CN102716182B - 一种用于治疗非酒精性脂肪肝的决明子提取物、制备方法及其制药应用 - Google Patents
一种用于治疗非酒精性脂肪肝的决明子提取物、制备方法及其制药应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于治疗非酒精性脂肪肝的决明子混合提取物,由决明子药材的水提取物与决明子药材乙醇提取物组成;发明将决明子中含有蒽醌类化合物、不饱和脂肪酸和萘并吡咯酮类成分的提取部位相组合得到的决明子混合提取物,治疗非酒精性脂肪肝的效果优于使用乙酸乙酯提取的有效部位和只用乙醇提取的有效部位,同时还多糖尿病肾病具有一定的治疗作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药材提取物,更具体的说涉及一种用于治疗非酒精性脂肪肝的决明子混合提取物、制备方法及其应用。
技术背景
非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征临床病理综合征,包括单纯性脂肪肝以及由其演变的脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化。近年来随着生活水平的改善和生活方式的改变,非酒精性脂肪肝的发病率不断升高,有资料研究显示美国、西欧、日本普通人群NAFLD患病率为10%~24%,而肥胖症患者NAFLD患病率则高达57.5%~74%。NAFLD将会是未来发病率最高的一种肝脏疾病,治疗NAFLD将是今后数十年肝病科医生面临的挑战。非酒精性脂肪肝目前尚无疗效理想的药物,某些治疗仅仅是改善胰岛素抵抗,维护机体内环境脂质代谢、能量代谢和抗氧化物的平衡,促使机体保持在适应性反应阶段,延缓、阻止脂肪肝肝病的病情进展。临床上对非酒精性脂肪肝病的防治以饮食调节、合理运动和药物干预为主。治疗非酒精性脂肪肝病的药物主要有二甲双胍、维生素等。二甲双胍是胰岛素增敏剂,通过改善患者的糖耐量和高胰岛素血症,降低体内血浆游离脂肪酸和血浆甘油三酯水平,但副作用明显,对胃肠道刺激性非常大,有心、肾功能障碍的老年患者有发生乳酸中毒的危险。维生素类药物如维生素A、E等,具有抗氧化作用,可以通过抑制过氧化自由基的形成防止肝细胞受损,但大剂量补充后易在体内蓄积产生毒性,反而加重肝脏负担。其他许多针对高脂血症的降血脂药物,可促进血脂更集中于肝脏进行代谢,反而易促进脂质在肝内的蓄积,并进一步损害肝功能。所以目前还缺乏安全有效、作用肯定的治疗非酒精性脂肪肝的药物,寻找具有保肝、降血脂、抗脂肪肝作用的药物显得非常有必要。
决明子为豆科植物决明CassiaobtusifoliaL.或小决明CassiatoraL.的干燥成熟种子,其性味甘、苦、咸、微寒,归肝、大肠经,具有清热明目,润肠通便的功效,作为临床常用中药,是国家卫生部公布的药食同源物质之一。现代研究表明,决明子中的主要成分为蒽醌类和多糖类化合物。蒽醌类成分目前研究有很多,发现具有抗衰老、调节免疫、降血脂、降血压和抗氧化等作用,是决明子发挥活性的主要成分。多糖类成分近年来逐渐引起科研人员的兴趣,发现其具有明显的抗氧化和调节免疫的功效。所以,决明子中的多种成分是其良好生物活性的物质基础。
