CN113061169A - 一种转录调控蛋白及其在共轭亚油酸生产中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种转录调控蛋白及其在共轭亚油酸生产中的应用，属于蛋白质工程和微生物工程技术领域。本发明的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的转录调控蛋白可提高共轭亚油酸生产菌株生产共轭亚油酸的产量，将含有本发明转录调控蛋白的重组短双岐杆菌接种至含有亚油酸的培养基中培养72h，即可使培养液中共轭亚油酸的产量高达0.48mg/mL、转化率高达96％，其中，cis9,trans11‑CLA占培养液中共轭亚油酸总量的96％、trans9,trans11‑C占培养液中共轭亚油酸总量的4％。

Description

一种转录调控蛋白及其在共轭亚油酸生产中的应用
技术领域
本发明涉及一种转录调控蛋白及其在共轭亚油酸生产中的应用，属于蛋白质工程和微生物工程技术领域。
背景技术
共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)是一系列含有共轭双键、具有多种位置和几何异构体的脂肪酸的总称。研究表明，共轭亚油酸具有缓解心血管疾病、减肥、抗炎症、缓解糖尿病症状等作用，因此，共轭亚油酸被广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。
不同共轭亚油酸异构体之间在功能上存在显著的区别，其中，cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA是公认的最具有生理活性的两种共轭亚油酸异构体，因此，市场上对cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA的需求极大。
天然的共轭亚油酸主要存在于瘤胃动物、某些植物和海洋生物中，并且，这些天然的共轭亚油酸主要以cis9,trans11-CLA的形式存在，生理活性极高，但是，它们含量极少，难以满足市场对于共轭亚油酸的需求。因此，人们逐渐开发了人工合成共轭亚油酸的方法。
目前，人工合成共轭亚油酸的方法主要有化学合成法以及微生物合成法。其中，化学合成法会导致很多有毒性的副产物的产生，对环境以及人体均具有毒害作用，并且，通过化学合成法制备得到的共轭亚油酸异构体种类多，很难进行有效的分离，因此，化学合成法无法真正实现共轭亚油酸的大规模工业化生产。与化学合成法相比，微生物合成法具有污染少、所得共轭亚油酸异构体种类单一的优点，因此，微生物合成法是一种极具潜力的可实现共轭亚油酸大规模工业化生产的方法。
但是，现有的微生物合成法仍存在许多缺陷，其中，产量低是限制微生物合成法的工业化生产进程的缺陷之一，例如，齐慧等人将植物乳杆菌ZS2058接种至含有亚油酸的培养基中培养72h，仅可使发酵液中共轭亚油酸的转化率达28.5％(具体可见参考文献：齐慧,杨波等.植物乳杆菌ZS2058生物转化共轭亚油酸机理的研究[D],江南大学,2017)；Hennessy等人将长双歧杆菌DPC6315接种至含有亚油酸的培养基中培养72h，仅可使发酵液中共轭亚油酸的转化率达11.02％(具体可见参考文献：Hennessy,A.A.,et al.2012.Theproduction of conjugated α-linolemic,γ-linolenic acid and stearidonic acidsby strains of bifidobacterial and propionibacteria,Lipids,47:313-327.)；Coakley等人将动物双歧杆菌Bb12接种至含有亚油酸的培养基中培养72h，仅可使发酵液中共轭亚油酸的转化率达27％(具体可见参考文献：Coakley,M.,et al.2003.Conjugatedlinoleic acid biosynthesis by human-derived Bifidobacterium species,J.Appl.Microbiol.94:138-145.)。
因此，急需找到一种提高共轭亚油酸生产菌株生产共轭亚油酸的产量的方法以克服现有微生物合成法产量低的缺陷。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种可提高共轭亚油酸生产菌株生产共轭亚油酸的产量的转录调控蛋白。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一种转录调控蛋白，所述转录调控蛋白为：
(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有转录调控蛋白活性的由(a)衍生的蛋白质。
本发明还提供了一种基因，所述基因编码上述转录调控蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒以pNZ44质粒为表达载体。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带上述基因或上述重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为短双岐杆菌。
本发明还提供了上述转录调控蛋白或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在生产共轭亚油酸方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述共轭亚油酸为cis9,trans11-CLA。
