CN113185405A - 改善睡眠的夏枯草有效成分的制备方法及药物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了改善睡眠的夏枯草有效成分的制备方法及药物制剂。该制备方法包括：夏枯草经溶剂提取，得夏枯草提取物；夏枯草提取物过HPD‑400大孔吸附树脂柱富集，洗脱，收集洗脱液，除去溶剂，得夏枯草洗脱物；夏枯草洗脱物上硅胶柱，将硅胶柱自柱头向底部平均切割成10～30段，采用薄层色谱法分别检识各段硅胶段，分别合并含有迷迭香酸或异迷迭香酸苷的硅胶段，甲醇洗脱，洗脱液除去溶剂，干燥，分别得迷迭香酸有效部位和异迷迭香酸苷有效部位；异迷迭香酸苷有效部位和迷迭香酸有效部位溶解，C18反向硅胶柱纯化，分别得异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体。本发明方法兼顾了迷迭香酸单体和异迷迭香酸苷单体的产率和纯度，且步骤少。

Description

改善睡眠的夏枯草有效成分的制备方法及药物制剂
技术领域
本发明涉及一种改善睡眠的夏枯草有效成分的制备方法及药物制剂，具体涉及一种从夏枯草中提取迷迭香酸单体和异迷迭香酸苷单体的制备方法，及含有迷迭香酸单体和异迷迭香酸苷单体的药物制剂。
背景技术
夏枯草(Prunella vulgarls L.)为唇形科植物夏枯草的干燥成熟果穗或全草，性寒，味苦、辛，归肝、胆经，具有清火、明目、散结、消肿之功效，用于目赤肿痛、目珠夜痈、头痛眩晕、痹病、癌瘤和乳腺肿痛，甲状腺肿大，淋巴结结核、乳腺增生、高血压等症。夏枯草的化学成分复杂，主要有黄酮类、三萜皂苷类、苯丙素、甾体、有机酸、挥发油及糖等。CN101507751A公开了夏枯草的乙醇提取物具有明显的镇静、催眠活性。CN109646445A公开了夏枯草中的异迷迭香酸苷和迷迭香酸具有改善睡眠的作用。
由于迷迭香酸在夏枯草中含量较大，因此目前现有技术多采用冷浸法、渗漉法、索氏提取法、超声波法、纤维素酶辅助法等方法提取迷迭香酸。如CN110540503A用纤维素酶辅助法提取夏枯草中迷迭香酸。再如CN108658769A结合响应面法和酶法提取夏枯草中迷迭香酸，提高迷迭香酸的得率，使得夏枯草中迷迭香酸的产率达到17.69mg/g以上。而现有技术对夏枯草中特征性成分异迷迭香酸苷的提取研究则较少，更未有报道以迷迭香酸和异迷迭香酸苷作为改善睡眠药效的物质基础进行提取，这阻碍了迷迭香酸和异迷迭香酸苷研发成临床新药的进度。因此，急需一种以迷迭香酸和异迷迭香酸苷作为指标成分，建立夏枯草改善睡眠作用的有效成分的制备方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的一个目的在于提供一种改善睡眠的夏枯草有效成分的制备方法。本发明以迷迭香酸和异迷迭香酸苷为指标，建立了改善睡眠作用的夏枯草有效成分的制备工艺，所得迷迭香酸单体和异迷迭香酸苷单体的产率高，纯度高，且工艺步骤少。
本发明的另一个目的在于提供一种药物制剂。
本发明采用如下技术方案实现上述目的。
本发明提供一种改善睡眠的夏枯草有效成分的制备方法，包括如下步骤：
1)提取步骤：
取夏枯草，加溶剂提取，得夏枯草提取物；
2)富集步骤：
取夏枯草提取物上HPD-400大孔吸附树脂柱，先用3～5BV水除杂，再用4～7BV的20vol％～50vol％乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，除去溶剂，得夏枯草洗脱物；
3)纯化步骤：
取夏枯草洗脱物，上硅胶柱，以1～2BV体积比为(7～8):(2～3):(0.2～0.3)的二氯甲烷-甲醇-水作为洗脱剂洗脱，挥干洗脱剂，将硅胶柱自柱头向底部平均切割成10～30段，采用薄层色谱法分别检识各段硅胶段，分别合并含有迷迭香酸或异迷迭香酸苷的硅胶段，甲醇洗脱，洗脱液除去溶剂，干燥，分别得迷迭香酸有效部位和异迷迭香酸苷有效部位；
4)进一步纯化步骤：
分别取异迷迭香酸苷有效部位和迷迭香酸有效部位，用20vol％～50vol％甲醇水溶液溶解，作为上样液，取C18反向硅胶柱纯化，分别得异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤1)中，所述溶剂为30vol％～70vol％的乙醇水溶液或水；所述提取的方法选自超声提取、保温提取、煎煮提取、浸泡提取或回流提取。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤1)中，所述提取的方法为80～100℃回流提取2～3次，每次1～2h。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤2)中，所述大孔吸附树脂柱是以95vol％乙醇水溶液浸泡12h后的大孔吸附树脂湿法装柱而得，并用4BV的95vol％乙醇水溶液动态清洗，再用水洗至无醇味；夏枯草提取物的上样重量与大孔吸附树脂柱的树脂体积比为(5～8)g：48mL。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤3)中，所述硅胶的目数为200～300目；硅胶柱的径高比为1:13。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤4)中，所述C18反向硅胶柱是以甲醇浸泡24h后的C18反向硅胶装入直径为2.70cm的色谱柱内，所得径高比为1:5的硅胶柱。
根据本发明的制备方法，优选地，包括如下步骤：
1)提取步骤：
