CN113061112A - 咪唑二肽的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种咪唑二肽的制造方法，与现有技术相比溶出处理的负荷和时间减小，进而能够获得肌酸酐的混入量少、纯度高的咪唑二肽。上述目的是通过包括以下工序(1)和(2)的高纯度咪唑二肽的制造方法而实现。(1)在规定的pH值下将含有咪唑二肽和肌酸酐的动物性提取物实施与离子交换基为碱金属盐型的强酸性阳离子交换树脂接触的离子吸附处理，由此将咪唑二肽向强酸性阳离子交换树脂吸附的工序；(2)在规定的pH值下，将吸附了咪唑二肽的强酸性阳离子交换树脂实施使用碱性水溶液的溶出处理，由此获得高纯度咪唑二肽的工序。

Description

咪唑二肽的制造方法
技术领域
本发明涉及一种咪唑二肽的制造方法。
背景技术
咪唑二肽是具有咪唑基的组氨酸或组氨酸衍生物与氨基酸结合的二肽；作为其具体例可列举：鹅肌肽(anserine，β-丙氨酰基-1-甲基组氨酸)、肌肽(carnosine，β-丙氨酰基组氨酸)、鲸肌肽(balenine，β-丙氨酰基-3-甲基组氨酸)、高肌肽(homocarnosine，γ-氨基丁酰基-L-组氨酸)等。咪唑二肽已知具有抗疲劳作用、降血糖值作用等生理作用，作为功能性成分而受到关注。
作为咪唑二肽的制造方法，除了使用化学合成或酶合成的方法以外，还有从含有咪唑二肽的金枪鱼、鲣鱼、鲑鱼等鱼类，牛、猪等哺乳类，家禽等鸟类的此类动物的提取物中取得的方法。
作为由动物性提取物来制造咪唑二肽的方法，有利用离子交换处理的方法。例如，在专利文献1中记载有如下方法：将对水产动物的提取物进行脱盐处理所得到的脱盐处理液通过H型弱酸性阳离子交换树脂从而吸附咪唑二肽，接着进行水洗然后用盐酸和/或食盐水将咪唑二肽溶出。
另外，在专利文献2中记载有如下方法：使动物性提取物与H型的强酸性阳离子交换树脂接触从而吸附含咪唑二肽、游离氨基酸的动物提取物中的阳离子性物质，接着一边搅拌强酸性阳离子交换树脂一边添加第一碱性溶剂将pH值设为4.5至7.5由此除去夹杂物，接着添加第二碱性溶剂将pH值定为7.5以上，从而将咪唑二肽溶出。
在专利文献3中记载有如下方法：使动物性提取物与使用调整至与动物性提取物相同电导率范围(10±2mS/cm)和pH范围(5.0±0.5)的缓冲液而预先平衡化为H型的强酸性阳离子交换树脂接触，从而吸附咪唑二肽，接着用缓冲液和纯水进行洗涤，然后将pH值在8至12范围的碱溶液进行通液或混合，由此将咪唑二肽溶出。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本发明专利第4612549号
专利文献2：日本发明专利第5512995号
专利文献3：日本发明专利第5142126号
发明内容
发明要解决的课题
专利文献1中记载的方法是使用H型弱酸性离子交换树脂的方法，利用动物性提取物中所含的钾离子等盐分来阻碍咪唑二肽向弱酸性离子交换树脂的吸附。另外，在弱酸性离子交换树脂从H型变为其他离子型时发生急剧的体积变化，在填充了树脂的柱内通液压损失增大，存在有可能柱会发生破损的问题。另外，弱酸性离子交换树脂的比重较小，难以实施采用反洗的树脂收集等，因此存在不适于工业规模应用的问题。
而另一方面，专利文献2和3中记载的方法是使用强酸性离子交换树脂的方法，利用盐分对咪唑二肽向离子交换树脂吸附的阻碍得到缓减。但是，专利文献2中记载的方法是使用两种溶出溶剂，将pH值分为2个阶段进行溶出由此提高咪唑二肽的溶出效率的方法；溶出处理的负担和时间增加，且经济性差，是存在收获率降低的可能性的方法。
另外，专利文献2中记载的方法是以除去水产动物提取物中大量含有的砷化合物即砷甜菜碱作为目的的方法，专利文献2中没有关于肌酸酐的记载。实际上，根据本发明者们的调查，若用H型强酸性阳离子交换树脂来吸附鸡提取物，再用碱性水溶液进行洗脱，则肌酸酐相对于咪唑二肽的含量为33.4质量％。专利文献3的图1和图2中也揭示了这种情况。因此，在专利文献2中记载的方法中几乎未能除去肌酸酐。
另外，在鸡胸肉提取物等含有很多咪唑二肽的动物性提取物中，除了咪唑二肽外，还含有大量的蛋白质、游离氨基酸、无机盐类等，尤其是鸡胸肉提取物以与咪唑二肽相同的摩尔程度而含有肌酸酐。肌酸酐在动物体内是以肌肉能量源即磷酸肌酸的代谢产物的形式而生成，并通过肾脏的功能而向体外排出的废物。因此，在从动物性提取物中提取咪唑二肽时，混入的肌酸酐变成了杂质。
就专利文献3中记载的方法而言，如专利文献3中记载的GPC-HPLC色谱图所示，肌酸酐相对于咪唑二肽的峰高的比，与原料中(图1)相比，在阳离子交换物处理液中(图2)有增加倾向，与咪唑二肽共存的肌酸酐的除去效率非常低。因此，在专利文献3中记载的方法中，夹杂成分与咪唑二肽一起被吸附和溶出，未能获得纯度高的咪唑二肽。
因此，本发明将提供与专利文献2中记载的方法相比溶出处理的负荷和时间减小，进而能够获得与专利文献3中记载的方法相比肌酸酐的混入量更少的纯度高的咪唑二肽的咪唑二肽的制造方法作为本发明要解决的课题。
解决课题的手段