本发明还提供了一种生产共轭亚油酸的方法，所述方法为将上述宿主细胞接种至含有亚油酸的培养基中，于温度为35～40℃的条件下静置培养，得到富含共轭亚油酸的培养液；将富含共轭亚油酸的培养液进行分离取，得到共轭亚油酸。
在本发明的一种实施方式中，所述共轭亚油酸为cis9,trans11-CLA。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基为MRS培养基。
[有益效果]
本发明的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的转录调控蛋白可提高共轭亚油酸生产菌株生产共轭亚油酸的产量，将含有本发明转录调控蛋白的重组短双岐杆菌接种至含有亚油酸的培养基中培养72h，即可使培养液中共轭亚油酸的产量高达0.48mg/mL、转化率高达96％，其中，cis9,trans11-CLA占培养液中共轭亚油酸总量的96％、trans9,trans11-CLA占培养液中共轭亚油酸总量的4％。
附图说明
图1：短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCCNo.11828在亚油酸胁迫下的clgr基因转录水平变化。
图2：clgr基因干扰前后短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCC No.11828的bbi、mcra以及clgr基因的转录水平变化。
图3：重组短双岐杆菌Bifidobacterium breve/pNZ44-clgr(-)发酵获得的发酵液中亚油酸、共轭亚油酸以及10-羟基十八碳烯酸的含量。
图4：重组大肠杆菌E.coli Rossatt(DE3)/pET28a-clgr发酵获得的发酵液的SDS-PAGE图谱。
图5：ClgR纯化蛋白的Western blot(WB)图谱。
图6：bbi基因上游调控区域于ClgR蛋白的凝胶迁移结果。
图7：mcra基因上游调控区域于ClgR蛋白的凝胶迁移结果。
图8：ClgR蛋白的不同区域于bbi基因上游序列的凝胶迁移结果。
图9：ClgR蛋白的不同区域于mcra基因上游序列的凝胶迁移结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的细菌基因组DNA提取试剂盒以及质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，型号分别为DP302、DP103；下述实施例中涉及的PCR产物纯化试剂盒购自Thermo fisher公司；下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α和大肠杆菌(Escherichia coli)Rossatte(DE3)购自通用生物技术有限公司；下述实施例中涉及的pET-28a(+)质粒购自Thermo fisher公司；下述实施例中涉及的pNZ44质粒的构建方法记载于文献“McGrath,S.et al.,2001.Improvement and optimization of twoengineered phage resistance mechanisms in Lactobacoccus lactic.Applied andEnvironmental Microbiology,67(2):608-616.”中；下述实施例中涉及的亚油酸购自NuChek公司，纯度≥99.9％。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2HPO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L、吐温80 1mL/L、琼脂15g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2HPO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，使用前添加100μg/mL的卡那霉素。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L，使用前添加100μg/mL的卡那霉素。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
共轭亚油酸转化率、共轭亚油酸中共轭亚油酸异构体类型以及共轭亚油酸中各共轭亚油酸异构体占比的检测方法：按照3mL发酵液+2mL异丙醇+3mL正己烷的比例，在发酵液中加入异丙醇和正己烷，得到混合液；将混合液涡旋振荡30s；静置分层；移取上层的正己烷层至干净的螺旋玻璃瓶内，氮吹至干；接着加入400μL的甲醇，涡旋30s；每个玻璃瓶中加入80μL的重氮甲烷，进行甲酯化，此时溶液为黄绿色，反应15min，如果颜色不褪色，代表甲酯化比较充分；充分甲酯化后的液体经过氮吹至干，分别加入800μL的正己烷进行回溶，离心后，将上清液转移至色谱进样瓶中，暂存至GC-MS检测；
其中，共轭亚油酸转化率＝(共轭亚油酸的质量/对照组中亚油酸的质量)×100％。
10-羟基十八碳烯酸(10-HOE)含量的检测方法：
按照3mL发酵液+2mL异丙醇+3mL正己烷的比例，在发酵液中加入异丙醇和正己烷，得到混合液；将混合液涡旋振荡30s；静置分层；移取上层的正己烷层至干净的螺旋玻璃瓶内，氮吹至干；接着加入400μL的甲醇，涡旋30s；每个玻璃瓶中加入80μL的重氮甲烷，进行甲酯化，此时溶液为黄绿色，反应15min，如果颜色不褪色，代表甲酯化比较充分；充分甲酯化后的液体经过氮吹至干，分别加入800μL的正己烷进行回溶，离心后，将上清液转移至色谱进样瓶中，暂存至GC-MS检测；
