CN104220084A

CN104220084A - 包含土茯苓提取物作为有效成分的肥胖、高脂血症或脂肪肝的预防或治疗用药剂学组合物

Info

Publication number: CN104220084A
Application number: CN201380017803.1A
Authority: CN
Inventors: 朴太瑄; 黄完均
Original assignee: IND ACADEMIC COOP
Current assignee: IND ACADEMIC COOP
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2013-03-30
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2033-03-30
Also published as: CN104220084B; WO2013147561A1; KR101225486B1

Abstract

本发明涉及包含土茯苓提取物作为有效成分的选自：肥胖、高脂血症及脂肪肝的代谢疾病的预防或治疗用药剂学组合物。本发明的组合物导致体脂肪量的减少、内脏脂肪量的减少、对脂肪组织生成起到重要作用的核转录因子肝X受体α(LXRα)及固醇调节元件结合蛋白1-C(SREBP1-C)以及作为它们的靶基因的脂肪酸转移酶(CD36)及脂肪酸结合蛋白(aP2)基因的表达量的减少，最终呈现肥胖的预防或治疗效果。并且，通过减少存在于肝组织内的脂质含量，来改善肝组织内的脂肪堆积，由此呈现预防脂肪肝的发生、抑制脂肪肝病情的进展或使病态好转的效果。本发明提供包含土茯苓提取物作为有效成分的选自：肥胖、高脂血症及脂肪肝的代谢疾病的改善或缓解用食品组合物。

Description

包含土茯苓提取物作为有效成分的肥胖、高脂血症或脂肪肝的预防或治疗用药剂学组合物

【相关申请的交叉引用】

本申请要求2012年3月30日提交到韩国知识产权局的韩国专利申请No.2012-0033316的优先权，其公开内容通过引用并入本文。

【技术领域】

本发明涉及包含土茯苓(Smilax china Linne)提取物作为有效成分的肥胖、高脂血症或脂肪肝的预防或治疗用药剂学组合物。

【背景技术】

世界卫生组织(WHO，World Health Organization)曾警告说，当前达10亿的超重肥胖人口(身体质量指数(BMI)值为30以上)将在2015年达到增加50％的15亿人，从而引起严重的健康问题(2005年9月22日)。肥胖作为多种疾病的根源，糖尿病患者的80％、心脏病患者的21％由肥胖引起，并且，由肥胖引起的社会经济损失巨大【美国的情况下，每年增加约1170亿美元，韩国的情况下，从2001年的10017亿韩元增加到了2005年的18000亿韩元(直接费用11087亿韩元，间接费用7152亿韩元)】。因此，安全有效的肥胖治疗剂的开发可以减少巨大的社会经济损失。但是，能够解决市场状况的医药品局限于食欲抑制剂及脂肪吸收抑制剂，因而满足不了需要，并存在如下所提示的多种副作用。赛尼可(罗氏(Roche)公司)以诱导从胰腺及消化系统中分泌的脂肪酶的抑制的方式抑制脂肪吸收，但伴随着2～3％的低减重效果及频繁的腹泻、脂肪便等副作用。并且，诺美婷(雅培(Abbott)公司)通过抑制血清素和去甲肾上腺素的再吸收的方式抑制食欲，这虽然具有5～10％的减重效果，但由于具有脑卒中和心肌梗塞等心血管类疾病的副作用，因此，2010年由欧洲药品管理局(EMA)和美国食品药品监督管理局(FDA)下达停止处方和使用及劝告自发性回收的措施，从而退出市场，并且，2010年10月，由韩国食品药品管理局中断了在韩国的销售。除此之外，近来开发为抗肥胖药剂的产品中有相当一部分因严重的副作用而禁止了销售。例如，氨茶碱虽然具有卓越的体脂肪分解效果，但有报告指出在精神神经系统、循环系统及消化系统等方面广范围地具有副作用，而芬氟拉明、右芬氟拉明、托吡酯及麻黄素等也被判定为治疗肥胖无效药物而禁止销售。像这样，随着西医在合成医药品的副作用和慢性疾病的克服方面呈现出界限，对天然食品和药品的价值得到青睐。

非酒精性脂肪肝疾病(non-alcoholic fatty liver disease，以下称之为“NAFLD”)意味着与饮酒无关地在肝脏内堆积中性脂肪的疾病，其中包括单纯脂肪肝(steatosis)和非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)。虽然单纯脂肪肝在临床上被认为预后良好的阳性疾病，但与脂肪肝一同伴随着炎症或纤维化的非酒精性脂肪肝炎作为进行性肝脏疾病，被誉为诱发肝硬化或肝癌的前驱疾病。

