CN113101299A - 水前寺蓝藻多糖在制备治疗烫伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了水前寺蓝藻多糖在制备治疗烫伤药物中的应用。水前寺蓝藻多糖在治疗烫伤时，使IL‑1β水平下降，能够缓解急性炎症反应，且在愈合过程中降低Col I含量，使Col III含量上升，伤口愈合后不易留下瘢痕。

Description

水前寺蓝藻多糖在制备治疗烫伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及水前寺蓝藻多糖在制备治疗烫伤药物中的应用。

背景技术

烫伤是常见的意外伤害类型，皮肤覆盖整个体表，是机体最大的器官，烫伤后普遍伴有组织坏死的情况，不仅损伤创面处局部组织，还可引起全身性的损伤及炎症反应，因此也被称为烫伤病。烫伤严重程度的衡量主要是根据烫伤部位、面积大小及烫伤深度进行综合判断，一般分为如下四个等级：

I度烫伤：烫伤深度较浅，仅涉及皮肤表层损伤，造成皮肤创面局部轻度红肿，具体表现为烫伤部位表面干燥且疼痛明显，无水泡出现，普遍在一周左右症状自行消退。

II度烫伤：烫伤深度较I度烫伤深，可细分为浅II度烫伤和深II度烫伤两类。

(1)浅II度烫伤涉及真皮部乳头层损伤，具体表现为烫伤部位出现局部红肿及剧烈疼痛，按压创面处会出现发白现象，这是浅II度烫伤的明显特征之一。同时，浅II度烫伤会伴随有大小不等的水泡和不同程度的体液渗出，具体表现为创面处发生水肿，一般需要2-3周才能恢复；

(2)深II度烫伤涉及真皮部网状层损伤，通常表现为创面处发白，但不产生水泡，创面处水肿现象明显，临床上属于最不稳定的一种烫伤状态，处理合理可恢复并向浅II度烫伤转化，处理不当时，则可恶化为III度烫伤。深II度烫伤因其变异因素较多，愈后可能出现瘢痕增生和挛缩现象，愈合时间普遍在3周以上。

III度烫伤：III度烫伤为重度烫伤，烫伤涉及深入至皮下基底层，皮下脂肪、肌肉、骨骼，具体表现为创面处呈灰色或红褐色，出现明显的水肿现象和强烈的炎症反应，创面处皮肤干燥坚硬，无痛感，皮肤附属器及神经被破坏。

其中深II度烫伤在临床上最为普遍。目前对烫伤修复的研究主要集中在抗炎方面，对具体的烫伤修复的机制研究依旧较少。

创面的愈合主要依赖于皮肤组织的修复和再生过程，因此在整个创面愈合过程中，适当的处理非常重要。若处置不当，轻则形成愈合缓慢的慢性创面，重则引起创面感染、损伤加剧，造成创面不愈形成瘢痕。

发明内容

为了解决上述问题之一，本发明提出了水前寺蓝藻多糖在制备治疗烫伤药物中的新用途。水前寺蓝藻多糖能够缓解伤口急性炎症反应，且在愈合过程中降低Col I含量，使Col III含量上升，伤口愈合后不易留下瘢痕。

