CN113136397A - 一种提高草原龙胆基因编辑效率的重组载体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高草原龙胆基因编辑效率的重组载体及其制备方法与应用，属于生物技术领域。为了提高草原龙胆基因的编辑效率。提高草原龙胆基因编辑效率的重组载体的构建方法是以pGmU6‑GmCRISPR/Cas9载体为原始载体，以草原龙胆的截短EgU6启动子替换原始载体的U6启动子，连接待编辑的草原龙胆基因的SgRNA序列或者以含有Cas9的表达载体1300为原始载体，按顺序依次连接EgU6启动子、待编辑的草原龙胆基因的SgRNA和gRNAscaffold得到重组片段，将重组片段与含有Cas9的表达载体1300连接。草原龙胆高效基因编辑载体为草原龙胆基因功能的研究及新品种的开发提供重要的技术平台。

Description

一种提高草原龙胆基因编辑效率的重组载体及其制备方法与 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高草原龙胆基因编辑效率的重组载体及其制备方法与应用。

背景技术

草原龙胆(Eustoma grandiflorum)，又名洋桔梗(Lisianthus)，其株态轻盈，花色典雅，多用于鲜切花和盆栽观赏。原产美国内布拉斯加州，后被日本引种，增添了一些花色和花型的变化使得它成为了目前国际上十分流行的鲜切花的种类之一。草原龙胆作为一种观赏花卉以及鲜切花，其花期、花的保鲜度以及抵抗各种胁迫的能力极为重要，尤其是抗旱保水方面，因此相应的基因调控网络的研究显得尤为重要。在早期的植物基因组功能的研究主要是靠自然突变获得的材料，但是这种材料的获得十分困难也十分的稀少。后来随着基因组测序技术的渐渐成熟，科学家在研究基因的生物学功能时采用反向遗传学技术，主要包括T-DNA的插入、RNA介导的基因沉默、RNA干涉以及基于EMS的定向诱导基因组局部突变技术(Tilling技术)，但是这些方法获得的突变往往存在着许多的不足，有的产生的基因的突变是随机的，例如T-DNA的插入；有的方法产生的基因的沉默不具有稳定性，例如RNA干涉，因此新一代研究基因组功能的技术应运而生，其中第三代基因组编辑技术即CRISPR/Cas9技术迅速发展起来，人们可以按照自己的意愿定向的改变物种基因组的序列，能对基因组完成精确的修饰，可对基因产生定点的碱基对的替换、增添或小片段的缺失，为基因功能的研究提供了重要的方法，同时其广泛应用大大促进了科研、农业、基础医学及临床治疗的发展。

发明内容

本发明的目的是为了提高草原龙胆基因的编辑效率，为了解决上述技术问题本发明提供了一种提高草原龙胆基因编辑效率的重组载体，所述重组载体以pGmU6-GmCRISPR/Cas9载体为原始载体，以草原龙胆(Eustoma grandiflorum)的截短EgU6启动子替换原始载体的U6启动子，然后连接待编辑的草原龙胆基因的SgRNA序列，即得到重组载体或者所述重组载体以含有Cas9的表达载体1300为原始载体，然后按顺序依次连接截断EgU6启动子、待编辑的草原龙胆基因的SgRNA和gRNA scaffold序列得到重组片段，最后将重组片段与含有Cas9的表达载体1300连接，即得到重组载体。

进一步地限定，所述重组载体以pGmU6-GmCRISPR/Cas9载体为原始载体，然后将草原龙胆的截短EgU6启动子与待编辑的草原龙胆基因的SgRNA序列连接得到重组序列，将所述重组序列与原始载体进行同源重组反应，即得到重组载体。进一步地限定，所述重组片段的连接方法如下：

1)用HindIII和BbsI将18T-AtU6克隆载体进行双酶切，取2809bp片段进行纯化和回收片段；2)以截短EgU6为模板，设计同源重组引物AT-EgU6-11-BbsI-TY–F的序列如SEQID NO:58所示，AT-EgU6-11-BbsI-TY–R的序列如SEQ ID NO:59所示，通过PCR克隆将酶切位点装在截短EgU6上，胶回收纯化目的片段DNA；3)将步骤1)得到的片段与步骤2)得到片段DNA通过同源重组的反应得到重组的载体18T；4)利用限制性内切酶BbsI对步骤3)得到的重组载体18T进行单酶切，胶回收纯化目的DNA片段；5)将草原龙胆PDS基因的SgRNA与步骤4)得到的DNA片段进行连接得重组载体EgU6-18T，以EgU6-18T为模板，利用引物AT-EgU6-11-TY-F序列如SEQ ID NO:60所示，AT-EgU6-11-TY-R序列如扩增得到的序列如SEQ ID NO:61所示；6)利用HindIII和SalI对1300表达载体进行双酶切，回收纯化后酶切后的1300表达载体与步骤5)得到的序列进行连接，即得到重组载体。进一步地限定，所述截短EgU6启动子的核酸序列如SEQ ID NO:66所示。进一步地限定，所述pGmU6-GmCRISPR/Cas9载体原始载体的U6启动子为GmU6，所述GmU6的核酸序列如SEQ ID NO:67所示。

本发明还提供了上述的重组载体在提高草原龙胆基因编辑效率中的应用。

本发明还提供了上述的重组载体的制备方法，所述重组载体的制备方法的具体步骤如下：(1)设计截短EgU6启动子的引物：EgU6-11-TY-F的序列如SEQ ID NO:29所示和EgU6-11-TY-R的序列如SEQ ID NO:30所示；(2)设计草原龙胆PDS基因的SgRNA：PDS基因的SgRNA的正义核苷酸序列为SEQ ID NO:64所示，所述PDS基因的SgRNA的反义核苷酸序列为SEQ ID NO:65所示；(3)连接EgU6启动子和草原龙胆PDS基因的SgRNA得到重组序列：以克隆得到的截短EgU6启动子序列为模板，利用引物Gm-EgU6-11-TY-F1、Gm-EgU6-11-TY-R1、Gm-EgU6-11-TY-F2和Gm-EgU6-11-TY-R2，利用PCR技术扩增得到重组序列；(4)构建草原龙胆CRISPR/Cas9载体：利用AscI和LguI酶切pGmU6-GmCRISPR/Cas9载体，将步骤(3)得到的重组序列与AscI和LguI酶切后pGmU6-GmCRISPR/Cas9载体进行同源重组反应，即得到重组载体。进一步地限定，步骤3)所述Gm-EgU6-11-TY-F1的序列如SEQ ID NO:46所示，所述Gm-EgU6-11-TY-R1的序列如SEQ ID NO:47所示。进一步地限定，步骤3)所述Gm-EgU6-11-TY-F2的序列如SEQ ID NO:48所示，所述Gm-EgU6-11-TY-R2的序列如SEQ ID NO:49所示。

有益效果：通过比对不同的CRISPR/Cas9载体对草原龙胆PDS基因的编辑效率，结果表明草原龙胆内源的活性强的EgU6启动子构建的CRISPR/Cas9载体编辑能力更强，其中pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体对草原龙胆PDS基因的编辑效率最高，提高对草原龙胆基因的编辑效率，从而获得草原龙胆高效基因编辑载体，为草原龙胆基因功能的研究及新品种的开发提供重要的技术平台。

附图说明

图1为草原龙胆EgU6启动子PCR扩增产物电泳检测，其中，M是DM2000 marker；1，2，3，4，5，6，7，8，9分别代表草原龙胆EgU6启动子EgU6-1，EgU6-2，EgU6-4，EgU6-8，EgU6-10，EgU6-11，EgU6-20，EgU6-17，EgU6-15；

图2为草原龙胆EgU6启动子的序列分析；其中，A是启动子的序列分析；B是拟南芥的pAtU6-AtCRISPR/Cas9载体图；

图3为构建EgU6启动子的Luc-RLuc双元载体酶切和PCR电泳检测；其中，M是DM10000marker；A是Luc-RLuc是双元载体经过XhoI酶切后电泳图；B是Luc-RLuc双元载体载体图；