本发明者们为了解决上述课题而进行了努力研究，结果认为，在咪唑二肽的分离精制中使用H型强酸性阳离子交换树脂的情况下，在动物性提取物中的咪唑二肽和无机盐类向树脂吸附时，放出质子从而使pH值下降，由此使动物性提取物中的肌酸酐、蛋白质、色素等弱电解质具有正电荷并且向树脂的吸附变得容易，因此以溶出物形式而获得的咪唑二肽的纯度降低。因此，发现了在使含有咪唑二肽的动物性提取物与制成不是H型而是Na型等的碱金属盐型的强酸性阳离子交换树脂接触时，防止由于平衡吸附时的pH降低所导致的肌酸酐吸附，并且咪唑二肽有效率地被树脂吸附。另外，在碱金属盐型的情况下，与H型相比吸附离子选择性更高，并且在吸附时pH值被保持在中性附近，因此对于在吸附时动物性提取物中所存在夹杂成分的阳离子的排除而言是有效的。
另外，本发明者们发现：基于在向强酸性阳离子交换树脂的吸附中吸附平衡时pH值(解离常数)的差异，探索将咪唑二肽与肌酸酐分离的可能性。于是，注意咪唑二肽和肌酸酐的电荷状态，并通过实验确认咪唑二肽具有正电荷并且肌酸酐的正电荷变弱的pH值，在其条件下达到吸附平衡由此提高肌酸酐的排他性，从而能够获得纯度高的咪唑二肽。特别是发现了，若使用碱金属盐型的强酸性阳离子交换树脂，则在规定的pH范围内，咪唑二肽相对于肌酸酐更优先被吸附。
总结这些见识，在将动物性提取物的pH值设定在规定的范围内并使用离子交换基为碱金属盐型的强酸性阳离子交换树脂而实施离子吸附处理时，令人惊奇地发现，即使不像专利文献2中记载的方法那样分阶段地实施溶出处理，也能维持回收率，从而获得肌酸酐含量减小的纯度高的咪唑二肽。更令人惊奇地，所获得咪唑二肽是与通过专利文献3中所记载方法而获得的咪唑二肽相比，肌酸酐的混入量更少、进而色味得到改善、苦味减小、嗜好性高的咪唑二肽。
基于这样的见识，本发明者们最后在规定的pH范围内将动物性提取物实施使用离子交换基为碱金属盐型的强酸性阳离子交换树脂的离子吸附处理，由此优先地吸附咪唑二肽，并且将所吸附的咪唑二肽实施使用碱性水溶液的溶出处理，由此成功地创建出包含获得高纯度咪唑二肽在内的高纯度咪唑二肽的制造方法。本发明是基于这样的分析结果、成功例而完成的发明。
因此，根据本发明的一个实施方案，提供以下的[1]至[9]项中所示的方法。
[1]包含以下的工序(1)和(2)的高纯度咪唑二肽的制造方法。
(1)在使咪唑二肽具有正电荷并且肌酸酐的正电荷相对于咪唑二肽的正电荷的比率为20％以下的pH值下，将含有咪唑二肽和肌酸酐的动物性提取物实施与离子交换基为碱金属盐型的强酸性阳离子交换树脂接触的离子吸附处理，由此将咪唑二肽向强酸性阳离子交换树脂吸附的工序；
(2)在使咪唑二肽具有零电荷或负电荷的pH值下，将吸附了咪唑二肽的强酸性阳离子交换树脂实施使用碱性水溶液的溶出处理，由此获得高纯度咪唑二肽的工序。
[2]如[1]中所述的方法，其中，所述工序(1)是在使咪唑二肽具有正电荷并且肌酸酐的正电荷相对于咪唑二肽的正电荷的比率为20％以下的pH值下，使含有咪唑二肽和肌酸酐的动物性提取物实施与离子交换基为碱金属盐型的强酸性阳离子交换树脂接触的离子吸附处理，然后将强酸性阳离子交换树脂实施使用水的洗涤处理，由此将咪唑二肽向强酸性阳离子交换树脂吸附的工序。
[3]如[1]至[2]中任一项所述的方法，其中，所述工序(1)的pH值为5.6至8.2，并且/或者所述工序(2)的pH值为8.5至15.0。
[4]如[1]至[3]中任一项所述的方法，其中，所述强酸性阳离子交换树脂是按顺序将酸水溶液和碱金属盐水溶液进行通液由此将离子交换基转换成碱金属盐型的强酸性阳离子交换树脂。
[5]如[1]至[4]中任一项所述的方法，其中，所述碱性水溶液是碱金属水合物的水溶液。
[6]如[1]至[4]中任一项所述的方法，其中，所述碱性水溶液是氢氧化钠水溶液。
[7]如[1]至[6]中任一项所述的方法，其中，所述碱金属盐是选自钠和钾中的至少一种碱金属盐。
[8]如[1]至[7]中任一项所述的方法，其中，所述动物性提取物是实施了脱盐处理的动物性提取物。
[9]如[1]至[8]中任一项所述的方法，其中，所述动物性提取物是选自鸡提取物、牛提取物、猪提取物、鲑鱼提取物、鲣鱼提取物和金枪鱼提取物中的至少一种动物性提取物。
发明的效果
根据本发明的一个实施方案的方法，通过使用强酸性阳离子交换树脂，即使没有复杂的设备、装置、操作等，也能够在不增加负荷和时间的情况下实施溶出处理，尽管这样也可以获得减少肌酸酐混入的纯度高的咪唑二肽。因此，本发明的一个实施方案的方法是简便并且经济性优异的能够以工业规模实施的方法。
另外，根据本发明的一个实施方案的方法，可以从动物性提取物中回收与专利文献3中记载的方法相同或超过该方法的咪唑二肽。因此，本发明的一个实施方案的方法，与专利文献3中记载的方法相比，可以减小肌酸酐相对于咪唑二肽的比率(肌酸酐/咪唑二肽)。进而，根据本发明的一个实施方案的方法，能够获得色味改善、苦味降低的嗜好性高的咪唑二肽。
附图说明
图1是如后述实施例中所示的、将鹅肌肽、肌肽和肌酸酐的pH值与实效电荷之间的关系图形化的图。
图2是如后述实施例中所示的、将pH值与肌酸酐相对于咪唑二肽的正电荷的比率的关系图形化的图。
图3是如后述实施例中所示的、将向树脂的吸附率相对于吸附时pH值和负荷量的关系图形化的图。
图4是如后述实施例中示的、将pH值、Brix和咪唑二肽量相对于鸡提取物的通液量的变化图形化的图。
图5A是如后述实施例中所示的、示出了表示作为原料的鸡提取物及实施本发明的一个实施方案的方法所获得离子交换洗脱液中的咪唑二肽和肌酸酐的存在量的GPC-HPLC的测定结果的图。
图5B是与专利文献3的图1和图2相对应的图。
图6是如后述实施例中所示的、示出了表示作为原料的鲑鱼提取物和实施本发明的一个实施方案的方法所所获得离子交换洗脱液中的咪唑二肽和肌酸酐的存在量的GPC-HPLC的测定结果的图。