目前决明子的提取方法主要以水提和乙醇提取为主,比较两种提取方法发现,决明子乙 醇提取物中的总蒽醌含量要明显比水提取高,而水提取的得膏率高于乙醇提取,但相应的杂质如蛋白质、无机盐等含量也很多,从而造成相应治疗效果不太理想。研究已证明决明子乙醇提取物或水提取物在治疗高血脂症的实际效果中,其降低总胆固醇和甘油三酯含量的效果并不是最佳。专利CN1739599A公开一种由决明子乙酸乙酯提取物制备的降脂保肝药物,据专利公开的数据显示,决明子的乙酸乙酯提取物在降脂的同时可以降低肝脏脂肪的含量,减缓或消除脂肪肝病理损害、改善肝功能。张荣等在《山西中医》杂志上发表的《决明子乙酸乙酯提取物对非酒精性脂肪肝大鼠的防治作用》一文中指出,决明子乙酸乙酯提取物能明显降低实验大鼠血清、肝脏中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂肪蛋白胆固醇(LDL-C)和血清ALT,AST的含量,升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量,改善肝脏的病理损害。焦素芳等在《临床合理用药》中发表的《决明子的化学成分与药理作用》一文中指出,决明子的水提取物中对于肝损伤具有良好的活性;同时,决明子水、醇提取物对于动物实验均有一定的降压作用。但是目前对决明子混合提取物的使用多为单一提取部位的使用。
发明内容
研究发现,决明子能抑制血清胆固醇升高和主动脉粥样硬化斑点形成,能明显增加血清HDL-C含量及提高HDL-C/TCM比值,改善体内胆固醇的分布状况,决明子中的蒽醌糖苷是降血脂的主要成分之一,它能减少肠道对胆固醇的吸收,增加排泄,通过反馈调节LDL-C代谢,降低血清胆固醇水平,延缓和抑制动脉粥样硬化斑块的形成。决明子水提取部位中的萘并吡咯酮类成分具有良好的解毒保肝作用,决明子水提取物对巨噬细胞吞噬功能有增强作用,小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数明显增高,并具有良好的抑菌作用;钝叶决明素、钝叶素、大黄酚、大黄素甲醚对l5-羟基前列腺素脱氢酶有弱的抑制作用,能减缓前列腺素的代谢,使其利尿作用延长;决明子含有大量的不饱和脂肪酸,相对含量占71.13%,其中亚油酸(41.80%)、油酸(27.82%)含量较高;而饱和脂肪酸以棕榈酸(15.33%)、硬脂酸(8.17%)、花生酸(1.66%)为主。据报道,油酸、棕榈酸具有降血脂、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集及血栓形成的作用。亚油酸是一种人体必须脂肪酸,为细胞膜和线粒体的组成成分,对胆固醇的代谢、输送和排泄起调节作用。所以本发明将决明子的水提取物和乙醇提取物相组合得到一种用于治疗非酒精性脂肪肝的决明子混合提取物,并发现改提取对于糖尿病肾病具有一定的疗效。
一种用于治疗非酒精性脂肪肝的决明子混合提取物,由决明子药材的水提取物与决明子药材乙醇提取物组成。
2.一种用于治疗非酒精性脂肪肝的决明子混合提取物的制备方法,包括以下步骤:
1)将决明子药材用乙醇提取,得到乙醇提取物;
2)将步骤1)中决明子药材残渣用水提取,得到水提取物;
3)合并乙醇提取物和水提取物,得到用于治疗非酒精性脂肪肝的决明子混合提取物。
步骤1)所述的乙醇提取为的决明子药材采用温浸提取方法、回流提取方法和渗漉提取方法中的任一种方法提取。
所述的乙醇提取为将决明子药材用2-20倍药材重量的15-99%的乙醇进行渗漉。
所述的乙醇提取为将决明子药材用8-16倍药材重量的60-95%的乙醇进行渗漉,渗漉前浸泡24h,渗漉的流速为每千克药材每分钟3-7ml。
步骤2)中所述水提取为将步骤1)中决明子药材残渣烘干挥去乙醇后,将决明子药材残渣采用温浸提取方法、水煎煮提取和回流提取方法中的任一种方法提取。
上述提取物及方法所述的用于治疗非酒精性脂肪肝的决明子混合提取物在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。
上述提取物及方法所述的用于治疗非酒精性脂肪肝的决明子混合提取物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。
