磺酰基)-1-甲基环丁烷甲酸(2种立体异构体的混合物)
Figure BDA0003695472250000581
中间体I-9-2：1-甲基-3-氧代环丁烷甲酸
向乙基1-甲基-3-氧代环丁烷甲酸酯I-9-1(4.00g，25.6mmol)在甲醇(50mL)和水(10mL)中的溶液中添加氢氧化锂一水合物(2.15g，51.2mmol)。在室温下搅拌过夜后，将混合物用2M盐酸盐水溶液酸化至pH约2，然后在减压下浓缩以给出残余物，将其溶解在水(50mL)中并用乙酸乙酯(30mL)萃取三次。将合并的有机层经Na2SO4(固体)干燥并浓缩以得到呈黄色油状物的标题化合物(4.10g，90％纯度，100％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.67-3.62(m,2H),2.99-2.93(m,2H),1.62(s,3H)。
中间体I-9-3：2-(三甲基甲硅烷基)乙基1-甲基-3-氧代环丁烷甲酸酯
在氮气下，向1-甲基-3-氧代环丁烷甲酸I-9-2(4.10g，纯度90％，28.8mmol)和2-(三甲基甲硅烷基)乙醇(3.75g，31.7mmol)、N,N-二甲基吡啶-4-胺(3.50g，28.6mmol)在四氢呋喃(100mL)中的溶液中添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(8.30g，43.2mmol)。在室温下搅拌过夜后，将混合物用水(50mL)淬灭，然后在减压下浓缩以去除挥发物，用乙酸乙酯(80mL)萃取三次。将合并的有机层用2M盐酸盐水溶液(100mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并浓缩以得到呈黄色油状物的标题化合物(5.10g，80％纯度，100％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.21-4.17(m,2H),3.54-3.49(m,2H),2.85-2.80(m,2H),1.52(s,3H),0.99-0.95(m,2H),0.07(s,9H)。
中间体I-9-4：2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-羟基-1-甲基环丁烷甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在室温下，向2-(三甲基甲硅烷基)乙基1-甲基-3-氧代环丁烷甲酸酯I-9-3(5.10g，80％纯度，17.9mmol)在四氢呋喃(100mL)和水(10mL)中的溶液中分批添加四氢硼酸钠(2.70g，71.5mmol)。在室温下搅拌过夜后，将混合物用水(20mL)淬灭，并然后在减压下浓缩以给出残余物。将残余物用水(50mL)吸收并用乙酸乙酯(50mL)萃取三次。将合并的有机层经Na2SO4(固体)干燥并浓缩以得到呈黄色油状物的标题化合物(3.80g，90％纯度，100％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.38-4.22(m,1H),4.16-4.10(m,2H),3.71-3.67(m,1H),2.80-2.71(m,1H),2.32-2.21(m,2H),1.85-1.77(m,1H),1.35(s,1.5H),1.30(s,1.5H),0.97-0.89(m,2H),0.07(s,9H)。
中间体I-9-5：2-(三甲基甲硅烷基)乙基1-甲基-3-(甲苯磺酰基氧基)环丁烷甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在氮气下，向2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-羟基-1-甲基环丁烷甲酸酯I-9-4(3.70g，90％纯度，14.5mmol)和N,N-二甲基吡啶-4-胺(2.90g，23.7mmol)在二氯甲烷(100mL)中的溶液中添加4-甲基苯-1-磺酰氯(3.3g，17.3mmol)。在室温下搅拌过夜后，将反应溶液用水(40mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并在减压下浓缩以给出残余物。将残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝8:1)纯化以得到呈浅黄色油状物的标题化合物(3.10g，95％纯度，48％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.74(d,J＝8.4Hz,2H),7.30(d,J＝8.0Hz,2H),4.87-4.83(m,1H),4.14-4.10(m,1H),2.72-2.66(m,0.8H),2.56-2.52(m,1.2H),2.42(s,3H),2.17-2.11(m,1.2H),2.08-2.03(m,0.8H),1.33(s,1H),1.28(s,2H),0.95-0.91(m,2H),0.01(s,9H)。
中间体I-9-6：2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-(乙酰基硫代)-1-甲基环丁烷甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在室温下，向2-(三甲基甲硅烷基)乙基1-甲基-3-(甲苯磺酰基氧基)环丁烷甲酸酯I-9-5(3.10g，95％纯度，7.26mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(70mL)中的溶液中添加硫代乙酸钾(3.00g，26.3mmol)。在100℃下搅拌6小时后，将反应混合物冷却并倒入水(200mL)中，并用乙酸乙酯(80mL)萃取三次。将合并的有机层用水(100mL)洗涤三次，经Na2SO4(固体)干燥并浓缩以得到呈黄色油状物的标题化合物(2.30g，90％纯度，99％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.27-4.21(m,2H),4.19-4.08(m,1H),3.06-3.00(m,1H),2.59-2.50(m,1H),2.41-2.36(m,1H),2.32(s,3H),2.04-1.99(m,1H),1.50(s,1.2H),1.44(s,1.8H),1.08-1.01(m,2H),0.07(s,9H)。
中间体I-9-7：2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-(氯磺酰基)-1-甲基环丁烷甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在0℃下，向2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-(乙酰基硫代)-1-甲基环丁烷甲酸酯I-9-6(1.10g，90％纯度，7.52mmol)在乙腈(50mL)中的溶液中添加2M盐酸盐水溶液(0.2mL)和1-氯吡咯烷-2,5-二酮(1.35g，10.1mmol)。在0℃下搅拌1小时后，将所得混合物在减压下浓缩并将获得的粗产物倒入水(30mL)中，用乙酸乙酯(30mL)萃取三次。将合并的有机层用水(20mL)洗涤三次，经Na2SO4(固体)干燥并浓缩以给出残余物，将其通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)纯化以得到呈浅黄色油状物的标题化合物(820mg，95％纯度，73％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.48-4.33(m,1H),4.26-4.19(m,2H),3.16-3.10(m,0.8H),2.97-2.91(m,1.2H),2.63-2.57(m,1.2H),2.41-2.36(m,0.8H),1.48(s,3H),1.04-0.99(m,2H),0.07(s,9H)。
中间体I-9-8：(S)-(顺式)-乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-((六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
向(顺式)-叔丁基4-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯I-5-1(200mg，90％纯度，0.307mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液中添加三氟乙酸(3mL)。在室温下搅拌3小时后，添加饱和的碳酸氢钠水溶液以调节至pH约7。将混合物用二氯甲烷(10mL)萃取两次。将合并的萃取物经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩以给出呈黄色固体的标题化合物(153mg，由1H NMR得到的纯度为90％，92％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝1.72min，C24H28FN5O3S的计算质量485.6，m/z实测值486.6[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.52(s,1H),7.82-7.81(m,1H),7.42-7.41(m,1H),7.09-7.04(m,1H),7.00-6.97(m,1H),6.92-6.88(m,1H),6.02(d,J＝6.8Hz,1H),4.29-4.17(m,2H),4.12-3.77(m,5H),3.41-3.30(m,2H),3.16-3.00(m,3H),2.92-2.78(m,1H),2.58-2.54(m,3H),2.45-2.42(m,0.5H),1.12(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体I-9-9：(S)-(顺式)-乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-((6-((3-甲基-3-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)羰基)环丁基)磺酰基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(4种立体异构体的混合物)
向(S)-(顺式)-乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-((六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯I-9-8(153mg，90％纯度，0.284mmol)在1,4-二噁烷(5mL)中的溶液中添加2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-(氯磺酰基)-1-甲基环丁烷甲酸酯I-9-7(273mg，90％纯度，0.785mmol)和三乙胺(96mg，0.949mmol)。在室温下搅拌4小时后，将溶液浓缩以给出残余物，将其通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:石油醚＝1:3)纯化以得到呈黄色固体的期望的化合物(138mg，94％纯度，60％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝2.06min，C35H48FN5O7S2Si的计算质量762.0，m/z实测值762.8[M+H]+。
中间体I-9-9A和I-9-9B：
(4aR*,7aS*)-(S)-乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-((6-((3-甲基-3-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)羰基)环丁基)磺酰基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)和(4aS*,7aR*)-(S)-乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-((6-((3-甲基-3-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)羰基)环丁基)磺酰基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
将(S)-(顺式)-乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-((6-((3-甲基-3-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)羰基)环丁基)磺酰基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4-基)甲基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯I-9-9的外消旋混合物(120mg，94％纯度，0.148mmol)通过手性制备型HPLC(柱：Chiralpak IC 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝60:40:0.3，以13mL/min；温度：30℃；波长：214nm)分离以给出呈黄色固体的标题化合物I-9-9A(40mg，98.7％纯度，35％产率，100％立体纯)和I-9-9B(30mg，99.5％纯度，26％产率，99.8％立体纯)。
中间体I-9-9A：LC-MS(ESI)：RT＝2.226min，C35H48FN5O7S2Si的计算质量762.0，m/z实测值762.3[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝60:40:0.2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝9.312min)。
中间体I-9-9B：LC-MS(ESI)：RT＝2.221min，C35H48FN5O7S2Si的计算质量762.0，m/z实测值762.2[M+H]+。手性分析(Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH:DEA＝60:40:0.2，以1mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝12.250min)。
化合物I-9F：(4aS*,7aR*)-(S)-3-((4-((5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)磺酰基)-1-甲基环丁烷甲酸(2种立体异构体的混合物)
在室温下，向(4aS*,7aR*)-(S)-乙基4-(3-氟-2-甲基苯基)-6-((6-((3-甲基-3-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)羰基)环丁基)磺酰基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯I-9-9B(30mg，99.5％纯度，0.039mmol)在二氯甲烷(2mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1mL)。在室温下搅拌过夜后，将混合物浓缩并通过C18柱(乙腈:水(+0.1％碳酸氢铵)＝50％至95％)纯化以给出呈黄色固体的标题化合物(3.5mg，98％纯度，13％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝3.498min，C30H36FN5O7S的计算质量3.746min，m/z实测值662.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.48(s,1H),8.00(d,J＝3.2Hz,1H),7.93(d,J＝3.2Hz,1H),7.18-7.15(m,1H),7.04-7.00(m,2H),5.90(s,0.2H),5.89(s,0.8H),4.15-3.81(m,7H),3.61-3.42(m,4H),3.25-3.22(m,1H),2.89-2.58(m,4H),2.45(s,3H),2.40-2.19(m,3H),1.35(s,0.5H),1.30(s,2H),1.23(s,0.5H),1.06(t,J＝6.8Hz,3H)。
化合物I-10A：3-((4aR*,8aS*)-4-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-6(7H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000631
Figure BDA0003695472250000641
中间体I-10-2：异丁酸叔丁酯
在0℃下，向异丁酰氯I-10-1(70.0g，657mmol)在四氢呋喃(100mL)中的溶液中添加叔丁醇钾(150g，1.34mol)。在室温下搅拌过夜后，在0℃下在氮气气氛下，将混合物用饱和的氯化铵水溶液(120mL)淬灭，并用乙酸乙酯(80mL)萃取两次。将合并的有机层在减压蒸馏下浓缩以得到呈无色油状物的标题化合物(77.0g，由1H NMR得到的纯度为90％，73％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.44-2.37(m,1H),1.42(s,9H),1.10-1.08(m,6H)。
中间体I-10-3：叔丁基2,2-二甲基-3-氧代丙酸酯