具体实施方式
下面，对作为本发明一个实施方案的方法的详细内容进行说明，但不仅局限于本项目的事项，本发明只要达到其目的则能够采用各种实施方案。
本说明书中的各术语，只要没有另外的规定，则以本领域技术人员通常所用的含义而使用，不能作为具有不适当限定含义的术语而解释。另外，在本说明书中所做出的推测和理论是根据本发明者们目前为止的见识和经验而做出的，因此本发明并不仅局限于这样的推测和理论。
“RV”表示相对于树脂量的溶剂的流量倍数，例如，在将相对于树脂量为2倍的动物性提取物进行通液的情况下，RV为2。
“SV”表示空间速率(Space Velocity)，表示每1小时通过树脂量(体积)的液量(体积)相对于树脂量的比率。例如，在1m3的树脂中每1小时通过5m3的液量的情况下，SV为5。
“和/或”意指列举的多个关联项中的任1个或2个以上的任意组合或者全部的组合。
数值范围的“～”是包含其前后数值的范围，例如，“0质量％～100质量％”意指0质量％以上且100质量％以下的范围。
“含有”意指可以附加所包含的而明确表示的要素以外的要素(与“至少含有”为同义)，包括“由……组成”和“本质上由……组成”。亦即，“含有”可以意指包含明确表示的要素及任意1种或2种以上的要素、由明确表示的要素组成、或本质上由明确表示的要素组成。作为要素，可列举成分、工序、条件、参数等的限制事项等。
整数值的位数与有效数字的位数是一致的。例如，1的有效数字为1位，10的有效数字为2位。另外，在小数值中，小数点之后的位数与有效数字的位数是一致的。例如，0.1的有效数字为1位，0.10的有效数字为2位。
[本发明的一个实施方案的方法的概要]
本发明的一个实施方案的方法是关于通过离子交换处理由动物性提取物制造咪唑二肽的方法。本发明的一个实施方案的方法包括以下的工序(1)和(2)。
(1)在使咪唑二肽具有正电荷并且肌酸酐的正电荷相对于咪唑二肽的正电荷的比率为20％以下的pH值下，将含有咪唑二肽和肌酸酐的动物性提取物提供者至向离子交换基为碱金属盐型的强酸性阳离子交换树脂接触的离子吸附处理，由此将咪唑二肽向强酸性阳离子交换树脂吸附的工序；
(2)在使咪唑二肽具有零电荷或负电荷的pH值下，将吸附了咪唑二肽的强酸性阳离子交换树脂实施使用碱性水溶液的溶出处理，由此获得高纯度咪唑二肽的工序。
咪唑二肽，如果是通常已知的化合物则没有特别限制，例如可以是具有咪唑基的组氨酸或组氨酸衍生物与氨基酸结合的二肽。作为咪唑二肽的具体例，可列举：鹅肌肽(β-丙氨酰基-1-甲基组氨酸)、肌肽(β-丙氨酰组氨酸)、鲸肌肽(β-丙氨酰基-3-甲基组氨酸)、高肌肽(γ-氨基丁酰基-L-组氨酸)等。
动物性提取物，如果是将鱼类、鸟类、哺乳类等动物的肉等部位中所含有的成分溶出到提取介质中所获得的提取物即可。动物的种类，如果是在肉等部位中含有咪唑二肽的动物则没有特别限制，例如可列举：含有很多鹅肌肽的鲣鱼、金枪鱼、鲑鱼、鳗鱼、鲨鱼、牛、鸡；含有很多肌肽的猪；含有很多鲸肌肽的鲸等。动物性提取物，从咪唑二肽含量较大、资源量丰富、或饲养容易的方面而言，优选的是鸡、牛、猪等畜肉及鲑鱼、鲣鱼、金枪鱼等鱼类的肌肉。
对于动物性提取物的取得方法没有特别限制，可以利用将含有咪唑二肽的动物的部位实施水提取、热水提取、乙醇提取、超临界提取等众所周知的提取方法而获得的提取物，也可以是市售的提取物，可利用任一种。动物性提取物可以是将上述提取物实施固液分离处理、浓缩处理、干燥处理、稀释处理等加工处理的动物性提取物。另外，动物性提取物由于所含的不溶性固形物和脂肪成分，可能会导致妨碍咪唑二肽向强酸性阳离子交换树脂的吸附、并带来强酸性阳离子交换树脂劣化的问题，因此优选的是通过利用上述加工处理等将这些不溶性固形物和脂肪成分除去。
动物性提取物在后段的离子交换处理中，损失率下降使得单位树脂的咪唑二肽的吸附量提高，结果使咪唑二肽的纯度提高，因此优选的是实施脱盐处理。动物性提取物的脱盐处理，优选的是例如在使用具备CMV-N/AMV-N的电透析脱盐机“DW-3E2型”(AGC工程公司制造)作为阳离子交换膜/阴离子交换膜，优选的是在相对于1质量％的咪唑二肽目标电导率为2mS/cm至14mS/cm、优选为5mS/cm左右的条件下实施。
[工序(1)：吸附处理工序]
在工序(1)中，在规定的pH值下，使动物性提取物与离子交换基为碱金属盐型的强酸性阳离子交换树脂接触，从而将咪唑二肽向强酸性阳离子交换树脂吸附。
阳离子交换树脂是具有阳离子性离子交换基的离子交换树脂。阳离子交换树脂被大致区分为具有磺酸基等强酸性离子交换基的强酸性阳离子交换树脂、和具有羧酸基等弱酸性离子交换基的弱酸性阳离子交换树脂。其中，在工序(1)中，使用强酸性阳离子交换树脂，优选使用具有磺酸基作为离子交换基的强酸性阳离子交换树脂。
强酸性阳离子交换树脂可以是利用众所周知的的方法制造的，也可以是市售的，两者均可。作为市售的强酸性阳离子交换树脂，可以列举：以“Diaion”(三菱化学公司制造)、“Amberlite”(奥加诺(Organo)公司制造)、“DOWEX”、“Muromac”、“Lewatit”(分别由室町化学公司制造)等商品名市售的强酸性阳离子交换树脂，具体地可列举：“Diaion SK1B”(交联度8％)、“Amberlite IR-120B”、“DOWEX HCR-S”、“Muromac C101”、“Lewatit S1668”等。
