CN113041175B - 源自鼠尾藻的半乳岩藻聚糖及其在犬猫口腔护理上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种源自鼠尾藻的半乳岩藻聚糖及其在犬猫口腔护理上的应用。一种源自鼠尾藻的褐藻多糖，名为半乳岩藻聚糖FT‑DSG，所述半乳岩藻聚糖FT‑DSG制备方法：为天然产物，提取自鼠尾藻。所述半乳岩藻聚糖FT‑DSG的用途：用于制备犬猫口腔护理配方，鸡胸肉70‑90份、半乳岩藻聚糖FT‑DSG（褐藻多糖）0.5‑1份、芦荟多糖1‑5份、柿子提取物0.1‑0.5份、牦牛骨粉1‑3份、薄荷精油0.01‑0.05份、溶菌酶0.5‑1份、维生素B族0.1‑0.5份、矿物质0.1‑0.5份。其中半乳岩藻聚糖不超过口腔护理配方总质量的1%，芦荟多糖不超过口腔护理配方总质量的5%。本发明能够有效清除口腔残渣，改善口腔炎症，保护口腔粘膜细胞。

Description

源自鼠尾藻的半乳岩藻聚糖及其在犬猫口腔护理上的应用

技术领域

本发明属于犬猫口腔保健品技术领域，特别是涉及一种源自鼠尾藻的半乳岩藻聚糖及其在犬猫口腔护理上的应用。

背景技术

多糖近年来被越来越多地应用到宠物食品领域。其中菊苣多糖应用最广泛，菊苣多糖，菊苣多糖主要来自于菊苣根提取物，具有提高消化力和改善肠道菌群的功能，在宠物膨化粮产品上应用较多。其次是海藻多糖，国内食用海藻可追溯到几千年前的秦朝，《神农本草经》中也有对海藻的食用和功效的记载。海藻多糖具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖以及提高免疫力等功能。鼠尾藻(Sargassum thunbergii)隶属于褐藻门，圆子纲，墨角藻目，马尾藻科，马尾藻属，资源非常丰富，鼠尾藻具有很高的应用价值。鼠尾藻中含有蛋白质，纤维素，氨基酸以及矿物质等多种营养物质。一些特殊的多糖例如鼠尾藻多糖中硫酸化半乳岩藻聚糖具有潜在抗氧化以及缓解炎症的功能，此外鼠尾藻还具有含多糖比例高结构稳定等特点，在宠物食品上具有广泛的应用前景。此外，近年来有研究表明，芦荟多糖具有修复口腔粘膜的功能，可以改善口腔溃疡，减少粘膜细胞的脱落，此外，大部分多糖可以作为益生菌能量来源之一，有助于口腔及肠道内益生菌的生长。目前市面上针对宠物口腔溃疡的产品主要是通过药物治疗，而芦荟多糖作为一个天然提取物，辅助治疗口腔溃疡以及预防口腔炎症具有一定的应用前景。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种源自鼠尾藻的半乳岩藻聚糖及其在犬猫口腔护理上的应用。

一种含半乳岩藻聚糖的犬猫口腔护理配方，包括以下质量份数的原料，鸡胸肉70-90份、半乳岩藻聚糖FT-DSG（褐藻多糖）0.5-1份、芦荟多糖1-5份、柿子提取物0.1-0.5份、牦牛骨粉1-3份、薄荷精油0.01-0.05份、溶菌酶0.5-1份、维生素B族0.1-0.5份、矿物质0.1-0.5份，其中半乳岩藻聚糖不超过口腔护理配方总质量的1%，芦荟多糖不超过口腔护理配方总质量的5%。

所述维生素B族的组分包括维生素B1、维生素B2、维生素B6和维生素B12 。

所述矿物质的组分包括焦磷酸钠、硫酸锌和甘油磷酸钙 。

所述的犬猫口腔护理配方中半乳岩藻聚糖FT-DSG的制备方法，所述半乳岩藻聚糖FT-DSG提取自鼠尾藻，先通过水提法粗提鼠尾藻多糖，经离子交换层析柱DEAE-Bio GelAgarose FF分离获得多个多糖组分，并使用Sephadex G-10柱对所属多个多糖组分进行脱盐纯化，最后通过液相进行单糖组分分析得到硫酸化半乳岩藻聚糖。