在-78℃下在氮气气氛下，向异丁酸叔丁酯I-10-2(95.0g，95％纯度，626mmol)在四氢呋喃(900mL)中的溶液中添加在四氢呋喃中的2M二异丙基氨基锂(376mL，752mmol)。将混合物在-78℃下搅拌0.5小时，然后添加甲酸乙酯(56.0g，756mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将混合物倒入水(1000mL)中并用乙酸乙酯(400mL)萃取两次。将合并的有机相用盐水(200mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液在真空中浓缩以给出呈黄色油状物的期望的化合物(152g，由1H NMR得到的纯度为70％，98％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.63(s,1H),1.46(s,9H),1.30(s,6H)。
中间体I-10-5：(顺式)-苄基3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-((4-硝基苯甲酰基)氧基)哌啶-1-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在0℃下，向(反式)-苄基3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-羟基哌啶-1-甲酸酯I-10-4(15.3g，43.7mmol)、三苯基膦(17.2g，65.6mmol)和4-硝基苯甲酸(11.0g，65.6mmol)在四氢呋喃(300mL)中的溶液中逐滴添加偶氮二甲酸二异丙酯(13.2g，65.6mmol)。在室温下在氮气气氛下搅拌过夜后，将反应混合物倒入水(200mL)中并用乙酸乙酯(150mL)萃取三次。将合并的有机相用盐水(150mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝6:1)纯化以给出呈白色固体的标题化合物(25.0g，粗的)。
LC-MS(ESI)：RT＝1.902min，C25H29N3O8的计算质量499.2，m/z实测值444.1[M-56+H]+。
中间体I-10-6：(顺式)-苄基3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-羟基哌啶-1-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
向(顺式)-苄基3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-((4-硝基苯甲酰基)氧基)哌啶-1-甲酸酯I-10-5(25.0g，粗的，约43.7mmol)在四氢呋喃(250mL)和水(150mL)中的溶液中添加氢氧化锂一水合物(10.5g，250mmol)。在室温下搅拌过夜后，将反应混合物用水(150mL)稀释，在真空中去除四氢呋喃并用乙酸乙酯(150mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(150mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)纯化以给出呈白色固体的标题化合物(15.0g，98％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.35-7.26(m,5H),5.18-5.09(m,2H),4.93(br s,1H),3.98(s,1H),3.80-3.32(m,5H),2.52-2.43(m,1H),1.74-1.65(m,2H),1.44(s,9H)。
中间体I-10-7：(顺式)-苄基3-氨基-4-羟基哌啶-1-甲酸酯盐酸盐(2种立体异构体的混合物)
向(顺式)-苄基3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-羟基哌啶-1-甲酸酯I-10-6(6.80g，19.4mmol)在乙酸乙酯(60mL)中的4M盐酸盐中的溶液在15℃下搅拌1小时。将反应混合物在真空中浓缩以给出呈白色固体的标题化合物(5.50g，99％产率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.19-8.14(m,3H),7.39-7.31(m,5H),5.69(s,1H),5.08(s,2H),4.00(s,1H),3.79(d,J＝10.4Hz,1H),3.54-3.49(m,1H),3.19(s,1H),1.68-1.66(m,2H)。
中间体I-10-8：(顺式)-苄基3-(2-氯乙酰胺基)-4-羟基哌啶-1-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在0℃下，向(顺式)-苄基3-氨基-4-羟基哌啶-1-甲酸酯盐酸盐I-10-7(5.50g，19.2mmol)、三乙胺(4.86g，48.1mmol)在四氢呋喃(70mL)中的溶液中逐滴添加2-氯乙酰氯(2.40g，21.1mmol)。在0℃下搅拌1小时后，将反应混合物用乙酸乙酯(100mL)稀释，用盐水(100mL)洗涤两次。将分离的有机层经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)纯化以给出呈白色固体的标题化合物(4.60g，73％产率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.98(d,J＝10.4Hz,1H),7.40-7.34(m,5H),5.15(d,J＝5.2Hz,1H),5.10(s,2H),4.14(s,2H),3.86-3.54(m,4H),3.40-3.35(m,1H),1.70-1.63(m,2H)。
中间体I-10-9：(顺式)-苄基3-氧代六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-6(7H)-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在0℃下在氮气气氛下，向(顺式)-苄基3-(2-氯乙酰胺基)-4-羟基哌啶-1-甲酸酯I-10-8(4.10g，12.5mmol)在四氢呋喃(2000mL)中的溶液中添加在矿物油中的60％wt.氢化钠(5.00g，125mmol)。在室温下搅拌2小时后，将反应混合物倒入水(500mL)中并用乙酸乙酯(500mL)萃取两次。将合并的有机相用盐水(200mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过C18柱(乙腈:水＝30％至95％)纯化以给出呈白色固体的标题化合物(1.74g，43％产率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.16(s,1H),7.40-7.31(m,5H),5.08(s,2H),4.10-3.98(m,3H),3.92-3.91(m,1H),3.82-3.78(m,1H),3.26-3.24(m,1H),3.93-3.88(m,2H),1.79-1.74(m,2H)。
中间体I-10-10：(顺式)-苄基4-苄基-3-氧代六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-6(7H)-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在0℃下在氮气气氛下，向(顺式)-苄基3-氧代六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-6(7H)-甲酸酯I-10-9(1.64g，5.66mmol)在四氢呋喃(20mL)中的溶液中添加在矿物油中的60％wt.氢化钠(450mg，11.4mmol)。然后添加苄基溴(1.27g，7.40mmol)。在室温下搅拌过夜后，将反应混合物倒入水(100mL)中并用乙酸乙酯(100mL)萃取两次。将合并的有机相用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)纯化以给出呈白色固体的标题化合物(1.47g，68％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝1.722min，C22H24N2O4的计算质量380.2，m/z实测值381.2[M+H]+。
中间体I-10-11：(顺式)-4-苄基六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(2种立体异构体的混合物)
在室温下，向(顺式)-苄基4-苄基-3-氧代六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-6(7H)-甲酸酯I-10-10(1.50g，3.95mmol)在四氢呋喃(20mL)中的溶液中添加10％wt.活性炭载钯(1.00g)。在室温下在氢气气氛气囊下搅拌过夜后，将反应混合物过滤并浓缩以得到呈浅黄色油状物的标题化合物(1.0g，由1H NMR得到的纯度为90％，93％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36-7.25(m,5H),4.94-4.90(m,1H),4.26-4.17(m,3H),3.95(d,J＝1.6Hz,1H),3.47-3.42(m,1H),3.21-3.16(m,1H),3.11-3.07(m,1H),2.67-2.61(m,2H),1.76-1.67(m,2H),1.06(t,J＝6.8Hz,1H)。
中间体I-10-12：(顺式)-叔丁基4-苄基-3-氧代六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-6(7H)-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
向(顺式)-4-苄基六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮I-10-11(550mg，90％纯度，2.01mmol)在乙腈(10mL)中的溶液中添加三乙胺(800mg，7.91mmol)、二碳酸二叔丁酯(1.32g，6.05mmol)和4-二甲基氨基吡啶(50mg，0.410mmol)。在35℃下搅拌过夜后，将混合物在减压下浓缩以给出残余物，将其通过C18柱(乙腈:水＝05％至95％)纯化以给出呈黄色油状物的标题化合物(700mg，由1H NMR得到的纯度为90％，90％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36-7.28(m,5H),5.34-5.24(m,1H),4.41-3.88(m,6H),3.14-2.93(m,3H),1.87-1.83(m,1H),1.73-1.67(m,1H),1.45(s,9H)。
中间体I-10-13：(顺式)-叔丁基4-苄基六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-6(7H)-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在0℃下，向(顺式)-叔丁基4-苄基-3-氧代六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-6(7H)-甲酸酯I-10-12(700mg，90％纯度，1.82mmol)在四氢呋喃(10mL)中的溶液中缓慢添加在四氢呋喃中的1M硼烷-四氢呋喃络合物(4.6mL，4.6mmol)。在35℃下搅拌过夜后，将混合物用1M盐酸盐水溶液淬灭，用水(20mL)稀释并用乙酸乙酯(20mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并在减压下浓缩以给出呈黄色油状物的期望的产物(720mg，78％纯度，93％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝1.904min，C19H28N2O3的计算质量332.2，m/z实测值333.2[M+H]+。
中间体I-10-14：(顺式)-4-苄基八氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪(2种立体异构体的混合物)
向(顺式)-叔丁基4-苄基六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-6(7H)-甲酸酯I-10-13(720mg，78％纯度，1.69mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(5mL)。在室温下搅拌1小时后，将混合物在减压下浓缩以给出残余物，将其通过C18柱(乙腈:水(+0.02％碳酸氢铵)＝05％至95％)纯化以给出呈黄色油状物的标题化合物(256mg，由1H NMR得到的纯度为90％，59％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.35-7.29(m,4H),7.26-7.22(m,1H),3.90-3.83(m,2H),3.75-3.62(m,3H),3.24-3.18(m,1H),2.94-2.67(m,5H),2.36-2.32(m,1H),1.89-1.86(m,1H),1.70-1.67(m,1H)。
中间体I-10-15：(顺式)-叔丁基3-(4-苄基六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-6(7H)-基)-2,2-二甲基丙酸酯(2种立体异构体的混合物)
在室温下在氮气气氛下，向(顺式)-4-苄基八氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪I-10-14(150mg，90％纯度，0.581mmol)和叔丁基2,2-二甲基-3-氧代丙酸酯I-10-3(570mg，70％纯度，2.32mmol)在无水二氯甲烷(5mL)中的混合物中添加在二氯甲烷中的1M三异丙氧基氯化钛(IV)(1.2mL，1.2mmol)。添加后，将混合物在室温下搅拌0.5小时。添加三乙酰氧基硼氢化钠(600mg，2.83mmol)，然后添加乙酸(0.2mL)。在室温下搅拌过夜后，将反应混合物用饱和的碳酸氢钠水溶液(20mL)淬灭并用二氯甲烷(20mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩以给出残余物，将其通过C18柱(乙腈:水＝05％至95％)纯化以给出呈黄色油状物的标题化合物(115mg，95％纯度，48％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝2.14min，C23H36N2O3的计算质量388.3，m/z实测值389.5[M+H]+。
中间体I-10-16：(顺式)-叔丁基3-(六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-6(7H)-基)-2,2-二甲基丙酸酯(2种立体异构体的混合物)
向(顺式)-叔丁基3-(4-苄基六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-6(7H)-基)-2,2-二甲基丙酸酯I-10-15(115mg，95％纯度，0.281mmol)在甲醇(5mL)中的溶液中添加20％wt.氢氧化钯(10mg)。在40℃下在氢气气氛气囊下搅拌2小时后，将混合物过滤并将滤液在减压下浓缩以给出呈无色油状物的标题产物(84mg，由1H NMR得到的纯度为90％，90％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.87-3.79(m,1H),3.65-3.49(m,2H),3.11-3.03(m,1H),2.90-2.83(m,2H),2.70-2.60(m,1H),2.53-2.36(m,5H),1.93-1.85(m,0.6H),1.75-1.65(m,1.4H),1.44(s,9H),1.10(s,3H),1.09(s,3H)。
中间体I-10-17：(顺式)-(S)-乙基6-((6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-4(3H)-基)甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
向(顺式)-叔丁基3-(六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-6(7H)-基)-2,2-二甲基丙酸酯I-10-16(80mg，90％纯度，0.242mmol)和(S)-乙基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯VIa-2(166mg，95％纯度，0.360mmol)在二氯甲烷(4mL)中的溶液中添加三乙胺(74mg，0.733mmol)。在25℃下搅拌过夜后，将混合物浓缩以给出残余物，将其通过C18柱(乙腈:水＝05％至95％)纯化以给出呈黄色固体的标题化合物(91mg，97％纯度，56％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝2.34min，C34H46FN5O5S的计算质量655.3，m/z实测值656.8[M+H]+。
中间体I-10-17A(单一立体异构体)和I-10-17B(单一立体异构体)：
(S)-乙基6-(((4aR*,8aS*)-6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-4(3H)-基)甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)和(S)-乙基6-(((4aS*,8aR*)-6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-4(3H)-基)甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