在与动物性提取物接触前，将强酸性阳离子交换树脂的离子交换基制成碱金属盐型。如果离子交换基已经是碱金属盐型则可以直接使用，但在H型等的情况下则转换成碱金属盐型。对于向离子交换基的碱金属盐型的转换方法没有特别限制，例如可列举：利用酸将强酸性阳离子交换树脂转换成H型，接着在含有碱金属盐的溶液中进行浸泡或通液而转换成碱金属盐型的方法等。
对于碱金属盐型的种类没有特别限制，例如可列举Na型、K型、Li型等，但从容易获得并且经济性优越的碱金属盐型的方面而言优选的是Na型和K型。为了获得碱金属盐型为Na型或K型的强酸性阳离子交换树脂，使用中性盐如氯化钠、氯化钾；使用氢氧化物如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钠等即可。其中，在将所获得高纯度咪唑二肽作为食品用途使用的情况下，优选的是碱金属盐型为Na型。在向Na型的转换中，从普通性和经济性方面而言，优选的是使用食盐、氢氧化钠及它们的混合物的水溶液。
例如，强酸性阳离子交换树脂向Na型的转换可以通过如下方法而实现：强酸性阳离子交换树脂的交换容量为2eq/L，因此首先将0.5N至2N的盐酸水溶液以1RV至4RV向填充了强酸性阳离子交换树脂的柱进行通液从而向H型转换，接着将0.5N至2N的氢氧化钠水溶以1RV至4RV、或者将3质量％至12质量％的氯化钠溶液以1RV至4RV进行通液，由此向Na型转换。
在强酸性阳离子交换树脂向碱金属盐型转换时，有时会预先对动物性提取物进行脱盐处理或大量地将碱金属盐水溶液进行通液等，由此可以在事前不制成H型的情况下转换成Na型。
在动物性提取物处于粉末状等固体形状的情况下或处于浓缩状态的情况下，将动物性提取物在水中溶解或稀释，而制成水溶液。在动物性提取物已经是水溶液的情况下，直接使用即可。就动物性提取物而言，为了减小由于夹杂成分对咪唑二肽向强酸性阳离子交换树脂的吸附的影响，相对于咪唑二肽1质量％，Brix优选为6.0％至8.0％、Brix更优选约为7.5％；电导率优选为5mS/cm至15mS/cm、电导率更优选为13mS/cm以下。
对于使动物性提取物与强酸性阳离子交换树脂接触的方法没有特别限制，如果通过使这些接触而使动物性提取物中的咪唑二肽向强酸性阳离子交换树脂吸附即可，可以采用将强酸性阳离子交换树脂浸泡于动物性提取物中的分批方式，也可以采用将动物性提取物在填充了强酸性阳离子交换树脂的柱中进行通液的柱方式中的任意方式。下面，对于作为具体例的、采用柱方式的动物性提取物与强酸性阳离子交换树脂的接触进行说明，但本发明的一个实施方案的方法并不局限于此。
动物性提取物与强酸性阳离子交换树脂的接触是以成为使咪唑二肽具有正电荷并且肌酸酐的正电荷相对于咪唑二肽的正电荷的比率为20％以下的pH的方式而实施。即，以将动物性提取物向填充了强酸性阳离子交换树脂的柱进行通液，柱内的pH值迅速变成使咪唑二肽具有正电荷并且肌酸酐的正电荷相对于咪唑二肽的正电荷的比率为20％以下的pH值的方式而实施。
如图1中所示，使鹅肌肽、肌肽的此类咪唑二肽具有正电荷的pH值最高约为8.2。另外，如图2中所示，使肌酸酐的正电荷相对于咪唑二肽的正电荷的比率为20％以下的pH值约为5.6以上。因此，动物性提取物与强酸性阳离子交换树脂的接触优选的是在pH值为5.6至8.2下实施。例如，如果将pH值为5.6至8.2、优选6.0至7.0的动物性提取物进行通液，则柱内的pH值变为5.6至8.2附近，从而可以一边促进咪唑二肽向强酸性阳离子交换树脂的吸附，一边抑制肌酸酐向强酸性阳离子交换树脂的吸附。此外，所谓“肌酸酐的正电荷相对于咪唑二肽的正电荷的比率为20％以下”是指将具有正电荷的咪唑二肽的摩尔量设为1时，具有正电荷的肌酸酐的摩尔量为0.2以下的情况。
动物性提取物中的咪唑二肽和肌酸酐的含量、动物性提取物向强酸性阳离子交换树脂的负荷量、吸附温度等的其他吸附条件根据动物性提取物的制造方法、动物性提取物中的盐分浓度、离子交换树脂的种类等而不同，在离子交换树脂的吸附容量的范围内适当地设定即可。在将动物性提取物在填充了强酸性阳离子交换树脂的柱中进行通液的情况下，动物性提取物向强酸性阳离子交换树脂的接触速度，只要使动物性提取物中的咪唑二肽吸附至强酸性阳离子交换树脂则没有特别限定，例如SV为0.5～8、优选为1～3的流速。
例如，如果设想将30g咪唑二肽吸附至1L树脂，则将咪唑二肽的含量为0.1质量％以上、优选为0.1质量％～1.0质量％的动物性提取物的3RV至30RV的量以SV 1.0～SV 3.0的流速，在10℃～60℃、优选在室温(25℃)下与强酸性阳离子交换树脂接触，由此可以将咪唑二肽吸附至强酸性阳离子交换树脂。
有时，在与动物性提取物接触后的强酸性阳离子交换树脂中吸附了动物性提取物中的夹杂成分。因此，为了除去夹杂成分，优选的是将与动物性提取物接触后的强酸性阳离子交换树脂实施使用水等溶剂的洗涤处理。对于洗涤处理的条件没有特别限制，例如在使动物性提取物在填充了强酸性阳离子交换树脂的柱中进行通液的情况下，将0.5RV～3RV的量的水在10℃至60℃、优选25℃下进行通液，从而可以将强酸性阳离子交换树脂进行洗涤。
[工序(2)：溶出处理工序]
在工序(2)中，在规定的pH值下，将吸附至强酸性阳离子交换树脂的咪唑二肽实施使用碱性水溶液的溶出处理，由此获得高纯度咪唑二肽。
就利用工序(1)向强酸性阳离子交换树脂的吸附量而言，咪唑二肽较多，肌酸酐较少。由此，如果在适于将咪唑二肽进行洗脱的条件下实施工序(2)，则可获得肌酸酐的含量较少的高纯度的咪唑二肽。