图4为克隆得到的草原龙胆EgU6启动子截短的电泳图；其中，M是DM2000 marker；1-9分别代表截短后的草原龙胆的EgU6启动子EgU6-1，EgU6-2，EgU6-4，EgU6-8，EgU6-10，EgU6-11，EgU6-15，EgU6-17和EgU6-20DNA片段；

图5为草原龙胆EgU6启动子的双荧光素酶报告载体示意图；

图6为双荧光素酶报告系统检测草原龙胆EgU6启动子活性结果；其中，横坐标是LUC/RLUC的比值代表启动子活性的强弱，纵坐标是不同的EgU6启动子；

图7为草原龙胆PDS基因PCR电泳检测；其中，M是marker；

图8为草原龙胆PDS基因的靶向位点选择示意图；其中，A是靶位点图PDS基因；B是大豆的pGmU6-GmCRISPR/Cas9载体载体图；

图9为构建编辑草原龙胆PDS基因的pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体PCR和酶切电泳结果；其中A是大豆CRISPR/Cas9载体经LguI酶切电泳图，M是DM10000 marker；B是构建对草原龙胆PDS基因编辑的CRISPR/Cas9载体的单克隆菌液PCR鉴定，M是DM2000 marker，1-5是单克隆鉴定；

图10为以大豆CRISPR/Cas9载体为基本骨架构建pEgU6-2-PDS-GmCRISPR/Cas9、pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体的PCR和酶切电泳结果；其中A和B是草原龙胆EgU6-2和EgU6-11启动子用同源重组引物PCR电泳图，M是DM2000 marker；C是大豆CRISPR/Cas9载体用限制性内切酶AscI和LguI双酶切电泳图，M是DM10000 marker；

图11为架构建草原龙胆CRISPR/Cas9载体结构示意图，其中，A是以大豆CRISPR/Cas9载体为基本骨架构建草原龙胆CRISPR/Cas9载体结构示意图；B是以拟南芥CRISPR/Cas9载体为基本骨架构建草原龙胆CRISPR/Cas9载体结构示意图；

图12为构建编辑草原龙胆PDS基因的pAtU6-PDS-AtCRISPR/Cas9载体PCR和酶切电泳结果；其中，A是AtU6克隆载体BbsI酶切电泳图，M是DM10000 marker；B是利用同源重组引物以构建成功的克隆载体为模板PCR电泳图，M是DM2000 marker；C是用HindIII和SalI双酶切表达载体1300酶切电泳图，M是DM10000 marker；D是构建的对草原龙胆PDS基因编辑的CRISPR/Cas9载体的单克隆鉴定，M是DM2000 marker，1-6是单克隆鉴定；

图13为以拟南芥CRISPR/Cas9载体为基本骨架构建pEgU6-11-PDS-AtCRISPR/Cas9载体的PCR和酶切电泳结果；其中A是AtU6克隆载体HindIII和BbsI双酶切电泳图，M是DM10000 marker；B是利用同源重组引物以EgU6-11为模板PCR电泳图，M是DM2000 marker；C是EgU6-11克隆载体BbsI单酶切电泳图，M是DM10000 marker；D是以构建成功的EgU6-11克隆载体为模板PCR电泳图，M是DM2000 marker；E是1300表达载体HindIII和SalI双酶切电泳图，M是DM10000 marker；

图14为载体图，其中，A是拟南芥的18T-AtU6克隆载体，B是含有Cas9的拟南芥的1300表达载体；C是35S-GFP-1301载体图；

图15为PEG诱导35S-GFP-1301表达载体质粒于草原龙胆原生质体瞬时表达；其中，A是草原龙胆原生质体图，B是转35S-GFP-1301质粒草原龙胆原生质体图；

图16为不同CRISPR/Cas9载体质粒瞬转草原龙胆原生质体后基因组DNA酶切后PCR电泳图；其中，A是Gm-1、Eg-1分别代表转pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体孵育24h原生质体DNA酶切后PCR；B是Gm-2、Eg-2分别代表转pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体孵育48h原生质体DNA酶切后PCR；C是Gm-3、Eg-3分别代表转pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体孵育72h原生质体DNA酶切后PCR；D是阴性：未转CRISPR载体的原生质体DNA酶切后PCR；阳性是未转CRISPR载体的原生质体未酶切直接PCR；At是转pAtU6-PDS-AtCRISPR/Cas9载体的原生质体DNA酶切后PCR；At-1是转pEgU6-11-PDS-AtCRISPR/Cas9载体的原生质体DNA酶切后PCR；PSC是转pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体的原生质体DNA酶切后PCR；PSC-1是转pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体的原生质体DNA酶切后PCR；

图17为草原龙胆原生质体中分别转pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体编辑的PDS基因突变位点检测；其中，A，B是草原龙胆原生质体中分别转pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体孵育24h编辑的PDS基因突变位点检测；C，D是草原龙胆原生质体中分别转pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体孵育48h编辑的PDS基因突变位点检测；E，F是草原龙胆原生质体中分别转pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体孵育72h编辑的PDS基因突变位点检测；

图18为转pEgU6-2-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体的草原龙胆PDS基因靶位点测序峰图；其中，A是未转任何载体的空草原龙胆原生质体DNAPCR测序峰图；B是转pEgU6-2-PDS-GmCRISPR/Cas9载体的草原龙胆原生质体DNA PCR测序峰图；C是转pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体的草原龙胆原生质体DNAPCR测序峰图；

图19为草原龙胆原生质体中分别转pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体编辑的PDS基因突变位点检测；其中，A是草原龙胆原生质体中转pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体编辑的PDS基因突变位点检测；B是草原龙胆原生质体中转pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体编辑的PDS基因突变位点检测；

图20为草原龙胆原生质体中分别转pAtU6-PDS-AtCRISPR/Cas9载体、pEgU6-11-PDS-AtCRISPR/Cas9载体编辑的PDS基因突变位点检测；其中，A是草原龙胆原生质体中转pAtU6-PDS-AtCRISPR/Cas9载体编辑的PDS基因突变位点检测；B是草原龙胆原生质体中转pEgU6-11-PDS-AtCRISPR/Cas9载体编辑的PDS基因突变位点检测。

具体实施例

实施例1.

一、1.草原龙胆EgU6启动子的克隆：草原龙胆基因组数据库筛选出EgU6基因(Genebank ID:DRX056156和DRX056155)，在其保守结构域上游设计PCR扩增引物(表1所示)，以用CTAB法提取的草原龙胆的DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应的体系如(25μL的高保真酶、2μL的Primer-F、2μL的Primer-R、1μL的DNA和20μL的H₂O)，PCR的反应条件如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min 30s，35cycles；72℃7min；4℃∞。通过PCR扩增得到9个不同的草原龙胆EgU6的启动子序列，获得的启动子分别命名为EgU6-1(引物用EgU6-1-F，序列如SEQID NO:1)和EgU6-1-R序列如SEQ ID NO:2)、EgU6-2(引物用EgU6-2-F，序列如SEQ ID NO:3)和EgU6-2-R序列如SEQ ID NO:4)、EgU6-4(引物用EgU6-4-F，序列如SEQ ID NO:5)和EgU6-4-R序列如SEQ ID NO:6)、EgU6-8(引物用EgU6-8-F，序列如SEQ ID NO:7)和EgU6-8-R序列如SEQ ID NO:8)、EgU6-10(引物用EgU6-10-F，序列如SEQ ID NO:9和EgU6-10-R序列如SEQID NO:10)、EgU6-11(引物用EgU6-11-F，序列如SEQ ID NO:11)和EgU6-11-R序列如SEQ IDNO:12)、EgU6-15(引物用EgU6-15-F，序列如SEQ ID NO:13)和EgU6-15-R序列如SEQ ID NO:14)、EgU6-17(引物用EgU6-17-F，序列如SEQ ID NO:15)和EgU6-17-R序列如SEQ ID NO:16)和EgU6-20(引物用EgU6-20-F，序列如SEQ ID NO:17)和EgU6-20-R序列如SEQ ID NO:18)。用1％琼脂糖凝胶电泳检测获得正确的目的条带后(图1)，所显示目标条带大小与预期结果一致，用Easy Pure Quick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒回收并纯化目的DNA片段：回收完成后检测DNA片段的浓度，放-40℃冰箱储存备用。