肥胖和胰岛素抵抗为代表性的非酒精性脂肪肝疾病的危险因子。作为肝纤维症的病情进展的危险因子，可以举出例如肥胖(身体质量指数＞30)、血中肝功能指标比率(天门冬氨酸氨基转移酶/丙氨酸氨基转移酶＞1)及糖尿病，尤其，在C型肝炎携带者患有非酒精性脂肪肝的情况下，能够引起肝癌，因此，预防及治疗的必要性正在抬头。非酒精性脂肪肝患者的69～100％为肥胖患者，20～40％的肥胖患者伴随着非酒精性脂肪肝，尤其，男性肥胖患者的肝脏疾病发病率比女性肥胖患者呈现的更高。有报告指出，在西方社会，不仅仅是肥胖患者，正常体重成人的3～30％呈现出非酒精性脂肪肝病变。与韩国饮食生活相似的日本的非酒精性脂肪肝发病率推断为约20％，其中，1％为非酒精性脂肪肝炎。非酒精性脂肪肝不仅对成人而言是个问题，而且对肥胖儿童而言也是个问题。10～77％的肥胖儿童(居住于欧洲、美国及亚洲)呈现出非酒精性脂肪肝病变，这是因为非酒精性肝脏疾病的最重要的危险因子为肥胖。

非酒精性脂肪肝的发病原因能够通过两种机制来说明。第一种机制是游离脂肪酸的增加在肝细胞内抑制脂肪酸氧化，由此使脂肪酸堆积于肝细胞内并发病，第二种机制是由与炎症及纤维症的病情进展相关的所有体内作用机制引发。即，脂肪酸的增加使细胞色素过氧化物酶2E1(cytochrome peroxidase 2E1，CYP2E1)的表达增加，并生成活性氧簇(reactive oxygen species)来诱导肝细胞膜的脂质过氧化，脂多糖(LPS，lipopolysaccharide)和氧化应激的增加使肿瘤坏死因子-α(TNF-α，tumor necrosis factor-α)增加，诱导肝细胞的细胞凋亡，引起肝损伤。胰岛素抵抗和脂肪酸的堆积会诱发线粒体功能障碍，而后者会使活性氧簇和一氧化氮合酶(NOS，NO synthetase)增加，最终诱导细胞凋亡。

用于治疗非酒精性脂肪肝病(NAFDL)的最好的方法为通过改变生活方式(代表性的为运动)的体重减少。但是，只通过运动难以治愈的情况下，能够并行选择利用药物的治疗，到目前为止，使用于非酒精性脂肪肝患者的治疗剂大致分为两种概念。第一种类型的治疗剂为通过校正肥胖治疗剂(赛尼可)、胰岛素抵抗治疗剂(二甲双胍、吡格列酮、罗格列酮)、高脂血症治疗剂(氯贝丁酯、吉非罗齐、苯扎贝特、阿托伐他汀、辛伐他汀)之类的危险因子来治疗及改善脂肪肝的药剂。即，二甲双胍具有增加脂肪酸的氧化，减少脂肪形成酶，并改善胰岛素血症和胰岛素抵抗的作用。另一方面，噻唑烷二酮、罗格列酮及吡格列酮使作为核激素受体的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)活性化，促进肌肉中的糖吸收。第二种类型的治疗剂作为与非酒精性脂肪肝的危险因子的校正独立地恢复肝细胞损伤的功能的药物，包括肝细胞保护剂(熊去氧胆酸及牛磺酸)、抗氧化剂(维生素E及维生素C)及营养补充剂(卵磷脂、甜菜碱、N-乙酰半胱氨酸)，但到目前为止，还没出现既没有副作用，治疗效果又好的理想的药剂。

根据韩国草药(生药)药典，土茯苓为属于百合科(Liliaceae)的根茎植物，学名为Smilax china Linne。土茯苓还被称之为菝葜、小勾儿茶、禹余粮、真果树、金刚藤、刺猪苓、山归来、久老薯、毛尾薯、地胡苓、山奇良、红土苓、土苓、狗朗头、尖光头及白葜的多种别名。

土茯苓自生于日本、中国及韩国。用作生药的土茯苓的部位为根，长度为5～15cm、直径为2～5cm，性状不均，且有时以打结状呈分开的圆柱形状。外表面为呈灰色的黄褐色，上面处处突出有茎的残基。土茯苓的根茎几乎没有气味和味道。

传统上，土茯苓被誉为具有祛风湿、利尿、解毒及消肿的功效，并使用为关节疼痛、麻木、水肿、肠炎、痢疾、淋巴腺炎、红白带下、梅毒、肿瘤等的治疗剂。到目前为止，以科学方式证明的土茯苓的药理作用有抗糖尿病、抗炎、抗氧化及抗癌作用。有报告指出过，以注射四氧嘧啶来诱发糖尿病的白化大鼠为对象，空腹给药土茯苓提取物时，使血糖减少(Rajesh Bhatii.,et al,Asian Journal of TraditionalMedicines,6:218-223(2011))。并且，土茯苓提取物被确认在被脂多糖诱导的巨噬细胞中使环氧合酶2的活性减少，并抑制前列腺素E2(PGE2，prostaglandin E2)的堆积，从而呈现抗炎作用(Xiao-ShunShu.,et al.Journal of Ethnopharmacology 103:327-332(2006))，并且，被报告为具有作为去除活性氧簇的抗氧化剂的效果(Lee SE.,et al.Exp Mol Med.33:263-268(2001))。并且，曾在乳腺癌细胞株(MCF-7)中确认了土茯苓提取物的抗癌作用(Li-ShengWu.,et al.Journal of Ethnopharmacology.130:460-464(2010))。