将(顺式)-(S)-乙基6-((6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-4(3H)-基)甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯I-10-17的外消旋混合物(135mg，92％纯度，0.189mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak IB 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH＝95:5，以18mL/min；温度：30℃；波长：214nm)分离以得到呈黄色固体的标题化合物I-10-17A(68mg，由1H NMR得到的纯度为90％，49％产率，99.9％立体纯)和I-10-17B(64mg，由1H NMR得到的纯度为90％，46％产率，99.2％立体纯)。
中间体I-10-17A：手性分析(柱：Chiralpak IB 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝95:5，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝4.818min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.71(s,1H),7.81(d,J＝3.2Hz,1H),7.40(d,J＝2.8Hz,1H),7.08-7.02(m,1H),6.98-6.96(m,1H),6.91-6.87(m,1H),6.00(s,1H),4.10-3.95(m,5H),3.87-3.80(m,2H),2.98-2.96(m,1H),2.85-2.63(m,3H),2.59-2.52(m,5H),2.42-2.40(m,3H),1.78-1.74(m,2H),1.42(s,9H),1.14-1.08(m,9H)。
中间体I-10-17B：手性分析(柱：Chiralpak IB 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝95:5，以1.0mL/min；温度：30℃；波长：254nm，RT＝6.445min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.74(s,1H),7.81(d,J＝2.8Hz,1H),7.40(d,J＝3.2Hz,1H),7.11-7.06(m,1H),7.01-6.99(m,1H),6.92-6.88(m,1H),6.02(s,1H),4.31(d,J＝17.2Hz,1H),4.10-4.01(m,2H),3.92-3.80(m,4H),2.89-2.85(m,3H),2.73-2.71(m,1H),2.65-2.54(m,5H),2.41-2.38(m,2H),2.26-2.23(m,1H),1.80(br s,2H),1.45(s,9H),1.14-1.09(m,9H)。
化合物I-10A：3-((4aR*,8aS*)-4-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-6(7H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
向(S)-乙基6-(((4aR*,8aS*)-6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢-2H-吡啶并[4,3-b][1,4]噁嗪-4(3H)-基)甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯I-10-17A(68mg，90％纯度，0.093mmol)在二氯甲烷(2mL)中的溶液中添加三氟乙酸(2mL)。在室温下搅拌3小时后，将混合物在减压下浓缩以给出残余物，将其通过C18柱(乙腈:水(+0.02％碳酸氢铵)＝20％至70％)纯化以给出呈黄色固体的标题化合物(45mg，99.6％纯度，80％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝3.839min，C30H38FN5O5S的计算质量599.3，m/z实测值600.3[M+H]+。1HNMR(400MHz,CD3OD)δ7.94(d,J＝3.2Hz,1H),7.74(d,J＝3.2Hz,1H),7.17-7.08(m,2H),6.96-6.92(m,1H),5.98(s,1H),4.37(d,J＝16.8Hz,1H),4.13-3.86(m,6H),3.56-3.50(m,1H),3.32-3.25(m,1H),3.18-3.00(m,6H),2.60-2.57(m,1H),2.53(d,J＝2.0Hz,3H),2.04-2.02(m,2H),1.26(s,3H),1.24(s,3H),1.14(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物I-11A：(S)-3-((4aR*,8aS*)-1-((5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(7H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000701
Figure BDA0003695472250000711
中间体I-11-2：苄基7-氧杂-3-氮杂双环[4.1.0]庚烷-3-甲酸酯
将苄基5,6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸酯(25.0g，115mmol)在二氯甲烷(400mL)中的溶液冷却至0℃。逐滴添加间氯过氧苯甲酸(27.8g，160mmol)在二氯甲烷(100mL)中的溶液，并将所得无色反应混合物升温至室温。在室温下搅拌过夜后，将反应混合物用5％亚硫酸钠水溶液(300mL)洗涤三次并用盐水(500mL)洗涤。将有机层经Na2SO4(固体)干燥，过滤并在真空中浓缩以给出呈黄色油状物的标题化合物(26.7g，84％纯度，84％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝1.26min，C13H15NO3的计算质量233.1，m/z实测值251.2[M+18]+。
中间体I-11-3和I-10-4：
(反式)-苄基4-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-羟基哌啶-1-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)和(反式)-苄基3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-羟基哌啶-1-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
将苄基7-氧杂-3-氮杂双环[4.1.0]庚烷-3-甲酸酯I-11-2(26.7g，84％纯度，96.3mmol)在25％-30％氢氧化铵水溶液(300mL)和乙醇(250mL)中的溶液在70℃下搅拌5小时。将反应混合物在真空中浓缩去一半。将所得溶液用四氢呋喃(300mL)稀释，然后逐滴添加碳酸氢钠(24.0g，287mmol)和二碳酸二叔丁酯(34.0g，150mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。然后将其用饱和的氯化铵水溶液(200mL)淬灭并分离各层。将水相进一步用乙酸乙酯(150mL)萃取两次。将合并的有机层在减压下浓缩以给出残余物，将其通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝10:1至4:1)纯化以给出呈白色固体的标题化合物I-11-3(17.0g，由1HNMR得到的纯度为90％，42％产率)和I-10-4(9.0g，由1H NMR得到的纯度为90％，23％产率)。
中间体I-11-3：LC-MS(ESI)：RT＝1.54min，C18H26N2O5的计算质量350.2，m/z实测值351.5[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38-7.33(m,5H),5.16(s,2H),4.76-4.75(m,1H),4.38-4.08(m,2H),3.49-3.42(m,2H),2.86-2.68(m,2H),2.01-1.97(m,1H),1.86(s,1H),1.49(s,9H)。
中间体I-10-4：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.35(m,5H),5.23-5.14(m,2H),4.88-4.71(m,1H),4.13-3.92(m,2H),3.69-3.46(m,3H),3.27-3.00(m,2H),2.03-1.75(m,2H),1.49(s,9H)。
中间体I-11-4：(顺式)-苄基4-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-((4-硝基苯甲酰基)氧基)哌啶-1-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在0℃下，向(反式)-苄基4-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-羟基哌啶-1-甲酸酯I-11-3(37.0g，95％纯度，101mmol)、三苯基膦(39.4g，150mmol)和4-硝基苯甲酸(25.0g，150mmol)在四氢呋喃(500mL)中的溶液中逐滴添加偶氮二甲酸二异丙酯(30.4g，150mmol)。在室温下在氮气气氛下搅拌过夜后，将反应混合物倒入水(200mL)中并用乙酸乙酯(150mL)萃取三次。将合并的有机相用盐水(150mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝6:1)纯化以给出呈白色固体的标题化合物(23.0g，85％纯度，39％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝1.75min，C25H29N3O8的计算质量499.2，m/z实测值444.1[M-56+H]+。
中间体I-11-5：(顺式)-苄基4-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-羟基哌啶-1-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
向(顺式)-苄基4-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-((4-硝基苯甲酰基)氧基)哌啶-1-甲酸酯I-11-4(23.0g，85％纯度，39.0mmol)在四氢呋喃(150mL)和水(150mL)中的溶液中添加氢氧化锂一水合物(6.60g，157mmol)。在室温下搅拌过夜后，将反应混合物用水(150mL)稀释，在真空中去除四氢呋喃并用乙酸乙酯(150mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(150mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)纯化以给出呈白色固体的标题化合物(15.0g，由1H NMR得到的纯度为90％，98％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39-7.31(m,5H),5.17(s,2H),5.03-5.02(m,1H),4.35-4.11(m,2H),3.94(s,1H),3.79-3.66(m,1H),3.14-2.89(m,2H),2.18-1.93(m,1H),1.83-1.69(m,2H),1.48(s,9H)。
中间体I-11-6：(顺式)-苄基4-氨基-3-羟基哌啶-1-甲酸酯盐酸盐(2种立体异构体的混合物)
向(顺式)-苄基4-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-羟基哌啶-1-甲酸酯I-11-5(15.0g，90％纯度，38.5mmol)在乙酸乙酯(50mL)中的4M盐酸盐中的溶液在15℃下搅拌1小时。将反应混合物在真空中浓缩以给出呈白色固体的标题化合物(12.0g，由1H NMR得到的纯度为90％，98％产率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.13(s,3H),7.37-7.31(m,5H),5.62(s,1H),5.07(s,2H),3.97(d,J＝12.0Hz,2H),3.88(s,1H),3.25(d,J＝8.0Hz,1H),3.14-2.82(m,2H),1.81-1.69(m,2H)。
中间体I-11-7：(顺式)-苄基4-(2-氯乙酰胺基)-3-羟基哌啶-1-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在0℃下，向苄基4-氨基-3-羟基哌啶-1-甲酸酯盐酸盐I-11-6(11.0g，90％纯度，34.5mmol)、三乙胺(8.73g，86.3mmol)在四氢呋喃(300mL)中的溶液中逐滴添加2-氯乙酰氯(4.29g，38.0mmol)。在0℃下搅拌1小时后，将反应混合物用乙酸乙酯(200mL)稀释，用盐水(200mL)洗涤两次。将分离的有机层经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)纯化以给出呈白色固体的标题化合物(11.0g，由1H NMR得到的纯度为90％，88％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.48-7.34(m,5H),7.06(s,1H),5.19(s,1H),4.42-4.23(m,2H),4.09-3.96(m,4H),3.14-2.89(m,2H),1.92-1.80(m,2H)
中间体I-11-8：(顺式)-苄基2-氧代六氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(7H)-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在0℃下在氮气气氛下，向(顺式)-苄基4-(2-氯乙酰胺基)-3-羟基哌啶-1-甲酸酯I-11-7(4.00g，90％纯度，11.0mmol)在四氢呋喃(1300mL)中的溶液中添加在矿物油中的60％wt.氢化钠(1.10g，27.5mmol)。在室温下搅拌2小时后，将反应混合物倒入水(200mL)中并用乙酸乙酯(200mL)萃取两次。将合并的有机相用盐水(200mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过C18柱(乙腈:水＝30％至95％)纯化以给出呈白色固体的标题化合物(1.50g，由
1H NMR得到的纯度为98％，46％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36-7.31(m,5H),7.00(s,1H),5.15(s,2H),4.58-4.37(m,1H),4.31-4.18(m,3H),3.83-3.80(m,1H),3.42-3.38(m,1H),3.15-3.00(m,1H),2.88-2.68(m,1H),2.02-1.92(m,1H),1.83-1.80(m,1H)。
中间体I-11-9：(顺式)-苄基1-苄基-2-氧代六氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(7H)-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在0℃下在氮气气氛下，向(顺式)-苄基2-氧代六氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(7H)-甲酸酯I-11-8(1.60g，98％纯度，5.40mmol)在四氢呋喃(60mL)中的溶液中添加在矿物油中的60％wt.氢化钠(431mg，10.7mmol)。然后添加苄基溴(1.85g，10.8mmol)。在室温下搅拌过夜后，将反应混合物倒入水(100mL)中并用乙酸乙酯(100mL)萃取两次。将合并的有机相用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)纯化以给出呈白色固体的标题化合物(2.00g，由1H NMR得到的纯度为90％，87％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.34-7.24(m,10H),5.32-5.28(m,1H),5.14-5.13(m,2H),4.56-4.17(m,4H),3.99(d,J＝15.2Hz,1H),3.77-3.71(m,1H),3.17-3.13(m,1H),2.97-2.88(m,1H),2.74-2.59(m,1H),1.97-1.83(m,2H)。
中间体I-11-10：(顺式)-叔丁基1-苄基-2-氧代六氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(7H)-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在室温下，向(顺式)-苄基1-苄基-2-氧代六氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(7H)-甲酸酯I-11-9(2.00g，90％纯度，4.73mmol)在四氢呋喃(20mL)中的溶液中添加二碳酸二叔丁酯(1.20g，5.50mmol)和10％wt.活性炭载钯(1.00g)。在室温下在氢气气氛气囊下搅拌过夜后，将反应混合物过滤并浓缩以得到呈浅黄色油状物的标题化合物(1.65g，由1HNMR得到的纯度为90％，91％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝1.58min，C19H26N2O4的计算质量346.2，m/z实测值291.2[M+H-56]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.42-7.29(m,5H),5.30(d,J＝20.0Hz,1H),4.67-4.11(m,4H),4.03(d,J＝20.0Hz,1H),3.80-3.67(m,1H),3.18-3.12(m,1H),2.96-2.80(m,1H),2.68-2.51(m,1H),1.96-1.83(m,2H),1.47(s,9H)。
