CN113116880A - 波棱甲素的提取物在制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了波棱甲素或主要有效成分为波棱甲素的提取物在制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。其提取方法如下：波棱瓜子粉碎后用95％乙醇提取，将提取液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩成浸膏。本发明通过实验发现波棱甲素可显著逆转蛋氨酸‑胆碱缺乏饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病C57BL/6J小鼠血清中肝功能指标ALT、AST、血清炎症因子IL‑6、IL‑1β和肝脏组织中TG等水平的升高，逆转HDL指标、小鼠体重及肝指数的降低、以及改善肝脏组织的脂肪病变，具有显著肝损伤保护作用。本发明拓宽了波棱甲素或波棱瓜子乙酸乙酯提取物的应用范围，对于开发肝损伤保护药物具有重要的应用价值和经济效益。

Description

波棱甲素的提取物在制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中 的应用

技术领域

本发明涉及中药单体化合物，具体涉及波棱甲素或主要有效成分为波棱甲素的提取物在制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指排除有明确损肝因素和过量饮酒所导致的肝细胞脂肪变性的临床综合征，也是肝脏代谢综合征的体现。NAFLD在普通人群中发病率达到20％～30％，其中75％～90％与病态的肥胖相关；3％～5％将可能进一步向脂肪性肝炎、肝硬化和肝癌发展。近年来，NAFLD全球患病率持续上升，在我国已取代乙型肝炎成为第一大慢性肝病，因而也越来越引起人们的重视。NAFLD的发病机制极其复杂，目前普遍认为与遗传、环境、生活方式及代谢应激等因素有关。较成熟的解释是“二次打击”学说：即胰岛素抵抗引起肝细胞脂肪蓄积，并诱导对内源性损害因子的敏感性增加；被活化的因子进一步加重氧化应激(oxidativestress，OS)和脂质过氧化，对肝细胞进行又一次打击，肝脏炎症反应加重。随着新的研究结果不断涌现，“多重平行打击”观念应运而生，涉及脂毒性、炎症反应、遗传多态性和表观遗传学、脂肪因子和肝脏因子、肠道菌群(gut microbiota，GM)等。动物模型是研究人类疾病的重要手段。目前，国内外用于科学研究的NAFLD动物模型主要分为两类，其中饮食模型最常用，操作简便，重复性好。MCD饮食模型是最为广泛研究和应用的一种。MCD饮食通常具有高蔗糖含量(～40％)和中等脂肪含量(～10％)，同时缺乏胆碱和蛋氨酸。长期MCD饮食可导致β-氧化受损与极低密度脂蛋白颗粒的产生受损。另外，胆碱缺乏可导致氧化应激以及细胞、脂肪因子的变化，进而促进肝脏脂肪堆积和肝细胞凋亡。迄今为止，尚无明确的药物被批准用于NAFLD的治疗，一些临床试验的证据表明，维生素E、噻唑烷二酮(TZDs)、己酮可可碱(PTX)、奥贝胆酸(OCA)可以改善NASH的组织学特征，但不同药物对个体纤维化和炎症的改善不尽相同。因此，急需研发高效、低毒及副作用小的药物用于NAFLD治疗。

波棱瓜子为葫芦科(Cucurbitaceae)波棱瓜属植物波棱瓜(Herpetospermumpedunculosum)的干燥成熟种子，是《中国药典》收载的常用中药之一，藏医学著作《月王药诊》中记载具有泻肝火胆热，解毒的功效。《四部医典》记载波棱瓜子味苦，主治赤巴病。《晶珠本草》记载波棱瓜子性凉、锐，治赤巴入肺腑。研究表明，波棱瓜子在藏医临床用于治疗肝胆疾病疗效确切。据报道，波棱瓜子中化学成分主要为木脂素、香豆素和脂肪酸等，具有保肝降酶、抗乙肝病毒(HBV)及抗肝纤维化等多种药理活性。但有关波棱瓜子中的木脂素波棱甲素(herpetrione，HPE)在抗非酒精性脂肪性肝病的活性却鲜见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供波棱甲素或主要有效成分为波棱甲素的提取物在制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用，为肝损伤提供新的药物治疗，同时拓宽了波棱甲素或波棱瓜子乙酸乙酯提取物的应用范围。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、波棱甲素或主要有效成分为波棱甲素的提取物在制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。