为此，本发明从三个方面来提出水前寺蓝藻多糖在制备治疗烫伤药物中的优势：

在本发明的第一方面，本发明研究了水前寺蓝藻多糖对大鼠烫伤愈合率的影响。

根据本发明的实施例，通过对被烫伤小鼠的分组用药对比实验，初步可以确定水前寺蓝藻多糖对烫伤创面恢复有辅助作用且辅助作用较为明显。

在本发明的第二方面，本发明研究了水前寺蓝藻多糖对烫伤初期炎症的影响。

根据本发明的实施例，实验结果表明水前寺蓝藻多糖可减缓急性炎症反应。

在本发明的第三方面，本发明研究了水前寺蓝藻多糖对I、III型胶原蛋白组织分布的影响。

根据本发明的实施例，实验结果表明水前寺蓝藻多糖能降低伤口处Col I的生成量，提高Col III的含量，使愈合后的伤口不易留下瘢痕。

附图说明

图1为大鼠烫伤修复实验流程图；

图2为大鼠烫伤后生理盐水阴性对照、水前寺蓝藻多糖、磺胺嘧啶银及联合用药组第15-21天伤口愈合情况及创面局部大图；

图3为大鼠烫伤后水前寺蓝藻多糖、磺胺嘧啶银及其联合用药组对烫伤愈合率的影响，数据表示为平均值标准误差(n＝3)，t检验分析每一天对应的组间数据(t-test，P<0.05视为有显著性差异，上标星号或P值)，红色星号表示Sac组具有显著性差异(P<0.05)，蓝色星号表示SD-Ag组具有显著性差异(P<0.05)，绿色星号表示联合用药组具有显著性差异(P<0.05)；

图4为大鼠烫伤后水前寺蓝藻多糖、磺胺嘧啶银组第1天和第7天血清中IL-1β含量的变化情况，数据表示为平均值标准误差(n＝3)，t检验分析对应的时间点实验组间数据(t-test，P<0.05视为具有显著性差异，上标星号或P值)；

图5为大鼠烫伤后水前寺蓝藻多糖、磺胺嘧啶银组第7天皮肤中Col I免疫荧光阳性区域分布情况，数据表示为平均值标准误差(n＝3)，t检验分析对应时间点的组间数据(t-test，P<0.05视为具有显著性差异，上标星号或P值)；

图6为为大鼠烫伤后水前寺蓝藻多糖、磺胺嘧啶银组第7天皮肤中Col I免疫荧光阳性区域相对光密度值，数据表示为平均值标准误差(n＝3)，t检验分析对应时间点的组间数据(t-test，P<0.05视为具有显著性差异，上标星号或P值)；

图7为大鼠烫伤后水前寺蓝藻多糖、磺胺嘧啶银组第7天皮肤中Col III免疫荧光阳性区域分布情况，数据表示为平均值标准误差(n＝3)，t检验分析对应时间点的组间数据(t-test，P<0.05视为具有显著性差异，上标星号或P值)；

图8为大鼠烫伤后水前寺蓝藻多糖、磺胺嘧啶银组第7天皮肤中Col III免疫荧光阳性区域相对光密度值，数据表示为平均值标准误差(n＝3)，t检验分析对应时间点的组间数据(t-test，P<0.05视为具有显著性差异，上标星号或P值)。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

水前寺蓝藻多糖(体)是从Aphanothece sacrum中提取出来的一种新型胞外多糖，具有超高分子量，高度硫酸化及高吸水率等特征。

水前寺蓝藻多糖体是一种硫酸化多糖类，其分子量为2,000,000以上，CAS登记号为1039552-36-7。具体而言，水前寺蓝藻多糖体是具有下述糖链单元重复结构的糖衍生物，所述糖链单元是具有己糖结构的糖结构体及具有戊糖结构的糖结构体通过α-糖苷键或β-糖苷键以直链状或支链状连接而成的，所述糖链单元中作为糖结构体包含经乳酸化的硫酸化糖，并且，在所述糖链单元中，每100个羟基中有2.7个以上的羟基被硫酸化，或者硫元素在全部元素中占1.5重量％以上。

已知水前寺蓝藻多糖体可通过对从作为日本特有品种的水前寺蓝藻提取的多糖类加以质子化、并部分水解而获得。

能够用于本发明的水前寺蓝藻多糖体不限于来自水前寺蓝藻的水前寺蓝藻多糖体。

中国发明专利申请CN106535904A及其引用的现有技术中关于水前寺蓝藻多糖体的描述适用于本发明申请的水前寺蓝藻多糖。

选取5周龄，体重150g左右的SD(Sprague Dawley)雌性大鼠，共48只，随机分组进行暂养，稳定7天后进行体重称量，根据体重进行分层分组，进行后续实验，所有实验动物由厦门大学实验动物中心代购。