中间体I-11-11：(顺式)-叔丁基1-苄基六氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(7H)-甲酸酯(2种立体异构体的混合物)
在0℃下，向(顺式)-叔丁基1-苄基-2-氧代六氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(7H)-甲酸酯I-11-10(1.30g，90％纯度，3.38mmol)在四氢呋喃(10mL)中的溶液中逐滴添加在四氢呋喃中的1M硼烷-四氢呋喃络合物(9mL，9mmol)。在室温下在氮气气氛下搅拌过夜后，将反应混合物用1M盐酸盐水溶液酸化至pH5并用二氯甲烷(20mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩以给出残余物，将其通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝10:1至2:1)纯化以得到呈白色固体的标题化合物(950mg，由1H NMR得到的纯度为90％，76％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.42-7.29(m,5H),4.26-4.08(m,3H),3.93-3.83(m,1H),3.70-3.51(m,4H),2.91-2.80(m,1H),2.78-2.64(m,2H),2.61-2.49(m,1H),2.34-2.31(m,1H),2.13-2.06(m,1H),1.45(s,9H)。
中间体I-11-12：(顺式)-1-苄基八氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪盐酸盐(2种立体异构体的混合物)
在氮气气氛下，向(顺式)-叔丁基1-苄基六氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(7H)-甲酸酯I-11-11(950mg，90％纯度，2.57mmol)在二氯甲烷(8mL)中的溶液中添加在乙酸乙酯中的4M盐酸盐(6mL，24mmol)。在室温下在氮气气氛下搅拌1小时后，将反应混合物浓缩以得到呈白色固体的标题化合物(760mg，由1H NMR得到的纯度为90％，99％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝1.28min，C14H21ClN2O的计算质量286.1，m/z实测值233.3[M+H-HCl]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.70(s,2H),7.50(s,3H),4.51-4.38(m,3H),4.21-4.18(m,1H),4.10-4.00(m,1H),3.92-3.89(m,1H),3.63-3.48(m,3H),3.38-3.34(m,1H),3.21-3.11(m,2H),2.66-2.53(m,1H),2.39-2.27(m,1H)。
中间体I-11-13：(顺式)-叔丁基3-(1-苄基六氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(7H)-基)-2,2-二甲基丙酸酯(2种立体异构体的混合物)
向(顺式)-1-苄基八氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪盐酸盐I-11-12(600mg，90％纯度，2.01mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三乙胺(200mg，1.98mmol)。在20℃下搅拌20分钟后，添加乙酸(1.5mL)、叔丁基2,2-二甲基-3-氧代丙酸酯(495mg，70％纯度，2.01mmol)和在己烷中的1M三异丙氧基氯化钛(IV)(4mL，4mmol)。将混合物在20℃下搅拌40分钟，然后添加三乙酰氧基硼氢化钠(1.30g，6.13mmol)。在20℃下搅拌16小时后，将反应混合物用饱和的碳酸氢钠水溶液(30mL)淬灭。将混合物用二氯甲烷(20mL)萃取三次。将合并的有机相用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩以给出残余物，将其通过C18柱(乙腈:水＝40％至70％)纯化以给出呈浅黄色油状物的标题化合物(800mg，由1HNMR得到的纯度为90％，92％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝2.09min，C23H36N2O3的计算质量388.3，m/z实测值389.4[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.34-7.22(m,5H),3.89-3.85(m,1H),3.67-3.52(m,4H),2.98(d,J＝12.4Hz,1H),2.88-2.79(m,1H),2.70-2.63(m,1H),2.58-2.56(m,1H),2.50(d,J＝13.6Hz,1H),2.42(d,J＝13.6Hz,1H),2.30(t,J＝12.4Hz,2H),2.16-2.04(m,2H),1.48-1.36(m,1H),1.44(s,9H),1.12(s,6H)。
中间体I-11-13A(单一立体异构体)和I-11-13B(单一立体异构体)：
叔丁基3-((4aR*,8aS*)-1-苄基六氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(7H)-基)-2,2-二甲基丙酸酯(单一立体异构体)和叔丁基3-((4aS*,8aR*)-1-苄基六氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(7H)-基)-2,2-二甲基丙酸酯(单一立体异构体)
将(顺式)-叔丁基3-(1-苄基六氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(7H)-基)-2,2-二甲基丙酸酯I-11-13的外消旋混合物(800mg，90％纯度，1.85mmol)通过手性制备型HPLC(分离条件：柱：Chiralpak IC 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH＝98:2，以25mL/min；温度：30℃；波长：230nm)分离以给出呈黄色固体的标题化合物I-11-13A(320mg，由1H NMR得到的纯度为90％，40％产率，100％立体纯)和I-11-13B(330mg，由1H NMR得到的纯度为90％，41％产率，99.6％立体纯)。
中间体I-11-13A：LC-MS(ESI)：RT＝2.09min，C23H36N2O3的计算质量388.3，m/z实测值389.5[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝98:2，以1mL/min；温度：30℃；波长：214nm，RT＝4.843min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.35-7.22(m,5H),3.90-3.86(m,1H),3.69-3.51(m,4H),2.98(d,J＝12.4Hz,1H),2.86-2.80(m,1H),2.70-2.63(m,1H),2.61-2.55(m,1H),2.50(d,J＝13.6Hz,1H),2.42(d,J＝13.6Hz,1H),2.33-2.27(m,2H),2.17-2.08(m,2H),1.49-1.36(m,1H),1.44(s,9H),1.12(s,6H)。
中间体I-11-13B：LC-MS(ESI)：RT＝2.09min，C23H36N2O3的计算质量388.3，m/z实测值389.5[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IC 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝98:2，以1mL/min；温度：30℃；波长：214nm，RT＝6.048min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.34-7.22(m,5H),3.91-3.86(m,1H),3.67-3.53(m,4H),2.98(d,J＝12Hz,1H),2.90-2.79(m,1H),2.70-2.64(m,1H),2.60-2.55(m,1H),2.49(d,J＝13.2Hz,1H),2.42(d,J＝13.2Hz,1H),2.33-2.26(m,2H),2.17-2.05(m,2H),1.50-1.38(m,1H),1.44(s,9H),1.12(s,6H)。
中间体I-11-14A：叔丁基3-((4aR*,8aS*)-六氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(7H)-基)-2,2-二甲基丙酸酯(单一立体异构体)
在室温下，向叔丁基3-((4aR*,8aS*)-1-苄基六氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(7H)-基)-2,2-二甲基丙酸酯I-11-13A(150mg，90％纯度，0.347mmol)在甲醇(4mL)中的溶液中添加10％wt.活性炭载钯(60mg)。在室温下在氢气气氛气囊下搅拌过夜后，将反应混合物过滤并浓缩以得到呈浅黄色油状物的标题化合物(111mg，由1H NMR得到的纯度为90％，96％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.91-3.82(m,1H),3.67-3.62(m,1H),3.56-3.49(m,1H),3.12-3.04(m,1H),3.00-2.96(m,1H),2.87-2.80(m,1H),2.71-2.68(m,2H),2.51-2.46(m,2H),2.44-2.40(m,1H),2.34-2.23(m,1H),2.15-2.01(m,1H),1.52-1.38(m,1H),1.44(s,9H),1.11(s,6H)。
中间体I-11-15A：(S)-乙基6-(((4aR*,8aS*)-6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)八氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-1-基)甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
在室温下，向(S)-乙基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯VIa-2(170mg，95％纯度，0.368mmol)在二氯甲烷(6mL)中的溶液中添加叔丁基3-((4aR*,8aS*)-六氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(7H)-基)-2,2-二甲基丙酸酯I-11-14A(111mg，90％纯度，0.335mmol)和三乙胺(110mg，1.09mmol)。在室温下搅拌过夜后，将反应混合物冷却至室温，用水(10mL)稀释并用乙酸乙酯(10mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩。将残余物通过C18柱(乙腈:水＝50％至80％)纯化以给出呈黄色固体的标题化合物(180mg，由1H NMR得到的纯度为90％，67％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝2.32min，C34H46FN5O5S的计算质量655.3，m/z实测值656.5[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.77(s,1H),7.81(d,J＝3.2Hz,1H),7.41(d,J＝3.2Hz,1H),7.08-7.03(m,1H),6.97-6.95(m,1H),6.92-6.87(m,1H),6.00(s,1H),4.10-3.98(m,5H),3.79-3.72(m,2H),3.06-3.02(m,1H),2.98-2.84(m,2H),2.61-2.58(m,1H),2.55(s,3H),2.51-2.43(m,4H),2.33-2.10(m,2H),1.52-1.47(m,1H),1.44(s,9H),1.14-1.10(m,9H)。
化合物I-11A：(S)-3-((4aR*,8aS*)-1-((5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(7H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
在室温下，向(S)-乙基6-(((4aR*,8aS*)-6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)八氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-1-基)甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯I-11-15A(180mg，90％纯度，0.247mmol)在二氯甲烷(8mL)中的溶液中添加三氟乙酸(4mL)。在室温下在氮气气氛下搅拌2小时后，将反应混合物用水(20mL)稀释并用乙酸乙酯(20mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥，过滤并浓缩。将残余物通过C18柱(乙腈:水＝60％至80％)纯化以给出呈黄色固体的期望的化合物(90mg，97.9％纯度，59％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝3.835min，C30H38FN5O5S的计算质量599.3，m/z实测值600.3。1HNMR(400MHz,CD3OD)δ7.93(d,J＝3.2Hz,1H),7.75(d,J＝3.2Hz,1H),7.17-7.08(m,2H),6.97-6.92(m,1H),5.97(s,1H),4.30(d,J＝16.8Hz,1H),4.11-4.03(m,5H),3.93-3.87(m,1H),3.61-3.51(m,2H),3.22(d,J＝14.8Hz,1H),3.11-2.96(m,5H),2.61-2.58(m,1.7H),2.53(s,3H),2.52-2.49(s,0.3H),1.92-1.85(m,1H),1.28(s,3H),1.23(s,3H),1.15(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物I-12A：
3-((4aR*,7aS*)-4-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基-3-氧代丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000781
中间体I-12-1A：(4aR*,7aS*)-苄基6-(3-(苄基氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙酰基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯(单一立体异构体)
在室温下在氮气气氛下，向3-(苄基氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙酸(112mg，90％纯度，0.454mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液中添加2-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(V)(172mg，0.452mmol)和三乙胺(107mg，1.06mmol)。在室温下搅拌15分钟后，添加(4aR*,7aS*)-苄基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯盐酸盐I-1-7A(100mg，90％纯度，0.301mmol)。在室温下搅拌过夜后，将混合物用水(5mL)稀释并用乙酸乙酯(5mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝20:1至3:1)纯化以给出呈黄色油状物的标题化合物(110mg，由1H NMR得到的纯度为90％，70％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37-7.30(m,10H),5.30-5.24(m,2H),5.17-5.10(m,2H),4.40(s,0.5H),4.22(s,0.5H),3.89-3.43(m,7H),3.11-2.86(m,2H),1.45-1.35(m,6H)。
中间体I-12-2A：3-((4aR*,7aS*)-六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基-3-氧代丙酸(单一立体异构体)