2.EgU6启动子的序列分析：运用DNAMAN软件进行多序列比对，将克隆得到的9个草原龙胆EgU6启动子中具有转录功能的必要元件进行分析。发现草原龙胆的EgU6启动子的序列也比较保守，有些特异但都含有转录所需的必要的功能元件USE和TATAbox，并且两个元件的位置也相对固定(结果如图2中的A所示)。

3.草原龙胆EgU6启动子双荧光素酶报告载体的构建：pLuc-RLuc双元载体质粒的提取：取实验室已经构建的pLuc-RLuc双元载体的菌液摇菌，37℃，180rpm摇12-16h，按以下步骤进行质粒的提取：1)取1mL菌液于1.5mL的离心管中，13000g离心1min，弃上清，多次重复富集6-7次菌体。2)取试剂盒中Resuspension SolutionI 250μL于1.5mL管中，用振荡器将菌体沉淀全部震荡起来。3)向管中加入250μL Lysis SolutionII，上下颠倒4-6次混匀。4)加入350μLNeutralization SolutionIII，并立即轻柔颠倒4-6次混匀，此时管中出现絮状沉淀。5)13000g离心10min。6)将上清取到新的柱上，静止2min，13000g离心1min后弃上清。7)向柱中加入500μLWashingbuffer，13000g离心1min，重复2次。8)空离13000g离心2min，将柱放于新的1.5mL离心管中晾干。9)向柱中心加入30μL ddH2O，静置5min，13000g离心2min，检测浓度后放于-40℃冰箱保存，备用。

pLuc-RLuc双元载体的酶切：构建草原龙胆EgU6启动子双荧光素酶报告载体，需要将草原龙胆的EgU6启动子连接到Luc基因前面，本试验采用同源重组的方法进行连接，选取单酶切位点XhoI对载体进行酶切，酶切体系(4μg的vecter、2μL的XhoI、5μL的Cutsmart(10x)补充ddH₂O到50μL)。酶切后的产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带的大小与预期结果一致(图3中的A)，回收纯化载体DNA片段。回收完成后并检测回收目的DNA片段的浓度，放-40℃冰箱储存备用。

4.草原龙胆EgU6启动子的截短：通过对克隆的9个草原龙胆EgU6启动子序列中具有转录功能的必要元件进行分析，利用CE design软件设计同源重组的PCR扩增引物，截短草原龙胆EgU6启动子的同源重组引物序列：EgU6-1-TY-F序列如SEQ ID NO:19所示，EgU6-1-TY-R序列如SEQ ID NO:20所示；EgU6-2-TY-F序列如SEQ ID NO:21所示，EgU6-2-TY-R序列如SEQ ID NO:22所示；EgU6-4-TY-F序列如SEQ ID NO:23所示，EgU6-4-TY-R序列如SEQID NO:24所示；EgU6-8-TY-F序列如SEQ ID NO:25所示，EgU6-8-TY-R序列如SEQ ID NO:26所示；EgU6-10-TY-F序列如SEQ ID NO:27所示，EgU6-10-TY-R序列如SEQ ID NO:28所示；EgU6-11-TY-F序列如SEQ ID NO:29所示，EgU6-11-TY-R序列如SEQ ID NO:30所示；EgU6-15-TY-F序列如SEQ ID NO:31所示，EgU6-15-TY-R序列如SEQ ID NO:32所示；EgU6-17-TY-F序列如SEQ ID NO:33所示，EgU6-17-TY-R序列如SEQ ID NO:34所示；EgU6-20-TY-F序列如SEQ ID NO:35所示，EgU6-20-TY-R序列如SEQ ID NO:36所示；

从转录起始位点向上游将启动子截短为350bp，其中包含USE序列和TATABOX两个功能元件。以已经克隆出来的9个草原龙胆的EgU6启动子为模板，进行PCR克隆，将草原龙胆EgU6启动子截短，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带正确(图4)切取条带大小正确的目的条带回收。

5.pLuc-RLuc双荧光素酶重组载体的构建(载体图如图3中的B)：将以上回收得到的9个DNA产物与pLuc-RLuc载体进行连接，连接的反应体系(3μL的Luc-RLuc Vecter、1μL的EgU6DNA、1μL的重组酶、2μL的Buffer(5x)和3μL的ddH₂O)：按上面体系加样，放37℃烘箱连接30min。

转化大肠杆菌后挑取阳性克隆的PCR检测与测序：随机挑取单菌落于20μL ddH₂O中，取7μL作为模板进行菌液PCR的检测，反应体系(7.5μL的ExTaq、0.6μL的EgU6-TY-F、0.6μL的EgU6-TY-R和6.3μL的Sample)。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，将条带大小正确的对应的菌液加入含有1mLLB液体培养基(50μg·mL-1，Amp+)的1.5mL的管中,37℃200rpm的揺箱中摇12-16h，电泳检测后将条带大小正确的菌液送测序，测序结果比对正确(图5)，草原龙胆EgU6启动子的Luc-RLuc双元载体构建成功。

6.草原龙胆原生质体的制备以及Luc-RLuc双元载体在原生质体中的瞬时表达

草原龙胆原生质体的分离：(1)CPW溶液：称取CaCl₂·2H₂O 1.48g，KNO₃101 mg，MgSO₄·7H₂O246mg，KH₂PO₄27.2 mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，KI 0.16mg于1L锥形瓶中，灭菌水定容至1L，无菌操净台中抽滤除菌，4℃保存。(2)酶液配制：用分析天平称量纤维素酶0.15g，离析酶0.1g，甘露醇1.6395g于50mL管内加入CPW溶液定容至10mL。(3)放入55℃水浴锅中10min。(4)水浴后加入100μL CaCl2，BSA若干，混匀后倒入小平皿中。(5)取野生型草原龙胆的组培苗，选取第2，3，4对叶片，撕去下表皮，放入酶液中，用锡纸包裹避光放置12-16h。

Luc-RLuc双元载体在原生质体中的瞬时表达：(1)WI溶液：取1mL MES，500μL KCl，甘露醇9.1085g加蒸馏水定容至50mL，调PH5.75-5.8，过滤除菌，4℃保存。WS溶液：取500μLMES，125μLKCl，7.7mLNaCl，6.25mL CaCl2加蒸馏水定容至50mL，调PH5.75-5.8，过滤除菌，4℃保存。MMG溶液：取1mLMES，375μLMgCl2，甘露醇8.1975g加蒸馏水定容至50mL，调PH5.75-5.8，过滤除菌，4℃保存。PEG溶液：由于PEG4000难溶所以需要提前1h配制，30％PEG4000诱导效率最高，PEG 4000称取1.5g，500μL CaCl2，0.8198g的甘露醇加水至5mL，上下颠倒混匀。(2)用100目的尼龙膜将酶解的原生质体过滤。(3)过滤后的酶液150g离心2min，弃上清。(4)用WS将沉淀稀释至2x10⁵个/mL，冰上沉降30min。(5)尽量除去WS，不要接触原生质体，用MMG溶解沉淀至2x10⁵个/mL。(6)取2mL的离心管，共9种质粒，每个做5个技术重复，分别加入100μL的原生质体，10μL的连接草原龙胆EgU6启动子的Luc-RLuc双元载体的质粒(1μg/μL)，110μL PEG于管中，轻柔混合，室温避光15min。(7)分别加入440μLWS，100g离心1min，弃上清。(8)向每管中加入1mLWI，上下轻轻混匀，将其转移到培养皿中，避光孵育21h左右。

双荧光素酶检测EgU6启动子的活性：检测的步骤如下：(1)从培养皿中缓慢吸出孵育21h的原生质体于2mL管中，100g离心1min，弃上清。(2)将试剂盒中5x的裂解液稀释成1x。(3)向每管中加入50μL 1x裂解液，于冰上静置5min，重悬原生质体。(4)12000rpm离心5min，取30μL上清于新的1.5mL离心管中。(5)向340μL的SGP中加入6.5μL的buffer混匀，将LAS和SGP室温平衡15min。(6)取新的AXYGEN 1.5mL的离心管加入50μLLAS，20μL上清，将其放入Promega GloMax 20/20发光检测仪中测出Luc值；加入50μL SGP测出RLuc值及Luc/RLuc的比值。

