CN101181341A - 一种参芪肝康片的质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种参芪肝康片的质量控制方法，提供了参芪肝康片质量检验方法及标准，主要是对参芪肝康片制订了严格的质量控制方法，该方法采用薄层色谱法对茵陈、黄芪、刺五加进行质量标准鉴别，并用高效液相色谱法进行含量测定，通过建立明确专属性强的鉴别及重现性、稳定性及精密度良好的含量测定方法，能够有效控制参芪肝康片的质量，使参芪肝康片质量达到稳定、可控、高效及安全，是对产品的投料要求及质量控制严格，克服现有技术的不足，提高产品的质量、疗效、生物利用度，产品质量高，能保证产品疗效，更好地满足医疗的需要。
Description
技术领域：
本发明涉及一种参芪肝康片质量控制方法。
背景技术：
中药制剂中片剂作为一种药物剂型，根据我国药品管理的相关法规，改变剂型或工艺作为新药研究管理。它是主要成分为当归、党参、水飞蓟、五味子、茵陈、黄芪、刺五加浸膏的参芪肝康片，为了严格控制药品的质量，确保疗效，制定了质量标准。
在参芪肝康片的定性鉴别的研究中，设计对处方中当归，茵陈，黄芪，刺五加、党参、水飞蓟及五味子进行定性鉴别，首先考察文献报道方法试验，结果制剂样品不理想，严重拖尾，多次换展开剂，分离效果差，采用不同的处理方法再展开，党参、水飞蓟及五味子效果依旧很差，结果茵陈、黄芪、刺五加分离效果好，且阴性无干扰，当归原胶囊中方法分离效果好，故未改变其方法。
参芪肝康片在定量分析的设计中，对茵陈进行了成分分析的实验，根据原标准中所采用的高效液相色谱法进行绿原酸的含量测定，样品峰分离效果差，故进行了流动相的筛选，经过对精密度、重现性、稳定性、回收率的试验考察，确定了以绿原酸对照品采用高效液相色谱法测定含量，重现性好，能快速准确的检验药品的质量。
参芪肝康片是祛湿清热，调和肝脾的药品，临床表现为能迅速改善乙肝患者临床症状，减轻病人痛苦，恢复肝细胞功能。转氨酶复常率高，血清病毒标志转阴率满意。现有剂型为胶囊，已列入国家中成药标准汇编内科肝胆分册，其质量标准：
【鉴别】(1)取参芪肝康胶囊内容物2g，加石油醚(60～90℃)25ml，超声处理20分钟，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材1g，加石油醚(60～90℃)10ml，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各2～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙脂(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(2)取参芪肝康胶囊内容物10g，加氯仿40ml，超声处理30分钟，滤过，滤液弃去，取药渣加甲醇40ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，加水饱和正丁醇振摇提取3次(20ml，20ml，10ml)，正丁醇加氨试液洗涤2次，每次20ml，弃去氨试液，正丁醇液再加正丁醇饱和的水洗至中性，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点清晰，分别置日光及紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点及荧光斑点。
【含量测定】照高效液相色谱法测定
色谱条件与系统适应性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水-磷酸(9∶91∶0.4)为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于1500。
对照品溶液的制备，精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含17μg的溶液，既得。
供试品溶液制备，取参芪肝康胶囊装量差异项下的内容物，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率30kHZ)60分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，离心(每分钟3500转)，滤过，取续滤液，既得。
测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪中进行测定。
本品每粒含茵陈以绿原酸(C16H18O9)计，不得少于80μg。
以上公开的参芪肝康胶囊质量标准现有技术中还存在鉴别项目、鉴别手段、含量测定方法不完善。
发明内容：
本发明的目的是提供一种参芪肝康片的质量控制方法，该方法采用薄层色谱鉴别茵陈、黄芪、刺五加进行鉴别，并用照高效液相色谱法测定，色谱条件与系统适应性试验，克服现有技术的弊端，提高产品的质量、疗效、生物利用度，更好地满足医疗的需要。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种参芪肝康片的质量标准控制方法，其特点在于：该方法中的a鉴别方法和b含量测定是以下方法的一种或几种：
a、鉴别茵陈薄层色谱鉴别取参芪肝康片5～20g，研细，加水15～60ml，超声处理15～60分钟加三氯甲烷2～3次，每次10～40ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇0.5～2ml使溶解，作为供试品溶液；另取茵陈对照药材0.5～3g，加水15～90ml，超声处理15～60分钟，放冷，滤过，加三氯甲烷提取2～3次，每次10～40ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇0.5～2ml使溶解，制成对照药材溶液；用薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2.5～20μl，分别点于硅胶板上，以石油醚-乙酸乙酯(5～20∶1～10)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5～10％香草醛10～20％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；