在室温下，向(4aR*,7aS*)-苄基6-(3-(苄基氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙酰基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯I-12-1A(100mg，90％纯度，0.179mmol)在甲醇(20mL)中的溶液中添加10％wt.钯炭(200mg，0.188mmol)。在25℃下在氢气气氛(气囊)下搅拌过夜后，将混合物过滤并将滤液浓缩以给出呈黄色油状物的标题化合物(48mg，由1H NMR得到的纯度为90％，99％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.01(s,1H),3.87-3.76(m,1H),3.67-3.43(m,6H),3.12-2.99(m,1H),2.70-2.63(m,1H),1.38(s,3H),1.35(s,3H)。
化合物I-12A：3-((4aR*,7aS*)-4-(((S)-5-(乙氧基羰基)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基-3-氧代丙酸(单一立体异构体)
在室温下在氮气气氛下，向3-((4aR*,7aS*)-六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基-3-氧代丙酸I-12-2A(48mg，90％纯度，0.178mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加三乙醇胺(133mg，0.891mmol)和(S)-乙基6-(溴甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯VIa-2(80mg，98％纯度，0.179mmol)。在35℃下搅拌过夜后，将混合物用水(20mL)稀释并用乙酸乙酯(20mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过C18柱(乙腈:水(+0.1％碳酸氢铵)＝30％至95％)纯化以给出呈黄色固体的标题化合物(50mg，99.5％纯度，46％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝3.408min，C29H34FN5O6S的计算质量649.3，m/z实测值600.2[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.49(br s,1H),8.00(d,J＝3.2Hz,1H),7.92(d,J＝3.2Hz,1H),7.20-7.15(m,1H),7.04-7.00(m,2H),5.88(s,0.96H),5.76(s,0.04H),4.14-3.97(m,5H),3.88-3.85(m,1H),3.58-3.54(m,2H),3.47-3.35(m,4H),2.84-2.78(m,1H),2.59-2.54(m,1H),2.44(s,3H),1.26-1.19(m,6H),1.07(t,J＝7.8Hz,3H)。
化合物I-13A：3-((4aR*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-3-氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000791
通过利用方法C的类似程序，从I-1-10A和VIa-3合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝3.575min，C28H33ClFN5O5S的计算质量605.2，m/z实测值606.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.06(s,1H),9.65(s,1H),8.02(d,J＝3.2Hz,1H),7.95(d,J＝3.2Hz,1H),7.38-7.28(m,2H),7.24-7.22(m,1H),6.01(s,1H),4.07-3.92(m,4H),3.86-3.83(m,1H),3.59-3.54(m,1H),3.29-3.26(m,1H),3.15-3.06(m,2H),2.81-2.67(m,5H),2.57-2.54(m,1H),1.05-1.02(m,9H)。
化合物I-14A：3-((4aR*,7aS*)-4-(((S*)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000801
通过利用方法C的类似程序，从I-1-10A和VIa-4合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝3.449min，C28H34FN5O5S的计算质量571.3，实测值572.3[M+H]+。1HNMR(400MHz,CD3OD)δ7.94(d,J＝2.8Hz,1H),7.75(d,J＝3.2Hz,1H),7.17-7.08(m,2H),6.95(t,J＝9.6Hz,1H),5.98(s,1H),4.35-4.26(m,2H),4.06-4.00(m,2H),3.91-3.76(m,3H),3.62(s,3H),3.46(br s,2H),3.40-3.38(m,1H),3.26(d,J＝12.8Hz,1H),3.16(d,J＝12.8Hz,1H),3.05(td,J＝12.4,2.8Hz,1H),2.69(d,J＝12.0Hz,1H),2.53(s,3H),1.30(s,3H),1.22(s,3H)。
化合物I-15A：3-((4aR*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-4-氟苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000802
通过利用方法C的类似程序，从I-1-10A和VIa-5合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝3.656min，C27H31ClFN5O5S的计算质量591.2，m/z实测值592.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.07(s,1H),9.69(s,1H),8.02(d,J＝2.8Hz,1H),7.94(d,J＝3.2Hz,1H),7.43-7.36(m,2H),7.19-7.14(m,1H),6.04(s,1H),4.07-3.93(m,3H),3.86-3.83(m,1H),3.60-3.54(m,1H),3.52(s,3H),3.26-3.22(m,1H),3.14-3.05(m,2H),2.81-2.67(m,5H),2.58-2.53(m,1H),1.05(s,3H),1.02(s,3H)。
化合物I-16A：3-((4aR*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-3-氟苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000811
通过利用方法C的类似程序，从I-1-10A和VIa-6合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝3.284min，C27H31ClFN5O5S的计算质量591.2，m/z实测值592.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.14(br s,1H),9.72(s,1H),8.02(d,J＝3.2Hz,1H),7.95(d,J＝2.8Hz,1H),7.38-7.29(m,2H),7.22-7.20(m,1H),6.09(s,1H),4.06(d,J＝17.2Hz,1H),3.98-3.94(m,2H),3.86-3.83(m,1H),3.59-3.54(m,1H),3.51(s,3H),3.27-3.22(m,1H),3.17-3.06(m,2H),2.81-2.67(m,5H),2.56-2.51(m,1H),1.05(s,3H),1.02(s,3H)。
化合物I-17B：3-((4aS*,7aS*)-4-(((S*)-6-(3,4-二氟-2-甲基苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000821
中间体I-17B-1：(4R*,7S*)-苄基6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯(单一立体异构体)
向(4R*,7S*)-苄基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯盐酸盐I-1-7A(20.3g，90％纯度，61.2mmol)在二氯甲烷(200mL)中的悬浮液中添加三乙胺(6.19g，61.2mmol)。搅拌10分钟后，在室温下添加叔丁基2,2-二甲基-3-氧代丙酸酯(30.1g，70％纯度，122mmol)和1M三异丙氧基氯化钛(IV)的二氯甲烷溶液(122mL，122mmol)。在室温下搅拌30分钟后，将三乙酰氧基硼氢化钠(38.9g，184mmol)和乙酸(11.0g，183mmol)添加至混合物中。在25℃下在氮气气氛下搅拌过夜后，在0℃下将混合物用饱和的碳酸氢钠的水溶液(100mL)淬灭。将混合物通过硅藻土垫过滤，用乙酸乙酯(100mL)洗涤两次。将滤液在减压下浓缩以给出残余物，将其通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝10:1至5:1)纯化以给出呈黄色油状物的标题化合物(28.0g，由1H NMR得到的纯度为80％，88％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38-7.30(m,5H),5.15(s,2H),4.36-4.29(m,0.4H),4.24-4.19(m,0.6H),3.89-3.71(m,3H),3.49-3.32(m,2H),3.21-3.08(m,1H),3.02-2.98(m,0.4H),2.93-2.88(m,0.6H),2.81-2.74(m,2H),2.68-2.57(m,2H),1.43(s,3H),1.39(s,6H),1.10(s,4H),1.09(s,2H)。
中间体I-17B-2(单一立体异构体)和I-17B-3(单一立体异构体)：
(4S*,7S*)-苄基6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯(单一立体异构体)和(4R*,7R*)-苄基6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-7-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯(单一立体异构体)
在室温下，向(4R*,7S*)-苄基6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯I-17B-1(56.0g，80％纯度，107mmol)在乙酸乙酯(280mL)和水(280mL)中的溶液中添加氯化钌(III)三水合物(2.80g，10.7mmol)和高碘酸钠(45.8g，214mmol)。在室温下搅拌1小时后，将混合物用饱和的碳酸氢钠(500mL)淬灭并用乙酸乙酯(500mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(500mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩以给出残余物，将其通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝5:1至1:1)纯化以给出呈棕色油状物的标题化合物I-17B-2(10.5g，由1H NMR得到的纯度为90％，20％产率，99.5％立体纯)、呈棕色油状物的化合物I-17B-2和I-17B-3的混合物(17.0g，90％纯度，33％产率)以及呈棕色固体的标题化合物I-17B-3(16.5g，90％纯度，32％产率，90.0％立体纯)。
中间体I-17B-2：手性分析(柱：Chiralpak IG 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝50:50，以1mL/min；温度：30℃；波长：214nm，RT＝10.473min)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37-7.30(m,5H),5.25-5.15(m,2H),4.81-4.77(m,0.5H),4.62-4.57(m,0.5H),4.13-4.07(m,1H),3.90-3.73(m,2H),3.69-3.64(m,1H),3.59-3.45(m,2H),3.33-3.29(m,1H),3.25(d,J＝11.6Hz,1H),3.08-2.93(m,1H),1.46(s,5H),1.44(s,4H),1.17(s,3H),1.13(s,3H)。
中间体I-17B-3：手性分析(柱：Chiralpak IG 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝50:50，以1mL/min；温度：30℃；波长：214nm，RT＝15.698min)。
中间体I-17B-2(单一立体异构体)和I-17B-3(单一立体异构体)：
(4S*,7S*)-苄基6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯(单一立体异构体)和(4R*,7R*)-苄基6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-7-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯(单一立体异构体)
将I-17B-1的混合物(26.0g，90％纯度，54.1mmol)通过手性制备型HPLC(柱：Chiralpak IG 5μm 20*250mm；流动相：Hex:EtOH＝50:50，以15mL/min；温度：30℃；波长：214nm)分离以得到呈黄色固体的标题化合物I-17B-2(12.7g，由1H NMR得到的纯度为90％，49％产率，100％立体纯)和I-17B-3(9.80g，由1H NMR得到的纯度为90％，38％产率，86.3％立体纯)。
中间体I-17B-2：LC-MS(ESI)：RT＝1.423min，C23H32N2O6的计算质量432.2，m/z实测值433.2[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IG 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝50:50，以1mL/min；温度：30℃；波长：214nm，RT＝10.491min)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.41-7.29(m,5H),5.26-5.14(m,2H),4.81-4.77(m,0.5H),4.62-4.57(m,0.5H),4.13-4.07(m,1H),3.90-3.41(m,5H),3.33-3.29(m,2H),3.09-2.92(m,1H),1.45(s,5H),1.43(s,4H),1.17(s,3H),1.13(s,3H)。
中间体I-17B-3：LC-MS(ESI)：RT＝1.411min，C23H32N2O6的计算质量432.2，m/z实测值433.2[M+H]+。手性分析(柱：Chiralpak IG 5μm 4.6*250mm；流动相：Hex:EtOH＝50:50，以1mL/min；温度：30℃；波长：214nm，RT＝15.826min)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.42-7.31(m,5H),5.16(s,2H),4.46-4.36(m,1H),4.01-3.78(m,3H),3.60-3.36(m,5H),3.25-3.11(m,1H),1.42(s,9H),1.15(s,6H)。
中间体I-17B-4：(4S*,7S*)-叔丁基2,2-二甲基-3-(5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)丙酸酯(单一立体异构体)
在室温下，向(4S*,7S*)-苄基6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯I-17B-2(8.50g，90％纯度，17.7mmol)在丙-2-醇(45mL)和四氢呋喃(45mL)中的溶液中添加20％氢氧化钯炭(1.24g，1.77mmol)。在50℃下在氢气气氛气囊下搅拌2小时后，将混合物通过硅藻土垫过滤。将滤液在减压下浓缩以给出呈无色油状物的标题化合物(5.60g，由1H NMR得到的纯度为90％，95％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.23(t,J＝3.6Hz,1H),3.76-3.72(m,1H),3.66(d,J＝14.0Hz,1H),3.62-3.57(m,1H),3.49-3.45(m,1H),3.41-3.38(m,1H),3.35(d,J＝14.0Hz,1H),3.18(d,J＝11.6Hz,1H),2.88-2.81(m,1H),2.66-2.62(m,1H),1.45(s,9H),1.18(s,3H),1.12(s,3H)。
