CN113186329B - 一种鉴定萝卜抗根肿病的InDel分子标记及其开发方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定萝卜抗根肿病的InDel分子标记及其开发方法和应用,属于萝卜育种技术领域。采用本发明提供的分子标记进行PCR扩增,能有效确定萝卜材料是否具有对根肿病的抗性,为萝卜育种提供技术支持,准确性高,成本低,并加快育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及萝卜育种技术领域,具体涉及一种鉴定萝卜抗根肿病的InDel分子标记及其开发方法和应用。
背景技术
根肿病是一种由芸苔根肿菌引起的十字花科植物病害,感病植物有甘蓝、白菜、萝卜、芥菜等。植物受根肿菌侵染后,在根部形成大小不一、光滑或龟裂粗糙的肿瘤;而植株的地上部分生长迟缓、缺水蔫萎。近年来,根肿菌在湖北、四川、云南等萝卜产区蔓延,对萝卜产业构成威胁。
由于根肿菌的孢子囊能在土壤中休眠越冬,休眠孢子囊抗逆性较强,且该真菌在土壤中能存活10年以上,因此仅通过物理防治和化学防治很难有效解决根肿菌的危害。抗病品种的选育和应用是解决根肿病危害的根本途径。
相较于十字花科芸苔属作物,萝卜对根肿病的抗性相关研究要少,抗病遗传规律还不是十分明确,目前已公开报道的抗根肿病分子标记多集中在芸苔属作物上。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种能够鉴定萝卜抗根肿病的InDel分子标记,以辅助选育具有抗根肿病基因的萝卜品种。
为了实现上述目的,本发明的技术方案具体如下:
本发明提供了一种鉴定萝卜抗根肿病的InDel分子标记,所述InDel分子标记为PA05引物对,所述PA05引物对的正向引物的核苷酸序列具体为:GGCATGATCTTTCGGAAATGTTTTGG(SEQ ID NO.1),所述PA05引物对的反向引物的核苷酸序列具体为:CACTCCATCTCTTAATTTTATGCCGC(SEQ ID NO.2)。
本发明还提供了一种鉴定萝卜抗根肿病的InDel分子标记的开发方法,具体包括以下步骤:
S1、将抗病亲本和感病亲本杂交获得F1代,F1代自交获得F2群体;
S2、从F2群体中选择多个高抗单株和多个高感单株,分别构建抗病混合池和感病混合池并对其进行测序,进而确定与根肿病相关的目标基因的候选区间;
S3、在步骤S2所述候选区间开发若干SNP标记,通过靶向测序技术分析上述标记在F2抗病单株中的基因型,获得可用的SNP标记,进一步缩小目标基因的候选区间;
S4、对抗病亲本和感病亲本重测序,选择两个亲本在步骤S3所述候选区间的变异位点,并对各变异位点设计扩增引物,筛选扩增引物得到具有特异性的InDel分子标记。
优选的,所述抗病亲本对根肿病Pb10生理小种呈抗性,所述感病亲本对根肿病Pb10生理小种呈感性。
优选的,步骤S2所述目标基因的候选区间为R08染色体的19.06至26.40Mb区间,步骤S3所述目标基因的候选区间为R08染色体的19.06至23.72Mb区间。
优选的,步骤S4所述变异位点的长度为3-10bp。
本发明还提供了上述技术方案所述的InDel分子标记在筛选具有抗根肿病性状的萝卜中的应用。
优选的,所述筛选的方法包括以下步骤:
(1)用PA01引物对或PA05引物对PCR扩增萝卜DNA样本,得到PCR扩增产物;
(2)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,可通过判断扩增产物中是否含有124bp的条带,直观获得萝卜品种是否具有对根肿病的抗性。
优选的,所述PCR扩增体系为:共10μL,50ng/μL DNA 1.0μL,2×Taq Master Mix5.0μL,10μmol混合引物0.5μL,ddH2O余量。
优选的,所述PCR扩增程序为:94℃预变性3min,90℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸45s、35个循环,72℃延伸5min,25℃保存10min。
本发明还提供了一种检测试剂盒,包括权利要求1所述PA01引物对或/和PA05引物对。
本发明的有益效果为:本发明开发的分子标记可为萝卜抗根肿病辅助选择育种提供有效的技术手段,可利用分子标记在苗期进行筛选,大大缩小田间鉴定的工作量,加快育种进程。
附图说明
图1为抗病亲本和感病亲本接种根肿病Pb10生理小种的发病情况(a为抗病亲本、b为感病亲本);
图2为Δ(SNP-index)值在各染色体上的分布图;
图3为缩小定位区间所用的SNP标记及其所在位置图;
图4为InDel标记对感病亲本和抗病亲本的筛选胶图;
图5为PA05引物对鉴定抗病性表型的胶图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明,本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外,实施方案应理解为说明性的,而非限制本发明的范围。
以下实施例中所使用的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所用的仪器、材料和试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例1
InDel分子标记的获得,具体包括以下步骤:
(1)抗病亲本材料与感病亲本材料的获得