1.实验动物分组

根据体重进行分层取样分组，每个区间随机选择3只，共12只作为一个处理组进行烫伤造模，共分为4个处理组，并采取单只分笼饲养，分层取样；A,B,C,D分别代表生理盐水阴性对照组(Ctrl)，水前寺蓝藻多糖组(Sac)，水前寺蓝藻多糖+磺胺嘧啶银(Sac+SD-Ag)联合用药组，磺胺嘧啶银(SD-Ag)组(Positive control)，按顺序编号1-12。

2.给药方式

水前寺蓝藻多糖使用浓度为0.5％，磺胺嘧啶银为目前治疗烧伤烫伤的普适阳性药，作为实验阳性对照，使用浓度为2％，联合用药组是将0.5％水前寺蓝藻多糖溶解于2％磺胺嘧啶银溶液中。给药方式：一天2次(早晚各一次)，药量以伤口涂抹均匀为宜(约需500μL/创口)。

3.烫伤造模及观察

使用经80℃水浴加热，直径2cm铜棒(铜棒进行称重计算压力，并抛光保证创面一致)进行烫伤，处理时间20s，烫伤后皮肤结构变化较大，其主要变化过程是在烫伤后，皮肤表面偏白，存在小水泡。为避免自身恢复能力差异性较大带来的误差，每只大鼠背部取前后两个烫伤创口(小于大鼠皮肤总表面积10％)，一个创口进行给药处理，另一创口作为自身对照。

在整个烫伤恢复过程中存在4个阶段中，重点关注炎症反应，组织增生和创面重塑。炎症反应期可分为急性炎症期和炎症后期，组织增生期和组织重塑期主要表现为胶原纤维的增生和成熟。烫伤后，每日进行生理盐水，水前寺蓝藻多糖，磺胺嘧啶银，联合用药处理，每天观察记录伤口愈合情况。

4.取样

整个实验在创面愈合的三个阶段内设置4个取样时间点，取皮肤样品和血清样品用于后续实验。烫伤后24h后进行第一次取样，之后分别在第7天、21天和28天进行取样，每组每个时间点选取3只大鼠处死，具体过程如图1所示。

5.愈合率统计

每天涂药时设置标尺对创面进行拍照记录，使用Image J软件进行面积测量，计算每一天创口的面积变化，以每天相应的变化面积大小与初始面积大小的比值作为该天的愈合率。计算公式如下：

P代表愈合率，An为第n天的创面面积，A0为创面初始面积。

6.数据分析

采用Graphpad Prism 7软件进行作图和统计分析，使用的统计分析方法为t检验，比较各个实验处理组与对照组之间的差异，P值小于0.05视为具有显著性差异，结果最后表示为平均值±标准误(mean±S.E.M)。

实施例1水前寺蓝藻多糖对大鼠烫伤愈合率的影响

图2为第15，17，19，21天不同处理组伤口恢复情况，前部伤口为对照伤口，后部伤口为处理伤口，在第15天时，在大鼠自身恢复能力的作用下，伤口基本已经结痂，存在一定的伤口出血情况，可能是由于剐蹭，挠抓等原因导致的痂皮非自然脱落。相较于生理盐水阴性对照创面，另3组处理创面恢复效果明显更优，恢复效果按从差到优依次为阴性对照生理盐水、联合用药组、磺胺嘧啶银、水前寺蓝藻多糖。因此，初步可以确定水前寺蓝藻多糖对烫伤创面恢复有治疗作用且治疗作用较为明显。