其中，10-HOE的定性分析：通过二级质谱获得该物质的碎片离子峰，该化合物的特征碎片离子为m/z133，169，201.；定量分析：基于内标(C17:0)的峰面积与10-HOE的峰面积的对比，结合内标的浓度进行计算；
10-羟基十八碳烯酸(10-HOE)含量＝(10-HOE峰面积/内标峰面积)×内标浓度。
实施例1：编码转录调控蛋白的基因的筛选
具体步骤如下：
通过PacBio测序平台采集短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCCNo.11828(记载于公开号为CN105925514A的专利申请文本中)在亚油酸胁迫下的转录组学数据，通过转录组学分析发现唯一一个在三个取样点处转录水平均有显著上调的转录调控蛋白，并且，此转录调控蛋白的转录水平随着短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCCNo.11828的生长呈现了先升高在下降的趋势，这与共轭亚油酸的合成速率变化是一致的(转录水平检测的结果见图1)；经生物信息学分析，此转录调控蛋白可能属于HTH型，即ClgR蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)。
实施例2：编码转录调控蛋白的基因的克隆
具体步骤如下：
从保菌管中挑取短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCC No.11828的菌液划线于MRS固体培养基上，于37℃恒温厌氧工作站中培养48h，获得单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，于37℃恒温厌氧工作站中继续静置培养24h，连续活化3代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％(v/v)的接种量接种至MRS液体培养基中，于37℃恒温厌氧工作站中培养24h，获得菌悬液；将获得的菌悬液于25℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取湿菌体中的基因组DNA，并通过PCR反应扩增clgr基因；PCR反应结束，得到扩增产物，对扩增产物进行纯化后通过1％琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：120V，35min)验证扩增产物条带大小，凝胶成像仪中成像验证条带为750bp左右，条带单一且大小正确，获得clgr基因(此clgr基因即为编码实施例1筛选得到的ClgR蛋白的基因)；将获得的clgr基因先按照PCR产物纯化试剂盒的要求进行纯化，然后使用ddH2O进行回溶，最后置于碎冰中暂存；其中，扩增clgr基因所用引物见表1；
PCR反应体系包含：KOD 1μL、ddH2O 29μL、上下游引物各1μL、基因组DNA 1μL、dNTP5μL、10×reaction buffer 5μL以及Mg2+3μL；
PCR反应条件为：95℃，5min；(95℃，30s；55℃，30s；68℃，1min)循环30次；68℃，5min；12℃，5min。
表1引物序列
Figure BDA0002423195320000051
实施例3：转录调控蛋白功能的验证
具体步骤如下：
将pNZ44质粒导入大肠杆菌E.coli DH5α中，获得大肠杆菌E.coli DH5α/pNZ44；将大肠杆菌E.coli DH5α/pNZ44划线于LB固体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中培养18h，获得单菌落；挑取单菌落接种于LB液体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，连续活化3代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％(v/v)的接种量接种至LB液体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，获得菌悬液；将获得的菌悬液于25℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；使用质粒小提试剂盒提取湿菌体中的pNZ44质粒；将获得的pNZ44质粒用50μL的ddH2O回溶，于-20℃下储存。
合成实施例2获得的clgr基因的反向序列(核苷酸序列如SEQ ID No.5所示)；使用限制性内切酶KpnI和NdeI对获得的pNZ44质粒以及合成的clgr基因的反向序列进行酶切，然后利用T4连接酶将经酶切、纯化后的DNA进行连接，获得连接产物，具体连接体系如表2。
将获得的连接产物于16℃下过夜连接15h后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌DH5α感受态细胞涂布LB固体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)，37℃倒置培养24h；挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得重组质粒pNZ44-clgr(-)。