本发明中优选的，所述主要有效成分为波棱甲素的提取物为波棱瓜子乙酸乙酯提取物；所述主要有效成分为波棱甲素的提取物由以下方法制备：用体积分数为95％的乙醇渗漏提取，合并提取液，将提取液用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，减压浓缩成浸膏。

本发明中优选的，所述波棱甲素的制备方法为：波棱瓜子乙酸乙酯萃取物与等重的硅胶拌样，烘干、上样后，进行正相硅胶柱层析，先用体积比为50：50的石油醚-丙酮体系进行等度洗脱，再以体积比70：30～45：55进行梯度洗脱；接着用二氯甲烷-甲醇体系按照体积比100：1～6.25：1梯度洗脱，最后经98：2的二氯甲烷-甲醇体系洗脱得到波棱甲素。

2、波棱甲素或主要有效成分为波棱甲素的提取物在下调非酒精性脂肪性肝病动物血清肝功能指标的药物中的应用，其特征在于：所述肝功能指标为谷丙转氨酶、谷草转氨酶。

3、波棱甲素或主要有效成分为波棱甲素的提取物在上调非酒精性脂肪性肝病动物血清高密度脂蛋白胆固醇的药物中的应用。

4、波棱甲素或主要有效成分为波棱甲素的提取物在下调非酒精性脂肪性肝病动物血清炎症因子的药物中的应用，其特征在于：所述炎症因子为IL-6、IL-1β。

5、波棱甲素或主要有效成分为波棱甲素的提取物在下调非酒精性脂肪性肝病动物肝脏组织中甘油三酯含量的药物中的应用。

6、波棱甲素或主要有效成分为波棱甲素的提取物在上调非酒精性脂肪性肝病动物体重的药物中的应用。

7、波棱甲素或主要有效成分为波棱甲素的提取物在上调非酒精性脂肪性肝病动物肝指数的药物中的应用。

本发明中优选的，所述动物为C57BL/6J小鼠；所述波棱甲素的有效剂量为大于25mg/kg。

本发明的有益效果在于：本发明公开了波棱甲素或主要有效成分为波棱甲素的提取物在制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用，通过实验发现波棱甲素可显著逆转蛋氨酸-胆碱缺乏(methionine-choline-deficient，MCD)饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病C57BL/6J小鼠血清中肝功能指标ALT、AST、血清炎症因子IL-6、IL-1β和肝脏组织中TG水平的升高以及逆转HDL水平的降低，改善肝脏组织的脂肪病变，具有显著肝损伤保护作用。本发明拓宽了波棱甲素或波棱瓜子乙酸乙酯提取物的应用范围，对于开发肝损伤保护药物具有重要的应用价值和经济效益。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1显示了波棱甲素对MCD饮食诱导小鼠非酒精性脂肪性肝病模型中血清和组织生化指标的影响(A：ALT，B：AST，C：HDL，D：TG，E：IL-6，F：IL-1β。图中control为空白组，model为模型组。与空白组比较：#p<0.05，##p<0.01；与模型组相比*p<0.05，**p<0.01)。

图2显示了波棱甲素对MCD饮食诱导小鼠非酒精性脂肪性肝病模型中组织病理状态和脂肪病变的影响(显微镜放大倍数为200倍，图中control为空白组，model为模型组。)。

图3显示了波棱甲素对MCD饮食诱导小鼠非酒精性脂肪性肝病模型中小鼠体重和肝指数的影响(A：小鼠体重，B：小鼠肝指数。图中control为空白组，model为模型组。与空白组比较：#p<0.05，##p<0.01；与模型组相比*p<0.05，**p<0.01)

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、波棱甲素的制备

波棱甲素的制备方法，具体步骤如下：将波棱瓜子干燥粉碎后用体积分数为95％的乙醇浸泡24小时，采用渗漏提取5～6次，合并提取液，将提取液分别用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇有机溶剂先后萃取，各萃取3次，分别合并依次得到石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液，减压浓缩成不同提取部位浸膏；取乙酸乙酯萃取物192g，用等重的硅胶(100～200目)拌样，烘干后，干法上样，先用石油醚：丙酮(体积比50：50)进行正向硅胶柱层析，再以石油醚：丙酮(体积比70:30-45:55)经正向硅胶柱层析，接着以二氯甲烷：甲醇(体积比100:1-6.25:1)梯度经正向硅胶柱层析后，最后以二氯甲烷：甲醇(体积比98:2)洗脱得到。