沈阳农业大学朴钟云教授团队利用SCD鉴别系统(Pang et al.,2020)针对全国主要的根肿病菌株进行了生理小种鉴定,本实施例鉴定了7个万亩连片的萝卜主产区根肿菌,结果如表1所示:
表1
注:H01~H09是根肿菌SCD生理小种鉴定系统的鉴别寄主。
用上述7个主产区的生理小种对核心育种资源GLX、L30、L34、B2、B20、R-13-3、R-15-3和杂交组合19青1进行人工接种表型鉴定,感病对照为XNQ,结果显示GLX、L30、L34、B2和B20抗7个地区生理小种,杂交组合19青1对7个地区生理小种均表现不抗病。
本实施例具体以火烧坪根肿菌Pb10生理小种为主要研究对象,以GLX为抗病亲本,以XNQ为感病亲本,GLX和XNQ接种火烧坪的Pb10生理小种后,GLX表现为全部抗病(如图1a所示),XNQ表现为全部感病(如图1b所示)。
(2)抗病性的遗传分析
GLX和XNQ杂交获得F1代,F1代自交获得F2群体,利用根肿病Pb10生理小种分别接种F1和F2群体。接种方法具体为:将30粒GLX、30粒XNQ、30粒F1和1000粒F2种子播种于30孔穴盘,两叶一心期时,灌根法接种,接种浓度为1.0×108/ml,接种后第6周调查发病情况,统计分离比并进行卡方测验,确定抗病基因的遗传规律。结果如表2所示:
表2
在存活的840个F2个体中,640株表现为抗病,200株表现为感病,抗、感比例在p=0.05水平时为χ2=0.573<χ20.05=3.841,符合单基因显性遗传3:1分离比,显示抗病性是由单个显性抗病基因控制的。
(3)抗病基因的初定位
根据840个F2个体的抗病性鉴定结果,从F2群体中选择50个高抗的单株和50个高感的单株,分别提取基因组DNA,分别构建抗病混合池(R池)和感病混合池(S池),通过BSA二代测序方法对两个极端混池进行高深度测序,并找出两池间的遗传差异,检测与根肿病抗性相关的目标基因的候选区间。采用QTL-seq方法中使用的Δ(SNP-index)来衡量混池间等位基因频率差异,具体如图2所示。从图2可知,候选区间在R08染色体上,具体信息如表3所示:
表3
(4)SNP标记缩小初步定位区间
在R08染色体的19.06至26.40Mb区间开发了20个SNP标记,通过靶向测序技术分析了这些SNP标记在154个F2抗病单株中的基因型,最终有16个SNP标记是可用的,基于这些标记筛选的交换单株的结果表明,候选基因应位于19.06至23.72Mb区间(标记PA09的左侧,具体如图3所示)。
(5)InDel分子标记的获得
对抗病亲本GLX和感病亲本XNQ重测序,获得其变异信息,选择两个亲本在候选区间的变异位点(3-10bp),使用Primer3软件(version 2.5.0)来设计各目标位点的扩增引物,设置的参数包括:1)引物序列的长度在17-32bp之间;2)Tm值在60-64℃之间,最优为62℃;3)产物大小不超过500bp。
每个目标位点会产生多对引物,可使用e-PCR软件(version 2.3.12)来检测每对引物的扩增特异性,最终得到能够特异扩增目标位点的引物。最终引物序列如表4所示:
表4
上述10个InDel分子标记所在位置信息如表5所示:
表5
实施例2
采用实施例1的10个InDel分子标记PCR扩增感病亲本XNQ和抗病亲本GLX,得到PCR扩增产物;PCR扩增体系为:共10μL,50ng/μL DNA 1.0μL,2×Taq Master Mix 5.0μL,10μmol混合引物(即正向引物+反向引物)0.5μL,ddH2O余量;PCR扩增程序为:94℃预变性3min,90℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸45s、35个循环,72℃延伸5min,25℃保存10min。
对PCR扩增产物进行凝胶电泳,具体如图4所示。图中,线左侧为感病材料,右侧为抗病材料,部分InDel分子标记的胶图中有拖尾或杂带,而PA01和PA05的检测结果较好,说明PA01和PA05可以作为区别两个亲本的多态性标记使用。需要说明的是,在检测过程中发现个别亲本在繁殖的过程中被混杂了,导致出现多个条带(如PA01中右侧的第4、5条带)。
实施例3
PA05鉴定抗病性表型,具体过程如下:
采用PA05 PCR扩增F2群体中的感病单株和抗病单株,得到PCR扩增产物;PCR扩增体系为:共10μL,50ng/μL DNA1.0μL,2×Taq Master Mix 5.0μL,10μmol混合引物(即正向引物+反向引物)0.5μL,ddH2O余量;PCR扩增程序为:94℃预变性3min,90℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸45s、35个循环,72℃延伸5min,25℃保存10min。
对PCR扩增产物进行凝胶电泳,检测结果如图5所示:图中,从左至右依次为感病亲本、抗病亲本、F2群体中的感病单株(40个)、Marker和F2群体中的抗病单株(19个),中间为以Marker为界。从图可知,PA05可以有效的区分抗病材料和感病材料,具体的:抗病材料的条带为124bp,感病材料的条带为121bp。
另外,采用PA01进行抗病性表型鉴定时,其区分效果不如PA05。
需要指出的是,以上的实施例只是对本发明的解释,并非是对发明的限定,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北省农业科学院经济作物研究所