将获得的重组质粒pNZ44-clgr(-)导入短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCC No.11828中，获得重组短双岐杆菌Bifidobacterium breve/pNZ44-clgr(-)；以短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCC No.11828为空白对照，将获得的重组短双岐杆菌Bifidobacterium breve/pNZ44-clgr(-)划线于MRS固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养18h，获得单菌落；挑取单菌落分别接种于MRS液体培养基中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，连续活化3代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％(v/v)的接种量分别接种至含有0.5mg/mL游离亚油酸的MRS液体培养基中，于温度为37℃的条件下静置培养72h，获得发酵液；以短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCC No.11828为空白对照，提取发酵液中重组短双岐杆菌Bifidobacterium breve/pNZ44-clgr(-)的总RNA，用Bio-Rad CFXConnectTM Real-time System进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)，并通过溶解曲线和扩增曲线评估实时荧光定量PCR数据质量，以groEL作为内参基因，采用2-ΔΔCt法对数据进行分析，获得clgr基因干扰前后短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCC No.11828的bbi、mcra以及clgr基因的转录水平变化；检测获得的发酵液中亚油酸、共轭亚油酸以及10-羟基十八碳烯酸的含量(检测结果见图3)：
由图2～3可知，重组短双岐杆菌Bifidobacterium breve/pNZ44-clgr(-)合成CLA以及10-HOE的能力较短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCC No.11828有了明显的下降，并且，重组短双岐杆菌Bifidobacterium breve/pNZ44-clgr(-)中编码BBI以及MCRA的基因的转录水平也较短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCC No.11828有了明显的下降。说明，ClgR蛋白确实直接影响了BBI以及MCRA对应基因的转录水平，进而导致对应蛋白的表达量受损。
表2连接体系
Figure BDA0002423195320000071
实施例4：转录调控蛋白功能的验证
具体步骤如下：
将pET-28a(+)质粒导入大肠杆菌E.coli DH5α中，获得大肠杆菌E.coli DH5α/pET28a；将大肠杆菌E.coli DH5α/pET28a划线于LB固体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中培养18h，获得单菌落；挑取单菌落接种于LB液体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，连续活化3代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％(v/v)的接种量接种至LB液体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，获得菌悬液；将获得的菌悬液于25℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；使用质粒小提试剂盒提取湿菌体中的pET-28a(+)质粒；将获得的pET-28a(+)质粒用50μL的ddH2O回溶，于-20℃下储存。
使用限制性内切酶HindⅢ和NdeI对获得的pET-28a(+)质粒以及实施例2获得的clgr基因进行酶切，然后利用T4连接酶将经酶切、纯化后的DNA进行连接，获得连接产物，具体连接体系如表3。
将获得的连接产物于16℃下过夜连接15h后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌DH5α感受态细胞涂布LB固体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)，37℃倒置培养24h；挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得重组质粒pET28a-clgr基因。
将获得的重组质粒pET28a-clgr基因导入大肠杆菌E.coli Rossatte(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli Rossatt(DE3)/pET28a-clgr；将获得的重组大肠杆菌E.coliRossatt(DE3)/pET28a-clgr分别划线于LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养18h，获得单菌落；挑取单菌落分别接种于LB液体培养基中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，连续活化3代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％(v/v)的接种量分别接种至LB液体培养基中，于温度为37℃、转速为200rpm的条件下培养至OD600为0.4后，添加IPTG至终浓度分别为0mM、0.05mM、0.1mM、0.5mM、1.0mM，继续于温度分别为16℃、37℃，转速为200rpm的条件下培养15h，获得发酵液。