就溶出处理中所使用的碱性水溶液而言，如果可以将咪唑二肽从强酸性阳离子交换树脂中进行洗脱，亦即，如果强酸性阳离子交换树脂周围的pH值是设为使咪唑二肽的实效电荷成为零以下的pH值，则对其种类、浓度和使用量没有特别限制；基于强酸性阳离子交换树脂的种类和量、填充或装入强酸性阳离子交换树脂的柱和贮罐等容器的种类和容量、咪唑二肽的种类和吸附量等而适当地进行选择即可。
作为碱性水溶液的具体例，可列举氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、氨水溶液等的无机碱性水溶液等，但从可以与咪唑二肽的洗脱同时地向碱金属盐型转换而言，优选的是碱金属水合物水溶液，更优选的是用于将强酸性阳离子交换树脂向Na型转换的氢氧化钠水溶液，更优选的是0.1N～1.0N氢氧化钠水溶液，进一步优选的是0.3N～0.5N氢氧化钠水溶液。在使用氢氧化钠水溶液的情况下，与使用氨水的情况相比，由于碱度的差异因而使洗脱效率提高，咪唑二肽的回收率有提高的倾向。
根据本发明者们的调查，肌肽和鹅肌肽的等电点(pI)为8.3，pK2为9.6～9.8。因此，碱性水溶液优选的是使用将强酸性阳离子交换树脂周围的pH值设为8.5以上、优选8.5～15.0的碱性水溶液。例如，在将pH值在6附近的动物性提取物在填充了强酸性阳离子交换树脂500L的柱中进行通液的情况下，如果在室温下将500L～1000L(1RV～3RV)的0.3N～0.5N氢氧化钠水溶液以SV 1.0～3.0进行通液，则柱内的pH值成为9.0～12.0左右，从而可以高效率地将吸附了强酸性阳离子交换树脂的咪唑二肽溶出。
如果在强酸性阳离子交换树脂中在搅拌的同时添加碱性水溶液，由此进行溶出处理，则即使树脂的量较多，操作性也较好，可以将强酸性阳离子交换树脂周围的pH值均匀地并且在早期设为8.5以上，因此可以更有效率地将咪唑二肽溶出。例如，在柱内填充并保持强酸性阳离子交换树脂的状态下，可以一边利用搅拌机或者通过吹入气体而搅拌强酸性阳离子交换树脂，一边慢慢地加入碱性水溶液，由此进行搅拌。
经过工序(1)和工序(2)，由此获得相对于咪唑二肽，肌酸酐的混入被抑制的高纯度咪唑二肽。就高纯度咪唑二肽而言，如果是经过工序(1)和工序(2)而获得的咪唑二肽，则对咪唑二肽和肌酸酐的含量没有特别限制，例如在使用鸡胸肉的热水提取物作为动物性提取物的情况下，相对于高纯度咪唑二肽的干燥质量(固体成分)，咪唑二肽的含量为70质量％以上、优选为80质量％以上；并且，相对于咪唑二肽的质量，肌酸酐的含量为10质量％以下、优选为5质量％以下。对于高纯度咪唑二肽中的咪唑二肽含量的上限及肌酸酐含量的下限没有特别限制，但典型地分别为100质量％和0质量％。咪唑二肽和肌酸酐的含量是通过后述实施例中所记载的方法进行测定。
经过工序(1)和工序(2)而获得的高纯度咪唑二肽，因为是作为食品素材而使用，所以优选的是实施pH调整处理、脱色处理、脱臭处理、固液分离处理、脱盐处理、浓缩处理、无菌处理等的各处理。例如可列举：将工序(2)中获得的高纯度咪唑二肽实施使用盐酸等酸调整至pH 6～8、优选7附近的pH调整处理；实施使用活性炭和强碱性离子交换树脂等的吸附着色成分和/或臭气成分的材料的脱色处理和/或脱臭处理；实施使用陶瓷滤器的过滤处理等的固液分离处理；实施使用电透析膜或纳米过滤膜的脱盐处理；实施使用蒸发器等的浓缩处理；实施使用膜滤器等的无菌处理；以及依次进行这些处理中的两种以上的处理等。在各处理中，只要咪唑二肽的损失不大，则对其条件、顺序等的方法没有特别限制，可以采用众所周知的方法。
例如，高纯度咪唑二肽的脱盐处理，可以在pH为8.0以下的条件下，使用截留分子量为500以下并且/或者食盐阻止率(将食盐保持在膜上的率)为50％以下的纳米过滤膜而实施。关于此类纳米过滤膜，在专利文献3的表3中有记载。在将高纯度咪唑二肽实施脱盐处理的情况下，脱盐后的盐浓度，例如相对于咪唑二肽的质量，以钠量计优选为5质量％以下、更优选为2质量％以下。
本发明的一个实施方案的方法，只要能够解决本发明的课题，便可以在上述工序的前段或后段，或在工序途中加入各种工序或操作。其中，就本发明的一个实施方案的方法而言，作为离子交换处理，优选的是由(1)在使咪唑二肽具有正电荷并且肌酸酐的正电荷相对于咪唑二肽的正电荷的比率为20％以下的pH值下，将含有咪唑二肽和肌酸酐的动物性提取物实施向离子交换基为碱金属盐型的强酸性阳离子交换树脂接触的离子吸附处理，然后将强酸性阳离子交换树脂实施使用水的洗涤处理，由此将咪唑二肽向强酸性阳离子交换树脂吸附的工序；(2)在使咪唑二肽具有零电荷或负电荷的pH值下，将吸附了咪唑二肽的强酸性阳离子交换树脂实施使用碱性水溶液的溶出处理，由此获得高纯度咪唑二肽的工序所组成。
下面，对本发明一个实施方案的方法的具体实施方案进行说明，但本发明的制造方法并不局限于以下方法。
将酸在填充了强酸性阳离子交换树脂的柱中进行通液以将树脂的离子交换基制成H型，然后用水进行通液，进而用碱金属盐水溶液进行通液，从而将树脂的离子交换基转换成Na型。接着，用水进行通液，将多余的碱金属盐水溶液洗涤干净。
在含有咪唑二肽和肌酸酐的动物的部位加入水，将其在80℃～95℃下实施数十分钟～数小时的热水提取处理。将所获得的热水提取物直接地实施脱盐处理或者使用电透析膜或纳米过滤膜的脱盐处理，然后实施浓缩处理和固液分离处理，从而获得咪唑二肽为0.1质量％～1.0质量％、Brix为1.0％～10.0％并且pH值为5.6～8.0的动物性提取物。