取夏枯草，向其加入16倍量的30vol％乙醇水溶液，100℃回流提取3次，每次1.5h，滤过，合并滤液，减压回收溶剂，蒸干，真空干燥，得夏枯草提取物；
2)富集步骤：
取夏枯草提取物，用水分散使溶液浓度为0.05g/mL，4000r/min离心15min，取上清液作为上样液，上样液过HPD-400大孔吸附树脂柱，夏枯草提取物的上样量与HPD-400大孔吸附树脂柱的树脂体积比为1:6g/mL，HPD-400大孔吸附树脂柱的径高比为1:10，先用3BV水除杂，再用5BV的30vol％乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，蒸干，真空干燥，得夏枯草洗脱物；
3)纯化步骤：
取夏枯草洗脱物，加70vol％乙醇水溶液溶解，与200～300目的硅胶按质量比1:2拌样，干法装柱，所得硅胶柱的径高比为1:13，以1.6BV体积比为7:3:0.3的二氯甲烷-甲醇-水洗脱剂洗脱后，置阴凉避光处挥干洗脱剂，将硅胶柱自柱头向底部平均切割成20段，分别取各段硅胶适量，甲醇洗脱，洗脱液采用薄层色谱法检识，分别合并含有指标成分迷迭香酸或异迷迭香酸苷且杂质少的硅胶段，甲醇洗脱，减压回收溶剂，干燥，分别得迷迭香酸有效部位和异迷迭香酸苷有效部位；
4)进一步纯化步骤：
分别取异迷迭香酸苷有效部位和迷迭香酸有效部位100～200mg，用30vol％甲醇水溶液超声溶解，作为上样液；取甲醇浸泡24h后的C18反向硅胶，装入直径为2.70cm的色谱柱内，得径高比为1:5的硅胶柱；硅胶柱先用甲醇冲洗，再用体积比为40:60的甲醇-水洗脱剂冲洗，待液面降至柱料的上缘，将上样液沿着柱内缓缓加入，待液面降至柱料的上缘，用体积比为40:60的甲醇-水洗脱剂洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，蒸干，真空干燥，分别得异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体。
本发明还提供一种药物制剂，包括上述方法制备得到的改善睡眠的夏枯草有效成分，所述改善睡眠的夏枯草有效成分为异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体，以及药学上可接受的载体。
根据本发明的药物制剂，优选地，所述异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体占药物制剂总重量的0.1％～99.9％，其余为药学上可接受的载体。
根据本发明的制备方法，优选地，所述药物制剂的剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、喷剂、膜剂、膏剂、栓剂、凝胶剂、冻干剂或注射剂。
本发明通过对工艺过程中的提取溶剂、提取溶剂量、提取温度、提取次数、提取时间、提取温度、大孔吸附树脂类型、上样量、除杂体积、洗脱溶剂、洗脱体积等参数进行合理的确定和选择，使制备得到的迷迭香酸单体的产率达到3mg/g以上，异迷迭香酸苷单体的产率达到1mg/g以上。且迷迭香酸单体和异迷迭香酸苷单体的纯度均达到90％以上。可见，本发明方法兼顾了迷迭香酸单体和异迷迭香酸苷单体的品质和产率。
附图说明
图1为实验例4制备的含有异迷迭香酸苷的流分与对照品的薄层色谱图。其中，1是异迷迭香酸苷对照品，2是第一流分。
图2为实验例4制备的含有迷迭香酸的流分与对照品的薄层色谱图。其中，3是迷迭香酸对照品，4是第二流分。
图3为实验例4以甲醇-水系统作为流动相测定异迷迭香酸苷的HPLC图。
图4为实验例4以乙腈-水系统作为流动相测定异迷迭香酸苷的HPLC图。
图5为实验例4以甲醇-水系统作为流动相测定迷迭香酸的HPLC图。
图6为实验例4以乙腈-水系统作为流动相测定迷迭香酸的HPLC图。
图7为本发明改善睡眠的夏枯草有效成分的制备方法流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明中，夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgarls L.的干燥成熟果穗或全草，是符合国家药典标准的药材。
本发明中，异迷迭香酸苷(Salviaflaside)是中药夏枯草中的特征成分，其分子式为C24H26O13，分子量为522.46，CAS号为178895-25-5。
本发明中，迷迭香酸(Rosmarinic acid)是中药夏枯草中的酚酸类化合物，其分子式为C18H16O8，分子量为360.31，CAS号为20283-92-5。
本发明中，百分含量“vol％”是指体积百分含量。
本发明改善睡眠的夏枯草有效成分的制备方法，包括夏枯草提取步骤、富集步骤、纯化步骤和进一步纯化步骤。
<提取步骤>
本发明的夏枯草提取步骤中，取夏枯草，加溶剂提取，得夏枯草提取物。
在本发明中，提取溶剂为30vol％～70vol％的乙醇水溶液或水，优选为30vol％～70vol％的乙醇水溶液，更优选为30vol％的乙醇水溶液。溶剂的用量为夏枯草用量的5～20倍，优选为14～18倍，更优选为15～17倍，再优选为16倍。根据本发明的一个优选的实施方式，采用夏枯草用量16倍的30vol％乙醇水溶液作为提取溶剂。采用上述用量的30vol％乙醇水溶液作为提取溶剂，使夏枯草提取物中迷迭香酸和异迷迭香酸苷被充分提取，提高总提取率。