取1mL发酵液于4℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；在湿菌体中加入500μL的PBS重悬菌体，获得重悬液；在100μL重悬液中加入25μL 5*loading buffer(含5％β-巯基乙醇)，95℃加热20min后，通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况(每孔上样量15μL)(检测结果见图4)。
由图4可知，IPTG最佳诱导浓度为1.0mM，最佳诱导温度为37℃。
将发酵液于4℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；取2.05g湿菌体进行破碎后于4℃、12000g的条件下离心10min，获得细胞破碎上清液；将细胞破碎上清液经0.22μm的水系滤膜过滤后，先使用2mL的超纯水冲洗镍柱，然后使用2mL binding buffer冲洗柱子，接着将过滤后的细胞破碎上清液上样，依次使用10mM、50mM、100mM、200mM、250mM、500mM、500mM的咪唑缓冲液冲洗柱子，每次洗脱液收集在干净的1.5mL的离心管中，所有的实验操作均在冰上操作；吸取各洗脱液1mL进行混合，得到混合液；取200μL混合液，在混合液中加入50μL 5*loading buffer(含5％β-巯基乙醇)，95℃加热20min，SDS-PAGE检测(每孔上样量15μL)(检测结果见图4)。
由图4可知，目前的洗脱液的梯度洗脱可以获得纯净的N端含有6*HIS的ClgR蛋白。
通过跑胶、转膜以及显影对洗脱液使用抗ClgR蛋白的抗体进行了Western blot(WB)验证(检测结果见图5)。
由图5可知，洗脱液中的蛋白确实为ClgR蛋白。
表3连接体系
Figure BDA0002423195320000081
实施例5：转录调控蛋白功能的验证
对实施例4获得的纯净的N端含有6*HIS的ClgR蛋白以及bbi以及mcra基因的上游序列进行体外的凝胶迁移实验，具体步骤如下：
通过PBS缓冲溶液稀释实施例4获得的纯净的N端含有6*HIS的ClgR蛋白至浓度为100ng/μL；通过PCR扩增获得bbi以及mcra基因的上游序列，分别以bbi以及mcra基因的上游序列作为DNA样品，通过PBS缓冲溶液稀释bbi和mcra上游序列的DNA样品至浓度为50ng/μL；按照摩尔比分别为10：1、20：1、50：1(蛋白质：DNA)的比例将稀释后的蛋白质和DNA样品混合，得到20μL的反应体系(体系不足时使用binding buffer补齐)；将反应体系于24℃下反应50min，得到反应液；在反应液中加入4μL 6*DNA loading buffer，吹吸均匀，得到样品；将所有样品加入到浓度为6％(v/v)的PAGE胶中，130V跑胶30min；将胶小心取出后放入1*TBE缓冲溶液(含体积浓度为万分之一的核酸染料)中，震荡染色30min，凝胶成像仪中成像(检测结果见图6～9)。
由图6～7可知，ClgR蛋白可以特异性的结合在bbi以及mcra基因的上游启动子区域。
由图8～9可知，ClgR蛋白含有5个α螺旋，其中α4区域参与了与bbi以及mcra基因上游区域的结合。
实施例6：转录调控蛋白的应用
具体步骤如下：
将pNZ44质粒导入大肠杆菌E.coli DH5α中，获得大肠杆菌E.coli DH5α/pNZ44；将大肠杆菌E.coli DH5α/pNZ44划线于LB固体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中培养18h，获得单菌落；挑取单菌落接种于LB液体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，连续活化3代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％(v/v)的接种量接种至LB液体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，获得菌悬液；将获得的菌悬液于25℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；使用质粒小提试剂盒提取湿菌体中的pNZ44质粒；将获得的pNZ44质粒用50μL的ddH2O回溶，于-20℃下储存。
使用限制性内切酶KpNI和NdeI对获得的pNZ44质粒以及实施例2获得的clgr基因进行酶切，然后利用T4连接酶将经酶切、纯化后的DNA进行连接，获得连接产物，具体连接体系如表4。
将获得的连接产物于16℃下过夜连接15h后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌DH5α感受态细胞涂布LB固体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)，37℃倒置培养24h；挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得重组质粒pNZ44-clgr。