以3～30RV、SV 1～3将动物性提取物向填充了转换成Na型的强酸性阳离子交换树脂的柱进行通液，接着用RV 0.5～2.0的水进行通液，从而将动物性提取物中的咪唑二肽向强酸性阳离子交换树脂吸附。该吸附处理后的柱内的pH值为5.6～8.0。
接着以SV 1.0～3.0、1.0～2.0RV将0.1N～1.0N碱金属盐氢氧化物水溶液向柱进行通液，从而以溶出液的形式获得高纯度咪唑二肽。溶出处理后的柱内的pH值为8.5～14.0。
将溶出液依次实施用酸调整至中性附近的pH调整处理、使用电透析膜或纳米过滤膜的脱盐处理、使用蒸发器的浓缩处理、及使用孔径为0.20μm～0.45μm的膜滤器的无菌过滤处理，从而获得咪唑二肽制品。
对于通过本发明一个实施方案的方法所获得高纯度咪唑二肽的剂型没有特别限制，可以是液体状，也可以是固体状，两者均可。为了制成适合于长期保存的高纯度咪唑二肽，优选的是将液体状的高纯度咪唑二肽实施风干、减压干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等的干燥处理，从而形成粉末状。
对于利用本发明一个实施方案的方法所获得高纯度咪唑二肽的用途没有特别限制。在高纯度咪唑二肽中，咪唑二肽的含量较大，并且肌酸酐的含量较小。进而，可以将高纯度咪唑二肽制成低盐化、脱色和/或脱臭的高纯度咪唑二肽。因此，高纯度咪唑二肽，期待具有咪唑二肽所具有的抗疲劳作用、降血糖作用等生理活性，从而可以以饮食品、药品的此类经口用组合物、化妆品的此类外用组合物等各组合物的原料或该组合物自身形式而使用。
对于饮食品和化妆品中的高纯度咪唑二肽的含量没有特别限制，例如相对于饮食品和化妆品的全部重量，咪唑二肽以干燥质量计，优选地是为0.001质量％以上的量、更优选的是为0.1质量％～99质量％的量。
对于饮食品的剂形没有特别限制，例如可列举：液剂、散剂、片剂、丸剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂、胶冻剂、咀嚼片、糊剂等。
作为饮食品的具体形态，例如可列举：清凉饮料、碳酸饮料、水果饮料、蔬菜汁、乳酸菌饮料、奶饮料、豆奶、矿泉水、茶类饮料、咖啡饮料、运动饮料、酒精饮料、胶冻剂饮料等的饮料类；蕃茄酱、蘑菇罐头、脱水蔬菜、腌制品等的蔬菜加工品；脱水水果、果酱、水果泥、水果罐头等的水果加工品；咖哩粉、山葵酱、生姜、香辛调味料、调味粉等的香辛料；意大利面、乌冬面、荞麦面、拉面、通心面等的面类(包含生面、干燥面)；长方形面包、甜面包、夹心面包、甜甜圈等的面包类；α化米、燕麦片、面筋、面糊粉等的粉类制品；蛋糕、饼干、米果子、糖果、巧克力、口香糖、快餐零食、冷冻甜品、沾砂糖甜品、日式甜点、未焙甜点、半生甜点、布丁、冰淇淋等的点心类；小豆、豆腐、纳豆、黄豆粉、豆腐皮、炖煨的豆、花生等的豆类制品；蜂蜜、蜂王浆等的加工食品；火腿、香肠、腌肉等的肉制品；酸奶、布丁、炼乳、奶酪、发酵乳、黄油、冰淇淋等的乳畜制品；加工蛋制品；晒干鱼、鱼板、圆筒状鱼糕、鱼肉香肠等的加工鱼；脱水裙带菜、海带、咸烹海味等的加工海藻；鳕鱼籽、晒干的鲱鱼籽、鲑鱼籽、乌鱼籽等的加工鱼籽；速溶肉汤、酱油、醋、日式甜料酒、清炖肉汤基、中华冷面、浓缩汁、调料、蛋黄酱、蕃茄沙司、豆酱等的调味料；色拉油、芝麻油、亚麻油、二酰基甘油、红花油等的食用油脂；汤(包含粉末、液体)、家常菜、蒸煮食品、儿童食品、半烹制食品(例如，菜饭的原料、芙蓉蛋面的原料)等的烹制食品等，但并不局限于这些。
在调配到化妆品中而使用的情况下，能够以化妆水、乳液、乳霜、凝胶、面膜剂等的各种形态而使用。
下面，通过实施例来更详细地说明本发明，但本发明并不局限于这些实施例，只要能够解決本发明的课题，则本发明可以采用各种实施方案。
[实施例]
[实施例1.咪唑二肽和肌酸酐对强酸性阳离子交换树脂的吸附行为的评价]
着眼于鹅肌肽、肌肽的此类咪唑二肽与肌酸酐之间对强酸性阳离子交换树脂的吸附行为的差异，按如以下的方式通过实验利用滴定法对各自的电解离行为进行测定。此外，pK和pI分别表示解离常数和等电点。
制备L-鹅肌肽、L-肌肽和肌酸酐的0.1M水溶液，并使用0.1N硫酸和0.1N氢氧化钠按照常用方法制作滴定曲线。从各滴定曲线中求出pK1、pKR和pK2。将结果示于表1中。
[表1]
名称 pK<sub>1</sub> pK<sub>R</sub> pK<sub>2</sub> pI
鹅肌肽 2.8 7.0 9.6 8.3
肌肽 2.8 6.8 9.8 8.3
肌酸酐 - 4.9 - -
在表1中，鹅肌肽和肌肽的pK1表示羧基的解离，pKR表示咪唑基的解離并且pK2表示氨基的解离。肌酸酐的pKR表示咪唑基的解离。
以所获得的测定结果为基础，将鹅肌肽、肌肽和肌酸酐的各pH值中的电荷状态示于图1。从图1中可明了，咪唑二肽的鹅肌肽和肌肽在pH 5下具有1价的正电荷，在pH 7下具有0.5价的正电荷，在pH 8下具有0.1价的正电荷，因此在这些pH值下能够吸附至阳离子交换树脂。另一方面，肌酸酐在pH 5下具有0.5价的正电荷，在pH 5.6下具有0.2价的正电荷，在pH 6下具有0.1价的正电荷，但在pH 7以上变得不具有正电荷。