图3中可以看出，相比较于生理盐水阴性对照组(Ctrl组)，水前寺蓝藻多糖处理后在第7，15，17，19，20，21天愈合率有显著变化(P<0.05)；同样，磺胺嘧啶银组在11，12，15，19，21天也有显著性变化(P<0.05)，但联合用药组却仅在21天表现出显著性差异。其中愈合率有显著性变化的天数集中在第14天之后的居多，这一阶段是胶原合成的高峰期，水前寺蓝藻多糖组和磺胺嘧啶银组的愈合率变化明显。从图3中的折线图可以看出，在胶原合成高峰期之前，磺胺嘧啶银组的愈合率高于水前寺蓝藻多糖组，而在胶原合成高峰期之后，水前寺蓝藻多糖组的愈合率要高于磺胺嘧啶银组。

实施例2水前寺蓝藻多糖对烫伤初期炎症的影响

1.血清炎症因子水平测定

使用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)测定血清内TNF-α，IL-1β(炎症因子)水平，以下所用试剂盒为Abcam试剂盒(ab100767和ab46070)，按照说明书操作，每组3个测试样品，每个样品2个平行重复。

样品及试剂准备：将标准品、HRP、washing buffer、IL-1β抗体、TNF-α抗体和生物素标记的二抗稀释至1x，使用Diluent A预处理样品。

IL-1β：加100μL标准品及样品，室温孵育2.5小时；300μL washing buffer每孔进行洗板，洗涤4次，每次尽可能除去孔中液体；每孔加入100μL检测抗体，孵育1小时，轻摇；洗板4次；每孔加入100μL HRP三抗，孵育45min，轻摇；洗板4次；每孔100μL TMB底物显色，黑暗条件下室温孵育30min，轻摇；每孔50μL终止液，溶液变黄时，酶标仪OD 450nm读值。

表1：Abcam 100767成分表：

TNF-α：加100μL标准品及样品并加入50μL二抗，室温孵育3小时；300μL washingbuffer每孔进行洗板，洗涤3次，每次尽可能除去孔中液体；每孔加入100μL HRP三抗，孵育30min，盖盖轻摇；洗板3次；每孔100μL TMB底物显色，黑暗条件下室温孵育10–20min，轻摇；每孔100μL终止液，溶液变黄时，酶标仪OD 450nm读值。

表2：Abcam 46070成分表

IL-1β水平检测情况如图4所示，第一天对照组IL-1β水平变化较大，水前寺蓝藻多糖组的下降趋势明显，磺胺嘧啶银组显著下降。随时间到第7天，水前寺蓝藻多糖组炎症水平与对照相同，而磺胺嘧啶银组的IL-1β较对照组水平上升。烫伤后，IL-1β水平较对照组下降，说明急性炎症反应被缓解，水前寺蓝藻多糖可减缓急性炎症反应。

实施例3水前寺蓝藻多糖对I、III型胶原蛋白组织分布的影响

A.固定液配制(4％多聚甲醛)

磷酸缓冲液A(0.2mol/L)：取NaH₂PO₄·2H₂O 27.6g溶于ddH₂O，定容至1L。

磷酸缓冲液B(0.2mol/L)：取Na₂HPO₄·12H₂O 71.6g溶于ddH₂O，定容至1L。

PB液(0.1mol/L)：取缓冲液A和缓冲液B，比例为19:81进行混合，调节pH值为7.4，加等体积ddH₂O和40g多聚甲醛粉末，65℃加热搅拌，完全溶解后，定容至1L。

B.石蜡组织包埋(正丁醇法)

准备9个50ml离心管，标记1-9号，按顺序加入50％乙醇；乙醇：正丁醇：水(5:2:3)混合液；乙醇：正丁醇：水(10:7:3)混合液；乙醇：正丁醇：水(9:9:2)混合液；乙醇：正丁醇(1:3)混合液；乙醇：正丁醇(3:17)混合液；乙醇：正丁醇(1:19)混合液；100％正丁醇；60℃的100％正丁醇。将组织浸泡在处理液中，保证组织尽可能接触到处理液，不重叠，时间分别为30min，2h，1h，1h，2h，1h，1h，1h，1h，将组织从处理液中取出放入60℃石蜡中1h，更换石蜡重复1次，最后石蜡包埋。

