CN113063883B - 一种同时鉴别三味拳参口服液中7种有效成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种同时鉴别三味拳参口服液中7种成分的方法，步骤为：第一步：供试品溶液的制备；第二步：对照品溶液的制备：取槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品，制备对照品储备溶液；再取7种储备液混合，作为混合对照品储备溶液；第三步：液相色谱法：进样量：0.2～5μL，流动相系统：A项：乙腈+0.01M醋酸铵溶液(3+2)：B项0.01M醋酸铵溶液(pH8.1)，梯度洗脱；PDA检测器，检测波长205nm～260nm；30‑40℃柱温；结果判定。本发明可同时鉴别苦参中的五种生物碱和穿心莲中的穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯，提高了工作效率，解决了原有苦参和穿心莲薄层鉴别方法存在的问题，从而更好地进行质量控制。

Description

一种同时鉴别三味拳参口服液中7种有效成分的方法
技术领域
本发明涉及一种同时鉴别三味拳参口服液中7种成分的方法，同时鉴别三味拳参口服液中槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的检测方法，属于兽药中有效成分检测领域。
背景技术
三味拳参口服液为中兽药成方制剂，收载于《兽药质量标准》2017年版(中药卷)，由拳参、穿心莲、苦参三味药组成，具有清热解毒、燥湿止痢的功效，主治湿热泄泻等证，广泛应用于集约化家禽养殖企业。三味拳参口服液质量标准中分别规定了苦参及穿心莲的薄层色谱鉴别方法，不仅费时，费试剂，而且在实际检验工作中发现苦参的鉴别方法存在一定的问题，苦参鉴别所用到的吸附剂是硅胶G薄层板，层析用的展开剂是苯-丙酮-乙酸乙酯-浓氨溶液(2∶3∶4∶0.2)，对照是采用苦参的指标成份氧化苦参碱，此方法中氧化苦参碱对照品并无斑点显示，而是在点样原点有一类似橙红色斑点，导致结果无法判定，且展开剂中苯具有较高毒性，是一种致癌物质易对实验人员造成危害。穿心莲鉴别采用穿心莲内酯作为对照。两个薄层色谱都有些以偏概全，尤其是在中药材基源复杂的情况下，无法准确鉴别。
发明内容
本发明针对上述问题，提供了一种同时鉴别三味拳参口服液中7种成分的方法，具体为同时鉴别三味拳参口服液中苦参五种生物碱和穿心莲中的穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯，该方法快速、灵敏、准确、专属性强，通过一次样品处理，利用液相色谱法同时鉴别并苦参五种生物碱和穿心莲中的穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯，不仅节省了试剂、时间，提高了工作效率。本发明的技术方案如下：
一种同时鉴别三味拳参口服液中7种成分的方法，步骤如下：
第一步：供试品溶液的制备；
优选的，供试品溶液的制备选自方法A、方法B或方法C；
所述方法A为：取供试品，加三氯甲烷，超声提取，分取三氯甲烷层，蒸干，残渣加无水乙醇/甲醇使溶解，过滤，作为供试品溶液。此方法可以通过浓缩，提高检出限。
所述方法B为：取供试品，加无水乙醇，超声提取，离心5min，过滤，作为供试品溶液。此方法试剂毒性最小，最快捷，最节约试剂，最安全。
所述方法C为：取取供试品，加水，再加氨水，加三氯甲烷，萃取，分取下层三氯甲烷层，反复萃取，再分多次加三氯甲烷，收集下层蒸干，残渣加乙醇适量使溶解，过滤，作为供试品溶液。此方法杂峰干扰较少，背景噪音最小最干净，信噪比高。
第二步：对照品溶液的制备：取槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品，加无水乙醇或甲醇制成每1ml各含2mg对照品的溶液，作为对照品储备溶液；再取7种储备液混合，作为混合对照品储备溶液；
第三步：液相色谱法：进样量：0.2～5μL，流动相系统：A项：乙腈+0.01M醋酸铵溶液(3+2)：B项0.01M醋酸铵溶液(pH8.1)，梯度洗脱；PDA检测器，检测波长205nm～260nm；30-40℃柱温；
结果判定：根据色谱图，供试品色谱中，在与7种对照品色谱相应的位置上，出现相同的色谱峰，表明可检出苦参和穿心莲。
优选的，所述第三步中，流动相梯度洗脱程序如表1所示。
表1
流速 时间 A项 B项
0.30ml/min 初始 3 97
0.30ml/min 1.5 3 97
0.30ml/min 2 8 92
0.30ml/min 4 15 85
0.30ml/min 6.8 15 85
0.30ml/min 7 16 84