土茯苓中所含的活性物质有菝葜皂甙、前皂甙元A、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷、甲基纤细薯蓣皂苷及甲基原薯蓣皂苷等(Kim,S.W.et al.20:145-146(1989),Sashida,Y.et al,Phytochemistry 31:2439-2443(1992))。

在本说明书全文中参照了多篇论文及专利文献，并标有它们的引用。所引用的论文及专利文献的公开内容作为参照全部插入于本说明书，由此更加明确地说明本发明所属技术领域的水准及本发明的内容。

【发明概述】

本发明人为了研发能够有效地预防或治疗肥胖、高脂血症或脂肪肝且对人体安全的物质，尤其研发植物来源物质而进行了努力研究，其结果，发现从以往开始用作中药材的土茯苓在预防或治疗肥胖、高脂血症或脂肪肝方面非常有效，由此完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供包含土茯苓提取物作为有效成分的代谢疾病的预防或治疗用药剂学组合物，所述代谢疾病选自：肥胖、高脂血症及脂肪肝。

本发明的另一目的在于，提供包含土茯苓提取物作为有效成分的代谢疾病的改善或缓解用食品组合物，所述代谢疾病选自：肥胖、高脂血症及脂肪肝。

本发明的另一目的在于，提供预防或治疗代谢疾病的方法，包括给有需求的对象施用包含土茯苓提取物作为有效成分的药剂学组合物，所述代谢疾病选自：肥胖、高脂血症及脂肪肝。

本发明的其他目的及优点通过发明内容及发明要求保护范围变得更加明确。

【附图说明】

图1为表示摄取实验食物的小鼠的饲养期间的体重增加量变化趋势(g)、8周内的总累计体重增加量(g/56天)及每日食物摄取量(g/天)的图。

图2为表示摄取实验食物的小鼠的不同部位的内脏脂肪重量(g)的图。

图3为表示摄取实验食物的小鼠血液的脂质及葡萄糖浓度的图。

图4为表示在摄取实验食物的小鼠中测定非酒精性脂肪肝相关指标的结果的图。

图5表示小鼠血中脂连激素浓度及肝组织的脂肪生成相关基因及蛋白质的表达变化的图。

【发明详述】

根据本发明的一实施方式，本发明提供包含土茯苓提取物作为有效成分的代谢疾病的预防或治疗用药剂学组合物，所述代谢疾病选自：肥胖、高脂血症及脂肪肝。

本发明人为了研发能够有效地预防或治疗肥胖、高脂血症或脂肪肝且对人体安全的物质，尤其研发植物来源物质而进行了努力研究，其结果，查明了从以往开始用作中草药的土茯苓在预防或治疗肥胖、高脂血症或脂肪肝方面非常有效。

本发明的组合物有效地作用于肥胖、高脂血症或脂肪肝的预防或治疗。

根据本发明，在摄取包含土茯苓提取物的高脂肪食品的情况下，与仅摄取高脂肪对照食物的情况相比，减少内脏脂肪量、中性脂肪浓度、总胆固醇浓度及游离脂肪酸浓度等血浆脂质的浓度，并且，在测定肝组织的脂质浓度及肝功能数值的变化的结果呈现出了显著的效果。

根据本发明，土茯苓提取物诱发体重及内脏脂肪的减少、血浆中性脂肪、总胆固醇、游离脂肪酸的浓度及肝组织中性脂肪的减少，发挥显著缓解由高脂肪食物诱发的肥胖现象。并且，通过减少因摄取高脂肪食物而在肝组织中增加的核转录因子及其靶基因的表达，从而抑制肝组织中的脂肪生成来显著改善脂肪肝。

在本发明的组合物中，用作有效成分的土茯苓意味着属于百合科的根茎植物。

在利用提取溶剂对土茯苓进行处理来获得在本发明的组合物中所使用的土茯苓提取物的情况下，可利用多种提取溶剂。优选地，可利用极性溶剂或非极性溶剂。作为极性溶剂适合的包含(i)水、(ii)醇(优选为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、1-戊醇、2-丁氧基乙醇或乙二醇)、(iii)醋酸、(iv)二甲基甲酰胺(DMFO，dimethyl-formamide)及(v)二甲基亚砜(DMSO，dimethyl sulfoxide)。作为非极性溶剂适合的包含丙酮、乙腈、乙酸乙酯、乙酸甲酯、氟代烷、戊烷、己烷、2,2,4-三甲基戊烷、癸烷、环己烷、环戊烷、二异丁烯、1-戊烯、1-氯丁烷、1-氯戊烷、邻二甲苯、二异丙基醚、2-氯丙烷、甲苯、1-氯丙烷、氯苯、苯、二乙基醚、二乙基硫醚、氯仿、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、苯胺、二乙基胺、醚、四氯化碳及四氢呋喃(THF，Tetrahydrofuran)。

更优选地，利用于本发明的提取溶剂包含(a)水、(b)碳数1-4的无水或含水低级醇(甲醇、乙醇、丙醇及丁醇等)、(c)上述低级醇和水之间的混合溶剂、(d)丙酮、(e)乙酸乙酯、(f)氯仿、(g)乙酸丁酯、(h)1，3-丁二醇、(i)己烷及(j)二乙基醚。最优选地，本发明的提取物为利用水、甲醇、乙醇或它们的组合对土茯苓进行处理来获取的。