草原龙胆EgU6启动子的活性检测：将9个草原龙胆EgU6启动子的Luc-RLuc双元载体的质粒分别用PEG诱导转入草原龙胆的原生质体，孵育21h左右进行草原龙胆不同启动子活性的检测。通过Luc与RLuc的比值来比较出活性最强的EgU6，RLuc作为内参，来消除细胞数量或者转染效率的差异。通过双荧光素酶检测数据分析可以看出这9个草原龙胆的EgU6启动子均具有转录活性但EgU6-11的启动子活性最强(图6)。启动子太长有可能是其上游有抑制转录活性的功能元件。

二、构建草原龙胆CRISPR/Cas9载体

根据草原龙胆PDS基因的CDS序列(序列如SEQ ID NO:70)，设计引物PDS-CDS-F/R(PDS-CDS-F序列如SEQ ID NO:37，PDS-CDS-R序列如SEQ ID NO:38)，分别以草原龙胆的两个品种的cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系(10μL的高保真酶、0.8μL的PDS-CDS-F、0.8μL的PDS-CDS-R、1μL的cDNA和7.4μL的ddH₂O)，反应条件如步骤一中2的PCR条件。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，单一条带大小1749bp(图7)检测目的条带大小正确将PCR产物送公司测序。Eg49和Eg2003为草原龙胆的两个品种，为了比较草原龙胆不同品种靶位点处是否有核苷酸多态性，排除CRISPR/Cas9载体对不同品种基因的编辑效率差异因素。

内源基因靶位点的选择：SgRNA对靶位点的识别取决于对PAM序列的识别，一般我们取PAM上游20bp作为靶位点的序列，但是靶位点的选择要考虑到SgRNA构建的原则以及脱靶等因素，本试验根据CRISPR-GE(Genome Editing)-LiuYG Lab网站提供的SgRNA的位点同时结合SgRNA设计的原则进行靶位点的选择。内源基因靶位点选择的位置如(图8中的A)所示。草原龙胆PDS基因的SgRNA的设计：利用在拟南芥、大豆中可成功获得突变体的CRISPR/Cas9编辑载体进行编辑草原龙胆内源基因，未能获得突变体植株，所以本试验共针对这两个CRISPR/Cas9系统进行改造。大豆的CRISPR/Cas9载体中SgRNA的序列直接设计在引物中；

拟南芥的CRISPR/Cas9载体中sgRNA的设计：SgRNA有义的寡核苷酸5’端添加特定的酶切接头(表1)，合成相应的引导寡核苷酸序列，然后将引物退火形成双链37℃，30min；95℃，5min；之后以每分钟降5℃的速度降至25℃。

表1 SgRNA引导寡核苷酸的设计

以大豆GmCRISPR/Cas9载体为骨架：

1.构建大豆GmCRISPR/Cas9载体编辑草原龙胆PDS基因：

(1)SgRNA引导的寡核苷酸的设计，SgRNA sequence序列如SEQ ID NO:64和SEQ IDNO:65Guide oligos:Sense:5'-ATTG(N)20-3'；Antisense：5'-AAC(N)20C-3'。

(2)取大豆CRISPR/Cas9载体(pGmU6-GmCRISPR/Cas9载体图如图8中的B)冻存的菌液，摇菌(Kana⁺，50μg·mL^-1)，提质粒，测浓度。用限制性内切酶LguI对大豆CRISPR/Cas9载体的质粒进行酶切，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，会产生单一条带(图9中的A)条带大小为15314bp，回收纯化DNA片段。

(3)SgRNA引导的寡核苷酸的二聚化：取设计的SgRNA引导的寡核苷酸正义链和反义链各5μL于PCR管中，PCR程序设定为：37℃，5min；95℃降温降到25℃，每秒降低0.2℃。

(4)用T4连接酶将酶切回收的大豆CRISPR/Cas9载体和上述设计好的SgRNA进行连接，连接的反应体系如(1μL的大豆CRISPR/Cas9载的片段、1μL的二聚化的产物、1μL的T4DNALigase、1μL的T4DNALigaseBuffer(10×)，补ddH₂O至10μL)。按上表加样后25℃连接30min，然后进行转化，转化成功后，设计引物GmU6-F/R(GmU6-F如SEQ ID NO:39)，GmU6-R如SEQ ID NO:40)，挑单克隆进行菌液PCR鉴定(图9中的B)，成功的利用了大豆的CRISPR/Cas9载体构建了对草原龙胆PDS基因编辑的CRISPR/Cas9载体(pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9)。

2.以大豆CRISPR/Cas9载体为基本骨架构建草原龙胆CRISPR/Cas9载体：

(1)取大豆CRISPR/Cas9载体冻存的菌液，摇菌(Kana⁺，50μg·mL^-1)，提质粒后测浓度，用AscI和LguI两个酶切位点对载体进行酶切，酶切体系如(1.5μL的AscI、1.5μL的LguI、5μL的Buffer(10x)、2μg的载体，补H₂O至50μL)，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，正确的电泳结果会有两个目的条带(图10中的A和图10中的B)，分别为14961bp和376bp，将条带大的目的条带切取用胶回收试剂盒回收纯化目的DNA。然后将大豆CRISPR/Cas9载体用限制性内切酶AscI和LguI双酶切，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(图10中的C)。

(2)选择克隆出的截短的活性最强的草原龙胆EgU6-11启动子和活性相对较强的草原龙胆EgU6-2启动子，设计引物Gm-EgU6-2-TY-F₁/R₁(F₂/R₂)(Gm-EgU6-2-TY-F1如SEQ IDNO:46，Gm-EgU6-2-TY-R1如SEQ ID NO:47，Gm-EgU6-2-TY-F2如SEQ ID NO:48，Gm-EgU6-2-TY-R2如SEQ ID NO:49)，Gm-EgU6-11-TY-F₁/R₁(F₂/R₂)(Gm-EgU6-11-TY-F1如SEQ ID NO:50，Gm-EgU6-11-TY-R1如SEQ ID NO:51，Gm-EgU6-11-TY-F2如SEQ ID NO:52，Gm-EgU6-11-TY-R2如SEQ ID NO:53)，将SgRNA设计在3’端引物里面，即U6启动子后面加上转录起始位点和SgRNA序列。分别以截短的EgU6-2、EgU6-11启动子为模板进行PCR克隆，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带大小正确，准确切取目的条带然后用胶回收试剂盒回收纯化目的DNA。

(3)将PCR克隆的草原龙胆EgU6-2、EgU6-11启动子纯化的目的DNA片段与酶切回收的大豆CRISPR/Cas9载体采用同源重组的方法进行连接转化，连接转化长出单菌落后，在EgU6-2启动子和EgU6-11启动子上设计检测引物Gm-EgU6-2-cexu-F/R(Gm-EgU6-2-cexu-F如SEQ ID NO:54，Gm-EgU6-2-cexu-R如SEQ ID NO:55)，Gm-EgU6-11-cexu-F/R(Gm-EgU6-11-cexu-F如SEQ ID NO:56，Gm-EgU6-11-cexu-R如SEQ ID NO:57)，挑单克隆先进行菌液PCR电泳检测，将条带大小正确的单克隆菌液送测序，测序正确的菌种保存-80℃冰箱，以大豆CRISPR/Cas9载体为基本骨架构建的草原龙胆EgU6-2，EgU6-11的CRISPR/Cas9载体构建完成(pEgU6-2-PDS-GmCRISPR/Cas9，pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9)，载体图如图11中的A所示。

以拟南芥GmCRISPR/Cas9载体为骨架：

1.构建拟南芥AtCRISPR/Cas9载体编辑草原龙胆PDS基因：(1)取18T-AtU6(载体图如图14中的A所示)克隆载体的菌液，摇菌(Amp⁺，50μg·mL^-1)提质粒后测浓度，用BbsI将18T-AtU6克隆载体的质粒进行单酶切，用1％琼脂糖凝胶电泳检测(图12中的A)，会有单条带产生，目的条带的大小为3103bp，将目的条带胶回收纯化目的片段DNA。