在本发明中，夏枯草提取物可以采用本领域常规提取方法制备得到，如超声提取、保温提取、煎煮提取、浸泡提取或回流提取，只要能够将夏枯草中的迷迭香酸和异迷迭香酸苷充分提取出来即可，没有特别限制。其中，超声提取、煎煮提取方法适合小批量制备提取液。保温提取、浸泡提取提取率低，耗时长。回流提取可通过调节提取参数达到最佳的提取效果，适合放大工业化生产。因此，本发明优选采用加热回流提取，实现高效且最大化地保留夏枯草中的异迷迭香酸苷和迷迭香酸。优选地，加热回流提取的温度为80～100℃，回流提取2～3次，每次1～2h。更优选地，加热回流提取的温度为100℃，回流提取3次，每次1.5h。根据本发明的一个优选的实施方式，100℃加热回流提取3次，每次1.5h。
在本发明中，夏枯草提取液经滤过，合并滤液，减压回收溶剂后，可进一步采用干燥处理，如蒸干、真空干燥、微波干燥、烘干等，具体干燥参数均可以采用本领域常规参数即可，只要能提高制备夏枯草提取物的效率，且不破坏异迷迭香酸苷和迷迭香酸的结构。根据本发明的一个优选的实施方式，夏枯草提取液经滤过，合并滤液，减压回收溶剂，蒸干，真空干燥，得夏枯草提取物。
采用本发明最优选的方法提取夏枯草中的异迷迭香酸苷和迷迭香酸，提高了有效成分的含量，使异迷迭香酸苷和迷迭香酸的总含量大于2.4％，总提取率大于73％，说明该方法达到了高效提取迷迭香酸和异迷迭香酸苷的目的，且具有高效、可控、稳定的特点。
<富集步骤>
取夏枯草提取物，以溶剂分散后上大孔吸附树脂柱，以富集异迷迭香酸苷和迷迭香酸，得到夏枯草洗脱物。优选地，取夏枯草提取物，用水分散使溶液浓度为0.02～0.08g/mL，离心，取上清液作为上样液，上样液过HPD-400大孔吸附树脂柱，先用3～5BV水除杂，再用4～7BV的20vol％～50vol％乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，除去溶剂，得夏枯草洗脱物。
在本发明中，夏枯草提取物用水分散使溶液浓度为0.02～0.08g/mL，优选为0.03～0.06g/mL，更优选为0.05g/mL。离心的参数为2000～5000r/min离心5～20min，优选为4000r/min离心15min。
在本发明中，大孔吸附树脂柱为预处理后的大孔吸附树脂柱，如利用95vol％乙醇水溶液浸泡12h后的大孔吸附树脂湿法装柱而得，并用4BV的95vol％乙醇水溶液动态清洗，再用水洗至无醇味。大孔吸附树脂HPD-400能够有效富集的异迷迭香酸苷和迷迭香酸，吸附-解吸率高，吸附量大且泄露损失少。夏枯草提取物的上样重量与大孔吸附树脂柱的树脂体积比为(5～8)g:48mL，优选为1g:6mL。采用上述上样重量与树脂体积比，异迷迭香酸苷和迷迭香酸的吸附-解吸率高，吸附量大且泄露损失少。
本发明中，所述HPD-400大孔吸附树脂柱的径高比为1:8～14。径高比过大，即大孔树脂柱过于粗短，则迷迭香酸和异迷迭香酸苷的吸附量较小，容易泄露造成成分损失；径高比过小，即大孔树脂柱过于细长，则冲柱时间过长。本发明中，所述HPD-400大孔吸附树脂柱的径高比优选为1:8～12，更优选为1:10～11，最优选为1:10。
在本发明中，HPD-400大孔吸附树脂柱先用3～5BV水除杂，水洗体积过小不能有效除去杂质，水洗体积过大则造成异迷迭香酸苷和迷迭香酸泄露损失。本发明中，优选地，HPD-400大孔吸附树脂柱先用3BV水除杂。然后，再用4～7BV的20vol％～50vol％乙醇水溶液洗脱，优选为5～6BV的30vol％～50vol％乙醇水溶液洗脱，更优选为5BV的30vol％乙醇水溶液洗脱。当洗脱溶剂中乙醇含量小于30vol％，迷迭香酸和异迷迭香酸苷的含量之和及吸附-解吸率随着洗脱溶剂中乙醇含量的增大而增加；当洗脱溶剂中乙醇含量大于30vol％时，迷迭香酸和异迷迭香酸苷的含量之和及吸附-解吸率而减小。当洗脱溶剂体积小于5BV时，迷迭香酸和异迷迭香酸苷的含量之和及吸附-解吸率随着洗脱体积的增大而增加；当洗脱溶剂体积大于5BV时，迷迭香酸和异迷迭香酸苷的含量之和及吸附-解吸率随着洗脱体积的增大而减小。本发明中，优选地，洗脱剂为30vol％乙醇水溶液，洗脱5BV。
采用本发明的大孔吸附树脂柱及工艺条件对夏枯草提取物进行分离，能够选择性地、有效地富集夏枯草中的异迷迭香酸苷和迷迭香酸这两种化学成分，提高二者的含量及吸附-解吸率，得率高，损失小。
<纯化步骤>
取所得的夏枯草洗脱物，经硅胶柱纯化，得到迷迭香酸有效部位和异迷迭香酸苷有效部位。优选地，取夏枯草洗脱物，加乙醇溶解，与硅胶按质量比1:(1～5)拌样，上硅胶柱，以1～2BV体积比为(7～8):(2～3):(0.2～0.3)的二氯甲烷-甲醇-水作为洗脱剂洗脱，挥干洗脱剂，将硅胶柱自柱头向底部平均切割成10～30段，采用薄层色谱法分别检识各段硅胶段，分别合并含有迷迭香酸或异迷迭香酸苷的硅胶段，甲醇洗脱，洗脱液除去溶剂，干燥，分别得迷迭香酸有效部位和异迷迭香酸苷有效部位。
在本发明中，取夏枯草洗脱物，加乙醇溶解，乙醇的用量不做具体限定，只要能将夏枯草洗脱物溶解即可。乙醇的浓度为50vol％～80vol％，优选为60vol％～70vol％，更优选为70vol％。采用上述浓度范围的乙醇水溶液能将夏枯草洗脱物充分溶解。夏枯草洗脱物经乙醇水溶液溶解后，与硅胶按质量比1:(1～5)拌样，优选为1:(1～3)，更优选为1:2。硅胶的目数为100～500目，优选为200～400目，更优选为200～300目。