黄芪薄层色谱鉴别取参芪肝康片5～40g，研细，加甲醇10～100ml，加热回流0.5～2小时，滤过，滤液加于中性氧化铝柱上，用20～80％甲醇40～100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水10～50ml使溶解，用水饱和的正丁醇提取1～3次，每次10～30ml，合并正丁醇液，用水洗涤1～3次，每次10～30ml；弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.2～2ml使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5～3mg的溶液，作为对照品溶液；用薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5～20μl，分别点于硅胶板上，以三氯甲烷-甲醇-水(1.3～26∶0.7～14∶0.2～4)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10～20％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
刺五加薄层色谱鉴别取参芪肝康片5～20g，研细，加50～85％乙醇10～100ml，加热回流0.5～2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水5～20ml使溶解，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取1～3次，每次5～20ml，合并三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇0.5～2ml使溶解，作为供试品溶液。另取异秦皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.5～3mg的溶液，作为对照品溶液。用薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5～20μl，分别点于硅胶板上，以三氯甲烷-甲醇(2.4～48∶0.1～10)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
b、含量测定：绿原酸含量测定照高效液相色谱法测定，色谱条件与系统适应性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶或辛基硅烷键合硅胶或氰基或氨基键合硅胶为填充剂；乙腈-0.4％磷酸溶液(8～10∶92～90)为流动相；检测波长为300～400nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于1000～5000；
对照品溶液的制备 称取绿原酸适量，加25～75％甲醇制成10～162μg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液制备取参芪肝康片，研细，取约0.5～4g，称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25～75％甲醇20～60ml，密塞，称定重量，超声处理20～60分钟，放冷，再称定重量，用25～75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～20μl，注入液相色谱仪中进行测定；本品每片含绿原酸不得少于480μg；
该方法中的a鉴别方法和b含量测定是以下方法的一种或几种：
a、鉴别：
茵陈薄层色谱鉴别取参芪肝康片10g，研细，加水30ml，超声处理30分钟，加三氯甲烷2次，每次20ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取茵陈对照药材2g，加水60ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，加三氯甲烷提取2次，每次20ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯(10∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；
黄芪薄层色谱鉴别取参芪肝康片20g，研细，加甲醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液加于中性氧化铝柱(100～120目，20g，内径10～15mm)上，用40％甲醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水30ml使溶解，用水饱和的正丁醇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各15μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
刺五加薄层色谱鉴别取参芪肝康片10g，研细，加75％乙醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取2次，每次5ml，合并三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取异秦皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(24∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
b、含量测定：绿原酸含量测定照高效液相色谱法测定，色谱条件与系统适应性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.4％磷酸溶液(8∶92)为动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于1500；
对照品溶液的制备精密称取绿原酸适量，加50％甲醇制成40μg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液制备取重量差异项下参芪肝康片20片，精密称定，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇40ml，密塞，称定重量，超声处理(功率160W，频率40kHZ)60分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中进行测定；