如上所述，本说明书中所使用的术语“提取物”虽然具有在所属领域通用为粗提物(crude extract)的意义，但在广义上也包含追加地分馏(fractionation)提取物的分馏物。即，土茯苓提取物不仅包含利用上述提取溶剂获得的提取物，而且还包含在此追加适用纯化过程来获得的提取物。例如，通过使上述提取物通过具有规定分子量截止值的超滤膜来获得的分馏，通过多种层析法(为了大小、电荷、疏水性或亲和性的分离而制作的)的分离等追加实施的多种纯化方法来获得的分馏也属于本发明的土茯苓提取物。

本发明所利用的土茯苓提取物可通过减压蒸馏及冷冻干燥或喷雾干燥等追加的过程来制备成粉末状态。

本发明所利用的土茯苓提取物优选为土茯苓茎提取物或土茯苓叶提取物，更优选为土茯苓茎提取物。

本说明书中所使用的术语“肥胖”意味着在体内过度堆积体脂肪，术语“脂肪肝”是指因肝的脂肪代谢障碍而使脂肪过度堆积于肝细胞的状态，这会成为心绞痛、心肌梗塞、脑卒中、动脉硬化及胰腺炎等多种疾病的原因。

本说明书中所使用的术语“高脂血症”是指因无法正常进行中性脂肪和胆固醇等的脂肪代谢，血液中的脂肪量增多而诱发的疾病。更具体地，高脂血症以血液内的中性脂肪、低密度(LDL)胆固醇、磷脂质及游离脂肪酸等的脂质成分增加的状态，包括发生频率高的高胆固醇血症或高中性脂肪血症。

本说明书中所使用的术语“非酒精性脂肪肝”意味着在没有饮酒史的患者身上呈现的与酒精性肝脏疾病类似的肝功能的障碍及组织损伤，更具体地，是指在没有饮酒史的患者中，肝内脂肪堆积占肝重量的约5～10％以上的情况。

本说明书中所使用的术语“代谢疾病”为以一种疾病组将各种心血管疾病和第二型糖尿病的危险因素相互形成群集的现象概念化的术语，是意味着均包括胰岛素抵抗及与其相关的复杂且多样的多种代谢异常和临床形态的概念。1988年，瑞文(Reaven)主张这种症状的共同原因为体内的胰岛素作用无法正常实现的胰岛素抵抗，并命名为胰岛素抵抗综合征，但1998年，世界卫生组织(WHO)称，胰岛素抵抗无法完全说明该症状的所有因素，因此，引入了叫做“代谢综合征”或“代谢疾病”的术语。

根据本发明的优选实例，本发明的组合物使肝脂肪或内脏脂肪减少。

本发明中的术语“肝”及“内脏”包括各个细胞或组织。

根据本发明，本发明的组合物摄取组与高脂肪食物(HFD，high fatdiet)对照组相比，显著减少了血中及肝组织的脂质浓度，并且，总内脏脂肪重量显著减少了38％。

根据本发明的更优选的实例，本发明的脂肪包含中性脂肪、胆固醇及游离脂肪酸。

根据本发明更优选的实例，本发明的内脏脂肪包含选自附睾脂肪、肾周围脂肪、肠系膜脂肪及腹膜后脂肪中的一种或一种以上的脂肪。

根据本发明的优选实例，本发明的组合物使血中丙氨酸氨基转移酶(ALT，alanine aminotransferase)及天门冬氨酸氨基转移酶(AST，aspartate aminotransferase)的量减少。

本发明中的术语“丙氨酸氨基转移酶”及“天门冬氨酸氨基转移酶”作为在肝受损的情况下，血中的数值分别增加的酶，是利用这种特性用作肝功能指标的酶。

本说明书中，术语“(丙氨酸氨基转移酶及天门冬氨酸氨基转移酶量的)减少”意味着与没有使用本发明的组合物的目标体(对照组)相比，丙氨酸氨基转移酶及冬氨酸氨基转移酶的量以能够测定的程度明显减少，优选地，意味着减少30％以上，更优选地，意味着减少20％以上，进一步优选地，意味着减少10％以上。

根据本发明，确认了本发明的组合物与高脂肪食物对照组相比，使血液内丙氨酸氨基转移酶及冬氨酸氨基转移酶的活性分别显著减少22％及38％，由此使脂肪肝现象，更优选为非酒精性脂肪肝现象得到显著缓解，从而具有改善脂肪肝的效果。因此，本发明的组合物最终具有明显改善由高脂肪食物诱导的肥胖中呈现出的脂肪肝的效果。

根据本发明的优选实例，本发明的组合物使血液内脂连激素(adiponectin)的量及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK，AMP-activatedprotein kinase)的磷酸化增加。若由于从脂肪细胞分泌的脂肪细胞因子而使血液内的浓度增加，脂连激素则使腺苷酸活化蛋白激酶的磷酸化增加，并使作为促进脂肪生成的主要转录因子的肝X受体α(LXRα)、固醇调节元件结合蛋白1-C(SREBP1-C)及作为它们的靶基因的脂肪酸转移酶(CD36)及脂肪酸结合蛋白(aP2)的表达减少。