本发明中，所述硅胶柱的径高比为1:8～15。硅胶柱的径高比过大，即硅胶柱过于粗短，迷迭香酸、异迷迭香酸苷及杂质成分的分离度不佳，多种成分重合在同一段硅胶柱中，分离难度大；硅胶柱的径高比过小，即硅胶柱过于细长，则迷迭香酸或异迷迭香酸苷的集中度差，扩散和拖尾比较严重，使后续的切割硅胶柱后的集中操作程序造成不利影响。本发明中，硅胶柱的径高比优选为1:9～13，最优选为1:11～14，最优选为1:13。
在本发明中，洗脱剂为体积比(7～8):(2～3):(0.2～0.3)的二氯甲烷-甲醇-水洗脱剂。采用所述洗脱剂，迷迭香酸和异迷迭香酸苷二者分离度好，Rf值较为合适，且杂质少，利于后续进一步纯化分离。本发明中，所述洗脱剂更优选为体积比7:3:0.3的二氯甲烷-甲醇-水。洗脱体积为1～2BV，优选为1.4～1.8BV，更优选为1.6BV。当洗脱体积为1.6BV时，迷迭香酸和异迷迭香酸苷均能够充分洗脱下来，且泄露少，含量和转移率均较高。
在本发明中，将硅胶柱自柱头向底部平均切割成10～30段。切割的段数过少，则有成分重合的硅胶段较多，不利于后续进一步分离；切割的段数过多，则增加大量工作量，影响生产效率。本发明中，优选将硅胶柱平均切割为15～25段，更优选为20段。
<进一步纯化步骤>
分别取所述异迷迭香酸苷有效部位和迷迭香酸有效部位，采用C18反向硅胶柱进行进一步纯化，分别得到异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体。优选地，分别取异迷迭香酸苷有效部位和迷迭香酸有效部位，用20～50vol％甲醇水溶液溶解，作为上样液，取C18反向硅胶柱，用甲醇冲洗，再用体积比为40:60的甲醇-水洗脱剂冲洗，待液面降至柱料的上缘，将上样液沿着柱内缓缓加入，待液面降至柱料的上缘，用体积比为40:60的甲醇-水洗脱剂洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，蒸干，真空干燥，分别得异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体。
本发明中，异迷迭香酸苷有效部位或迷迭香酸有效部位用20vol％～50vol％甲醇水溶液超声溶解，优选为20vol％～40vol％甲醇水溶液，更优选为30vol％甲醇水溶液。采用上述浓度范围的甲醇水溶液能将异迷迭香酸苷有效部位和迷迭香酸有效部位充分溶解。
本发明中，优选地，C18反向硅胶柱是以甲醇浸泡24h后的C18反向硅胶。所述C18反向硅胶柱的径高比为1:4～8，优选为1:5～6，更优选为1:5。
本发明方法提供的迷迭香酸苷有效部位和迷迭香酸有效部位进一步纯化步骤，可以使异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体的纯度达到90％以上，有效排除杂质对所述成分的干扰；同时纯度增加，可减小服用剂量、降低不良反应，为研究其发挥药效的物质基础及作用机制奠定基础，扩大了夏枯草的应用范围和药用价值。
<药物制剂>
本发明还提供一种药物制剂，包括上述方法制备得到的改善睡眠的夏枯草有效成分，所述改善睡眠的夏枯草有效成分为异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体，以及药学上可接受的载体。现有技术已知异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体具有改善睡眠的药效，因此本发明提供的异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体适宜开发成治疗睡眠障碍的药物制剂。
本发明中，异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体占药物制剂总重量的0.1％～99.9％，其余为药学上可接受的载体。药物可接受的载体包括甘露醇、山梨醇、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、盐酸、醋酸、硫酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸镁等。
本发明中，药物制剂的剂型可以是任何可药用的剂型，包括颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、喷剂、膜剂、膏剂、栓剂、凝胶剂、冻干剂或注射剂中的一种。片剂如口腔崩解片、分散片等，胶囊剂如软胶囊剂、硬胶囊剂等，丸剂如滴丸、微丸剂等，膏剂如软膏剂、硬膏剂等。更优选地，药物制剂的剂型为口服剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸剂或冻干剂。口服剂型可含有常用的赋形剂，如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖等。崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和羟基乙酸淀粉钠等。润滑剂包括硬脂酸镁等。湿润剂包括十二烷基硫酸钠等。
实施例1
本实施例的改善睡眠的夏枯草有效成分的制备方法，提取步骤包括：
取夏枯草，向其加入16倍量的30vol％的乙醇水溶液，100℃回流提取3次，每次1.5h，滤过，合并滤液，减压回收溶剂，蒸干，真空干燥，得夏枯草提取物。
实施例2
本实施例的改善睡眠的夏枯草有效成分的制备方法，富集步骤包括：