本品每片含绿原酸不得少于480μg。
本发明的技术方案是：改变黄芪的鉴别方法，在现有质量标准中增加了茵陈、刺五加：
【鉴别】茵陈薄层色谱鉴别 取参芪肝康片5～20g，研细，加水15～60ml，超声处理15～60分钟加三氯甲烷2～3次，每次10～40ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇0.5～2ml使溶解，作为供试品溶液；另取茵陈对照药材0.5～3g，加水15～90ml，超声处理15～60分钟，放冷，滤过，加三氯甲烷提取2～3次，每次10～40ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇0.5～2ml使溶解，制成对照药材溶液；用薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2.5～20μl，分别点于硅胶板上，以石油醚-乙酸乙酯(5～20∶1～10)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5～10％香草醛10～20％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。
黄芪薄层色谱鉴别取参芪肝康片5～40g，研细，加甲醇10～100ml，加热回流0.5～2小时，滤过，滤液加于中性氧化铝柱上，用20～80％甲醇40～100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水10～50ml使溶解，用水饱和的正丁醇提取1～3次，每次10～30ml，合并正丁醇液；用水洗涤1～3次，每次10～30ml；弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.2～2ml使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5～3mg的溶液，作为对照品溶液。用薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5～20μl，分别点于硅胶板上，以三氯甲烷-甲醇-水(1.3～26∶0.7～14∶0.2～4)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10～20％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
刺五加薄层色谱鉴别取参芪肝康片5～20g，研细，加50～85％乙醇10～100ml，加热回流0.5～2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水5～20ml使溶解，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取1～3次，每次5～20ml，合并三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇0.5～2ml使溶解，作为供试品溶液；另取异秦皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.5～3mg的溶液，作为对照品溶液；用薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5～20μl，分别点于硅胶板上，以三氯甲烷-甲醇(2.4～48∶0.1～10)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
改进了含量测定的提取方法并提高茵陈以绿原酸(C16H18O9)计的标准如下：
【含量测定】含量测定绿原酸含量测定照高效液相色谱法测定，色谱条件与系统适应性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶或辛基硅烷键合硅胶或氰基或氨基键合硅胶为填充剂；乙腈-0.4％磷酸溶液(8～10∶92～90)为流动相；检测波长为300～400nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于1000～5000。
对照品溶液的制备称取绿原酸适量，加25～75％甲醇制成10～162μg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液制备取参芪肝康片，研细，取约0.5～4g，称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25～75％甲醇20～60ml，密塞，称定重量，超声处理20～60分钟，放冷，再称定重量，用25～75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～20μl，注入液相色谱仪中进行测定，本品每片含绿原酸不得少于480μg。
本发明的有益效果：本发明经过多次试验在该品种的质量标准中制定了薄层色谱鉴别及含量测定项目，是提供参芪肝康片质量检验方法及标准，通过建立明确专属性强的鉴别及重现性、稳定性及精密度良好的含量测定方法，能够有效控制参芪肝康片的质量，使参芪肝康片质量达到稳定、可控、高效及安全，是对产品的投料要求及质量控制严格，克服现有技术的不足，提高产品的质量、疗效、生物利用度，产品质量高，能保证产品疗效，更好地满足医疗的需要。
附图说明：
图1是本发明茵陈薄层色谱图；
图2是本发明黄芪薄层色谱图；
图3是本发明刺五加薄层色谱图；
图4是本发明绿原酸HPLC测定标准曲线；
图5是本发明空白溶剂；
图6是本发明绿原酸对照品；
图7是本发明参芪肝康片样品；
图8是本发明阴性样品；
图9是本发明茵陈对照药材；
图10是本发明刺五加浸膏；
图11是本发明含量测定之绿原酸对照品色谱图；
图12是本发明含量测定之样品1色谱图；
图13是本发明含量测定之样品2色谱图；
图14是本发明含量测定之样品3色谱图
具体实施方式：
实施例1：
【鉴别】
一、鉴别对象本处方共七味药，设计处方中当归、茵陈、黄芪、刺五加四味药材建立鉴别方法。在试验研究中，分别采用不同的样品处理方法及不同极性的展开剂分离层析，由于成分复杂，干扰大，结果对处方中当归、茵陈、黄芪、刺五加四味药材建立了薄层鉴别方法，比原工艺胶囊增加了两项定性鉴别。