C.烤片，常规二甲苯-乙醇复水

60℃烤片1h，二甲苯Ⅰ5min→二甲苯Ⅱ5min→100％乙醇3min→95％乙醇3min→85％乙醇3min→70％乙醇3min→50％乙醇3min→ddH₂O 3min

D.抗原修复

0.01M柠檬酸钠溶液：0.588g Na₃C₆H₅O₇·2H₂O溶于200mL ddH₂O中，混合均匀。

0.01M柠檬酸溶液：0.21g C₆H₈O₇·H₂O溶于10mL ddH₂O中，混合均匀。

使用0.01M柠檬酸溶液调节0.01M柠檬酸钠溶液pH值至6.0，制备抗原修复工作液，微波加热工作液90s。将切片用1x TBS(0.05M tris-base，0.15M氯化钠)漂洗后放入热抗原修复液中60s，微波加热10s，自然冷却60s，加热-冷却操作重复3次后，自然冷却至室温(2h)。

E.非特异性蛋白结合位点的封闭

0.3％Triton X-100溶液：600μL Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)溶于200mL1x TBS稀释，制备成工作液。

10％山羊血清溶液(血清封闭液)：100μL山羊血清加入950μL洗涤液(1x TBS+0.03％Triton-X)中混匀，并加入1％(w/v)BSA和0.3M甘氨酸。将血清封闭液均匀涂布在组织切片上，放入湿盒中37℃封闭1h，洗涤液漂洗3次，每次5min。

F.抗体孵育

将用TBST稀释后的一抗(1:50)均匀涂布在组织切片上，4℃孵育过夜，不同来源(鼠源、兔源等)的一抗可以混合孵育，隔天取出后37℃复温2h，回收一抗，洗涤液漂洗3次，5min/次，加入对应抗性的荧光二抗(Alexa Fluor 488显绿色荧光，Alexa Fluor 555显黄色荧光，Alexa Fluor 647显红色荧光)，二抗稀释比1:400，37℃避光孵育1h，洗涤液漂洗3次，5min/次。

G.细胞核染色

在细胞核中加入稀释的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)，加入水1:10000稀释至2ug/L，室温孵育3min染核，1x PBS漂洗3次，5min/次。

H.封片

加入Solarbio购买抗荧光淬灭剂后放上盖玻片，排除气泡。

I.镜检及结果统计

使用Leica DM48荧光显微镜进行拍摄，照片使用Image J选取切片荧光区域，统计阳性区域组织占比，平均荧光强度。

从图5中可知，通过免疫组化对Col I(I型胶原蛋白)进行定位，结果表明在第7天时，整个胶原网络中的Col I呈均匀分布，部分高亮区域存在胶原局部积累。对荧光染色结果进行平均荧光值计算，结果如图6所示，处理组相较于对照组Col I的含量都有所下降，其中水前寺蓝藻多糖组含量极显著下降。Col I为成熟胶原，创面处Col I局部积累说明创面愈合直接合成大量Col I，为快速愈合模式，愈后易形成瘢痕。

从图7中可知，通过免疫组化对Col III(III型胶原蛋白)进行定位，结果表明在第7天时，对照组III型胶原含量明显少于处理组，处理组中整个胶原网络中的Col III分布较为均匀，部分高亮区域存在局部积累。对荧光染色结果进行平均荧光值计算，结果如图8所示，处理组相较于对照组Col III的含量都有所上升，其中水前寺蓝藻多糖组含量显著增加。Col III为创面愈合过程中新生的胶原蛋白，成熟后转化为Col I，Col III胶原蛋白含量高表明创面愈合趋于平稳进行，愈合不易留下瘢痕。

结果表明水前寺蓝藻多糖能降低伤口处Col I的生成量，提高Col III的含量，使愈合后的伤口不易留下瘢痕，具有巨大的市场潜力。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (1)

1.水前寺蓝藻多糖在制备治疗烫伤药物中的应用。

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