取实施例1制备的夏枯草提取物，用水分散使溶液浓度为0.05g/mL，4000r/min离心15min，取上清液作为上样液，上样液过HPD-400大孔吸附树脂柱，夏枯草提取物的上样量与HPD-400大孔吸附树脂柱的树脂体积比为1:6g/mL，树脂体积为24mL，HPD-400大孔吸附树脂柱的径高比为1:10，先用3BV水除杂，再用5BV的30vol％乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，蒸干，真空干燥，得夏枯草洗脱物。
上述HPD-400大孔吸附树脂柱是以95vol％乙醇水溶液浸泡12h后的HPD-400大孔吸附树脂湿法装柱而得，并用4BV的95vol％乙醇水溶液动态清洗，再用水洗至无醇味。
实施例3
本实施例的改善睡眠的夏枯草有效成分的制备方法，纯化步骤包括：
取实施例2制备的夏枯草洗脱物，加70vol％乙醇水溶液溶解，与200～300目的硅胶按质量比1:2拌样，干法装柱，所得硅胶柱的径高比为1:13，以1.6BV体积比为7:3:0.3的二氯甲烷-甲醇-水洗脱剂洗脱后，置阴凉避光处挥干洗脱剂，将硅胶柱自柱头向底部平均切割成20段，分别取各段硅胶适量，甲醇洗脱，洗脱液采用薄层色谱法检识，分别合并含有指标成分迷迭香酸或异迷迭香酸苷且杂质少的硅胶段，甲醇洗脱，减压回收溶剂，干燥，分别得迷迭香酸有效部位和异迷迭香酸苷有效部位。
实施例4
本实施例的改善睡眠的夏枯草有效成分的制备方法，进一步纯化步骤包括：
分别取异迷迭香酸苷有效部位100mg和迷迭香酸有效部位200mg，用30vol％甲醇水溶液超声溶解，作为上样液。取甲醇浸泡24h后的C18反向硅胶，装入直径为2.70cm的色谱柱内，得径高比为1:5的硅胶柱。硅胶柱先用甲醇冲洗，再用体积比为40:60的甲醇-水洗脱剂冲洗，待液面降至柱料的上缘，将上样液沿着柱内缓缓加入，待液面降至柱料的上缘，用体积比为40:60的甲醇-水洗脱剂洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，蒸干，真空干燥，分别得异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体。每克夏枯草得1.40mg异迷迭香酸苷单体和3.10mg迷迭香酸单体。
实施例5～7及对比例1
实施例5～7和对比例1分别采用水、50vol％乙醇水溶液、70vol％乙醇水溶液、90vol％乙醇水溶液作为溶剂，其余步骤与实施例1相同。
实施例8～18及对比例2～6
对比例2～5采用的大孔吸附树脂柱的填料为D101、AB-8、HPD-200A、HPD-826，其余步骤与实施例2相同。
实施例8～10及对比例6采用的上样体积为50mL、60mL、70mL、90mL，其余步骤与实施例2相同。
实施例11～12采用的水除杂体积为4BV、5BV，其余步骤与实施例2相同。
实施例13～15采用的洗脱溶剂为20vol％乙醇、40vol％乙醇、50vol％乙醇，其余步骤与实施例2相同。
实施例16～18采用的洗脱溶剂体积为4BV、6BV、7BV，其余步骤与实施例2相同。
对比例7及实施例19～20
对比例7采用的洗脱剂为体积比为8:2:0.2的二氯甲烷-甲醇-水洗脱剂，其余步骤与实施例3相同。
实施例19～20采用的洗脱剂体积分别为1.4BV、1.8BV，其余步骤与实施例3相同。
实验例1
1、实验仪器与试剂
Waters 1525高效液相色谱仪(1525型二元梯度泵，2707自动进样器，2998型PDA检测器，Breeze 2色谱工作站，美国Waters公司)；Sartorius BS 124S型万分之一电子分析天平(北京赛多利斯有限公司)；Sartorius BT 25S型十万分之一电子分析天平(北京赛多利斯有限公司)；DZT-6050型真空干燥箱(上海齐欣科技仪器有限公司)；ZNHW型智能恒温电热套(郑州恒岩仪器有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(上海振捷实验设备有限公司)。
夏枯草药材由安国市盛泰中药饮片有限公司提供，经北京中医药大学张媛教授鉴定为唇形科植物夏枯草夏枯Prunella vulgaris L.的干燥果穗；异迷迭香酸苷对照品(批号：R02M9F60399，上海源叶生物科技有限公司)和迷迭香酸对照品(批号：S03N8H47130，上海源叶生物科技有限公司)，纯度均大于98％；甲醇(色谱纯，Fisher公司)；三氟乙酸(色谱纯，天津市光复精细化工研究所)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；乙醇(分析纯，北京化工试剂厂)；去离子水。
2、实验方法
2.1色谱条件
色谱柱：SunFireTM C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：以甲醇(A)-0.1％三氟乙酸水(B)(42:58)等度洗脱20min；流速：1.0mL/min；检测波长：330nm；柱温：30℃；进样体积：10μL。
2.2对照品溶液制备
分别精密称取迷迭香酸和异迷迭香酸苷对照品适量，置5mL容量瓶中，分别加甲醇溶解并稀释至刻度，制得各对照品母液；精密吸取两种母液适量，加甲醇稀释，制成浓度为0.08200mg/mL、0.03504mg/mL的混合对照品溶液A。
2.3提取工艺考察实验
对实施例1、实施例5～7和对比例1制备的夏枯草提取物进行含量测定，计算总提取率。
2.4提取工艺验证实验
分别取夏枯草药材3份，分别为20g、100g、500g，按照实施例1的方法制备3份夏枯草提取物，进行含量测定，计算总提取率。
3、实验结果
3.1提取工艺考察实验结果
表1提取溶剂考察结果
Figure BDA0003034529200000161