二、对照品来源本品所用对照品均购于中国生物制品检定所。
三、鉴别方法
茵陈薄层色谱鉴别
供试品溶液的制备取参芪肝康片10g，研细，加水30ml，超声处理30分钟加三氯甲烷2次，每次20ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；
对照药材溶液的制备取茵陈对照药材2g，加水60ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，加三氯甲烷提取2次，每次20ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制成对照药材溶液；
阴性空白对照溶液的制备按处方组成份量，除去茵陈外的其余药味，按工艺要求制成阴性样品，称取10g，按供试品溶液制备项下的方法操作，得阴性样品溶液。
吸取上述三种溶液各5～10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯(10∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点显色清晰。
结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。阴性样品无此斑点。见图1。
黄芪薄层色谱鉴别
供试品溶液的制备取参芪肝康片20g，研细，加甲醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液加于中性氧化铝柱(100～120目，20g，内径10～15mm)上，用40％甲醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水30ml使溶解，用水饱和的正丁醇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次20ml；弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性空白对照溶液的制备按处方组成份量，除去黄芪外的其余药味，按工艺要求制成阴性样品，称取20g，按供试品溶液制备项下的方法操作，得阴性样品溶液。
照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各15μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性样品无此斑点。见图2。
刺五加薄层色谱鉴别
供试品溶液的制备取参芪肝康片10g，研细，加75％乙醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取2次，每次5ml，合并三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备取异秦皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性空白对照溶液的制备按处方组成份量，除去刺五加外的其余药味，按工艺要求制成阴性样品，称取10g，按供试品溶液制备项下的方法操作，得阴性样品溶液。
照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各5～10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(24∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。
结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性样品无此斑点。见图3。
【含量测定】含量测定对象和成分选择依据：参芪肝康片中茵陈主要含绿原酸，选择在本方中具有专属的绿原酸作为指标，测定含量，并提高了其标准能较好的控制药品质量。
一、高效液相色谱条件
十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
流动相：乙腈-0.4％磷酸溶液(8∶92)
检测波长：327nm
流速：1.0ml/min
二、含量测定
(一)方法考察
1、流动相筛选
采用高效液相色谱法，流动相筛选结果见表1。
表1色谱条件筛选结果
| 流动相 | 保留时间(min) | 理论塔板数 | 备注 |
| 乙腈-水-磷酸(9∶91∶0.4) | 25.638 | 10279.6 | 主峰拖尾 |
| 乙腈-0.4％磷酸溶液(10∶90) | 20.367 | 8282.9 | 主峰与前面峰分离不好 |
| 乙腈-0.4％磷酸溶液(8∶92) | 30.447 | 12344.4 | 峰形良好 |
以上各液相色谱条件其它参数均为：检测波长为327nm；柱温为40℃；流速为1.0ml/min。
由以上试验结果可知，条件3保留时间适当，柱效高。故确定色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.4％磷酸溶液(8∶92)为流动相；检测波长为327nm；柱温为40℃。理论板数按绿原酸峰计不低于1500，杂峰与主峰分离度符合规定。
2、参芪肝康片供试品提取方式、提取时间的选择
2.1参芪肝康片供试品提取方式的确定
根据实际操作，我们选择比较了加热回流和超声两种不同的提取参芪肝康片中绿原酸的方法，分别采用50％甲醇20ml回流提取60min和超声提取(功率160W，频率40kHZ)60min对所测得样品中绿原酸的含量的影响，结果见表2。
表2提取方式比较结果表
| 提取方式 | 回流提取60min | 超声提取60min |
| 绿原酸含量(mg/片) | 0.56 | 0.59 |
结果表明：超声提取60min提取供试品的效果比较理想。
2.2参芪肝康片供试品提取时间的确定
取50％甲醇20ml超声提取参芪肝康片，分别考察不同提取时间对所测得参芪肝康片中绿原酸的含量的影响，结果见表3。
表3提取时间比较结果表
| 提取时间(min) | 20 | 30 | 50 | 60 | 100 |
| 绿原酸含量(mg/片) | 0.37 | 0.43 | 0.57 | 0.59 | 0.58 |
结果表明：参芪肝康片中的绿原酸的提取率随提取时间的延长而增加，但提取时间到60min后再延长，其绿原酸的提取率不再增加，所以确定了用50％甲醇20ml超声提取60min为宜。