0.30ml/min 10.5 16 84
0.30ml/min 11 26 74
0.30ml/min 14 26 74
0.30ml/min 15.5 35 65
0.30ml/min 18.2 35 65
0.30ml/min 18.5 42 58
0.30ml/min 22 42 58
0.30ml/min 23 55 45
0.30ml/min 25.2 85 15
0.30ml/min 26 3 97
0.30ml/min 28 3 97
优选的，所述第三步中，槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯的检测波长为225nm，脱水穿心莲内酯的检测波长为252nm波长；第三步中检测波长为205nm，210nm，215nm，220nm，225nm，252nm等时，PDA检测器可以同时进行多个波长的采集，检测波长经过比较，前6种物质槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯虽然在205、210、215、220nm处响应值较高，但基线有小的波动，穿心莲内酯225nm处响应值较高，最终选择225nm波长，响应值适当且干扰较小，脱水穿心莲内酯选择252nm波长，响应值较高，背景干扰小。
进一步的，所述第一步中供试品的取样量为1.0-2.0mL；
所述供试品溶液的制备：方法A为，取供试品1.0mL，加三氯甲烷25.0mL，超声提取30min，分取三氯甲烷层10.0mL-20.0mL，蒸干，残渣加乙醇10.0mL-20.0mL使溶解，过滤，作为供试品溶液。
方法B为，取供试品1.0mL，加无水乙醇25.0mL，超声提取30min，过滤，作为供试品溶液。
方法C为：取三味拳参口服液1.0mL-2.0mL，加入分液漏斗中，加水10ml，再加氨水1.0ml，加三氯甲烷15.0mL，萃取，分取下层三氯甲烷层，再反复萃取2-4次，再分多次加三氯甲烷10mL+10mL(+10mL+10mL)，收集下层蒸干，残渣加乙醇适量使溶解，定容至10.0mL，过滤，作为供试品溶液。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
(1)本发明中通过液相色谱法同时把苦参中五种生物碱和穿心莲中的穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯一次鉴别出来，方法简便快速、分离效果好，鉴别精度高，结果重现性好，易于观察，专属性强，色谱峰峰形良好，既达到中国兽药典的要求，还节省时间、试剂。
(2)本发明方法样品处理简便、省试剂、省时间，三味拳参口服液原标准对苦参鉴别，采用薄层方法，毒性大，斑点有时候不清晰，且不能测定。
(3)本发明方法前处理和流动相采用的4种试剂：三氯甲烷、无水乙醇、乙腈、0.01M醋酸铵水溶液，三氯甲烷属于二类易制毒化学品；原方法展开剂采用的4种试剂：苯、丙酮、乙酸乙酯、浓氨溶液，且苯属于一类致癌物，本发明的方法更环保安全。
附图说明
图1为对照品光谱图；其中，化合物从上而下依次为6.34min氧化苦参碱、7.03min氧化槐果碱、12.06min槐定碱、17.65min苦参碱、18.60min槐果碱、20.93min穿心莲内酯、25.75min脱水穿心莲内酯；
图2为浓度1对照品225nm色谱图；进样量1μl；化合物从左到右依次为6.34min氧化苦参碱、7.03min氧化槐果碱、12.06min槐定碱、17.65min苦参碱、18.60min槐果碱、20.93min穿心莲内酯；
图3为浓度1对照品252nm色谱图；进样量1μl；化合物从左到右依次为6.34min氧化苦参碱、18.60min槐果碱、25.76min脱水穿心莲内酯；
图4为浓度2对照品225nm色谱图；进样量1μl；
图5为浓度2对照品252nm色谱图；进样量1μl；
图6为浓度3对照品225nm色谱图；进样量1μl；
图7为浓度3对照品252nm色谱图；进样量1μl；
图8为浓度3对照品225nm色谱图；进样量0.5μl；
图9为浓度3对照品252nm色谱图；进样量0.5μl；
图10为苦参阴性2号样品对照225nm；
图11为苦参阴性2号样品252nm；
图12为穿心莲阴性4号样品225nm；
图13为穿心莲阴性4号样品252nm；
图14为1号样品(超声法2)225nm色谱图；
图15为1号样品(超声法2)252nm色谱图；
图16为1号样品(萃取法3)225nm色谱图；
图17为1号样品(萃取法3)252nm色谱图；
图18为1号样品(超声浓缩法1)225nm色谱图；
图19为1号样品(超声浓缩法1)252nm色谱图；
图20为1号样品(超声浓缩法1，无氨水)225nm色谱图；