本说明书中，术语“(血液内脂连激素的量的)增加”意味着与没有给药本发明的组合物的对象(对照组)相比，血液内脂连激素的量以能够测定的程度显著增加，优选地，意味着增加40％以上，更优选地，意味着增加10％以上。

本说明书中，术语“(腺苷酸活化蛋白激酶的磷酸化的)增加”意味着与没有给药本发明的组合物的对象(对照组)相比，腺苷酸活化蛋白激酶的磷酸化以能够测定的程度显著增加，优选地，意味着增加40％以上，更优选地，意味着增加10％以上。

根据本发明的优选实例，本发明的组合物使肝X受体α(LXRα，Liver X receptorα)、固醇调节元件结合蛋白1-C(SREBP1-C，Sterolresponse element binding protein)、脂肪酸转移酶(CD36，Fatty acidtranslocase)或脂肪酸结合蛋白(aP2，fatty acid binding protein)的表达减少。本发明的组合物使肝X受体α及固醇调节元件结合蛋白1-C的表达减少，最终使作为它们的靶基因的脂肪酸转移酶(CD36)及脂肪酸结合蛋白(aP2)的表达减少，由此呈现出使肝组织的脂肪生成得到改善的效果。

在本发明的组合物制备为药剂学组合物的情况下，本发明的药剂学组合物包含药剂学上允许的载体。包含于本发明的药剂学组合物的药剂学上允许的载体作为制剂时通常所利用的载体，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不局限于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分之外，还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂及保鲜剂等。药剂学上允许的适合的载体及制剂详细地记载于Remington's Pharmaceutical Sciences(19 th ed，1995)。

本发明的药剂学组合物可以口服给药或非口服给药，优选地，以口服给药的方式适用。

本发明的药剂学组合物的适合的给药量能够根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素以多种方式进行处方。以成人为标准，本发明的药剂学组合物的优选给药量在于0.001～100mg/kg范围内。

本发明的药剂学组合物可根据该发明所属技术领域的普通技术人员能够容易实施的方法，能够利用药剂学上允许的载体和/或赋形剂实现制剂化，由此以单位容量形态制备或以内置于多容量容器内的方式制备。此时，剂型可以为油性或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆剂，或者也可以为乳化液形态或浸膏剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还能包括分散剂或稳定剂。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含土茯苓提取物作为有效成分的代谢疾病的改善或缓解用药剂学组合物，所述代谢疾病选自：肥胖、高脂血症及脂肪肝。

在本发明的组合物制备为食品组合物的情况下，不仅包含土茯苓提取物作为有效成分，还包含制备食品时通常添加的成分作为有效成分，例如，包含蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素、调味剂及香味剂。上述碳水化合物的例为单糖，例如，葡萄糖、果糖等；双糖，例如，麦芽糖、蔗糖及寡糖等；以及多糖，例如，糊精、环糊精等常规的糖及木糖醇、山梨糖醇及赤藓糖醇等糖醇。作为香味剂，可以使用天然香味剂“奇异果甜蛋白、甜叶菊提取物(例如，莱鲍迪甙A、甘草皂苷等)”及合成香味剂(糖精、阿斯巴甜等)。

例如，在本发明的食品组合物制备为饮料剂的情况下，除了作为本发明的有效成分的土茯苓提取物之外，还能包含柠檬酸、液态果糖、糖、葡萄糖、醋酸、苹果酸、果汁、杜仲提取液、大枣提取液或甘草提取液等。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供代谢疾病(metabolicdisease)的预防或治疗方法，包括给对象施用药剂学有效量的包含土茯苓提取物作为有效成分的组合物的步骤，所述代谢疾病选自：肥胖、高脂血症及脂肪肝。

简要本发明的特征及优点如下。

(i)本发明提供包含土茯苓提取物作为有效成分的代谢疾病的预防或治疗用药剂学组合物，所述代谢疾病选自：肥胖、高脂血症及脂肪肝。

(ii)本发明的组合物导致体脂肪量的减少、内脏脂肪量的减少、对脂肪组织生成起到重要作用的核转录因子肝X受体α及固醇调节元件结合蛋白1-C以及作为它们的靶基因的脂肪酸转移酶(CD36)及脂肪酸结合蛋白(aP2)基因的表达量的减少，最终呈现肥胖的预防或治疗效果。

(iii)本发明的组合物通过减少存在于肝组织内的脂质含量，来改善肝组织内的脂肪堆积，从而呈现出预防脂肪肝产生，抑制脂肪肝的病情进展或使疾病状态好转的效果。

(iv)并且，本发明提供包含土茯苓提取物作为有效成分的代谢疾病的改善或缓解用药剂学组合物，所述代谢疾病选自：肥胖、高脂血症及脂肪肝。

(v)此外，本发明还提供预防或治疗代谢疾病的方法，包括给有需求的对象施用药剂学有效量的包含土茯苓提取物作为有效成分的药剂学组合物，所述代谢疾病选自：肥胖、高脂血症及脂肪肝。

以下，通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例用于更具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不会局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言是显而易见的。