波棱甲素鉴定：¹H-NMR(CD3OD,400MHz)δH:7.65(1H,d,J＝1.90Hz,H-2),6.73(1H,d,J＝8.24Hz,H-5),7.61(1H,dd,J＝8.35,1.95Hz,H-6),4.62(1H,dd,J＝10.52,9.12Hz,H-8),6.83(1H,d,J＝1.76Hz,H-2′),6.62(1H,d,J＝1.78Hz H-6′),4.63(2H,m,H-7′,H-7″),3.05(2H,q,J＝5.72,4.67Hz,H-8′,H-8″),4.18(1H,dd,J＝8.96,6.25Hz,H-9′),6.92(1H,d,J＝1.56Hz,H-2″),6.76(1H,s,H-5″),6.78(1H,dd,J＝8.13,1.70Hz,H-6″),3.83(3H,s,3-OCH3),3.85(3H,s,3′-OCH3),3.87(3H,s,3″-OCH3)；¹³C-NMR(CD3OD,100MHz)δC:199.8(C-7),149.3(C-3),149.1(C-3″),148.9(C-3′),148.1(C-4),147.3(C-4″),144.4(C-4′),133.8(C-1″),133.3(C-1′),129.8(C-1),124.8(C-6),124.6(C-5′),120.1(C-6″),118.7(C-6′),116.1(C-5),115.9(C-5″),112.7(C-2″),111.0(C-2),109.5(C-2′),87.6(C-7′),87.3(C-7″),72.7(C-9′),72.4(C-9″),64.1(C-9),56.6(3-OCH3),56.4(3′-OCH3),56.3(3″-OCH3),55.3(C-8′),55.1(C-8″),36.7(C-8).

实施例2、化合物波棱甲素抗MCD饮食诱导的C57BL/6J小鼠非酒精性脂肪性肝病的作用研究

1、动物分组与给药

C57BL/6J小鼠40只，饲养于SPF级动物实验室，温度20℃～25℃，湿度45％～50％，保持通风换气，动物室内每12小时明暗交替一次，定期更换垫料，自由饮水，自由进食。适应性喂养一周后，应用随机数字表法分为空白对照组、模型组(MCD)、HPE低剂量组(12.5mg/kg)、HPE中剂量组(25mg/kg)、HPE高剂量组(50mg/kg)。空白对照组喂以MCS饲料，其余各组喂以MCD饲料，自由摄食及饮水。连续4周后随机选取2只空白对照组和2只模型组小鼠处死，取肝，行常规肝组织病理学检查及血清学指标检测，确认造模成功。随后，各组分别以上述方式继续喂养与干预，连续灌胃4周。

收集血清：灌胃结束末日晚，小鼠禁食不禁水12小时后，称重，麻醉(乙醚)，处死，摘眼球取血，室温静置1～2h后，4℃，9000rpm离心10～15min，取上层血清分装后置于-80℃冰箱备用。

收集肝脏：摘取肝脏，称重后，迅速将肝脏于4℃生理盐水洗净并分为两部分，一部分保存于-80℃冰箱用于后续研究，一部分固定于多聚甲醛溶液中待肝组织病理切片检查。

2、生化指标的测定

将收集得到的C57BL/6J小鼠血液于室温下放置30min后，台式冷冻离心机4℃9000r/min分离得到上层血清。酶标仪测定血清中AST、ALT、HDL、IL-6、IL-1β和肝脏中TG，结果如图1所示，波棱甲素能够降低MCD饮食诱导的C57BL/6J小鼠血清中AST、ALT、IL-6、IL-1β含量、提高HDL含量，以及降低肝脏组织中TG含量。