中间体I-17B-5：甲基(S*)-6-(((4aS*,7aS*)-6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-4-(3,4-二氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法C的类似程序，从I-17B-4和VIb-7合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：Rt＝3.4min，C32H39F2N5O6S的计算质量659.3，m/z实测值660.3[M+H]+。
化合物I-17B：3-((4aS*,7aS*)-4-(((S*)-6-(3,4-二氟-2-甲基苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
在氩气中，在0℃下，向I-17B-5(33mg，0.05mmol)在DCM(1.5mL)中的溶液中添加TFA(3.0mL)并在rt下搅拌2小时。将溶剂去除以给出残余物，将其用二氯甲烷(20mL)萃取三次。将合并的有机相用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩以给出残余物，将其通过C18柱(乙腈:水＝40％至70％)纯化以给出呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：Rt＝2.8min，C28H31F2N5O6S的计算质量603.6，m/z实测值604.3[M+H]+。1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ:7.93(d,1H),7.72(d,1H),6.94-7.05(m,2H),5.89(s,1H),4.50-4.68(m,2H),4.27(m,1H),3.74-3.90(m,2H),3.68(d,1H),3.55-3.65(m,5H),3.27-3.40(m,2H),2.83-2.94(m,1H),2.60-2.67(m,1H),2.55(d,3H),1.21(s,3H),1.17(s,3H)。
化合物I-18A：3-((4aS*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-3-氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000851
中间体I-18A-1：乙基(R*)-6-(((4aS*,7aS*)-6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-4-(2-氯-3-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法C的类似程序，从I-17B-4和VIa-3合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：Rt＝3.41min，C32H39ClFN5O6S的计算质量675.2，m/z实测值676.3[M+H]+。
化合物I-18A：3-((4aS*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-3-氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
通过利用I-17B的类似程序，从I-18A-1合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：Rt＝2.91min，C28H31ClFN5O6S的计算质量619.2，m/z实测值620.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:9.60(brs,1H),7.84(d,J＝3.2Hz,1H),7.44(d,J＝3.2Hz,1H),7.20-7.10(m,2H),7.05-7.01(m,1H),6.26(s,1H),4.65-4.52(m,2H),4.30(t,J＝3.2Hz,1H),4.08-4.03(q,J＝7.2Hz,2H),3.88-3.80(m,2H),3.64-3.60(d,J＝13.9Hz,1H),3.55-3.52(dd,J＝3.6,11.2Hz,1H),3.45-3.35(m,3H),2.98-2.93(m,1H),2.58(d,J＝11.8Hz,1H),1.26(s,3H),1.23(s,3H),1.15(t,J＝7.1Hz,3H)。
化合物I-19A：3-((4aS*,7aS*)-4-(((S*)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000861
中间体I-19A-1：甲基(S*)-6-(((4aS*,7aS*)-6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-4-(3-氟-2-甲基苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法C的类似程序，从I-17B-4和VIa-4合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：Rt＝3.29min，C32H40FN5O6S的计算质量641.3，m/z实测值642.3[M+H]+。
化合物I-19A：3-((4aS*,7aS*)-4-(((S*)-6-(3-氟-2-甲基苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
通过利用I-17B的类似程序，从I-19A-1合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：Rt＝2.69min，C28H32FN5O6S的计算质量585.2，m/z实测值586.3[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:9.52(brs,1H),7.82(d,J＝3.2Hz,1H),7.42(d,J＝3.2Hz,1H),7.09-7.03(m,1H),6.98-6.96(m,1H),6.90(t,J＝9.35Hz,1H),6.01(s,1H),4.68-4.52(m,2H),4.30(m,1H),3.88-3.76(m,2H),3.63(s,3H),3.61-3.37(m,3H),2.98-2.92(m,1H),2.64(s,2H),2.59(s,1H),2.55(d,J＝2.0Hz,3H),1.27(s,3H),1.24(s,3H)。
化合物I-20A：3-((4aS*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-4-氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000871
中间体I-20A-1：乙基(R*)-6-(((4aS*,7aS*)-6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法C的类似程序，从I-17B-4和VIa-1合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：Rt＝2.73min，C32H39ClFN5O6S的计算质量675.2，m/z实测值676.3[M+H]+。
化合物I-20A：3-((4aS*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-4-氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
通过利用I-17B的类似程序，从I-20A-1合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：Rt＝2.85min，C28H31ClFN5O6S的计算质量619.2，m/z实测值620.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.27-12.61(m,1H),9.55-9.91(m,1H),7.96(d,J＝3.06Hz,1H),7.89(d,J＝3.18Hz,1H),7.32-7.38(m,2H),7.10(dt,J＝2.69,8.50Hz,1H),5.97(s,1H),4.44(s,2H),4.09(br s,1H),3.82-3.95(m,2H),3.63-3.78(m,2H),3.50-3.62(m,1H),3.38-3.49(m,2H),3.10-3.21(m,1H),3.04(d,J＝11.00Hz,1H),2.53-2.71(m,2H),0.97-1.05(m,9H)。
化合物I-21A：3-((4aS*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-3-氟苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000872
中间体I-21A-1：甲基(R*)-6-(((4aS*,7aS*)-6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-4-(2-氯-3-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法C的类似程序，从I-17B-4和VIa-5合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：Rt＝2.57min，C31H37ClFN5O6S的计算质量661.2，m/z实测值662.3[M+H]+。
化合物I-21A：3-((4aS*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-3-氟苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
通过利用I-17B的类似程序，从I-21A-1合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：Rt＝2.71min，C27H29ClFN5O6S的计算质量605.2，m/z实测值606.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.15-12.55(m,1H),9.54-9.86(m,1H),7.96(d,J＝3.18Hz,1H),7.89(d,J＝3.18Hz,1H),7.30-7.38(m,2H),7.10(dt,J＝2.63,8.47Hz,1H),5.96(s,1H),4.44(br s,2H),4.01-4.17(m,1H),3.64-3.80(m,2H),3.50-3.63(m,1H),3.45(s,3H),3.38-3.48(m,2H),3.15(d,J＝13.69Hz,1H),3.05(d,J＝11.00Hz,1H),2.53-2.72(m,2H),1.03(s,3H),1.00(s,3H)。
化合物I-22A：3-((4aS*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-3,4-二氟苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000881
中间体I-22A-1：甲基(R*)-6-(((4aS*,7aS*)-6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-4-(2-氯-3,4-二氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法C的类似程序，从I-17B-4和VIa-8合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：Rt＝3.37min，C31H36ClF2N5O6S的计算质量679.2，m/z实测值680.3[M+H]+。
化合物I-22A：3-((4aS*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-3,4-二氟苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
通过利用I-17B的类似程序，从I-22A-1合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：Rt＝2.81min，C27H28ClF2N5O6S的计算质量623.1，m/z实测值624.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ:7.94(d,J＝3.18Hz,1H),7.74(d,J＝3.18Hz,1H),7.17-7.24(m,2H),6.14(s,1H),4.51-4.66(m,2H),4.28(t,J＝3.55Hz,1H),3.75-3.88(m,2H),3.66-3.72(m,1H),3.56-3.65(m,5H),3.32-3.40(m,2H),2.83-2.92(m,1H),2.61-2.69(m,1H),1.20(s,3H),1.17(s,3H)。
化合物I-23A：3-((4aS*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-3,4-二氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000891
中间体I-23A-1：乙基(R*)-6-(((4aS*,7aS*)-6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-4-(2-氯-3,4-二氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法C的类似程序，从I-17B-4和VIa-9合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：Rt＝2.73min，C32H38ClF2N5O6S的计算质量693.2，m/z实测值694.3[M+H]+。
化合物I-23A：3-((4aS*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-3,4-二氟苯基)-5-(乙氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
通过利用I-17B的类似程序，从I-23A-1合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：Rt＝2.90min，C28H30ClF2N5O6S的计算质量637.1，m/z实测值638.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ:ppm 7.94(d,J＝3.18Hz,1H),7.74(d,J＝3.06Hz,1H),7.17-7.25(m,2H),6.14(s,1H),4.51-4.66(m,2H),4.28(t,J＝3.55Hz,1H),4.05(q,J＝7.09Hz,2H),3.82(td,J＝10.42,2.14Hz,2H),3.69(d,J＝3.79Hz,1H),3.55-3.63(m,2H),3.33-3.40(m,1H),3.27-3.30(m,1H),2.88(br s,1H),2.60-2.71(m,1H),1.12-1.23(m,9H)。
化合物I-24A：3-((4aS*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-3-氟苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000901
中间体I-24A-1：甲基(R*)-6-(((4aS*,7aS*)-6-(3-(叔丁氧基)-2,2-二甲基-3-氧代丙基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-4(4aH)-基)甲基)-4-(2-氯-3-氟苯基)-2-(噻唑-2-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法C的类似程序，从I-17B-4和VIa-6合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：Rt＝3.30min，C31H37ClFN5O6S的计算质量661.2，m/z实测值662.3[M+H]+。
化合物I-24A：3-((4aS*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-3-氟苯基)-5-(甲氧基羰基)-2-(噻唑-2-基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)-5-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-基)-2,2-二甲基丙酸(单一立体异构体)
通过利用I-17B的类似程序，从I-24A-1合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：Rt＝2.70min，C27H29ClFN5O6S的计算质量605.1，m/z实测值606.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:ppm 9.45-9.64(m,1H),7.80-7.94(m,1H),7.40-7.51(m,1H),7.08-7.21(m,2H),6.97-7.08(m,1H),6.18-6.30(m,1H),4.59-4.74(m,1H),4.45-4.57(m,1H),4.25-4.36(m,1H),3.72-3.94(m,2H),3.62(s,3H),3.39-3.60(m,5H),2.87-2.99(m,1H),2.51-2.63(m,1H),1.22-1.33ppm(m,6H)。
从专利WO 01/68641中选择以下化合物(在该专利中为化合物72)作为参考1。化学结构示于下文。