【实施例】

【实施例1：土茯苓提取物的调配】

利用粉碎机将1kg的土茯苓(Similac china Linne)茎制成粗末之后，放入6L的酒精(90％乙醇)，并在回流提取机中提取了三次。利用过滤纸过滤土茯苓茎提取物之后，在减压浓缩机中进行低温浓缩，之后使用冷冻干燥机获得80.8g(收率8.08％)的提取物，并使用于实验中。利用粉碎机将100g的土茯苓叶制成粗末之后，放入6L的酒精(90％乙醇)，并在回流提取机中提取了三次。利用过滤纸过滤土茯苓叶提取物之后，在减压浓缩机中进行低温浓缩，之后使用冷冻干燥机获得18.3g(收率18.3％)的提取物，并使用于实验中。

【实施例2：土茯苓提取物减少体重及内脏脂肪的功效】

【实验食物的制备及实验动物的饲养】

在本实验中所使用的肥胖诱导食物为高脂肪对照食物(high fatdiet，HFD：40％脂肪卡路里，17g猪油+3％玉米油/100 g食物)，而补充土茯苓茎提取物的食物(Similac china L.stalkextract-supplemented diet，T1D)的组成成分虽然与高脂肪食物的组成成分相同，但以0.4％的水准包含土茯苓茎提取物。正常食物组(Chow)摄取了商业性的啮齿类饲料(表1)。

利用固体饲料使5周龄的雄性C57BL/6J小鼠(东方(Orient)公司，韩国)在一周内适应于实验室环境之后，根据随机分组法任意配置为高脂肪食物对照组和实验组，并饲养了8周。每天上午10～11点之间和水一同供给了食物，并每天测定了食物摄取量，每周测定了体重。为了防止饲料摄取引起的突然的体重变化而去除了饲料桶，并在2小时之后测定了体重。使实验动物禁食12小时以上之后，在利用二乙基醚麻醉的状态下采集血液、肝及内脏脂肪组织(附睾脂肪、肾周围脂肪、肠系膜脂肪及腹膜后脂肪)，并利用0.1M磷酸缓冲溶液(pH7.4)清洗之后，测定了重量。从腹部大动脉采集的血液在1000xg的转速之下离心分离15分钟，由此分离了血浆。

【表1】

实验食物组成表

【体重及内脏脂肪重量的变化】

摄取8周的实验食物之后，观察最终体重及累计体重增加量(g/8周)如下，即，与高脂肪食物对照组(HFD)相比，在补充摄取土茯苓茎提取物的组(T1D)中，最终体重显著减少了22％，且累计体重增加量显著减少了40％，在补充摄取土茯苓叶提取物的组(T2D)中，累计体重增加量显著减少了25％。摄取土茯苓茎提取物及土茯苓叶提取物，在食物摄取量方面未造成变化，而与高脂肪食物对照组相比，将实验食物饲养期间内的总体重增加量除以实验食物摄取量的食物功效比(food efficiency ratio)在T1D组及T2D组中显著减少(图1)。因此，可知土茯苓茎及叶提取物具有体重下降效果，尤其，与土茯苓叶提取物相比，土茯苓茎提取物的体重下降功效更卓越。并且，可知这种土茯苓提取物的体重减少功效并非缘于食物抑制。

在摄取8周实验食物之后，分别摘除组成内脏脂肪的附睾脂肪、肾周围脂肪、肠系膜脂肪及腹膜后脂肪，并测定重量的结果见图2。将这四个部位加起来的总内脏脂肪重量与高脂肪食物对照组(HFD)相比，在土茯苓茎提取物摄取组(T1D)中显著减少了32％，在土茯苓叶提取物摄取组(T2D)的情况下显著减少了16％(P＜0.001)(图2)。因此，确认了土茯苓茎提取物具有非常卓越的体重及内脏脂肪量减少效果。

【实施例3：土茯苓提取物的高脂血症及非酒精性脂肪肝的改善功效】

【血液及肝组织的生化分析方法】

在上述内容中，以饲养8周的实验动物为对象，以如下方式测定了血浆总胆固醇、中性脂肪、葡萄糖浓度及肝组织的脂质成分。利用商业用测定试剂盒(生物临床系统，Bio Clinical system)分别反复测定两次血浆总胆固醇、中性脂肪及游离脂肪酸及葡萄糖的浓度。使用商业用分析试剂盒(生物临床系统，韩国)测定了使用为肝功能指标的血中丙氨酸氨基转移酶及天门冬氨酸氨基转移酶的量。

根据福尔茨(Folch)等的方法(Folch J et al.，J Biol Chem。226:497-509(1957))，如下摄取肝组织的脂质成分。在0.25g的肝组织中加入1mL的蒸馏水之后，使用宝创(Polytron)均质机来进行均质化。在均质液中加入5mL的氯仿:甲醇溶液(2:1，v/v)并均匀混合之后，在1000xg的转速条件下离心分离10分钟，分离出下清液，并在上清液重新添加2mL的氯仿:甲醇溶液(2:1，v/v)之后，反复执行相同过程，由此完全分离了肝的脂质成分。在如此获得的下清液中加入3mL的氯仿:甲醇：0.05％的CaCl₂(3:48:47，v/v/v)溶液来混合1分钟之后，在1000xg的转速条件下离心分离10分钟，取下最终下清液，用氮气完全干燥之后，将干燥的脂质溶解于1mL的甲醇，用于脂质成分的分析。肝组织脂质提取液的中性脂肪、胆固醇及游离脂肪酸的浓度是使用与为了分析血浆而使用的试剂盒相同的商业用脂质分析试剂盒(生物临床系统，韩国)来测定的。