另外，这些结果与目前为止所发表文献的数据是非常一致的。例如，在Bate-Smith,E.C.的文献(《生理学杂志(J.Physiol.)》(伦敦)92期，336页(1938年))中记载有肌肽的pK2为6.83，在Deutcch,A.、Eggleton,P.等人的文献(《生物化学杂志(Biochem.J.)》32期，209页(1938年))中记载有鹅肌肽的pK2为7.04。这些文献的pK2是咪唑基的解离常数，相当于表2中的pKr。另外，在Geoge S.Eadie和Andrew Hunter等人的文献中(《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》1926年，67期：237-244页)中记载有肌酸酐的pKb为9.20。若将它用pKR表示，则为4.8。由此可知，表2中的鹅肌肽、肌肽和肌酸酐的pKR与以往文献中记载的数据是非常一致的。
基于以上结果，着眼于鹅肌肽和肌肽的解离常数与肌酸酐的解离常数之间的差异，对咪唑二肽被吸附且肌酸酐不被吸附的pH值进行验证。将对肌酸酐的正电荷与咪唑二肽的正电荷的比相对于pH值的曲线进行绘图的结果示于图2。如图2中所示，pH 5.6～pH8.2的肌酸酐相对于咪唑二肽的正电荷比率为0.2以下。由此可知，在该pH范围内，相对于肌酸酐，咪唑二肽被吸附至强酸性阳离子交换树脂。另外，基于这些结果发现了在利用吸附平衡时的pH值向强酸性阳离子交换树脂的吸附中咪唑二肽可以与肌酸酐分离的可能性。
[实施例2.咪唑二肽和肌酸酐的共存系中的间歇吸附评价]
基于实施例1中所获得的结果，实施了在pH 4～pH 8.5各阶段中的咪唑二肽和肌酸酐的共存系中的间歇吸附试验并加以确认。此外，在下面，在咪唑二肽中，将鹅肌肽与肌肽的混合物表示为“AC”，将肌酸酐表示为“Cre”。
对鸡的胸肉进行热水提取，再通过硅藻土过滤将所获得的鸡提取物澄清化，用水稀释，制备咪唑二肽为0.56质量％并且肌酸酐为0.21质量％的滤液。向滤液中添加盐酸或氢氧化钠，在25℃下在pH 3～pH 9范围内分阶段地调整鸡提取物水溶液。以咪唑二肽添加量成为0.20g的方式，向加入10ml预先平衡化为Na型的强酸性阳离子交换树脂(“DiaionSK1B”；三菱化学公司制造)的容积为100mL的烧杯中加入鸡提取物水溶液，进而加入水稀释至100mL。利用磁力搅拌器将烧杯中的溶液在25℃下搅拌2小时，然后实施离心分离。利用GPC-HPLC对所获得的上清进行分析，测定使用各pH值鸡提取物水溶液的情况下咪唑二肽和肌酸酐的吸附量。这里，咪唑二肽和肌酸酐向树脂的吸附量是从负荷量与非吸附液(上清液)中的含量之间差而求出。在GPC-HPLC中，使用“TSKgel 2500PWXL(粒径6μm、
Figure BDA0002848190130000131
)”(东曹公司制造)作为柱，使用添加0.1％三氟乙酸的45％乙腈作为展开溶剂，使用“PU-2089”(日本分光公司制造；流速0.5ml/min，检测器波长210nm)作为HPLC。
将测定结果示于图3。如图3中所示可知，肌酸酐的吸附量随着pH从4上升至6.5而减少，在这以后的pH 7～pH 8.5几乎看不见。另一方面，咪唑二肽的吸附量在pH 4～pH 6.5之间几乎不下降，在pH 6.5之后pH值上升同时吸附量降低，吸附一直到pH 8.5左右。
基于这些结果可知，若使用Na型强酸性阳离子交换树脂，则在弱酸性至弱碱性的领域，即在pH为5.6～8.2附近的情况下，咪唑二肽相对于肌酸酐优先被吸附。
[实施例3.咪唑二肽含有物的制造方法(1)]
将500L的强酸性阳离子交换树脂(“Diaion SK1B”；三菱化学公司制造)填充于柱中。用2RV的1N盐酸在树脂填充后的柱中进行通液从而制成H型，然后用1RV的RO水进行水驱，接着用2RV的1N氢氧化钠进行通液，进而用1RV的RO水进行水驱，从而将柱中的树脂转换成Na型。此外，柱内的pH值为10～11左右。
向2000kg鸡胸肉(含有约15kg的咪唑二肽)中加入3000kg城市自来水，在90℃下进行60分钟热水提取，接着利用蒸发器进行减压浓缩，从而获得咪唑二肽为0.47质量％并且含有相对于咪唑二肽以质量比计为30％(30质量％)的肌酸酐的鸡粗提取物。在不进行pH调整的情况下，将所获得的鸡粗提取物进行减压浓缩以使Brix为5.8％并且咪唑二肽为0.6质量％，再进行硅藻土过滤，从而获得鸡提取物。该鸡提取物的pH值约为6.2。
将所获得的鸡提取物以4.5RV、SV 2.0在Na型树脂填充柱中进行通液，接着实施以1RV的RO水进行水驱的吸附处理。吸附处理后的柱内的pH为7.5～8左右。
接着，以SV 2.0、1.5RV用0.4N氢氧化钠在柱中进行通液，以溶出液的形式获得高纯度咪唑二肽。溶出处理后的柱内的pH值为8.5～12.0左右。在所获得的高纯度咪唑二肽中，咪唑二肽的含量约为80质量％，并且相对于咪唑二肽的肌酸酐含量为5质量％。
用盐酸将750L溶出液调整pH值至7.0左右，用活性炭进行脱色，然后用陶瓷滤器进行过滤，然后利用纳米过滤膜(“DRA-4510”；达纤膜系统公司(DAICEN MEMBRANE-SYSTEMSLTD.)制造；氯化钠阻止率为45％；过滤膜面积约为7.5m2)进行脱盐浓缩，并利用孔径为0.45μm的膜滤器进行无菌过滤，从而获得150kg含有10％咪唑二肽的液体制品。
所获得咪唑二肽制品中的咪唑二肽含量，相对于制品的干燥质量，约为80质量％；肌酸酐含量，相对于咪唑二肽的干燥质量为2质量％；并且盐分，相对于咪唑二肽的干燥质量，以钠量计为1质量％。