3、肝组织病理切片检查

3.1肝脏HE染色

石蜡切片：依照常规流程，行脱蜡、复水、苏木素染色、伊红染色、脱水、透明、中性树胶封片、显微镜观察并摄片。

鉴定标准：肝细胞如果出现了脂肪变性的表现，局部会形成脂滴，在HE染色后，脂滴脱落，在局部形成空泡样改变。

3.2肝脏油红O染色

冰冻切片：依照常规方法，异丙醇漂洗、油红O工作液染色、60％异丙醇分化漂洗，水洗、甘油明胶封片、显微镜观察和摄片。油红O为脂溶性染料，在脂肪内能高度溶解，可特异性的使组织内甘油三酯等中性脂肪着色。鉴定标准：肝细胞内的脂肪滴呈红色，细胞核呈蓝色。

结果如图2所示，小鼠肝脏组织的HE染色切片经镜下观察，正常组小鼠肝脏可见肝小叶结构完整清晰，肝细胞大小均一，核清晰可见，胞浆丰富红染。模型组小鼠肝脏可见重度弥漫大泡性肝细胞脂肪变，肝细胞体积增大，胞浆内可见大小不等的脂肪空泡。与模型组相比，经药物干预后，小鼠的肝脏组织也可见到一定程度的肝细胞脂肪变，但胞浆内脂滴的数量和大小随着药物浓度的增大，均有不同程度的减少。油红O染色结果显示，模型组小鼠肝脏细胞内有大量的红染脂滴存在，而药物干预后，小鼠肝细胞内的脂滴均有所减少，表明脂肪变有所缓解。此外。经肝脏组织大体观察，正常组的小鼠肝脏大小、形态正常，肝脏表面光滑，色暗红。而模型组小鼠肝脏体积有所减小，且质地较软，表面呈灰黄色。经药物干预后，小鼠肝脏在体积、色泽、质地及包膜紧张度等方面的性状与模型组相比，均有一定程度的改善。

波棱甲素能够改善MCD饮食诱导的C57BL/6J小鼠的肝脏损伤和脂肪病变。

4、小鼠体重与肝指数

结果如图3所示，与正常组相比，模型组小鼠的体重有显著性降低，经药物干预后，小鼠体重有所回升。在肝指数方面，模型组小鼠的肝指数相比正常组有显著性降低，经药物干预后，小鼠肝指数有所上升。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.波棱甲素或主要有效成分为波棱甲素的提取物在制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述主要有效成分为波棱甲素的提取物为波棱瓜子乙酸乙酯提取物；所述主要有效成分为波棱甲素的提取物由以下方法制备：用体积分数为95％的乙醇渗漏提取，合并提取液，将提取液用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，减压浓缩成浸膏。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述波棱甲素的制备方法为：波棱瓜子乙酸乙酯萃取物与等重的硅胶拌样，烘干、上样后，进行正相硅胶柱层析，先用体积比为50：50的石油醚-丙酮体系进行等度洗脱，再以体积比70：30～45：55进行梯度洗脱；接着用二氯甲烷-甲醇体系按照体积比100：1～6.25：1梯度洗脱，最后经98：2的二氯甲烷-甲醇体系洗脱得到波棱甲素。

4.波棱甲素或主要有效成分为波棱甲素的提取物在下调非酒精性脂肪性肝病动物血清肝功能指标的药物中的应用，其特征在于：所述肝功能指标为谷丙转氨酶、谷草转氨酶。

5.波棱甲素或主要有效成分为波棱甲素的提取物在上调非酒精性脂肪性肝病动物血清高密度脂蛋白胆固醇的药物中的应用。

6.波棱甲素或主要有效成分为波棱甲素的提取物在下调非酒精性脂肪性肝病动物血清炎症因子的药物中的应用，其特征在于：所述炎症因子为IL-6、IL-1β。

7.波棱甲素或主要有效成分为波棱甲素的提取物在下调非酒精性脂肪性肝病动物肝脏组织中甘油三酯含量的药物中的应用。

8.波棱甲素或主要有效成分为波棱甲素的提取物在上调非酒精性脂肪性肝病动物体重的药物中的应用。

9.波棱甲素或主要有效成分为波棱甲素的提取物在上调非酒精性脂肪性肝病动物肝指数的药物中的应用。

10.根据权利要求4～9任一项所述的应用，其特征在于：所述动物为C57BL/6J小鼠；所述波棱甲素的有效剂量为大于25mg/kg。

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