(2)用T4连接酶将克隆载体目的片段DNA和表1设计好的SgRNA引导的寡核苷酸接头二聚化的产物进行连接、转化成功后，挑单克隆，上游引物用M13F，下游引物用设计的特异性引物18T-AtU6-JC-R(序列如SEQ ID NO:43)进行菌液PCR鉴定。

(3)取上步构建好的克隆载体和表达载体1300分别提质粒，设计同源重组引物AtU6-SgRNA-TY-F/R(AtU6-SgRNA-TY-F如SEQ ID NO:41，AtU6-SgRNA-TY-R如SEQ ID NO:42)，以克隆载体的质粒为模板，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(图12中的B)，胶回收目的片段，用HindIII和SalI对1300表达载体(载体图如图14中的B)进行双酶切，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(图12中的C)，会有两条带大小分别为17371bp和1479bp，将大片段的产物胶回收纯化。

(4)采用同源重组的方法将步骤(2)构建好的克隆载体与步骤(3)回收的表达载体1300进行连接转化，连接转化成功后挑单克隆用设计好的引物1300-F如SEQ ID NO:44和CDC45-R如SEQ ID NO:44，做菌液PCR，PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测(图12中的D)，编辑草原龙胆PDS基因的拟南芥的CRISPR/Cas9载体构建完成(pAtU6-PDS-AtCRISPR/Cas9)。

2.以拟南芥CRISPR/Cas9载体为基本骨架构建草原龙胆CRISPR/Cas9载体：

(1)取18T-AtU6克隆载体的菌液，摇菌提质粒后测浓度。用HindIII和BbsI将18T-AtU6克隆载体进行双酶切，用1％琼脂糖凝胶电泳检测(图13中的A)，会有两条带产生，大小分别为2809bp和316bp。将大的目的条带胶回收纯化目的片段DNA。

(2)以截短的EgU6-11为模板，设计同源重组引物AT-EgU6-11-BbsI-TY-F/R(AT-EgU6-11-BbsI-TY-F如SEQ ID NO:58，AT-EgU6-11-BbsI-TY-R如SEQ ID NO:59)，同时在引物的3’端加上BbsI两个酶切位点，通过PCR克隆将酶切位点装在EgU6-11上，胶回收纯化目的片段DNA(图13中的B)。

(3)采用同源重组的方法将目的片段连接到克隆载体18T-AtU6，挑单菌落PCR克隆电泳检测，取上步新构的克隆载体的菌液，摇菌提质粒，用限制性内切酶BbsI对克隆载体进行单酶切，用1％琼脂糖凝胶电泳检测(图13中的C)，胶回收纯化目的DNA片段。

(4)将表1中设计好的SgRNA引导的寡核苷酸接头二聚化后和步骤(3)纯化的克隆载体DNA片段用T4连接酶连接，连接的反应体系如(1μL的T4DNALigase、1μL的T4DNALigaseBuffer(10×)、2μL的SgRNA寡核苷酸接头、1μL的克隆载体，补H₂O至10μL)，加样后25℃连接30min，转化后挑单克隆进行菌液PCR电泳检测(图13中的D)。

(5)取表达载体1300的菌液(Kana⁺，50μg·mL^-1)，摇菌提质粒，用HindIII和SalI对1300表达载体进行双酶切，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(图13中的E)，将大片段的产物胶回收。

(6)将克隆载体上的EgU6启动子、SgRNA、gRNA scaffold这部分连接到表达载体1300上，设计引物AT-EgU6-11-TY-F/R(AT-EgU6-11-TY-F如SEQ ID NO:60，AT-EgU6-11-TY-R如SEQ ID NO:61)，以克隆载体EgU6-18T为模板，PCR克隆扩增目的片段，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，将正确的目的条带切取用胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段。

(7)采用同源重组的方法将(6)的目的DNA片段和表达载体1300进行连接，连接后挑单克隆做菌液PCR，PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，将正确的目的条带对应的菌液送测序，测序正确的菌液与40％甘油1：1混合冻存于-80℃冰箱，以拟南芥CRISPR/Cas9载体为基本骨架构建了草原龙胆EgU6-11的CRISPR/Cas9载体(pEgU6-11-PDS-AtCRISPR/Cas9，载体图如图11中的B所示。

利用以下实验验证实验效果：

步骤一：CRISPR/Cas9载体在草原龙胆原生质体中的瞬时转化：取新鲜的草原龙胆的叶片，制备草原龙胆的原生质体，方法按步骤一中的7，制备草原龙胆的原生质体，然后转CRISPR/Cas9载体的质粒，具体方法如下：(1)用200目的尼龙膜轻缓过滤酶解的原生质体。(2)过滤后的酶液150g离心2min，吸去上清。(3)用WS溶液将沉淀稀释至2x10⁵个/mL，冰上静置30min。(4)尽量除去WS溶液，不要吸到原生质体，用MMG溶解沉淀至2x10⁵个/mL。(5)取6个2mL的离心管，分别加入100μL的原生质体，每三个分别加入10μL pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体的质粒(1μg/μL)，另外三个对照组分别加入10μL pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体的质粒，分别加入110μL PEG于管中，轻柔混合，室温避光15min。(6)分别加入440μL WS，100g离心1min，去上清。(7)向每管中加入1mL WI，上下轻轻混匀，将其转移到培养皿中，避光孵育24h，48h，72h。(8)将孵育不同时间的原生质体分别取样镜检。(9)将孵育不同时间的原生质体100g离心1min，弃上清，-40℃冰箱冻存。

步骤二：CRISPR/Cas9载体、35S-GFP-1301载体在草原龙胆原生质体中的瞬时转化：取组培室中新鲜的草原龙胆的叶片，制备草原龙胆的原生质体，制备好草原龙胆的原生质体，然后分别共转35S-GFP-1301质粒和不同的CRISPR/Cas9载体的质粒，具体方法如下：筛选原生质体的步骤参照上述步骤一，(1)取3个2mL的离心管，分别加入100μL的原生质体，然后每个离心管单独加入10μL35S-GFP-1301质粒和10μL pEgU6-2-PDS-GmCRISPR/Cas9载体的质粒(1μg/μL)，10μL 35S-GFP-1301质粒和10μL pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体的质粒(1μg/μL)，对照组加10μL 35S-GFP-1301质粒和10μL pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体的质粒，分别加入120μL PEG于管中，轻柔混合，室温避光15min。(2)分别加入480μL WS，100g离心1min，弃上清。(3)向每管中加入1mL WI，上下轻轻混匀，将其转移到培养皿中，避光孵育48h。(4)将孵育不同时间的原生质体分别取样镜检，用血细胞计数板统计含有GFP荧光的原生质体的数量和总的原生质体的数量。(5)将剩下的孵育不同时间的原生质体100g离心1min，弃上清，-40℃冰箱冻存：pEgU6-11-PDS-AtCRISPR/Cas9载体、pAtU6-PDS-AtCRISPR/Cas9载体按照同样的方法瞬转，具体步骤方法如上。拟南芥的pAtU6-AtCRISPR/Cas9载体，载体图如图2中的B所示。

检验质粒在PEG诱导下的转染效率结果：草原龙胆原生质体在自然光下20x倍镜成像如(图15中的A)，通过借助35S-GFP-1301表达载体(载体图如图14中的C所示)中GFP绿色荧光蛋白，在40x倍镜荧光显微镜下能够发出绿光(图15中的B)，这样我们就能用血细胞计数板统计总的原生质体数和转染GFP绿色荧光蛋白的原生质体数。采用以下的计算方法：细胞数/mL＝80小格内细胞个数/80×10000×稀释倍数×400，分别计算出pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pEgU6-11-PDS-AtCRISPR/Cas9载体、pAtU6-PDS-AtCRISPR/Cas9载体共转35S-GFP-1301表达载体的原生质体的瞬转的效率分别为86.62％，90.18％，88.31％，89.66％。

步骤三、靶向基因PDS的突变检测：采用RE/PCR的方法对草原龙胆PDS基因突变情况的检测

(1)在草原龙胆PDS基因的靶位点左右设计引物PDS-F/R(PDS-F如SEQ ID NO:62，PDS-R:如SEQ ID NO:63)，以草原龙胆的DNA为模板进行PCR克隆，将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测有目的条带，测序结果无套峰则该引物可以作为判断靶位点突变的PCR克隆引物。