总结以上结果，经过吸附处理和溶出处理，将表示相对于鸡提取物的通液量pH、Brix和咪唑二肽量的变化的图作为图4。
[实施例4.咪唑二肽的纯度评价]
利用GPC-HPLC对实施例3的鸡提取物及溶出液(离子交换洗脱液)中的鹅肌肽、肌肽和肌酸酐进行测定。将结果示于图5A。另外，将作为参考例的专利文献3中记载的图1和图2汇总示于图5B中。另外，将这些结果汇总示于表2中。
[表2]
Figure BDA0002848190130000151
如图5A和图5B以及表2所示，已确认，在实施例3的方法中通过离子交换处理排除了大部分的肌酸酐，若与原料中的量相比，肌酸酐的量相对于离子交换洗脱液中的咪唑二肽而言是非常少的。
基于以上结果，可以通过本方法以工业规模获得肌酸酐的混入量少且纯度高的咪唑二肽。由此可知，本方法是用于大量获得高纯度咪唑二肽的优异的方法。
[实施例5.咪唑二肽含有物的制造方法(2)]
向2500kg除去头部和内脏的白鲑鱼(含有约12kg咪唑二肽)中加入3000kg的城市自来水，在90℃下进行20分钟的热水提取，从而获得Brix为3.2％、咪唑二肽为0.35质量％并且相对于咪唑二肽含有以质量比计为20％(20质量％)肌酸酐的鲑鱼提取物。在不进行pH调整的情况下，将所获得的鲑鱼提取物进行硅藻土过滤，从而获得鲑鱼提取物。该鲑鱼提取物的pH值为6.0。
以6.5RV、SV 2.0将所获得的鲑鱼提取物在Na型树脂填充柱中进行通液，接着实施以1RV的RO水进行水驱的吸附处理。吸附处理后的柱内的pH值为7.5～8左右。
接着，实施与例3同样的溶出处理，从而以溶出液的形式获得高纯度咪唑二肽。溶出处理后的柱内的pH值为8.5～12.0左右。就所得到的高纯度咪唑二肽而言，咪唑二肽的含量约为75质量％，并且肌酸酐含量相对于咪唑二肽为7质量％。
对于所获得的溶出液，以与例3同样的方式，依次实施pH调整处理、使用活性炭的脱色处理、使用陶瓷滤器的过滤处理、使用纳米过滤膜的脱盐处理、使用膜滤器的无菌过滤处理，从而获得100kg含有10％咪唑二肽的液体制品。
所获得咪唑二肽制品中的咪唑二肽含量，相对于制品的干燥质量约为75质量％；肌酸酐含量，相对于咪唑二肽的干燥质量为5质量％；并且盐分，相对于咪唑二肽的干燥质量，以钠量计为1质量％。
另外，以与例4同样的方式，通过GPC-HPLC对鲑鱼提取物和溶出液(离子交换洗脱液)中的鹅肌肽、肌肽和肌酸酐进行测定。将结果示于图6。如图6所示，已确认，在本方法中，通过离子交换处理排除了大部分的肌酸酐，若与原料中的量相比，相对于离子交换洗脱液中的咪唑二肽的量，肌酸酐的量是非常少的。
工业上的可利用性
本发明在饮食品、药品、化妆品、准药品等领域中是有用的，尤其在可以制造抗疲劳用组合物、降血糖用组合物或这些组合物的原料这一点上是有用的。

Claims (9)

1.一种高纯度咪唑二肽的制造方法，包括以下的工序(1)和(2)：
(1)在使咪唑二肽具有正电荷并且肌酸酐的正电荷相对于咪唑二肽的正电荷的比率为20％以下的pH值下，将含有咪唑二肽和肌酸酐的动物性提取物实施与离子交换基为碱金属盐型的强酸性阳离子交换树脂接触的离子吸附处理，由此将咪唑二肽吸附至强酸性阳离子交换树脂的工序；
(2)在使咪唑二肽具有零电荷或负电荷的pH值下，将吸附了咪唑二肽的强酸性阳离子交换树脂实施使用碱性水溶液的溶出处理，由此获得高纯度咪唑二肽的工序。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述工序(1)是在使咪唑二肽具有正电荷并且肌酸酐的正电荷相对于咪唑二肽的正电荷的比率为20％以下的pH值下，将含有咪唑二肽和肌酸酐的动物性提取物实施与离子交换基为碱金属盐型的强酸性阳离子交换树脂接触的离子吸附处理，然后将强酸性阳离子交换树脂实施使用水的洗涤处理，由此将咪唑二肽吸附至强酸性阳离子交换树脂的工序。
3.如权利要求1至2中任一项所述的方法，其中，所述工序(1)的pH值为5.6至8.2，并且/或者所述工序(2)的pH值为8.5至15.0。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述强酸性阳离子交换树脂是按顺序将酸水溶液和碱金属盐水溶液进行通液由此将离子交换基转换成碱金属盐型的强酸性阳离子交换树脂。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述碱性水溶液是碱金属水合物的水溶液。
6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述碱性水溶液是氢氧化钠水溶液。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述碱金属盐是选自钠和钾中的至少一种碱金属盐。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述动物性提取物是实施了脱盐处理的动物性提取物。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述动物性提取物是选自鸡提取物、牛提取物、猪提取物、鲑鱼提取物、鲣鱼提取物和金枪鱼提取物中的至少一种动物性提取物。
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