将获得的重组质粒pNZ44-clgr导入短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCCNo.11828中，获得重组短双岐杆菌Bifidobacterium breve/pNZ44-clgr；以短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCC No.11828为空白对照，将获得的重组短双岐杆菌Bifidobacterium brev/epNZ44-clgr划线于MRS固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养18h，获得单菌落；挑取单菌落分别接种于MRS液体培养基中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，连续活化3代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％(v/v)的接种量分别接种至含有0.5mg/mL游离亚油酸的MRS液体培养基中，于温度为37℃的条件下静置培养72h，获得发酵液；检测获得的细胞破碎上清液中共轭亚油酸的含量及转化率。
由检测结果可知，重组短双岐杆菌Bifidobacterium breve/pNZ44-clgr发酵获得的发酵液中共轭亚油酸的产量高达0.48mg/mL、转化率高达96％，其中，cis9,trans11-CLA占培养液中共轭亚油酸总量的96％、trans9,trans11-CLA占培养液中共轭亚油酸总量的4％；而短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCC No.11828发酵获得的发酵液中共轭亚油酸的产量为0.425mg/mL、转化率为85％，其中，cis9,trans11-CLA占培养液中共轭亚油酸总量的93％、trans9,trans11-CLA占培养液中共轭亚油酸总量的7％。可见，ClgR蛋白可提高短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCC No.11828生产共轭亚油酸的产量。
表4连接体系
Figure BDA0002423195320000101
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种转录调控蛋白及其在共轭亚油酸生产中的应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 172
<212> PRT
<213> Bifidobacterium breve
<400> 1
Met Ala Met Glu Thr Met Thr Arg Val Asn Glu Gln Met Glu Val Ser
1 5 10 15
Ala Lys Lys Pro Met Ala Val Gln Gln Gly Val Ala Arg Met Arg Glu
20 25 30
Leu Thr Pro Ala Gln Arg Arg Ala Val Met Phe Ala Gln Gln Gln Val
35 40 45
Leu Lys Ala Gln Ala Ala Lys Lys Ala Lys Asp Glu Arg Gln Ala Ala
50 55 60
Arg Asp Arg Met Trp Gln Glu Gln Glu Ser Ala Ser Tyr Gln Pro Asn
65 70 75 80
Ala Val Ala Glu Thr Ala Val Val Glu Glu Glu Pro Arg Glu Val Ser
85 90 95
Leu Arg Gly Ala Ile Gly His Val Leu Arg Asp Leu Arg Thr Arg Asp
100 105 110
Arg Arg Thr Leu Arg Glu Val Ser Glu Lys Ala Gly Val Ser Leu Gly
115 120 125
Tyr Leu Ser Glu Val Glu Arg Gly Gln Lys Glu Ala Ser Ser Glu Leu
130 135 140
Leu Ser Ser Ile Ser Asp Ala Leu Gly Val Ser Thr Ala Gln Met Leu
145 150 155 160
Arg Met Val Ala Asp Tyr Leu Glu Ser Val Glu Arg
165 170
<210> 2
<211> 519
<212> DNA
<213> Bifidobacterium breve
<400> 2
atggcgatgg aaacgatgac ccgagtgaac gaacaaatgg aagtgtccgc taagaagccg 60
atggctgtac agcagggtgt cgcccgtatg cgtgaattga ccccggccca gcgccgtgca 120
gtgatgtttg cgcagcagca ggtgctcaag gcgcaggccg ctaagaaggc caaggatgag 180
cgtcaggcgg ctcgtgaccg tatgtggcag gagcaggaat ccgcctccta ccagcccaat 240
gccgttgccg agaccgcggt ggtcgaagag gagccacgtg aggtttcttt gcgtggtgct 300
atcggccatg tgctgcgtga cctgcgtacc cgtgatcgcc gcaccctgcg tgaggtgtcc 360
gagaaggccg gcgtctcgct gggctatctg tccgaagtcg agcgtggtca gaaggaagcc 420
agctccgaat tgctgagctc catttccgat gcgctgggcg tgtcaactgc acagatgctg 480