3、检测波长选择参照资料方法，检测绿原酸波长327nm，对其进行了试验。结果表明：阴性在327nm波长处无干扰，样品与对照品有相同的最大吸收峰，结果较理想，故采用检测波长为327nm。
(二)色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.4％磷酸溶液(8∶92)为流动相；检测波长为327nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于1500。
(三)对照品溶液的制备取绿原酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含绿原酸40μg的溶液。
(四)参苠肝康片供试品溶液的制备取重量差异项下参芪肝康片20片，精密称定，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇40ml，密塞，称定重量，超声处理(功率160W，频率40kHZ)60分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(五)阴性溶液的制备取缺茵陈提取物样品，按供试品方法制得阴性溶液。
(六)含量测定
1.线性关系的考察：取绿原酸对照品约4.0mg，精密称定，置于25ml量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为母液。取母液分别稀释成四种不同浓度的对照品溶液，各取10μl注入液相色谱仪，测定峰面积，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标做线性回归，峰面积结果及回归方程见表4，标准曲线见图4。
表4线性关系考察结果
| 浓度(μg/ml) | 10.125 | 20.25 | 40.5 | 81.0 | 162.0 |
| 峰面积回归方程 | 344021.4 | 697288.6Y＝34928 | 1398657.3X-2393.8 | 2874016.9r＝0.9999 | 5637182.7 |
表明绿原酸的进样浓度在10.125μg/ml～162.0μg/ml之间呈现良好的线性关糸。
2.溶液稳定性试验
取参芪肝康片供试品溶液，依含量测定方法分别在放置0、2、4、6、8小时后测定其绿原酸含量，结果表明样品溶液8小时内稳定，测定结果见表5。
表5溶液稳定性试验结果
| 时间(小时) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 |
| 峰面积RSD(％) | 1364047.5 | 13489l0.3 | 1344182.50．69 | 1344236.2 | 1340319.4 |
试验结果表明：绿原酸含量测定方法的溶液稳定性较好。
3.进样精密度试验
取绿原酸对照品适量，精密称定，用50％甲醇稀释制成每1ml中约含绿原酸40μg的溶液，摇匀，精密量取10μl注入液相色谱仪，连续进样5次。结果见表6。
表6进样精密度试验结果
| 次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 峰面积RSD(％) | 1416958．3 | 1434834.0 | 1409537.30.75 | 1408584.9 | 14148820.6 |
试验结果表明：绿原酸含量测定方法的进样精密度较好。
4.中间精密度试验
由不同试验人员，使用不同的仪器，在不同时间，按照含量测定项下的方法，各测定3份参芪肝康片样品，结果见表7。
表7中间精密度试验结果
| 次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 绿原酸含量(mg/片)RSD(％) | 0.58 | 0.59 | 0.58 | 0.581.00 | 0.58 | 0.59 |
结论：绿原酸含量测定方法的中间精密度较好。
5.重复性试验
取同一批号参芪肝康片样品6份，精密称定，依含量测定方法分别测定其绿原酸含量。测定结果见表8。
表8含量测定重复性试验结果
| 次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 绿原酸含量(mg/片)RSD(％) | 0.59 | 0.59 | 0.58 | 0.590.87 | 0.59 | 0.58 |
试验结果表明：绿原酸含量测定方法的重复性较好。
6.空白干扰实验
取空白溶剂50％甲醇10μl，直接进样，结果见图5。
取缺茵陈和刺五加的阴性对照样品，制备阴性对照样品溶液，按上述色谱条件，测得绿原酸对照品、参芪肝康片样品溶液、阴性对照溶液、茵陈对照药材溶液和刺五加浸膏溶液的色谱图，分别见图6～10。结果在与绿原酸对照品相同保留时间处，参芪肝康片供试品溶液、茵陈对照药材溶液均出现绿原酸色谱峰，阴性对照样品保留时间处无杂质峰出现，表明阴性对照无干扰。
7.回收率试验
精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含绿原酸40μg的溶液，作为对照品溶液。
精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含绿原酸400μg的溶液，作为储备液。
取参芪肝康片细粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入储备液2ml，精密加入50％甲醇38ml，密塞，称定重量，超声(功率160W，频率40kHZ)处理60min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪。
按照以上方法分别配制6份参芪肝康片样品进行测定，计算加样回收率，结果见表9。
表9回收率试验测定结果
| 序号 | 样品中含量(mg) | 对照品加入量(mg) | 测得总量(mg) | 回收率(％) | 平均值(％) | RSD(％) |
| 123456 | 0.7440.7500.7540.7460.7490.749 | 0.7980.7980.7980.7980.7980.798 | 1.5431.5411.5381.5461.5511.556 | 100.1399.1298.2510025100.50101.13 | 99.90 | 1.04 |
试验结果表明：绿原酸含量测定方法的加样回收率符合要求。
8.定量限