(2)将孵育24h、48h、72h的转pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体的原生质体和孵育48h的转pEgU6-2-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pEgU6-11-PDS-AtCRISPR/Cas9载体、pAtU6-PDS-AtCRISPR/Cas9载体以及未转任何载体的空原生质体分别放在95℃金属浴中加热5min，然后冰上放置2min，将原生质体破碎提取DNA。

(3)在草原龙胆PDS基因的靶位点左右设计合适引物PDS-F/R，以未转任何载体的草原龙胆的空原生质体为模板，设计不同的PCR反应体系和反应条件，通过琼脂糖凝胶电泳检测，最终确定了草原龙胆原生质体的PCR反应体系(2μL的酶切产物DNA、2μL的F-PDS、2μL的R-PDS、25μL的高保真酶(2x)和19μL的ddH2O)。

(4)将孵育24h、48h、72h的转pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体的原生质体的DNA用BauI进行酶切，酶切体系如(1μg的原生质体DNA、1μL的BauI、1μL的Buffer(10x)，补ddH2O至10μL)，酶切24h后，将酶切的产物作为模板，用上述相同的引物和反应体系以及反应条件进行PCR扩增，用2％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测(图16中的A，图16中的B，图16中的C)。将PCR产物电泳回收分别连接T载体，挑单克隆做菌液PCR电泳，将条带大小正确的单克隆菌液送测序，测序结果用DNAMAN软件比对分析(图17中的A-F)，序列比对结果表明孵育的时间影响CRISPR/Cas9载体对草原龙胆PDS基因靶位点的编辑，并且在孵育48hCRISPR/Cas9载体对草原龙胆PDS基因靶位点的编辑能力明显增大。由于Cas9蛋白在PAM上游3-4个碱基对处开始切割所以在此位点附近选择单一的酶切位点对有靶位点的PDS基因进行酶切，如果发生编辑，酶切位点会发生改变，再一次进行PCR会有目的条带。如果没有发生编辑，酶切位点不会发生改变，再一次进行PCR不会有目的条带，根据PCR电泳图判定不同的CRISPR/Cas9载体对草原龙胆PDS基因的编辑情况，通过电泳图(图16中的D)可以看出pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体对草原龙胆PDS基因都有编辑。(图17-20中圆圈出来的是突变位点)

(5)以转pEgU6-2-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体的草原龙胆原生质体DNA为模板，用高保真酶PCR扩增，PCR产物直接送测序，根据测序的色谱峰图与野生型做对照，来判断靶向基因是否发生突变。一般在SgRNA位点附近有双峰，则认为有突变。通过比对发现瞬转pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体的原生质体的PCR产物测序结果有套峰(图18)，因此推测pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体对草原龙胆PDS基因的编辑效率较高。

(6)分别将孵育48h的转pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pEgU6-11-PDS-AtCRISPR/Cas9载体、pAtU6-PDS-AtCRISPR/Cas9载体的草原龙胆原生质体基因组DNA用BauI进行酶切，酶切体系如(1μg的原生质体DNA、1μL的BauI、1μL的Buffer(10x)，补ddH₂O到Addto 10μL)，酶切24h后，将酶切的产物作为模板，用上述相同的引物和反应体系以及反应条件进行PCR扩增，用2％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，根据PCR电泳图(图16中的D所示)判定不同的CRISPR/Cas9载体对草原龙胆PDS基因的编辑情况。测序检测靶基因的突变位点：将采用RE/PCR的方法初步检测有突变的对应的PCR产物胶回收通过连接T载体，转化大肠杆菌然后涂在相应抗性的LB固体培养基上，培养12-16h，挑单克隆菌落，M13F/R(M13F:GTAAAACGACGGCCAGT，序列如SEQ ID NO:68，M13R:CAGGAAACAGCTATGAC序列如SEQ ID NO:69)引物进行菌液PCR扩增，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，将条带大小正确的菌液送测序，单克隆测序至少保证20以上成功，测序结果用DNAMAN软件进行比对分析靶基因的突变类型。测序结果用DNAMAN软件比对分析(图19中A和B)，通过序列比对，进一步验证了pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体、pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体对草原龙胆PDS基因都有编辑，pGmU6-PDS-GmCRISPR/Cas9载体对草原龙胆PDS基因编辑能力相对较低，pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体对草原龙胆PDS基因的编辑能力相对较高，有碱基的替换和小片段的缺失。pEgU6-11-PDS-AtCRISPR/Cas9载体、pAtU6-PDS-AtCRISPR/Cas9载体瞬转草原龙胆原生质体DNA，酶切后PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测(图16中的D)，回收产物连接T载体挑单克隆送测序，测序结果比对发现pAtU6-PDS-AtCRISPR/Cas9载体对草原龙胆PDS基因编辑能力相对于pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体对草原龙胆PDS基因编辑能力较低，在靶位点处都只有碱基对的替换，没有发现碱基对缺失或增添的情况(图20)，pEgU6-11-PDS-AtCRISPR/Cas9载体对草原龙胆PDS基因编辑能力相于pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体对草原龙胆PDS基因编辑能力较差。

步骤四、草原龙胆CRISPR/Cas9载体编辑效率的统计：共转草原龙胆原生质体的35S-GFP-1301质粒瞬时表达的GFP绿色荧光蛋白，在荧光显微镜下用血细胞计数板统计转进GFP的原生质体数以及总的草原龙胆原生质体数，计算出草原龙胆原生质体的转染效率W1；然后统计测序成功的总的单克隆数N总和发生突变的单克隆数N突，计算出草原龙胆CRISPR/Cas9载体对于PDS基因编辑效率W％＝N突/N总/W1×100％。结果(表4)pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体编辑效率为30.786％，比对照提高23.396％；pEgU6-11-PDS-AtCRISPR/Cas9载体编辑效率为15.098％，比对照提高11.378％。pEgU6-11-PDS-GmCRISPR/Cas9载体比pEgU6-11-PDS-AtCRISPR/Cas9载体对草原龙胆PDS基因的编辑能力更强。PDS基因靶位点突变的类型主要有碱基的替换和小片段的缺失(图20中A和B)。

表4 CRISPR载体对草原龙胆PDS基因编辑效率的统计

SEQUENCE LISTING

<110> 东北林业大学

<120> 一种提高草原龙胆基因编辑效率的重组载体及其制备方法与应用

<130>

<160> 70

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> EgU6-1-F

<400> 1

agggatggag aggtagagaa tggagt 26

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> EgU6-1-R

<400> 2

ggctatgcag caattgtggg gtca 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> EgU6-2-F

<400> 3

acccccaccc acccacttct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> EgU6-2-R

<400> 4

agctccagcg gtacagcgtt 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> EgU6-4-F

<400> 5

tcgaaactgc aggatttgga gcct 24

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> EgU6-4-R

<400> 6

tggcagggta tgggataggt cgg 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> EgU6-8-F

<400> 7

tcccactctc ctcccaacgt c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> EgU6-8-R

<400> 8

cgtgtggcca gaatgcgtgt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> EgU6-10-F

<400> 9

agggctttta ccgcccccat 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> EgU6-10-R

<400> 10

gggtggtgcg aacgtcgctt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> EgU6-11-F

<400> 11

ccgttgcggc cctttgacct 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> EgU6-11-R

<400> 12

ggcctggaat gagaagccgg a 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> EgU6-15-F

<400> 13

acagcctctc tggacggaac ca 22

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> EgU6-15-R

<400> 14

tcaccagatg gagcaccgta gag 23

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> EgU6-17-F

<400> 15

gcgatgtctc catcagaggc cg 22

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> EgU6-17-R

<400> 16

cgtcggtctt agctcgcacg g 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> EgU6-20-F

<400> 17

acttccccaa ccggcaacgg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> EgU6-20-R