图21为1号样品(超声浓缩法1无氨水)252nm色谱图；
图22为1号样品(超声浓缩法1)225nm色谱图；
图23为1号样品(超声浓缩法1)252nm色谱图；
图24为1号样品(超声法2)225m色谱图；
图25为1号样品(超声法2)252nm色谱图；
图26为1号样品(萃取法3)225nm色谱图；
图27为1号样品(萃取法3)252nm色谱图；
图28为3号样品(萃取法3)225nm色谱图；
图29为3号样品(萃取法3)252nm色谱图；
图30为5号样品(萃取法3)225nm色谱图；
图31为5号样品(萃取法3)252nm色谱图；
图32为5号样品(超声浓缩法1)225nm色谱图；
图33为5号样品(超声浓缩法1)252nm色谱图；
图34为6号样品(超声浓缩法1)225nm色谱图；
图35为6号样品(超声浓缩法1)252nm色谱图；
图36为6号样品(萃取法3)225nm色谱图；
图37为6号样品(萃取法3)252nm色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本文所用供试品：1号样品为自制样品，2号为苦参阴性样品，4号样品为穿心莲阴性样品，3号，5号，6号，7号样品为市场样品。(自制样品，为严格按照药典处方本实验进行生产的样品)
实施例1：一种同时鉴别三味拳参口服液中7种成分的方法
步骤如下：
第一步：供试品溶液的制备：取三味拳参口服液1.0mL，加三氯甲烷25.0mL，超声提取30min，分取三氯甲烷层10.0mL，蒸干，残渣加乙醇10.0mL使溶解，作为供试品溶液；
第二步：对照品溶液的制备：另分别精密称取槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品适量，加无水乙醇制成适量浓度的溶液，作为对照品储备溶液；再取5种生物碱储备液各2.0ml，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯各1.0ml，混合均匀，作为混合对照品储备溶液。第三步：液相色谱法：进样量：0.5～2μL，A项：乙腈+0.01M醋酸铵溶液(3+2)：B项0.01M醋酸铵溶液(pH8.1)，梯度洗脱；PDA检测器，检测波长205nm～260nm，；30-40度柱温；上机检测。
结果比较：检测波长经过比较，前6种物质槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯虽然在205、210、215、220nm处响应值较高，但基线有小的波动，最终选择225nm波长，响应值适当且干扰较小，脱水穿心莲内酯选择252nm波长，响应值较高，背景干扰小。
结果判定：根据色谱图，供试品阳性样品色谱图中，在与7种对照品色谱相应的位置上，出现相同的色谱峰，峰形良好，分离度达标，阴性样品背景无干扰，表明可检出苦参。
试药及试剂：
三氯甲烷、无水乙醇均为分析纯，醋酸铵为优级纯；乙腈色谱纯，对照品来源表如表2所示，对照品信息如表3所示。
表2 对照品来源表
药品名称 来源 含量 批号
苦参碱 中国食品药品检定研究院 100％ 110805-200508
氧化槐果碱 中国食品药品检定研究院 100％ 111652-200301
氧化苦参碱 中国食品药品检定研究院 92.3％ 110780-201007
槐定碱 中国食品药品检定研究院 98.8％ 110784-201706
槐果碱 成都曼斯特生物科技有限公司 98.0％ MμST-18061205
穿心莲内酯 中国食品药品检定研究院 99.7％ 110797-201609
脱水穿心莲内酯 中国食品药品检定研究院 99.4％ 110854-201710
表3 对照品浓度和峰面积等信息
Figure BDA0003061819700000081
其中所用仪器；BP211D分析天平(赛多利斯，德国)；Waters超高效液相色谱仪，PDA检测器，CSHTM C18色谱柱(waters，2.1*100mm，1.7μm)。
实施例2：一种同时鉴别三味拳参口服液中7种成分的方法
步骤如下：
第一步：供试品溶液的制备：取三味拳参口服液2.0mL，加三氯甲烷25.0mL，超声提取30min，分取三氯甲烷层5.0mL，蒸干，残渣加乙醇10.0mL使溶解，作为供试品溶液；
第二步、第三步、结果判定等同实施例一。
实施例3：一种同时鉴别三味拳参口服液中7种成分的方法
步骤如下：
第一步：供试品溶液的制备：取三味拳参口服液1.0mL，加无水乙醇至25.0mL，超声提取30min，10000rpm/min离心5分钟(或静置等待澄清)，吸取上清液过滤，作为供试品溶液；
第二步、第三步、结果判定等同实施例一。
实施例4：一种同时鉴别三味拳参口服液中7种成分的方法