Figure BDA0003695472250000902
参考1A(单一立体异构体)和参考1B(单一立体异构体)：
(4aR*,7aR*)-叔丁基4-(((R*)-6-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-5-(甲氧基羰基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯(单一立体异构体)和(4aS*,7aS*)-叔丁基4-(((R*)-6-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-5-(甲氧基羰基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000911
中间体Ref-1-1：叔丁基6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-甲酸酯
在室温下，向叔丁基2,5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸酯I-1-1(20g，118mmol)在二氯甲烷(300mL)中的溶液中添加3-氯过氧苯甲酸(41g，238mmol)。在室温下搅拌12小时后，将反应混合物用饱和的亚硫酸钠水溶液(500mL)淬灭，用饱和的碳酸氢钠水溶液(500mL)洗涤三次，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩以给出呈黄色油状物的标题化合物(19g，由1H NMR得到的纯度为80％，69％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ3.82(d,J＝12.8Hz,1H),3.74(d,J＝12.8Hz,1H),3.68(d,J＝2.8Hz,2H),3.36-3.30(m,2H),1.45(s,9H)。
中间体Ref-1-2：(反式)-叔丁基3-(苄基氨基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸酯
在室温下，向叔丁基6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-甲酸酯Ref-1-1(21g，80％纯度，90.7mmol)在乙醇(200mL)中的溶液中添加苯甲胺(20mL，183mmol)。在95℃下搅拌12小时后，将反应混合物浓缩以给出残余物。将残余物用石油醚(50mL)和乙酸乙酯(50mL)的溶液稀释。将所得悬浮液在室温下搅拌1小时。将沉淀物通过过滤收集以给出呈白色固体的标题化合物(21g，由1HNMR得到的纯度为95％，75％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.36-7.28(m,4H),7.23-7.20(m,1H),5.00(br s,1H),3.97(s,1H),3.70(s,2H),3.46-3.31(m,2H),3.13-3.06(m,2H),2.95-2.93(m,1H),1.39(s,9H)。
中间体Ref-1-3：(反式)-叔丁基3-(N-苄基-2-氯乙酰胺基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸酯
在0℃下，向(反式)-叔丁基3-(苄基氨基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸酯Ref-1-2(21g，95％纯度，68.2mmol)和三乙胺(19mL，137mmol)在二氯甲烷(200mL)中的溶液中逐滴添加2-氯乙酰氯(6.6mL，82.9mmol)。在室温下搅拌4小时后，将混合物用水(100mL)稀释并用乙酸乙酯(100mL)萃取三次。将合并的有机层经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝1:0至8:1)纯化以给出呈黄色固体的标题化合物(11.5g，由1H NMR得到的纯度为80％，37％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.41-7.15(m,5H),5.61-5.58(m,0.7H),5.37(s,0.3H),4.87-4.77(m,1.3H),4.51(d,J＝14.0Hz,0.7H),4.40-4.21(m,3.3H),3.52-3.38(m,2H),3.18-2.93(m,2H),1.36-1.31(m,9H)。
中间体Ref-1-4：(反式)-叔丁基4-苄基-3-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯
在0℃下，向(反式)-叔丁基3-(N-苄基-2-氯乙酰胺基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸酯Ref-1-3(11.5g，80％纯度，24.9mmol)在四氢呋喃(100mL)中的溶液中添加叔丁醇钾(5.3g，47.2mmol)。在室温下搅拌12小时后，将反应混合物用水(100mL)稀释并用乙酸乙酯(100mL)萃取三次。将合并的有机层经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩以给出呈白色固体的标题化合物(2.8g，由1HNMR得到的纯度为95％，32％产率)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.41-7.36(m,2H),7.33-7.26(m,3H),4.83-4.74(m,1H),4.40(s,2H),4.38-4.32(m,1H),4.25-4.16(m,1H),3.77-3.57(m,3H),3.13-2.88(m,2H),1.39(s,9H)。
中间体Ref-1-5：(反式)-叔丁基4-苄基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯
向(反式)-叔丁基4-苄基-3-氧代六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯Ref-1-4(500mg，90％纯度，1.35mmol)在四氢呋喃(10mL)中的混合物中添加1M硼烷-四氢呋喃络合物(5.5mL，5.5mmol)。在70℃下搅拌4小时后，将反应混合物冷却至室温，用饱和的氯化铵水溶液(20mL)淬灭并用乙酸乙酯(30mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4(固体)干燥并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇＝20:1)纯化以给出呈黄色油状物的标题化合物(400mg，由1H NMR得到的纯度为90％，84％产率)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ7.41-7.32(m,5H),3.94(dd,J＝11.4Hz,3.0Hz,1H),3.81-3.61(m,5H),3.31-3.17(m,2H),3.07-3.00(m,1H),2.73(d,J＝11.7Hz,1H),2.46-2.33(m,1H),2.26-2.15(m,1H),1.49(s,9H)。
中间体Ref-1-6：(反式)-叔丁基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯向(反式)-叔丁基4-苄基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯Ref-1-5(1.7g，90％纯度，4.81mmol)在甲醇(30mL)中的混合物中添加10％wt.钯炭(340mg)。在50℃下在氢气气氛(50psi)下搅拌过夜后，将反应混合物过滤。将滤液浓缩并通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇＝20:1)纯化以给出呈黄色油状物的标题化合物(1.1g，由1H NMR得到的纯度为90％，90％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.96-3.93(m,1H),3.75-3.56(m,3H),3.50-3.40(m,1H),3.15-2.77(m,5H),1.46(s,9H)。
化合物参考1A和参考1B：
(4aR*,7aR*)-叔丁基4-(((R*)-6-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-5-(甲氧基羰基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯
(4aS*,7aS*)-叔丁基4-(((R*)-6-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-5-(甲氧基羰基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯
通过利用方法C的类似程序，从Ref-1-6和VIa-10合成呈黄色固体的标题化合物的滤液。将滤液通过制备型HPLC(柱：X-bridge C18(5um 19*150mm)；流动相A：水(+0.1％碳酸氢铵)，流动相B：乙腈，UV：214nm，流速：15mL/min，梯度：40％-90％(％B))纯化以给出呈白色固体的参考1A(25mg，95.4％纯度，32％产率)和参考1B(28mg，96.3％纯度，36％产率)。
参考1A：LC-MS(ESI)：RT＝3.105min，C29H31ClF3N5O5的计算质量621.2，m/z实测值622.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.52(s,1H),7.72-7.68(m,1H),7.41-7.38(m,1H),7.22(d,J＝8.8Hz,1H),7.05-7.01(m,1H),6.22(s,1H),4.19-4.02(m,2H),3.94-3.86(m,2H),3.73-3.67(m,3H),3.62(s,3H),3.17-2.94(m,3H),2.63-2.55(m,2H),1.45(s,4H),1.42(s,5H)。
参考1B：LC-MS(ESI)：RT＝3.255min，C29H31ClF3N5O5的计算质量621.2，m/z实测值622.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.51(s,1H),7.80-7.69(m,1H),7.50-7.40(m,1H),7.31-7.21(m,1H),7.12-6.99(m,1H),6.33(s,0.2H),6.24(s,0.8H),4.21-4.13(m,1H),4.06-3.88(m,4H),3.83-3.70(m,2H),3.62(s,3H),3.20-3.09(m,2H),2.78(t,J＝10.4Hz,1H),2.69-2.60(m,1H),2.49-2.39(m,1H),1.48(s,9H)。
参考1C(单一立体异构体)和参考1D(单一立体异构体)：
(4aR*,7aR*)-叔丁基4-(((S*)-6-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-5-(甲氧基羰基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯(单一立体异构体)和(4aS*,7aS*)-叔丁基4-(((S*)-6-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-5-(甲氧基羰基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000941
通过利用方法C的类似程序，从Ref-1-6和VIb-10合成呈黄色固体的标题化合物的滤液。将滤液浓缩并通过制备型HPLC(柱：X-bridge C18(5um 19*150mm)；流动相A：水(+0.1％碳酸氢铵)，流动相B：乙腈，UV：214nm，流速：15mL/min，梯度：40％-90％(％B))纯化以给出呈白色固体的参考1C(16mg，99.3％纯度，21.3％产率)和参考1D(6mg，98.1％纯度，7.9％产率)。
参考1C：LC-MS(ESI)：RT＝3.514min，C29H31ClF3N5O5的计算质量621.2，m/z实测值622.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.51(s,1H),7.74-7.68(m,1H),7.41-7.37(m,1H),7.21(d,J＝8.4Hz,1H),7.05-7.01(m,1H),6.21(s,1H),4.18-4.02(m,2H),3.94-3.85(m,2H),3.75-3.65(m,3H),3.63(s,1H),3.62(s,2H),3.17-2.93(m,3H),2.65-2.52(m,2H),1.44(s,4H),1.41(s,5H)。
参考1D：LC-MS(ESI)：RT＝3.697min，C29H31ClF3N5O5的计算质量621.2，m/z实测值622.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.51(s,1H),7.75-7.70(m,1H),7.44-7.42(m,1H),7.25-7.22(m,1H),7.12-7.02(m,1H),6.26(s,1H),4.22-4.14(m,1H),3.99-3.84(m,4H),3.80-3.72(m,2H),3.62(s,3H),3.19-3.13(m,2H),2.78(t,J＝10.8Hz,1H),2.69-2.63(m,1H),2.51-2.43(m,1H),1.48(s,9H)。
参考1E：叔丁基(4aR*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-5-(甲氧基羰基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000942
中间体Ref-1-7：叔丁基(4aR*,7aS*)-六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯
在室温下，向I-1-6A(150mg，90％纯度，0.372mmol)在甲醇(20mL)中的溶液中添加10％wt.氢氧化钯炭(90mg)。在45℃下在氢气气氛(气囊)下搅拌4小时后，将混合物过滤。将滤液浓缩以给出呈无色油状物的标题化合物(85mg，由1H NMR得到的纯度为90％，90％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝1.25min，C11H20N2O3的计算质量228.1，m/z实测值229.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ3.99-3.93(m,1H),3.84(td,J＝11.2Hz,2.8Hz,1H),3.61-3.52(m,2H),3.47-3.35(m,4H),3.15-3.10(m,1H),2.66(td,J＝13.2Hz,2.4Hz,1H),1.46-1.45(m,9H)。
参考1E：叔丁基(4aR*,7aS*)-4-(((R*)-6-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-5-(甲氧基羰基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法C的类似程序，从Ref-1-7和VIa-10合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝3.329min，C28H31ClF3N5O5的计算质量621.2，m/z实测值622.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.53-8.51(m,1H),7.75-7.69(m,1H),7.44-7.38(m,1H),7.23-7.22(m,1H),7.06-6.99(m,1H),6.23(s,0.4H),6.22(s,0.6H),4.35-4.21(m,2H),4.03-3.89(m,2H),3.84-3.74(m,1H),3.62(s,3H),3.58-3.51(m,1.5H),3.48-3.31(m,3.5H),2.96-2.82(m,1H),2.67-2.61(m,0.6H),2.50-2.47(m,0.4H),1.46(s,4H),1.43(s,2.5H),1.37(s,2.5H)。
参考1F：叔丁基(4aR*,7aS*)-4-(((S*)-6-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-5-(甲氧基羰基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000951
通过利用方法C的类似程序，从Ref-1-7和VIb-10合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝3.766min，C28H31ClF3N5O5的计算质量621.2，m/z实测值622.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.53-8.51(m,1H),7.75-7.68(m,1H),7.44-7.37(m,1H),7.23-7.20(m,1H),7.06-7.00(m,1H),6.24(s,0.5H),6.22(s,0.5H),4.35-4.19(m,2H),4.03-3.90(m,2H),3.84-3.74(m,1H),3.62(s,3H),3.58-3.52(m,1.7H),3.48-3.37(m,3.3H),2.96-2.82(m,1H),2.67-2.59(m,0.5H),2.50-2.47(m,0.5H),1.46(s,4H),1.43(s,2.5H),1.37(s,2.5H)。