取绿原酸对照品适量，精密称定，适当稀释后，取10μl注入液相色谱仪，直至主峰峰高约为基线噪音的10倍，作为绿原酸的定量限，绿原酸定量限浓度：0.30μg/ml。
9.含量测定结果
按含量测定法拟定的色谱条件，将供试品溶液和对照品溶液各10μl注入液相色谱仪中，测定绿原酸含量结果。三批样品的含量结果见表10。见图11～14。
表10含量测定结果
| 样品 | 绿原酸含量(mg/片) | 平均含量(mg/片) |
| 样品1样品2样品3 | 0.620.610.60 | 0.61 |
由测定结果可见，考虑到大生产时药材不同，故规定本品每片含绿原酸(C16H18O9)不得少于0.48mg。
实施例2：
鉴别茵陈薄层色谱鉴别取参芪肝康片10g，研细，加水30ml，超声处理30分钟，加三氯甲烷2次，每次20ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取茵陈对照药材2g，加水60ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，加三氯甲烷提取2次，每次20ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯(10∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。
黄芪薄层色谱鉴别取参芪肝康片20g，研细，加甲醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液加于中性氧化铝柱(100～120目，20g，内径10～15mm)上，用40％甲醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水30ml使溶解，用水饱和的正丁醇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各15μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
刺五加薄层色谱鉴别取参芪肝康片10g，研细，加75％乙醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取2次，每次5ml，合并三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取异秦皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(24∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
2.含量测定绿原酸含量测定照高效液相色谱法测定，色谱条件与系统适应性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.4％磷酸溶液(8∶92)为动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于1500。
对照品溶液的制备精密称取绿原酸适量，加50％甲醇制成40μg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液制备取重量差异项下参芪肝康片20片，精密称定，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇40ml，密塞，称定重量，超声处理(功率160W，频率40kHZ)60分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中进行测定。
本品每片含绿原酸不得少于480μg。
Claims (2)
1.一种参芪肝康片的质量标准控制方法，其特征在于：该方法中的a鉴别方法和b含量测定是以下方法的一种或几种：
a鉴别：
茵陈薄层色谱鉴别取参芪肝康片5～20g，研细，加水15～60ml，超声处理15～60分钟，加三氯甲烷提取2～3次，每次10～40ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇0.5～2ml使溶解，作为供试品溶液；另取茵陈对照药材0.5～3g，加水15～90ml，超声处理15～60分钟，放冷，滤过，加三氯甲烷提取2～3次，每次10～40ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇0.5～2ml使溶解，制成对照药材溶液；用薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2.5～20μl，分别点于硅胶板上，以石油醚-乙酸乙酯5～20∶1～10为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5～10％香草醛10～20％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；
黄芪薄层色谱鉴别取参芪肝康片5～40g，研细，加甲醇10～100ml，加热回流0.5～2小时，滤过，滤液加于中性氧化铝柱上，用20～80％甲醇40～100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水10～50ml使溶解，用水饱和的正丁醇提取1～3次，每次10～30ml，合并正丁醇液，用水洗涤1～3次，每次10～30ml；弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.2～2ml使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5～3mg的溶液，作为对照品溶液；用薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5～20μl，分别点于硅胶板上，以三氯甲烷-甲醇-水1.3～26∶0.7～14∶0.2～4的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10～20％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