步骤如下：
第一步：供试品溶液的制备：取三味拳参口服液1.0mL，加入分液漏斗中，加水10ml，再加氨水1.0ml，加三氯甲烷15.0mL，萃取，分取下层三氯甲烷层，再反复萃取3次，再分两次加三氯甲烷10ml+10mL+10mL，收集下层蒸干，残渣加乙醇适量使溶解，定容至10.0mL，过滤，作为供试品溶液。
第二步、第三步、结果判定等同实施例一。
实施例5：一种同时鉴别三味拳参口服液中7种成分的方法
步骤如下：
第一步：取三味拳参口服液2.0mL，加入分液漏斗中，加水10ml，再加氨水1.0ml，加三氯甲烷15.0mL，萃取，分取下层三氯甲烷层，再反复萃取4次，再分多次加三氯甲烷10mL+10mL+10mL+10m)，收集下层蒸干，残渣加乙醇适量使溶解，定容至10.0mL，过滤，作为供试品溶液。
第二步、第三步、结果判定等同实施例一。
对照例
采用《兽药质量标准》2017年版(中药卷)的收载的方法，具体步骤如下：
(1)取三味拳参口服液10ml，加三氯甲烷25ml，摇匀，加浓氨溶液调节pH值至9.5，加热回流1小时，放冷，取三氯甲烷液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取氧化苦参碱对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-丙酮-乙酸乙酯-浓氨溶液(2：3：4：0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，日光下检视，供试品色谱中，在与氧化苦参碱对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(2)取三味拳参口服液10ml，加三氯甲烷25ml，摇匀，加热回流1小时，放冷，取三氯甲烷液蒸干，残渣加2ml乙醇溶解，作为供试品溶液。另取穿心莲内酯对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G254薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(8：3：0.4)为展开剂，展开，取出，晾干，放置在紫外光(254nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
采用上面的方案重复验证喷以稀碘化铋钾试液，日光下检视，供试品色谱中，氧化苦参碱对照品在原点有时展不开，只是在点样原点有一类似橙红色斑点，重复性太差。另外本方案两个薄层色谱均需要加热回流，费时费力，应用了多种毒性较大的试剂如：苯-丙酮-乙酸乙酯等，对实验人员的伤害比较大。而且只单一的检出了氧化苦参碱和穿心莲内酯两个成分，而且方法重现性差，受环境温湿度等因素的干扰比较大，检测限在2mg/ml左右。
不同浓度对照品结果的比较见表4，光谱图谱见附图1，光谱图可以辅助对化合物进行定性，色谱图谱见附图2-9，可以通过保留时间进一步进行化合物的定性。
表4 不同浓度对照品结果比较表进样量1μl
Figure BDA0003061819700000111
自制样品，由于受不同前处理方法的影响，目标化合物的响应值也有一定的差异，图谱见附图10-27。如果市场样品化合物的含量比较低，我们可以选择实例1-2，可以通过改变浓缩后溶解样品的量，来提高检测灵敏度。如果从时间上看，我们优选实施例3，最节省时间，色谱柱对化合物响应值最高；如果从样品背景来看，我们优选实施例4或5，虽然化合物响应值没有那么高，但样品基质背景小，能满足监测需求，对色谱柱更好，但样品前处理稍微复杂一些。
通过对市场样品的检测，图谱见附图28-37，我们发现7种成分峰高和峰面积响应有高有低，氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱响应值较高，槐果碱、槐定碱较低，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯有高有低，峰面积响应值有的相差几倍甚至十几倍，与企业使用的原药材质量和各家的生产提取工艺密切相关。本方法使用超高效液相色谱仪，以色谱图的方式呈现结果，由信噪比可以推算出大体的检测限，其检测限非常低，见下表5，大大提升了检测灵敏度和检验效果。
表5 不同方法检测限比较表
Figure BDA0003061819700000121
如在实际检测样品时发现响应值较低，可以适当提高进样量到5-10μl，色谱图中的各种成分色谱峰可以显而易见。在现有的2017年版国家兽药质量标准下，薄层鉴别很难控制三味拳参口服液的质量，使用本发明，可以进行准确而快速的鉴别，为制定2025年兽药质量标准，打下了坚实的基础。