<400> 18

cacaagagcg gcgcgaaagc 20

<210> 19

<211> 39

<212> DNA

<213> EgU6-1-TY-F

<400> 19

taagagctcg gtaccctcga gatgtgtgac cgcgcgaca 39

<210> 20

<211> 45

<212> DNA

<213> EgU6-1-TY-R

<400> 20

tttggcgtct tccatctcga gcgatataga gcctgagtga tagcg 45

<210> 21

<211> 46

<212> DNA

<213> EgU6-2-TY-F

<400> 21

taagagctcg gtaccctcga gatttgacgc ctatttctgt actcct 46

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> EgU6-2-TY-R

<400> 22

tttggcgtct tccatctcga gcaatgtgca gctgaaagcc c 41

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> EgU6-4-TY-F

<400> 23

taagagctcg gtaccctcga ggacaggctt aacggcgagg 40

<210> 24

<211> 55

<212> DNA

<213> EgU6-4-TY-R

<400> 24

tttggcgtct tccatctcga gcaactttaa gatgtttatg taaatgtata tgttc 55

<210> 25

<211> 54

<212> DNA

<213> EgU6-8-TY-F

<400> 25

taagagctcg gtaccctcga gatatataat cttttcctga gtagtttgag taca 54

<210> 26

<211> 43

<212> DNA

<213> EgU6-8-TY-R

<400> 26

tttggcgtct tccatctcga gcaaaattca ggagcagcga gtt 43

<210> 27

<211> 50

<212> DNA

<213> EgU6-10-TY-F

<400> 27

taagagctcg gtaccctcga gctaaatgat ccgagtttga atatctaatt 50

<210> 28

<211> 48

<212> DNA

<213> EgU6-10-TY-R

<400> 28

tttggcgtct tccatctcga gcattgatgt tttatttagt ggtcaagc 48

<210> 29

<211> 49

<212> DNA

<213> EgU6-11-TY-F

<400> 29

taagagctcg gtaccctcga gagcttcact ctcattaata aagtgaggt 49

<210> 30

<211> 47

<212> DNA

<213> EgU6-11-TY-R

<400> 30

tttggcgtct tccatctcga gctatagatg tatctgctac ttggccg 47

<210> 31

<211> 42

<212> DNA

<213> EgU6-15-TY-F

<400> 31

taagagctcg gtaccctcga gcgatttggc tcgattcgtt aa 42

<210> 32

<211> 52

<212> DNA

<213> EgU6-15-TY-R

<400> 32

tttggcgtct tccatctcga gcaatatcaa ttattgattc atcattgata tc 52

<210> 33

<211> 46

<212> DNA

<213> EgU6-17-TY-F

<400> 33

taagagctcg gtaccctcga gctcgtttaa catgcaagaa cgtaac 46

<210> 34

<211> 42

<212> DNA

<213> EgU6-17-TY-R

<400> 34

tttggcgtct tccatctcga gcgtggacgc atctattcac ga 42

<210> 35

<211> 50

<212> DNA

<213> EgU6-20-TY-F

<400> 35

taagagctcg gtaccctcga gactgtgtgt acgatgtata ttccactatg 50

<210> 36

<211> 46

<212> DNA

<213> EgU6-20-TY-R

<400> 36

tttggcgtct tccatctcga gcgtgtgacg ttactcttga attgtt 46

<210> 37

<211> 28

<212> DNA

<213> PDS-CDS-F

<400> 37

atgtcacaat tggggcacat gtctgttg 28

<210> 38

<211> 28

<212> DNA

<213> PDS-CDS-R

<400> 38

tcaaggcatg cttggttctg ctagcttg 28

<210> 39

<211> 17

<212> DNA

<213> GmU6-F

<400> 39

caggaaacag ctatgac 17

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> GmU6-R

<400> 40

caagttgata acggactagc c 21

<210> 41

<211> 44

<212> DNA

<213> AtU6-SgRNA-TY-F

<400> 41

aacgacggcc agtgccaagc ttcattcgga gtttttgtat cttg 44

<210> 42

<211> 42

<212> DNA

<213> AtU6-SgRNA-TY-R

<400> 42

ctttatcatc aggaggtcga cccatttgtc tgcagaattg gc 42

<210> 43

<211> 27

<212> DNA

<213> 18T- AtU6-JC-R

<400> 43

ctcgagccat ttgtctgcag aattggc 27

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 1300 CDC45-F

<400> 44

ggcgattaag ttgggtaacg 20

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 1300 CDC45-R

<400> 45

gacattggtc tagagttaca g 21

<210> 46

<211> 47

<212> DNA

<213> Gm-EgU6-2-TY-F1

<400> 46

tacccgggga tctttcactg gcgcgccgat ttgacgccta tttctgt 47

<210> 47

<211> 52

<212> DNA

<213> Gm-EgU6-2-TY-R1

<400> 47

tagctctaaa accctcgtga ttcgatgtga ttcaatgtgc agctgaaagc cc 52

<210> 48

<211> 41

<212> DNA

<213> Gm-EgU6-2-TY-F2

<400> 48

tgattacgaa ttcgagctcg gtacccgggg atctttcact g 41

<210> 49

<211> 50

<212> DNA

<213> Gm-EgU6-2-TY-R2

<400> 49

cggactagcc ttattttaac ttgctatttc tagctctaaa accctcgtga 50

<210> 50

<211> 46

<212> DNA

<213> Gm-EgU6-11-TY-F1

<400> 50

tacccgggga tctttcactg gcgcgccaag cttcactctc attaat 46

<210> 51

<211> 49

<212> DNA

<213> Gm-EgU6-11-TY-R1

<400> 51

agctctaaaa ccctcgtgat tcgatgtgat tctatagatg tatctgcta 49

<210> 52

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm-EgU6-11-TY-F2

<400> 52

tgattacgaa ttcgagctcg gtacccgggg atctttcact 40

<210> 53

<211> 49

<212> DNA

<213> Gm-EgU6-11-TY-R2

<400> 53

cggactagcc ttattttaac ttgctatttc tagctctaaa accctcgtg 49

<210> 54

<211> 27

<212> DNA

<213> Gm-EgU6-2-cexu-F

<400> 54

acgcctattt ctgtactcct attggct 27

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> Gm-EgU6-2-cexu-R

<400> 55

tgtgcagctg aaagcccagc 20

<210> 56

<211> 25

<212> DNA

<213> Gm-EgU6-11-cexu-F

<400> 56

gtgaggtaat gccgtattcg ttggt 25

<210> 57

<211> 21

<212> DNA

<213> Gm-EgU6-11-cexu-R

<400> 57

tggccgtcat gctctgaggg a 21

<210> 58

<211> 44

<212> DNA

<213> AT- EgU6-11-BbsI -TY-F

<400> 58

aacgacggcc agtgccaagc ttcactctca ttaataaagt gagg 44

<210> 59

<211> 58

<212> DNA

<213> AT- EgU6-11-BbsI -TY-R

<400> 59

ttgctatttc tagctctaaa acaggtcttc tcgaagaccc tatagatgta tctgctac 58

<210> 60

<211> 59

<212> DNA

<213> AT- EgU6-11-TY-F

<400> 60

cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgccaaagc ttcactctca ttaataaag 59