刺五加薄层色谱鉴别取参芪肝康片5～20g，研细，加50～85％乙醇10～100ml，加热回流0.5～2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水5～20ml使溶解，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取1～3次，每次5～20ml，合并三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇0.5～2ml使溶解，作为供试品溶液；另取异秦皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.5～3mg的溶液，作为对照品溶液；用薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5～20μl，分别点于硅胶板上，以三氯甲烷-甲醇2.4～48∶0.1～10为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
b含量测定：
绿原酸含量测定照高效液相色谱法测定，色谱条件与系统适应性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶或辛基硅烷键合硅胶或氰基或氨基键合硅胶为填充剂；乙腈-0.4％磷酸溶液8～10∶92～90为流动相；检测波长为300～400nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于1000～5000；
对照品溶液的制备 称取绿原酸适量，加25～75％甲醇制成10～162μg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液制备取参芪肝康片，研细，取约0.5～4g，称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25～75％甲醇20～80ml，密塞，称定重量，超声处理20～60分钟，放冷，再称定重量，用25～75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～20μl，注入液相色谱仪中进行测定；本品每片含绿原酸不得少于480μg。
2.根据权利要求1所述的一种参芪肝康片质量标准控制方法，其特征在于：该方法中的a鉴别方法和b含量测定是以下方法：
a鉴别：
茵陈薄层色谱鉴别取参芪肝康片10g，研细，加水30ml，超声处理30分钟，加三氯甲烷2次，每次20ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取茵陈对照药材2g，加水60ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，加三氯甲烷提取2次，每次20ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制成对照药材溶液；照薄层色谱法中国药典2005年版一部附录VIB试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚30～60℃-乙酸乙酯10∶5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；
黄芪薄层色谱鉴别取参芪肝康片20g，研细，加甲醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液加于中性氧化铝柱100～120目，20g，内径10～15mm上，用40％甲醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水30ml使溶解，用水饱和的正丁醇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法中国药典2005年版一部附录VI B试验，吸取上述两种溶液各15μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水13∶7∶2的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
刺五加薄层色谱鉴别取参芪肝康片10g，研细，加75％乙醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取2次，每次5ml，合并三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取异秦皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法中国药典2005年版一部附录VIB试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇24∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
b含量测定：
绿原酸含量测定照高效液相色谱法测定，色谱条件与系统适应性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.4％磷酸溶液8∶92为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于1500；
对照品溶液的制备精密称取绿原酸适量，加50％甲醇制成40μg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液制备取重量差异项下参芪肝康片20片，精密称定，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇40ml，密塞，称定重量，超声处理功率160W，频率40kHZ60分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中进行测定；
本品每片含绿原酸不得少于480μg。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN102240325A (zh) * | 2010-05-11 | 2011-11-16 | 西安兆兴制药有限公司 | 用于治疗肝炎的中药分散片及其制备方法 |
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2007
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080521 |