3.2提取工艺验证实验结果
表2三批样品制备结果
Figure BDA0003034529200000162
表3三批验证指标成分含量和总提取率结果
Figure BDA0003034529200000171
可见，对比例1方法提取迷迭香酸和异迷迭香酸苷的含量和总提取率明显低于实施例1。采用本发明的提取工艺制备得到三批样品，指标成分含量之和为2.772％～2.781％，总提取率为89.16％～90.25％，说明该工艺稳定可行，可作为夏枯草改善睡眠有效成分的提取工艺。
实验例2
1、实验仪器与试剂
Waters 1525高效液相色谱系统(1525型二元梯度泵，2998型PDA检测器，2707型自动进样器，Breeze 2色谱工作站，美国Waters公司)；Sartorius BS 124S型万分之一电子分析天平(北京赛多利斯有限公司)；Sartorius BT 25S型十万分之一电子分析天平(北京赛多利斯有限公司)；DZT-6050型真空干燥箱(上海齐欣科技仪器有限公司)；ZNHW型智能恒温电热套(郑州恒岩仪器有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(上海振捷实验设备有限公司)；大孔吸附树脂HPD-400(沧州恩宝吸附材料科技有限公司)；甲醇(色谱纯，Fisher公司)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；三氟乙酸(色谱纯，天津市光复精细化工研究所)；其他试剂均为分析纯。
夏枯草药材购于安国市盛泰药材有限公司，经北京中医药大学张媛教授鉴定为唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥成熟花穗；异迷迭香酸苷对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：R02M9F60399)和迷迭香酸对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：S03N8H47130)，纯度均大于98％。
2、实验方法
2.1色谱条件
同实验例1。
2.2对照品溶液制备
同实验例1。
2.3富集工艺考察实验
对实施例2、实施例8～18和对比例2～6制备的夏枯草洗脱物进行含量测定，计算吸附-解吸率。
2.4富集工艺验证实验
为验证夏枯草大孔吸附树脂富集工艺的重现性，取3份同一批次的夏枯草药材500g，采用实施例2的方法制备3批夏枯草洗脱物，测定迷迭香酸和异迷迭香酸苷的含量，计算吸附-解吸率。
3、实验结果
3.1富集工艺考察实验结果
表4不同类型大孔吸附树脂考察结果
Figure BDA0003034529200000181
表5不同上样量考察结果
Figure BDA0003034529200000191
表6不同除杂体积考察结果
Figure BDA0003034529200000192
表7不同洗脱溶剂考察结果
Figure BDA0003034529200000193
表8不同洗脱溶剂体积考察结果
Figure BDA0003034529200000201
3.2富集工艺验证实验结果
表9工艺验证结果
Figure BDA0003034529200000202
可见，对比例2～6方法富集迷迭香酸和异迷迭香酸苷的含量和吸附-解吸率明显低于实施例2。结果表明，按实施例2的大孔吸附树脂工艺制备所得3批夏枯草洗脱物的迷迭香酸和异迷迭香酸苷的含量及吸附-解吸率均较稳定，故此工艺稳定合理、重复性良好。
实验例3
1、实验仪器与试剂
Waters 1525高效液相色谱系统(1525型二元梯度泵，2998型PDA检测器，2707型自动进样器，Breeze 2色谱工作站，美国Waters公司)；Sartorius BS 124S型万分之一电子分析天平(北京赛多利斯有限公司)；Sartorius BT 25S型十万分之一电子分析天平(北京赛多利斯有限公司)；DZT-6050型真空干燥箱(上海齐欣科技仪器有限公司)；ZNHW型智能恒温电热套(郑州恒岩仪器有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(上海振捷实验设备有限公司)；柱层析硅胶(200～30目)、硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂分厂)；甲醇(色谱纯，Fishe公司)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；其他试剂均为分析纯。
异迷迭香酸苷对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：R02M9F60399)和迷迭香酸对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：S03N8H47130)，纯度均大于98％。
2.1色谱条件
同实验例1。
2.2对照品溶液制备
同实验例1。
2.3纯化工艺考察实验
对实施例3、实施例19～20和对比例7制备的迷迭香酸有效部位和异迷迭香酸苷有效部位进行含量测定，按夏枯草洗脱物计算转移率。
2.4纯化工艺验证实验
2.4.1同一批次药材的硅胶色谱柱工艺验证
分别取同一批次夏枯草药材，采用实施例3的方法分别制备3批夏枯草迷迭香酸和异迷迭香酸苷有效部位，测定迷迭香酸和异迷迭香酸苷的含量，按夏枯草洗脱物计算转移率。
2.4.2不同批次药材的硅胶色谱柱工艺验证