cgtatggtgg ccgattacct cgagtccgtc gaacgttaa 519
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aagcctatgg cgatggaaac gatgacccg 29
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catatgttaa cgttcgacgg actcga 26
<210> 5
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttaacgttcg acggactcga ggtaatcggc caccatacgc agcatctgtg cagttgacac 60
gcccagcgca tcggaaatgg agctcagcaa ttcggagctg gcttccttct gaccacgctc 120
gacttcggac agatagccca gcgagacgcc ggccttctcg gacacctcac gcagggtgcg 180
gcgatcacgg gtacgcaggt cacgcagcac atggccgata gcaccacgca aagaaacctc 240
acgtggctcc tcttcgacca ccgcggtctc ggcaacggca ttgggctggt aggaggcgga 300
ttcctgctcc tgccacatac ggtcacgagc cgcctgacgc tcatccttgg ccttcttagc 360
ggcctgcgcc ttgagcacct gctgctgcgc aaacatcact gcacggcgct gggccggggt 420
caattcacgc atacgggcga caccctgctg tacagccatc ggcttcttag cggacacttc 480
catttgttcg ttcactcggg tcatcgtttc catcgccat 519

Claims (10)

1.一种转录调控蛋白，其特征在于，所述转录调控蛋白为：
(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有转录调控蛋白活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的转录调控蛋白。
3.如权利要求2所述的一种基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.一种重组质粒，特征在于，所述重组质粒携带权利要求2或3所述的基因。
5.如权利要求4所述的一种重组质粒，特征在于，所述重组质粒以pNZ44质粒为表达载体。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带权利要求2或3所述的基因或权利要求4或5所述的重组质粒。
7.如权利要求6所述的一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为短双岐杆菌。
8.权利要求1所述转录调控蛋白或权利要求2或3所述基因或权利要求4或5所述重组质粒或权利要求6或7所述宿主细胞在生产共轭亚油酸方面的应用。
9.一种生产共轭亚油酸的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求6或7所述宿主细胞接种至含有亚油酸的培养基中，于温度为35～40℃的条件下静置培养，得到富含共轭亚油酸的培养液；将富含共轭亚油酸的培养液进行分离，得到共轭亚油酸。
10.如权利要求9所述的一种生产共轭亚油酸的方法，其特征在于，所述共轭亚油酸为cis9,trans11-CLA。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050170477A1 (en) * 2002-03-27 2005-08-04 Marjatta Vahvaselka Process for preparing conjugated linoleic acid
CN101341254A (zh) * 2005-12-24 2009-01-07 蒂加斯克乳制品研究中心 反-10，顺-12十八碳二烯酸的生产方法
CN101864463A (zh) * 2010-06-09 2010-10-20 中国农业大学 一种生物合成共轭亚油酸cla的方法
EP2368905A2 (en) * 2004-12-17 2011-09-28 Metanomics GmbH Process for the control of production of fine chemicals
CN103917644A (zh) * 2011-09-21 2014-07-09 桑格摩生物科学股份有限公司 调控转基因表达的方法和组合物
CN105164152A (zh) * 2013-03-15 2015-12-16 拜尔健康护理有限责任公司 作为靶向试剂的gla结构域
CN105925514A (zh) * 2016-07-12 2016-09-07 江南大学 一株短双歧杆菌及其制备共轭亚油酸或共轭亚麻酸的应用
CN106148230A (zh) * 2016-07-12 2016-11-23 江南大学 一株假小链双歧杆菌及其制备共轭亚油酸或共轭亚麻酸的应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050170477A1 (en) * 2002-03-27 2005-08-04 Marjatta Vahvaselka Process for preparing conjugated linoleic acid