参考1G：(4aS*,7aR*)-叔丁基4-(((R*)-6-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-5-(甲氧基羰基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000961
中间体Ref-1-8：(4aS*,7aR*)-叔丁基六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯
在室温下，向I-1-6B(150mg，90％纯度，0.372mmol)在甲醇(20mL)中的溶液中添加10％wt.氢氧化钯炭(90mg)。在45℃下在氢气气氛(气囊)下搅拌4小时后，将混合物过滤。将滤液浓缩以给出呈无色油状物的标题化合物(85mg，由1H NMR得到的纯度为90％，90％产率)。
LC-MS(ESI)：RT＝1.25min，C11H20N2O3的计算质量228.1，m/z实测值229.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ3.99-3.93(m,1H),3.84(td,J＝11.2Hz,2.8Hz,1H),3.61-3.52(m,2H),3.47-3.35(m,4H),3.15-3.10(m,1H),2.66(td,J＝13.2Hz,2.4Hz,1H),1.46-1.45(m,9H)。
参考1G：(4aS*,7aR*)-叔丁基4-(((R*)-6-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-5-(甲氧基羰基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯(单一立体异构体)
通过利用方法C的类似程序，从Ref-1-8和VIa-10合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝4.601min，C29H31ClF3N5O5的计算质量621.2，m/z实测值622.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.52(d,J＝6.4Hz,1H),7.76-7.69(m,1H),7.44-7.37(m,1H),7.24-7.20(m,1H),7.06-7.00(m,1H),6.23(s,1H),4.28-4.21(m,2H),4.04-3.93(m,2H),3.79-3.70(m,1H),3.62(s,3H),3.59-3.56(m,1.3H),3.51-3.38(m,3.7H),2.96-2.91(m,1H),2.68-2.61(m,1H),1.43(s,4.3H),1.37(s,4.7H)。
参考1H：(4aS*,7aR*)-叔丁基4-(((S*)-6-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二氟吡啶-2-基)-5-(甲氧基羰基)-3,6-二氢嘧啶-4-基)甲基)六氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯(单一立体异构体)
Figure BDA0003695472250000971
通过利用方法C的类似程序，从Ref-1-8和VIb-10合成呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(ESI)：RT＝3.662min，C29H31ClF3N5O5的计算质量621.2，m/z实测值622.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.51(s,1H),7.74-7.69(m,1H),7.42-7.38(m,1H),7.22(dd,J＝8.8Hz,2.8Hz,1H),7.04-6.99(m,1H),6.24(s,1H),4.35-4.29(m,1H),4.21-4.19(m,1H),4.01-3.90(m,2H),3.84-3.79(m,1H),3.62(s,3H),3.59-3.52(m,2H),3.49-3.47(m,3H),2.89-2.82(m,1H),2.49(d,J＝12.0Hz,1H),1.46(s,9H)。
实例2：HepG2.2.15细胞中的抗病毒测定
材料和设备
1)细胞系
HepG2.2.15(该HepG2.2.15细胞系可以通过转染HepG2细胞系产生，如Sells,Chen和Acs 1987(Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]84:1005-1009)所述的，并且该HepG2细胞系可以从
Figure BDA0003695472250000972
在编号HB-8065TM下获得)。
2)试剂
DMEM/F12(英杰公司(INVITROGEN)-11330032)
FBS(吉博科公司(GIBCO)-10099-141)
二甲亚砜(DMSO)(西格玛公司(SIGMA)-D2650)
青霉素-链霉素溶液(海克隆公司(HYCLONE)-SV30010)
NEAA(英杰公司-1114050)
L-谷氨酰胺(英杰公司-25030081)
遗传霉素选择性抗生素(G418，500mg/ml)(英杰公司-10131027)
胰蛋白酶消化液(英杰公司-25300062)
CCK8(BIOLOTE公司-35004)
QIAamp 96 DNA血液试剂盒(12)(凯杰公司(QIAGEN)-51162)
FastStart通用探针Mast Mix(罗氏公司(ROCHE)-04914058001)
3)耗材
96孔细胞培养板(科斯塔公司(COSTAR)-3599)
Micro Amp Optical 96孔反应板(应用生物系统公司(APPLIED BIOSYSTEMS)-4306737)
Micro Amp Optical 384孔反应板(应用生物系统公司)
4)设备
读板器(分子设备公司(MOLECULAR DEVICES)，SPECTRAMAX M2e)
离心机(贝克曼公司(BECKMAN)，ALLEGRA-X15R)
实时PCR系统(应用生物系统公司，QUANTSTUDIO 6)
实时PCR系统(应用生物系统公司，7900HT)
方法
1)抗HBV活性和细胞毒性测定
将HepG2.2.15细胞以40,000个细胞/孔和5,000个细胞/孔的密度铺到96孔板中的2％FBS培养基中，分别用于HBV抑制剂活性和细胞毒性测定。在37℃下、5％CO2下孵育过夜后，将细胞用含有化合物的培养基处理6天(处理3天后更新培养基和化合物)。将每种化合物在一式三份的8种不同浓度的1:3连续稀释液中进行测试。针对抗HBV活性测定，化合物的最高浓度是10uM或1uM，针对细胞毒性测定，其最高浓度是100uM。
通过CCK-8测定法来测定细胞活力。化合物处理6天后，将20μl CCK-8试剂添加至细胞毒性测定板中的每个孔中。将细胞培养板在37℃下、5％CO2中孵育2.5h。测量450nm波长处的吸光度和630nm波长处的吸光度(后者为参考吸光度)。
通过定量实时聚合酶链式反应(qPCR)评估化合物诱导的HBV DNA水平的变化。简言之，根据手册使用QIAamp 96DNA血液试剂盒提取培养基中的HBV DNA，然后使用下表1中的引物和探针通过实时PCR测定来定量。
表2：
Figure BDA0003695472250000981
2)数据分析
通过GRAPHPAD PRISM软件计算EC50和CC50值。如果DMSO对照的CV％低于15％并且参考化合物显示预期的活性或细胞毒性，则认为此批实验的数据是合格的。
结果：参见下表3。
表3：
Figure BDA0003695472250000991
序列表
<110> 詹森药业有限公司
强生（中国）投资有限公司
<120> 杂芳基二氢嘧啶衍生物和治疗乙型肝炎感染的方法
<130> P2020TC1426
<150> PCT/CN2019/127038
<151> 2019-12-20
<160> 3
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 1
gtgtctgcgg cgttttatca 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 2
gacaaacggg caacatacct t 21
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 3
cctctkcatc ctgctgctat gcctcatc 28

Claims (19)

1.一种具有式(I)的化合物，
Figure FDA0003695472240000011
包括其任何可能的氘代异构体、立体异构体或互变异构形式，其中：
R1选自芳基或杂芳基，其各自任选地被选自卤素和C1-C6烷基的一个或多个取代基取代；
R2选自芳基或杂芳基，其各自被R4、R5、和R6取代；
R3是C1-C4烷基；
R4、R5、和R6独立地选自由以下组成的组：H、-OH、-CN、C1-C4烷基、和卤素；
R10选自由以下组成的组：H和C1-C4烷基；
环B选自由3-8元饱和或不饱和环组成的组，这些环中的每一个任选地包含1、2或3个选自O、N和S的杂原子，并且这些环中的每一个任选地被独立地选自由以下组成的组的一个或多个取代基取代：卤素、＝O、-OH、-CN、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、和羟基C1-C4烷基，其中每个C1-C4烷基任选地被卤素取代；
R7选自由以下组成的组：-SO2-R8、-SO2-Q-R8、-OC(＝O)C1-C6烷基、-C(＝O)OC1-C6烷基-COOH、-C(＝O)NHC1-C6烷基-COOH、-C(＝O)O-Q-COOH、-C(＝O)NH-Q-COOH、-C(＝O)C1-C6烷基、-C(＝O)C1-C6烷基-R8、-NHC1-C6烷基-R8、-C1-C6烷基、-C1-C6烷基-R8、-C1-C6烷氧基C1-C6烷基-R8、-(CH2)p-R8、-(CH2)p-C(R11R12)-R8、和-(CH2)p-Q-R8；
R8选自由以下组成的组：-C1-C6烷基、-C1-C6烷基-COOH、-COOH、和羧酸生物电子等排体；
R11和R12连同它们所附接的碳原子一起形成任选地被R9取代的3-8元饱和环，该3-8元饱和环任选地含有杂原子，该杂原子是N或O；
Q选自由以下组成的组：芳基、杂芳基、和3-8元饱和环，其各自任选地被R9取代，该3-8元饱和环任选地含有杂原子，该杂原子是N或O；
R9选自由以下组成的组：H、-C1-C6烷基、-C1-C6烷氧基C1-C6烷基和-C1-C6烷基羰基；
p是整数0、1、2、3、或4；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
2.如权利要求1所述的化合物，其中环B选自5-7元饱和环，其各自任选地包含一个为N的杂原子，并且其各自任选地被独立地选自由以下组成的组的一个或多个取代基取代：卤素、＝O、-OH、-CN、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、和羟基C1-C4烷基。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其具有以下通式：
Figure FDA0003695472240000021
Figure FDA0003695472240000031
4.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R1选自由以下组成的组：噻唑基、吡啶基、和噁唑基，其各自任选地被选自F和C1-C6烷基的一个或多个取代基取代。
5.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R1是噻唑基。
6.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R2选自由以下组成的组：苯基、苯硫基、和吡啶基，其各自被R4、R5、和R6取代，其中R4、R5、和R6独立地选自由以下组成的组：H、-OH、-CN、C1-C4烷基、和卤素。
7.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R2是被R4、R5、和R6取代的苯基，其中R4、R5、和R6独立地选自由以下组成的组：H、-CN、-CH3、F、Cl和Br。
8.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R3是甲基、乙基、丙基、或异丙基。
9.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R7选自由以下组成的组：-SO2-Q-R8、-C(＝O)OC1-C6烷基-COOH、-C(＝O)NHC1-C6烷基-COOH、-C(＝O)O-Q-COOH、-C(＝O)NH-Q-COOH、-C(＝O)C1-C6烷基-R8、-NHC1-C6烷基-R8、-C1-C6烷基-R8、-(CH2)p-R8、和-(CH2)p-Q-R8。
10.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R8选自由以下组成的组：-C1-C6烷基-COOH、-COOH、-C(＝O)NHS(＝O)2C1-C6烷基、和四唑基。
11.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Q选自由以下组成的组：芳基、杂芳基、和3-8元饱和环，其各自任选地被R9取代，该3-8元饱和环任选地含有杂原子，该杂原子是N或O；并且R9选自由以下组成的组：H、-C1-C6烷基。
12.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中p是整数0、1、或2。
13.如权利要求1所述的化合物，其选自由具有以下式的化合物组成的组：
Figure FDA0003695472240000041
Figure FDA0003695472240000051
Figure FDA0003695472240000061
14.一种药物组合物，其包含如前述权利要求中任一项所述的化合物并进一步包含至少一种药学上可接受的载体。
15.如权利要求1-13中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，或如权利要求14所述的药物组合物，用于作为药物使用。
16.如权利要求1-13中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，或如权利要求14所述的药物组合物，用于在有需要的哺乳动物中预防或治疗HBV感染或HBV诱发的疾病。
17.如权利要求1-13中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，或如权利要求14所述的药物组合物，用于在预防或治疗慢性乙型肝炎中使用。
18.一种包含第一化合物和第二化合物的产品，该产品作为组合制剂用于在有需要的哺乳动物的HBV感染或HBV诱发的疾病的预防或治疗中同时、分开或顺序使用，其中所述第一化合物不同于所述第二化合物，其中所述第一化合物是如权利要求1-13中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐或如权利要求14所述的药物组合物，并且其中所述第二化合物是选自由以下组成的组的另一种HBV抑制剂：HBV复方药物、HBV DNA聚合酶抑制剂、免疫调节剂、toll样受体(TLR)调节剂、干扰素α受体配体、透明质酸酶抑制剂、乙型肝炎表面抗原(HbsAg)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(ipi4)抑制剂、亲环蛋白抑制剂、HBV病毒进入抑制剂、反义寡核苷酸靶向病毒mRNA、短干扰RNA(siRNA)和ddRNAi内切核酸酶调节剂、核糖核苷酸还原酶抑制剂、HBV E抗原抑制剂、共价闭合环状DNA(cccDNA)抑制剂、法尼醇X受体激动剂、HBV抗体、CCR2趋化因子拮抗剂、胸腺肽激动剂、细胞因子、核蛋白调节剂、维甲酸诱导基因1刺激因子、NOD2刺激因子、磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)抑制剂、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)途径抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、重组胸腺肽α-1、布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、KDM抑制剂、HBV复制抑制剂、精氨酸酶抑制剂以及抗HBV药物。
19.一种用于制备如权利要求1至13所述的化合物的方法，该方法包括以下步骤：
a.以下各项的缩合：具有的式(II)醛，其中式(II)为
Figure FDA0003695472240000071
具有式(III)的乙酰乙酸盐，其中式(III)为
Figure FDA0003695472240000072
以及具有式(IV)的脒，其中式(IV)为
Figure FDA0003695472240000073
该缩合在碱的存在下进行，该碱优选NaOAc，以形成根据式(I-1)的化合物：
Figure FDA0003695472240000074
b.具有式(I-1)的化合物的溴化，溴化剂优选N-溴代琥珀酰亚胺，以形成根据式(I-2)的化合物，其中式(I-2)为
Figure FDA0003695472240000081
c.具有式(I-2)的化合物与具有式(V)的化合物的偶联，其中式(V)为
Figure FDA0003695472240000082
该偶联在碱的存在下进行，该碱优选三乙醇胺，以形成根据式(I)的化合物。
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