采用实施例3的方法分别制备10批样品，每批次样品测定迷迭香酸和异迷迭香酸苷的含量。
3、实验结果
3.1纯化工艺考察实验结果
表10不同洗脱剂考察结果
Figure BDA0003034529200000221
表11不同洗脱体积考察结果
Figure BDA0003034529200000222
3.2纯化工艺验证实验结果
表12同一批次药材工艺验证结果
Figure BDA0003034529200000223
表13不同批次药材的工艺验证结果
Figure BDA0003034529200000231
可见，对比例7方法纯化迷迭香酸和异迷迭香酸苷的含量和转移率明显低于实施例3。以不同批次的夏枯草药材为原料制备迷迭香酸和异迷迭香酸苷的有效部位，两者含量均达到50％以上，说明此制备工艺稳定可行。
实验例4
1、实验仪器与试剂
Waters 1525高效液相色谱系统(1525型二元梯度泵，2998型PDA检测器，2707型自动进样器，Breeze 2色谱工作站，美国Waters公司)；Sartorius BS 124S型万分之一电子分析天平(北京赛多利斯有限公司)；Sartorius BT 25S型十万分之一电子分析天平(北京赛多利斯有限公司)；DZT-6050型真空干燥箱(上海齐欣科技仪器有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(上海振捷实验设备有限公司)；ODS-A填料(S-50μm，YMC产品)、硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂分厂)；甲醇(色谱纯，Fisher公司)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；其他试剂均为分析纯。
异迷迭香酸苷对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：R02M9F60399)和迷迭香酸对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：S03N8H47130)，纯度均大于98％。
2、实验方法
2.1制备异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体
收集实施例4中用体积比40:60的甲醇-水洗脱剂洗脱的含有异迷迭香酸苷的洗脱液，以10mL作为一个洗脱流分，收集10个流分，作为第一流分。另收集含有迷迭香酸的洗脱液，作为第二流分。两组流分分别采用薄层色谱法和HPLC法进行检测。
2.2薄层色谱法
取各流分适量点于硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(体积比7:3:0.3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰。
2.3高效液相色谱法
色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：(1)甲醇(A)-水系统(0～60min，10％～90％A，梯度洗脱)，流速：1mL/min；检测波长：330nm；进样体积：20μL；柱温：30℃；(2)乙腈(B)-水系统(0～60min，10％～90％B，梯度洗脱)；流速：1mL/min；检测波长：330nm；进样体积：20μL；柱温：30℃。
3、实验结果
薄层色谱法检测结果发现，第一流分与异迷迭香酸苷对照品在相应的位置上显相同颜色的斑点，如图1所示。第二流分与迷迭香酸对照品在相应的位置上显相同颜色的斑点，如图2所示。
高效液相色谱法检测结果发现，在甲醇-水、乙腈-水2种不同系统条件下，经HPLC峰面积归一化法计算，异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体的色谱纯度均大于90％，如图3-6所示。
综上所述，本发明制备迷迭香酸单体和异迷迭香酸苷单体的方法，兼顾了迷迭香酸单体和异迷迭香酸苷单体的产率和纯度，且工序简便，步骤少，耗时短，易于控制，方法稳定，重现性好，易于放大生产。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (10)

1.一种改善睡眠的夏枯草有效成分的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取步骤：
取夏枯草，加溶剂提取，得夏枯草提取物；
2)富集步骤：
取夏枯草提取物上HPD-400大孔吸附树脂柱，先用3～5BV水除杂，再用4～7BV的20vol％～50vol％乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，除去溶剂，得夏枯草洗脱物；
3)纯化步骤：
取夏枯草洗脱物，上硅胶柱，以1～2BV体积比为(7～8):(2～3):(0.2～0.3)的二氯甲烷-甲醇-水作为洗脱剂洗脱，挥干洗脱剂，将硅胶柱自柱头向底部平均切割成10～30段，采用薄层色谱法分别检识各段硅胶段，分别合并含有迷迭香酸或异迷迭香酸苷的硅胶段，甲醇洗脱，洗脱液除去溶剂，干燥，分别得迷迭香酸有效部位和异迷迭香酸苷有效部位；
4)进一步纯化步骤：