<120> 一种鉴定萝卜抗根肿病的 InDel 分子标记及其开发方法和应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcatgatct ttcggaaatg ttttgg 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cactccatct cttaatttta tgccgc 26
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaaacaaaa gcccacttat atctttttac a 31
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggtgggcct ggctcaat 18
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
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aggagtcctt gggagagagt gt 22
<210> 6
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<400> 7
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<210> 8
<211> 20
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cggtctcgct cagtcttgga 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
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<400> 9
tgctacagat tagagacggg gg 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 13
ccaaagaacc aaaacagggg act 23
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
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<400> 14
cacgcgtgac ctcgagact 19
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agatccctta ttacacagct gcaa 24
<210> 16
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<212> DNA
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<400> 16
ggcttgtgta gggagacttc gt 22
<210> 17
<211> 17
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gacgcgcgac ccgagta 17
<210> 18
<211> 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
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<212> DNA
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<400> 19
agggttctct caaatcccta attctcc 27
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcgagcgggc tctgatct 18
Claims (3)
1.一种InDel分子标记在筛选具有抗根肿病性状的萝卜中的应用,其特征在于,以萝卜基因组DNA为模板,使用PA05引物对扩增获得所述InDel分子标记,扩增条带为124bp的是抗根肿病萝卜,扩增条带为121bp的是感根肿病萝卜,所述PA05引物对的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述InDel分子标记位于萝卜基因组R08染色体的19.06至23.72Mb区间。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,扩增体系为:共10μL, 50ng/μL DNA 1.0μL,2×Taq Master Mix 5.0μL,10μmol混合引物 0.5μL,ddH2O余量。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,扩增程序为:94℃预变性3min,90℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸45s、35个循环,72℃延伸5min,25℃保存10min。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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