本发明的有益技术效果是:本发明将决明子中含有蒽醌类化合物、不饱和脂肪酸和萘并吡咯酮类成分的提取部位相组合得到的决明子混合提取物,治疗治疗非酒精性脂肪肝的效果优于使用乙酸乙酯提取的有效部位和只用乙醇提取的有效部位,同时还多糖尿病肾病具有一定的治疗作用。
具体实施方式
实施例1决明子提取方法的筛选
大黄素、决明素、橙黄决明素、黄决明素、决明内酯、大黄酚-1-β龙胆二糖苷等成分,主要为蒽醌类化合物,以游离、结合状态存在,其中结合型蒽醌为主。现代药理结果表明决明子具明显的降血脂作用,蒽醌糖苷是降血脂的主要成分之一。考虑蒽醌类成分遇热不稳定,我们设计渗漉法提取进行正交试验,以1,8-二羟基蒽醌为标准品,以其结合蒽醌为指标筛选最佳提取工艺。并与回流法、温浸法比较。
决明子渗漉法与回流法、温浸法的比较:按筛选出的最佳方法提取:渗漉法浸泡24h、醇浓度8O%、流速3ml/(min·kg)、乙醇用量8倍药材重量。回流法浸泡0.5h、60%酒精、回流提取3次、每次5倍量、时间2h。温浸温度为60℃,分别温浸3次,每次加水量5倍.每次温浸1h,进行蒽醌类成分含量比较,采用紫外分光光度法测定,结果见表1所示。
表1决明子不同提取方法蒽醌类成分的含量(%)
根据表1的实验结果采用渗漉作为提取方法,渗漉正交试验:以浸泡时间、醇浓度、流速、乙醇用量为考察因素,每因素设计三水平见表2所示。称取粉碎后的决明子适量,分别按L9(34)正交表进行正交试验,以浸膏率和1,8-二羟基结合蒽醌为考察指标,综合评分、极差分析见表3所示,方差分析见表4所示。
表2因素水平表
表3决明子渗漉L9(34)正交试验表
表4方差分析表
按正交试验所得乙醇渗漉液,减压回收乙醇,然后水浴浓缩成稠膏,减压干燥至恒重,精密称定,以其投料药材量计算浸膏得率。测定的总蒽醌含量减去直接测定的游离蒽醌含量为1,8-二羟基结合葸醌含量,结果见表5所示。
表5决明子蒽醌类成分含量(%)
由表4,R值可知,B>A>C>D,方差分析表明A、B、C有显著性差异,宜选AlB2C1,D无显著性差异,以节约成本考虑选D1,故最佳方案为A1B2C1D1,即决明子渗漉最佳提取工艺为浸泡24小时、醇浓度80%、流速3ml/(min·kg)、乙醇用量8倍。
实施例2决明子混合提取物的制备
称取决明子药材10kg,按照实施例1所述优选的浸泡24小时、醇浓度80%、流速3ml/(min·kg)、乙醇用量8倍的渗漉方法,得到决明子得到乙醇提取物。
将上述决明子药材残渣低温挥去乙醇后,采用温浸提取、煎煮提取和回流提取中任一种方法提取的得到水提取物。
合并水提取物和乙醇提取物得到用于治疗非酒精性脂肪肝的决明子混合提取物。
实施例3决明子混合提取物对大鼠非酒精性脂肪肝活性考察
将决明子药材用10倍药材重量的乙酸乙酯作为溶媒,40℃温浸提取,得到决明子乙酸乙酯提取物组。按照实施例1所述优化渗漉方法得到决明子乙醇提取物组,按实施例2所述方法得到决明子混合提取物组;上述各组的给药量为所述提取物折算为提取浸膏所需的原药材的量。高脂饲料(2%胆固醇、0.2%丙基硫氧嘧啶、15%猪油、82.8%基础饲料),由重庆市中药研究院制备;SD大鼠60只,由重庆市中药研究院动物中心提供,合格证号:SCXK渝20070006。TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST试剂盒:北京福瑞生物工程公司;ALT、AST、SOD、MDA试剂盒:南京建成生物技术公司;血脂灵片:浙江天一堂药业有限公司。
动物与分组:SD大鼠基础饲料适应性喂养1周后,根据随机数字表随机分为6组:空白对照组,模型对照组,血脂灵片阳性对照组,决明子乙酸乙酯提取物组,决明子乙醇提取物组,决明子混合提取物组,每组10只。依文献复制非酒精性脂肪肝大鼠模型。除空白对照组常规饲养外,其余各组均饲喂高脂饲料,24h饮水,摄食不限。同时,血脂灵片对照组、决明子乙酸乙酯提取物组,决明子乙醇提取物组和决明子混合提取物组分别于每日8时,20时按5ml/kg灌胃相应药物,正常组、模型组灌服等量的2%吐温-8O溶液,连续8周。