1号样品不同提取方式的结果比较(进样量1μl)，见下表6：
表6 1号样品不同提取方式的结果比较表
Figure BDA0003061819700000131
2号、4号样品为阴性对照样品，其他市场样品3号、5号、6号、7号结果见表7：
表7 市场(3号、5号、6号、7号)样品检测结果比较表(进样量1μl)。
Figure BDA0003061819700000141
Figure BDA0003061819700000151
优势：1.本发明使用的溶剂，毒性小，对人和环境危害小；2.本发明一个样品从样品处理到上机检测品判定结果，约2个小时可以检测完成；而现有国家标准，样品前处理非常复杂，需要加热回流装置，需要跑薄层，晾干，喷色等多个步骤，一个样品约需要8个小时，大大缩短了检测时间，提高了检验效率；3.本发明采用液相色谱图，结果直观，容易判断，检测限低；国家标准方法，采用薄层色谱，斑点受环境温湿度和人为操作的影响非常大，斑点常常不清晰，结果不易判定。
尽管已经出示和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，比如使用不同品牌的色谱仪，使用不同厂家的色谱柱，使用比例稍微改变的流动相组成，不同的柱温等等，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种同时鉴别三味拳参口服液中7种成分的方法，其特征在于，所述方法步骤如下：
第一步：供试品溶液的制备；
第二步：对照品溶液的制备：取槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品，加无水乙醇或甲醇制成每1ml各含2mg对照品的溶液，作为对照品储备溶液；再取7种储备液混合，作为混合对照品储备溶液；
第三步：液相色谱法：进样量：0.2～5μL，流动相系统：A项：乙腈+0.01M醋酸铵溶液：B项pH8.1的0.01M醋酸铵溶液，梯度洗脱；PDA检测器，检测波长205nm～260nm；30-40℃柱温，其中，A项中乙腈与0.01M醋酸铵溶液的体积比为3:2；
结果判定：根据色谱图，供试品色谱中，在与7种对照品色谱相应的位置上，出现相同的色谱峰，表明可检出苦参和穿心莲；所述第三步中，色谱柱为CSHTM C18色谱柱，流动相梯度洗脱程序如表1所示：
表1
Figure FDA0003847610310000011
Figure FDA0003847610310000021
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备选自方法A、方法B或方法C；
所述方法A为：取供试品，加三氯甲烷，超声提取，分取三氯甲烷层，蒸干，残渣加无水乙醇/甲醇使溶解，过滤，作为供试品溶液；
所述方法B为：取供试品，加无水乙醇，超声提取，离心5min，过滤，作为供试品溶液；
所述方法C为：取供试品，加水，再加氨水，加三氯甲烷，萃取，分取下层三氯甲烷层，反复萃取，再分多次加三氯甲烷，收集下层蒸干，残渣加乙醇适量使溶解，过滤，作为供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三步中，槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯的检测波长为225nm，脱水穿心莲内酯的检测波长为252nm波长。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一步中供试品的取样量为1.0-2.0mL。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法A中取三味拳参口服液1.0mL，加三氯甲烷25.0mL，超声提取30min，分取三氯甲烷层10.0mL-20.0mL，蒸干，残渣加乙醇10.0mL-20.0mL使溶解，过滤，作为供试品溶液。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法B中取三味拳参口服液1.0mL，加无水乙醇25.0mL，超声提取30min，过滤，作为供试品溶液。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法C为：取三味拳参口服液1.0mL-2.0mL，加入分液漏斗中，加水10ml，再加氨水1.0ml，加三氯甲烷15.0mL，萃取，分取下层三氯甲烷层，再反复萃取2-4次，再分多次加三氯甲烷，每次三氯甲烷的加入量为10mL，收集下层蒸干，残渣加乙醇适量使溶解，定容至10.0mL，过滤，作为供试品溶液。
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