【血液生化指标的变化】

观察摄取8周实验食物的小鼠的血浆脂质浓度如下，即，与高脂肪食物对照组(HFD)相比，在土茯苓茎提取物摄取组(T1D)中的总胆固醇浓度显著减少了36％，中性脂肪浓度显著减少了41％，游离脂肪酸浓度显著减少了45％(图3)。并且，使摄取高脂肪食物的小鼠补充摄取土茯苓茎提取物的结果表明，与高脂肪食物对照组相比，当空腹时，血糖显著减少了40％。因此，可知土茯苓提取物具有显著缓解由高脂肪食物诱导的肥胖所呈现的高脂血症，并在空腹时降低血糖的效果。

【非酒精性脂肪肝相关指标的变化】

与高脂肪食物对照组(HFD)相比，使小鼠摄取8周实验食物之后所测定的肝重量在土茯苓茎提取物摄取组(T1D)显著减少了22％，在土茯苓叶提取物摄取组(T2D)显著减少了20％。观察肝组织的脂质浓度如下，即，与高脂肪食物对照组相比，在T1D组中的中性脂肪浓度显著减少了47％，胆固醇浓度显著减少了71％，游离脂肪酸浓度显著减少了69％(图4)。与高脂肪食物对照组相比，作为肝功能指标的血浆丙氨酸氨基转移酶及天门冬氨酸氨基转移酶的活性在T1D组中分别显著减少了22％及38％(图4)。因此，可知土茯苓茎提取物具有显著缓解由于长时间摄取高脂肪食物而诱导的脂肪肝现象的效果。

【实施例4：基于土茯苓茎提取物的小鼠肝组织的脂肪质生物合成相关基因及蛋白质表达抑制功效】

【血中脂连激素浓度的测定】

利用商业用试剂盒(密理博(Millipore)公司，马萨诸塞州，美国)测定了血中脂连激素浓度。在96孔板中放入1×分析缓冲液和血浆试样，处理检测抗体，并在常温条件下反应2小时。在去除各孔板中的溶液之后，利用清洗缓冲液清洗了五次。将酶溶液放入各孔板，并在常温条件下反应30分钟之后，利用清洗缓冲液清洗了五次。添加基质溶液，并在常温条件下反应20分钟之后，放入停止溶液，使反应停止。利用分光计(450nm)测定了最终反应产物。

【RNA的分离及确认】

在每0.1g附睾脂肪组织添加1mL的三环唑(tricyclazole)溶液来粉碎组织之后，在4℃、12000×g转速条件下离心分离10分钟。将上清液移到新试管之后，添加200μl的氯仿，并进行了涡流。将这一过程反复实施两次之后，将上清液移到新试管，然后以1:1的比率添加了异丙醇及上清液。用力摇荡10次之后，在室温下放置10分钟，之后在12000×g、4℃条件下离心分离10分钟，然后去除上清液，并在剩余的沉淀物添加1mL的70％乙醇，在7500×g、4℃条件下离心分离5分钟。在去除乙醇之后，在室温条件下使装有RNA沉淀物的试管干燥5分钟，并使用未包含核酸水解酶的水使RNA团块(pellet)溶解。利用UV/VIS分光计(贝克曼库尔特(Beckman coulter)公司，DU730)在260nm及280nm波长下，测定所提取的RNA试样的浓度，并实时琼脂糖凝胶电泳，来确认了RNA试样的纯度。

【逆转录聚合酶链反应(RT-PCR，reversetranscription-polymerase chain reaction)结果】

以在附睾脂肪组织中提取的RNA试样为对象，利用寡dT引物和逆转录酶(玉博公司(GIBCO BRL)，盖色斯堡，马里兰州，美国)执行逆转录，从而合成了cDNA。以通过逆转录获得的cDNA为模板，将待扩增的基因cDNA的5’和3’侧翼序列(flanking sequence)使用为引物来执行聚合酶链式反应(PCR)，此时所使用的引物序列如表2所示。用1％的琼脂糖凝胶的所扩增的聚合酶链式反应产物1μl进行电泳来确认DNA带。

【表2】

利用于逆转录聚合酶链反应的引物序列

【蛋白质印迹(Western blotting)分析方法】

在研钵中，与液氮及细胞溶解缓冲液一同使规定量的肝组织均质化之后，将组织液移到新试管并进行涡流。在13000rpm、4℃条件下离心分离20分钟之后，取中间层，并通过考马斯亮蓝(Bradford)方法对蛋白质进行定量。用十二烷基硫酸钠(SDS，Sodium dodecylsulfate)聚丙烯酰胺(polyacrylamide)凝胶对50μg的蛋白质量进行电泳之后，对聚偏氟乙烯(PVDF，Polyvinylidene fluoride)超薄膜进行免疫印迹。使用针对蛋白质的相关抗体(腺苷酸活化蛋白激酶及磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phospho AMPK)(Thr172)，细胞信号转导技术公司(Cell Signaling Technology)，马萨诸塞州，美国)进行反应，并利用增强型化学发光试剂(ECL)来检测，并评价了特定蛋白质量。