分别取异迷迭香酸苷有效部位和迷迭香酸有效部位，用20vol％～50vol％甲醇水溶液溶解，作为上样液，取C18反向硅胶柱纯化，分别得异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述溶剂为30vol％～70vol％的乙醇水溶液或水；所述提取的方法选自超声提取、保温提取、煎煮提取、浸泡提取或回流提取。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述提取的方法为80～100℃回流提取2～3次，每次1～2h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述大孔吸附树脂柱是以95vol％乙醇水溶液浸泡12h后的大孔吸附树脂湿法装柱而得，并用4BV的95vol％乙醇水溶液动态清洗，再用水洗至无醇味；夏枯草提取物的上样重量与大孔吸附树脂柱的树脂体积比为(5～8)g：48mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述硅胶的目数为200～300目；硅胶柱的径高比为1:13。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中，所述C18反向硅胶柱是以甲醇浸泡24h后的C18反向硅胶装入直径为2.70cm的色谱柱内，所得径高比为1:5的硅胶柱。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取步骤：
取夏枯草，向其加入16倍量的30vol％乙醇水溶液，100℃回流提取3次，每次1.5h，滤过，合并滤液，减压回收溶剂，蒸干，真空干燥，得夏枯草提取物；
2)富集步骤：
取夏枯草提取物，用水分散使溶液浓度为0.05g/mL，4000r/min离心15min，取上清液作为上样液，上样液过HPD-400大孔吸附树脂柱，夏枯草提取物的上样量与HPD-400大孔吸附树脂柱的树脂体积比为1:6g/mL，HPD-400大孔吸附树脂柱的径高比为1:10，先用3BV水除杂，再用5BV的30vol％乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，蒸干，真空干燥，得夏枯草洗脱物；
3)纯化步骤：
取夏枯草洗脱物，加70vol％乙醇水溶液溶解，与200～300目的硅胶按质量比1:2拌样，干法装柱，所得硅胶柱的径高比为1:13，以1.6BV体积比为7:3:0.3的二氯甲烷-甲醇-水洗脱剂洗脱后，置阴凉避光处挥干洗脱剂，将硅胶柱自柱头向底部平均切割成20段，分别取各段硅胶适量，甲醇洗脱，洗脱液采用薄层色谱法检识，分别合并含有指标成分迷迭香酸或异迷迭香酸苷且杂质少的硅胶段，甲醇洗脱，减压回收溶剂，干燥，分别得迷迭香酸有效部位和异迷迭香酸苷有效部位；
4)进一步纯化步骤：
分别取异迷迭香酸苷有效部位和迷迭香酸有效部位100～200mg，用30vol％甲醇水溶液超声溶解，作为上样液；取甲醇浸泡24h后的C18反向硅胶，装入直径为2.70cm的色谱柱内，得径高比为1:5的硅胶柱；硅胶柱先用甲醇冲洗，再用体积比为40:60的甲醇-水洗脱剂冲洗，待液面降至柱料的上缘，将上样液沿着柱内缓缓加入，待液面降至柱料的上缘，用体积比为40:60的甲醇-水洗脱剂洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，蒸干，真空干燥，分别得异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体。
8.一种药物制剂，其特征在于，包括权利要求1～7任一项所述方法制备得到的改善睡眠的夏枯草有效成分，所述改善睡眠的夏枯草有效成分为异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体，以及药学上可接受的载体。
9.根据权利要求8所述的药物制剂，其特征在于，所述异迷迭香酸苷单体和迷迭香酸单体占药物制剂总重量的0.1～99.9％，其余为药学上可接受的载体。
10.根据权利要求8所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、喷剂、膜剂、膏剂、栓剂、凝胶剂、冻干剂或注射剂。
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BRPI0809073A2 (pt) * 2007-03-23 2014-09-09 Basf Se Processos para o armazenamento de uma fase de monômero, para a polimerização por radical livre, e para transportar uma fase de monômero líquida.
CN105017345A (zh) * 2015-04-13 2015-11-04 湖南中医药大学 从夏枯草中同时提取四种化合物的方法及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (3)

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Title
孔令义主编: "《中药制药化学》", 30 April 2007, 中国医药科技出版社 *
宋丹丹主编: "《基础化学实验教程第2版》", 30 August 2014, 华中师范大学出版社 *
林丽美等: ""夏枯草中异迷迭香酸苷和迷迭香酸的含量测定"", 《中国药学杂志》 *

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