末次给药后禁食12h,20%乌拉坦麻醉,腹主动脉取血4-5mL,3500rpm离心20min,分离血清,按照TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST试剂盒说明测定血清及肝脏脂质的含量。迅速摘取相同部位肝脏组织100mg,加入预冷的乙醇:丙酮(1:1)抽提液2.5ml,冰浴中制成肝组织匀浆,4℃4000rpm离心15min,上清液按照TC、TG、LDL-C、HDL-C试剂盒说明测定肝组织脂质含量。
分取左叶肝组织1cm×1cm,福尔马林固定,做HE染色切片,在光镜下观察肝脏组织形态,肝小叶结构脂肪变程度、肝细胞变性、坏死、炎细胞浸润、纤维增生等情况,并摄片。实验数据均以 表示,应用SPSS11.0统计学软件进行统计学处理,多组间数据比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验,方差不齐者做相应转换。
结果见表6所示。实验结束时,与模型组相比,正常组大鼠血清TC,TG,LDL-C均显著性降低(P<0.01),HDL-C有降低趋势但差异无显著性(P>0.05),表明非酒精性脂肪肝大鼠存在着明显的血脂代谢紊乱。给药后,决明子乙醇提取物组、决明子混合提取物组和血脂灵片对照组均能降低实验大鼠血清TC,TG,LDL-C含量,升高HD-C含量,与模型组比较,除决明子乙醇提取物组的血清TC和阳性组的血清HDL-C外,其余指标均具有显著性差异(P<0.05),表明决明子乙醇提取物组、决明子混合提取物组有明显的降低脂肪肝大鼠血脂,调节脂肪代谢的作用。
表6各组大鼠血清脂质比较
注:与模型组比较*P<0.05,**P<0.01
各治疗组对非酒精性脂肪肝大鼠肝功能的影响结果见表7所示。实验结束时,模型组大鼠血清ALT、AST均高于空白对照组,其中ALT有统计学意义(P<0.05),表明非酒精性脂肪肝大鼠存在一定程度的肝损伤;各治疗组ALT均低于模型组,其中血脂灵片组、决明子乙醇提取物组组、决明子混合提取物组与模型组比较有显著性差异(P<0.05),说明各治疗组均可降低脂肪肝大鼠血清ALT,且决明子混合提取物组有明显的量效关系,随着其剂量的增加,ALT逐渐降低。另外,与模型组比较,各治疗组大鼠血清AST均有降低趋势,但无统计学意义。
表7各组大鼠肝功能参数比较
注:与空白组比较*P<0.05,与模型组比较**P<0.05
决明子混合提取物组对非酒精性脂肪肝大鼠肝组织脂质的影响:结果见表8所示。实验结束时,与模型组相比,正常组大鼠肝组织TC,TG,LDL-C均显著性降低(P<0.01),HDL-C有降低趋势但差异无显著性(P<0.05),表明非酒精性脂肪肝大鼠存在着明显的肝内脂质代谢紊乱。给药后,决明子混合提取物组和血脂灵组均能显著降低实验大鼠肝组织TC,TG,LDL-C含量,升高HD-C含量,表明决明子混合提取物组有明显的调节脂肪肝大鼠肝内脂质代谢的作用。
表8各组大鼠肝组织脂质参数比较
注:与模型组比较*P<0.05,**P<0.01
研究结果显示,决明子混合提取物具有明显的降低非酒精性脂肪肝大鼠血清及肝组织TG、TC、LDL-C含量,升高HDL-C含量的作用,同时也表现出良好保护肝功能,减轻肝脏病理损害的效果。说明决明子混合提取物的降脂保肝作用确切。
实施例4决明子混合提取物对实验性大鼠糖尿病肾病的活性考察