【血中脂连激素浓度变化】

以在8周内摄取正常食物(Chow)、高脂肪食物(HFD)及在高脂肪食物中补充0.4％的土茯苓茎提取物的食物(T1D)的小鼠的血浆作为对象执行酶联免疫吸附试验(ELISA)的结果，观察到了高脂肪食物对照组(HFD)与正常食物组相比，血中脂连激素的浓度显著减少，相反，T1D组与高脂肪食物对照组相比，血中脂连激素的浓度显著增加(图5)。

【肝组织的脂肪生成相关基因表达及腺苷酸活化蛋白激酶磷酸化变化】

血中脂连激素为从脂肪细胞中分泌的脂肪细胞因子(Adipokine)，若血中脂连激素的浓度增加，则会与肝组织的脂连激素受体相结合，来增加腺苷酸活化蛋白激酶(AMPactivated protein kinase)的磷酸化。活性化的腺苷酸活化蛋白激酶通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR，mammalian target of rapamycin)来抑制S6激酶1(S6K1)的磷酸化，其结果，减少作为促进脂肪生成的主要转录因子的肝X受体α及固醇调节元件结合蛋白1-C以及作为它们的靶基因的CD36及aP2的mRNA表达，由此改善肝组织的脂肪生成。

在摄取高脂肪食物的小鼠中，在改善脂肪肝的作用机制之下，假设土茯苓茎提取物参与脂连激素受体-腺苷酸活化蛋白激酶的信号传递的情况下，本发明测定了参与脂连激素-受体-腺苷酸活化蛋白激酶的信号传递的分子的蛋白质磷酸化程度及基因表达量。在肝组织中执行蛋白质印迹的结果，观察到了高脂肪食物对照组与正常食物组相比，腺苷酸活化蛋白激酶的磷酸化显著减少，相反，T1D组与高脂肪食物对照组相比，腺苷酸活化蛋白激酶的磷酸化显著增加(图5)。作为腺苷酸活化蛋白激酶的下游信号(downstream signal)传递物质，且作为促进脂肪生成的主要核转录因子的肝X受体α及固醇调节元件结合蛋白1-C以及它们的靶基因(CD36及aP2)的mRNA表达量在高脂肪食物对照组中比正常食物组显著增加，相反，在T1D组中比高脂肪食物对照组再次显著减少(图5)。因此，可知土茯苓茎提取物在摄取高脂肪食物的小鼠的肝组织中通过脂连激素受体-腺苷酸活化蛋白激酶介导的信号传递体系抑制了脂肪生成。

以上，对本发明的特定部分进行详细说明，这种具体说明仅作为优选实例，本发明的范围并不局限于此，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言是显而易见的。因此，本发明的实质范围应通过所附的发明要求保护范围及其等同技术方案而定义。

Claims

1.一种代谢疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其包含土茯苓提取物作为有效成分，所述代谢疾病选自：肥胖、高脂血症及脂肪肝。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述土茯苓提取物为土茯苓茎提取物或土茯苓叶提取物。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物用于减少肝脂肪或内脏脂肪。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述脂肪包含中性脂肪、胆固醇或游离脂肪酸。

5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述内脏脂肪包含选自附睾脂肪、肾周围脂肪、肠系膜脂肪及腹膜后脂肪中的一种或一种以上。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述脂肪肝为非酒精性脂肪肝。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物用于减少血液内的丙氨酸氨基转移酶或天门冬氨酸氨基转移酶的量。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物用于增加血液内的脂连激素的量。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物用于增加腺苷酸活化蛋白激酶的磷酸化。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物用于减少肝X受体α、固醇调节元件结合蛋白1-C、脂肪酸转移酶或脂肪酸结合蛋白的表达。

11.一种代谢疾病的改善或缓解用食品组合物，其包含土茯苓提取物作为有效成分，所述代谢疾病选自：肥胖、高脂血症及脂肪肝。

12.一种代谢疾病的预防或治疗方法，其包括给对象施用药剂学有效量的包含土茯苓提取物作为有效成分的组合物的步骤，所述代谢疾病选自：肥胖、高脂血症及脂肪肝。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述土茯苓提取物为土茯苓茎提取物或土茯苓叶提取物。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述组合物用于减少肝脂肪或内脏脂肪。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述脂肪包含中性脂肪、胆固醇或游离脂肪酸。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述内脏脂肪包含选自附睾脂肪、肾周围脂肪、肠系膜脂肪及腹膜后脂肪中的一种或一种以上。

17.根据权利要求12所述的方法，其中所述脂肪肝为非酒精性脂肪肝。

18.根据权利要求12所述的方法，其中所述组合物用于减少血液内的丙氨酸氨基转移酶或天门冬氨酸氨基转移酶的量。

19.根据权利要求12所述的方法，其中所述组合物用于增加血液内的脂连激素的量。

20.根据权利要求12所述的方法，其中所述组合物用于增加腺苷酸活化蛋白激酶的磷酸化。

21.根据权利要求12所述的方法，其中所述组合物用于减少肝X受体α、固醇调节元件结合蛋白1-C、脂肪酸转移酶或脂肪酸结合蛋白的表达。