EP2368905A2 (en) * 2004-12-17 2011-09-28 Metanomics GmbH Process for the control of production of fine chemicals
CN101341254A (zh) * 2005-12-24 2009-01-07 蒂加斯克乳制品研究中心 反-10，顺-12十八碳二烯酸的生产方法
CN101864463A (zh) * 2010-06-09 2010-10-20 中国农业大学 一种生物合成共轭亚油酸cla的方法
CN103917644A (zh) * 2011-09-21 2014-07-09 桑格摩生物科学股份有限公司 调控转基因表达的方法和组合物
CN105164152A (zh) * 2013-03-15 2015-12-16 拜尔健康护理有限责任公司 作为靶向试剂的gla结构域
CN105925514A (zh) * 2016-07-12 2016-09-07 江南大学 一株短双歧杆菌及其制备共轭亚油酸或共轭亚麻酸的应用
CN106148230A (zh) * 2016-07-12 2016-11-23 江南大学 一株假小链双歧杆菌及其制备共轭亚油酸或共轭亚麻酸的应用

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLACK I L等: "Chronic but not acute treatment with conjugated linoleic acid (CLA) isomers (trans-10, cis-12 CLA and cis-9, trans-11 CLA) affects lipid metabolism in Caco-2 cells", 《JOURNAL OF NUTRITION》 *
FRANCESCA B 等: "Comparative genome and methylome analysis reveals restriction/modification system diversity in the gut commensal Bifidobacterium breve", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
JAUDSZUS, A等: "Cis-9,Trans-11-CLA exerts anti-inflammatory effects in human bronchial epithelial cells and eosinophils: Comparison to Trans-10,Cis-12-CLA and to linoleic acid", 《BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA》 *
NCBI: "Bifidobacterium breve strain lw01 chromosome, complete genome", 《GENBANK DATABASE》 *
NCBI: "helix-turn-helix transcriptional regulator [Bifidobacterium breve]", 《GENBANK DATABASE》 *
NCBI: "Transcriptional regulator [Bifidobacterium breve]", 《GENBANK DATABASE》 *
SENIZZA A等: "Effects of Linoleic Acid on Gut-Derived Bifidobacterium breve DSM 20213: A Transcriptomic Approach", 《MICROORGANISMS》 *
VENTURA M等: "Genetic and Transcriptional Organization of the clpC Locus in Bifidobacterium breve UCC 2003", 《APPLIED & ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
VENTURA M等: "The ClgR Protein Regulates Transcription of the clpP Operon in Bifidobacterium breve UCC 2003", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 *
YOSHIYUKI等: "Mycobacterial Caseinolytic Protease Gene Regulator ClgR Is a Substrate of Caseinolytic Protease", 《MSPHERE》 *
夏珺等: "共轭亚油酸改善肥胖糖尿病小鼠的糖脂代谢", 《南方医科大学学报》 *
金凤等: "共轭亚油酸(CLA)负突变植物乳杆菌p8中转录因子rpoD基因序列的变化研究", 《农产品加工(学刊)》 *
陈海琴等: "植物乳杆菌ZS2058生物转化共轭亚油酸反应条件的优化研究", 《食品工业科》 *
高鹤: "双歧杆菌生物转化共轭亚油酸的机制研究", 《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *

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