模型组及治疗组采用2%链脲佐菌素(新鲜配制,溶于0.1mol/L枸橼酸缓冲液,pH4.5)60mg/kg一次性腹腔注射;对照组注射等量枸橼酸缓冲液。72小时后,用血糖仪测定末梢血血糖,血糖值≥16.5mmo/L确定为模型制备成功。糖尿病模型建立后,治疗组予实施例2所提供的决明子混合提取物5g原药材量/(kg·d)煎水灌胃。实验动物同实施例3相同。正常组和模型组喂等量饮用水。
第8周用代谢笼收集各组大鼠24小时尿液,自动生化分析仪测定尿蛋白;收集抗凝血5ml,测定血浆肌酐(Cr)、血糖(GLU)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)(仪器同上);取出右肾,横切 为约1mm的薄片,置4%多聚甲醛缓冲液中固定4小时,常规脱水、浸蜡、包埋、切片(3μm),SABC法测定NF-KB、FN表达,HE和PAS染色观察肾形态学变化。
每例标本按顺序取肾皮质20个肾小球,高倍视野下(×400),分别观察肾小球中NF-kB(细胞核呈棕褐色),均值表示每例肾小球中阳性细胞数;彩色图像分析系统分析肾皮质8个肾小球中FN染色阳性(棕褐色)的平均光密度(×400),以均值表示每组光密度。
实验结果以 表示,组间比较采用t检验,相关分析采用直线相关。总胆固醇、甘油三酯、肌酐、血糖变化见表9所示。肾小球中NF-kB、FN的表达和24小时尿蛋白变化见表10所示。
表9三组生化指标变化
注:与正常组比较*P<0.01,与模型组比较**P<0.05
表10三组肾小球NF-kB、FN表达和24h尿蛋白
HE染色光镜观察,糖尿病组大鼠肾小球系膜区基质中度增多,系膜细胞中度增生,小管间质散在单个核细胞浸润,决明子混合提取物组上述病理改变均有不同程度减轻;PAS染色对照组未见明显病理改变,糖尿病组细胞外基质明显增多,系膜区扩大;决明子混合提取物组可见细胞外基质增加,但较糖尿病组减少,系膜区扩张较糖尿病组明显减轻。NF-kB是一种介导细胞内信号转导的转录因子。在机体的免疫应答、炎症反应和细胞生长发育等方面发挥作用。糖尿病时的高血糖、高血脂、AngⅡ、尿蛋白均可激活肾组织中NF-kB。本组研究证实,DM时NF-kB活性升高的程度和尿蛋白、血肌酐水平呈正相关,抑制NF-KB的活化可延缓DN的进展。
Claims (5)
1.一种用于治疗非酒精性脂肪肝的决明子混合提取物,其特征在于:由决明子的乙醇提取物和决明子乙醇提取后残渣的水提物组成。
2.一种用于治疗非酒精性脂肪肝的决明子混合提取物的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)将决明子药材用乙醇提取,得到乙醇提取物;
2)将步骤1)中决明子药材残渣用水提取,得到水提取物;
3)合并乙醇提取物和水提取物,得到用于治疗非酒精性脂肪肝的决明子混合提取物;
步骤1)所述的乙醇提取为的决明子药材采用温浸提取方法、回流提取方法和渗漉提取方法中的任一种方法提取;
所述的乙醇提取为将决明子药材用2-20倍药材重量的15-99%的乙醇进行渗漉。
3.根据权利要求2所述的用于治疗非酒精性脂肪肝的决明子混合提取物的制备方法,其特征在于:所述的乙醇提取为将决明子药材用8-16倍药材重量的60-95%的乙醇进行渗漉,渗漉前浸泡24h,渗漉的流速为每千克药材每分钟3-7ml。
4.根据权利要求2所述的用于治疗非酒精性脂肪肝的决明子混合提取物的制备方法,其特征在于:步骤2)中所述水提取为将步骤1)中决明子药材残渣烘干挥去乙醇后,将决明子药材残渣采用温浸提取方法、水煎煮提取和回流提取方法中的任一种方法提取。
5.权利要求1所述的用于治疗非酒精性脂肪肝的决明子混合提取物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。
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