<210> 61

<211> 59

<212> DNA

<213> AT- EgU6-11-TY-R

<400> 61

taatgacact cccaccttta tcatcaggag gtcgactcga gccatttgtc tgcagaatt 59

<210> 62

<211> 24

<212> DNA

<213> PDS-F

<400> 62

cttcgctgat aagaatgaat gaac 24

<210> 63

<211> 21

<212> DNA

<213> PDS-R

<400> 63

accaaactgg ttgactgacc a 21

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> PDS-SgRNA-正义链

<400> 64

aatcacatcg aatcacgagg 20

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> PDS-SgRNA-反义链

<400> 65

cctcgtgatt cgatgtgatt 20

<210> 66

<211> 350

<212> DNA

<213> 截短EgU6启动子

<400> 66

aagcttcact ctcattaata aagtgaggta atgccgtatt cgttggttag gaatatctac 60

atgactagta cacataggtt cggatgatgc cttatgtaat agaactattg tatgagtggc 120

atttcgttga tgcttagatt acggttaata tattagcatt ttaactaaaa aaaggttatc 180

aatcagactc gaaagttaaa agaaactgag atgtataaag catagaaata aatagttagc 240

tgcaagcact ttgatttaga acactgtcaa acaataatat tggtacaaac caatcaagtc 300

aacagcttcc tccctcagag catgacggcc aagtagcaga tacatctata 350

<210> 67

<211> 350

<212> DNA

<213> GmU6

<400> 67

aactaattaa agaaaataaa aatgcaagtg cggtgacaag acaagctaga ataaagttgc 60

aaagaaatga cagggctaca aaaggctcac ctacttctgg atttaccaaa cttctgtttg 120

tccccatact ccaaaaacaa aaccattttt ttttatcttc gtttttgttt gctttgactg 180

tgagttgagg cccaactttc tgcttctgtc cgactctatt tgatgaattt tgtttgcctc 240

ctgtgatgtg aaggatgtat cattgaaagg gaacgtgtct caatgatccc acatcggcca 300

aatatgctca ttacattgcg tttatatagt cccaggaaaa catatggatt 350

<210> 68

<211> 17

<212> DNA

<213> M13F

<400> 68

gtaaaacgac ggccagt 17

<210> 69

<211> 17

<212> DNA

<213> M13R

<400> 69

caggaaacag ctatgac 17

<210> 70

<211> 1749

<212> DNA

<213> PDS基因

<400> 70

atgtcacaat tggggcacat gtctgttgtt aacattggaa ggcagggcaa tgctgttagt 60

ctttggagct tgcaatcgac ctgtatgggc ggttttcatt tttgttcaga tcaaaggaat 120

ttactttctt tacggagcag caacctcatc agtcataaac tgaatgttcc actgaccagt 180

acttcagtta ggagagcaag caagtctgca agccctttaa aggtggtttg tgttgactat 240

ccaagaccag atcttgacaa caccagcaac tttttggaag ctgcttactt atcctccttg 300

ttccgctctt ctccacgccc aaataaacca ttagacgtgg tcattgctgg tgcaggtttg 360

ggtggtttgt gtactgcaaa gtacttagct gatgcaggtc atagacctat actcttggaa 420

gcaagagatg ttctgggagg aaagattgcc gcatggaaag atgatgatgg ggattggtat 480

gagacaggct tacatatatt ctttggggct tacccaaaca tgcagaactt gttcggggag 540

ctaggaatta atgatcgact gcagtggaaa gagcattcta tgatatttgc tatgcctagt 600

aaacctggag aattcagtcg atttgatttt cccgaggttt tacccgcgcc atttaatgga 660

attttggcca ttttgaagaa caatgaaatg ctcacttggc ctgagaaagt caagtttgca 720

attggcctct tgcccgcaat tcttggtgga caggcttatg ttgaggcgca agatggcatt 780

actgtgaaag actggatgag aaagcaagga gtgcctgatc gggtaacaga tgaagtattt 840

attgctatgt caaaggccct gaacttcata aatcccgacg aactctcgat gcagtgcatt 900

ttaattgctt tgaaccgttt tcttcaggag aagcatggat caaaaatggc atttttagat 960

ggtaatcctc cagagaggct ttgcatgcca attgttaatc acatcgaatc acgaggaggt 1020

gaagtacgac ttaactcacg cattcagagg attgagctga atgaagatgg gagcgtgaaa 1080

agttttgttc taaatgacgg gtcagttata aaaggagatg catacgtatt tgctactcca 1140

gttgatatcc tgaagcttct tttgcctgag gattggaaag agatgccata tttcagaaaa 1200

ttggagaact tagttggagt tccagtcata aatgtccata tatggtttga cagaaaactg 1260

aaaaacacat atgatcatct tctttttagc agaagcccac ttctcagtgt gtatgctgac 1320

atgtccgtga cgtgtaagga atattacaac ccaaaccagt ctatgttgga gctagttttt 1380

gcacctgcag aagattggat ctcgcgaagt gattcagata tcttggaggc taccatgaag 1440

gaacttgcaa aactctttcc tgatgaaatt gctgcggacc agagcaaagc aaaaatcttg 1500

aagtaccata ttgtaaagac cccaaggtca gtttataaaa ctgtcccagg cacggaacct 1560

tgccggcctt tacaaagatc cccagtggct ggattctatt tagctggtga ctacacaaag 1620

cagaagtatt tagcctccat ggaaggtgca gttttatcag gaaaactatg tgcacaagct 1680

attgtacagg attacgactc acttcttgct cgatcgcgag gcaagctagc agaaccaagc 1740

atgccttga 1749

Claims (9)

1.一种提高草原龙胆基因编辑效率的重组载体，其特征在于，所述重组载体以pGmU6-GmCRISPR/Cas9载体为原始载体，以草原龙胆(Eustoma grandiflorum)的截短EgU6启动子替换原始载体的U6启动子，然后连接待编辑的草原龙胆基因的SgRNA序列，即得到重组载体或者所述重组载体以含有Cas9的表达载体1300为原始载体，然后按顺序依次连接截断EgU6启动子、待编辑的草原龙胆基因的SgRNA和gRNA scaffold序列得到重组片段，最后将重组片段与含有Cas9的表达载体1300连接，即得到重组载体。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体以pGmU6-GmCRISPR/Cas9载体为原始载体，然后将草原龙胆的截短EgU6启动子与待编辑的草原龙胆基因的SgRNA序列连接得到重组序列，将所述重组序列与原始载体进行同源重组反应，即得到重组载体。

3.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述重组片段的连接方法如下：

1)用HindIII和BbsI将18T-AtU6克隆载体进行双酶切，取2809bp片段进行纯化和回收片段；

2)以截短EgU6为模板，设计同源重组引物AT-EgU6-11-BbsI-TY–F的序列如SEQ ID NO:58所示，AT-EgU6-11-BbsI-TY–R的序列如SEQ ID NO:59所示，通过PCR克隆将酶切位点装在截短EgU6上，胶回收纯化目的片段DNA；

3)将步骤1)得到的片段与步骤2)得到片段DNA通过同源重组的反应得到重组的载体18T；

4)利用限制性内切酶BbsI对步骤3)得到的重组载体18T进行单酶切，胶回收纯化目的DNA片段；

5)将草原龙胆PDS基因的SgRNA与步骤4)得到的DNA片段进行连接得重组载体EgU6-18T，以EgU6-18T为模板，利用引物AT-EgU6-11-TY-F序列如SEQ ID NO:60所示，AT-EgU6-11-TY-R序列如扩增得到的序列如SEQ ID NO:61所示；

6)利用HindIII和SalI对1300表达载体进行双酶切，回收纯化后酶切后的1300表达载体与步骤5)得到的序列进行连接，即得到重组载体。

4.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述截短EgU6启动子的核酸序列如SEQ ID NO:66所示。

5.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述pGmU6-GmCRISPR/Cas9载体原始载体的U6启动子为GmU6，所述GmU6的核酸序列如SEQ ID NO:67所示。

6.权利要求1-5任意一项所述的重组载体在提高草原龙胆基因编辑效率中的应用。

7.权利要求2所述的重组载体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法的具体步骤如下：

(1)设计截短EgU6启动子的引物：EgU6-11-TY-F的序列如SEQ ID NO:29所示和EgU6-11-TY-R的序列如SEQ ID NO:30所示；

(2)设计草原龙胆PDS基因的SgRNA：PDS基因的SgRNA的正义核苷酸序列为SEQ ID NO:64所示，所述PDS基因的SgRNA的反义核苷酸序列为SEQ ID NO:65所示；

(3)连接EgU6启动子和草原龙胆PDS基因的SgRNA得到重组序列：以克隆得到的截短EgU6启动子序列为模板，利用引物Gm-EgU6-11-TY-F1、Gm-EgU6-11-TY-R1、Gm-EgU6-11-TY-F2和Gm-EgU6-11-TY-R2，利用PCR技术扩增得到重组序列；

(4)构建草原龙胆CRISPR/Cas9载体：利用AscI和LguI酶切pGmU6-GmCRISPR/Cas9载体，将步骤(3)得到的重组序列与AscI和LguI酶切后pGmU6-GmCRISPR/Cas9载体进行同源重组反应，即得到重组载体。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述Gm-EgU6-11-TY-F1的序列如SEQ ID NO:46所示，所述Gm-EgU6-11-TY-R1的序列如SEQ ID NO:47所示。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述Gm-EgU6-11-TY-F2的序列如SEQ ID NO:48所示，所述Gm-EgU6-11-TY-R2的序列如SEQ ID NO:49所示。

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