一种所述的口腔护理配方的制备方法，

①解冻，将冷冻鸡胸肉进行低温解冻，-5~5℃，解冻时间10h；

②前处理，将鸡胸肉进行斩拌、滚揉、拍板、切丁；

③上料，将处理好的鸡胸肉与半乳岩藻聚糖、芦荟多糖、柿子提取物、牦牛骨粉、薄荷精油、溶菌酶、维生素B族、矿物质拌匀，成型；

④速冻，速冻温度为-35~25℃，速冻时间0.5-6h；

⑤杀菌，制成品之后，进行紫外杀菌，杀菌时间0.5min。

本发明的有益效果：该口腔配方制成的产品，有助于改善口腔炎症预防口腔疾病。具体表现如下：犬猫通过咀嚼冻干肉有助于清洁口腔异物、防治食物残渣残留下口腔内；薄荷精油有助于改善口气；半乳岩藻聚糖FT-DSG能够增强口腔细胞抗氧化功能，通过改善口腔细胞免疫功能来预防口腔炎症的产生；芦荟多糖和维生素B有助于修复口腔粘膜层，促进口腔益生菌的生长；溶菌酶和柿子单宁具有直接杀菌的功能。具体如表1：

表1各成分功能

成分	功能
		薄荷精油	改善口气
芦荟多糖	修复口腔粘膜破损，增强冻干粘合度
		柿子提取物	对口腔细菌有抑菌杀菌功能
溶菌酶	利用酶活性对口腔细菌产生抑菌杀菌功能
		半乳岩藻聚糖	抗氧化、抗炎功能，预防改善口腔炎症情况
牦牛骨粉	补钙，促进牙齿发育
		维生素B族（VB1、VB2、VB6和VB12）	修复口腔粘膜层，促进口腔益生菌
矿物质（焦磷酸钠、硫酸锌和甘油磷酸钙）	改善消化吸收和促进牙龈生长

附图说明

图1是半乳岩藻聚糖FT-DSG的红外光谱检测图。

图2是半乳岩藻聚糖FT-DSG的电喷雾质谱检测图。

图3是半乳岩藻聚糖FT-DSG的电磁共振检测图。

图4是半乳岩藻聚糖FT-DSG的预测结构图。

图5是半乳岩藻聚糖FT-DSG对氧化应激状态下IPEC-J2细胞丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响。

图6是透射电镜（TEM）观察半乳岩藻聚糖FT-DSG对氧化应激(炎症）状态下IPEC-J2细胞形态的影响。

图7是半乳岩藻聚糖FT-DSG处理 IPEC-J2细胞能够提高铁蛋白(FTH1)和抗氧化蛋白谷胱甘肽过氧化物酶 4(GPX4)表达，并降低铁自噬蛋白(NCOA4、LC3)的表达量。

图8是免疫荧光检测半乳岩藻聚糖FT-DSG 处理后 IPEC 细胞内铁自噬蛋白NCOA4 表达下降 (NCOA4:绿色荧光) 。

图9是冻干口腔护理产品成品图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例1、源自鼠尾藻的半乳岩藻聚糖FT-DSG提取以及结构分析

①脱色处理：将鼠尾藻进行脱色处理，用85%乙醇的脱色三次，得到色素较低的鼠尾藻；②水提法提取多糖：热水加压多糖，维持温度为105 ℃提取4h，用硅藻土抽滤得到含有粗多糖的上清液，将上清液分装至试管中，用8000rpm离心5分钟得到上清浓缩液。对上清浓缩液进行透析，3600Da透析袋透析24小时，红外烘干灯烘干后得到鼠尾藻粗多糖。③鼠尾藻粗多糖的分离及纯化：取鼠尾藻粗多糖若干克，先通过DEAE-Bio Gel Agarose FF gel双蒸水洗脱收集后用NaCl梯度洗脱收集洗脱液若干次，红外烘干后得到纯化的鼠尾藻多糖FT-DSG，经组分分析后发现，主要成分为岩藻糖和半乳糖。由此得到FT-DSG为目标多糖即半乳岩藻聚糖，命名为半乳岩藻聚糖FT-DSG；④半乳岩藻聚糖FT-DSG水解组分制备：将FTP-21溶于双蒸水后，用阳离子交换树脂充分混匀水解3小时，经浓缩、透析、冻干之后得到脱硫半乳岩藻聚糖FT-DSG；⑤半乳岩藻聚糖FT-DSG结构分析：用红外光谱、电喷雾质谱检测、核磁共振检测等方法分析半乳岩藻聚糖FT-DSG结构。

试验结果如下，综合红外光谱(图1)、电喷雾质谱(图2)和核磁共振图谱(图3)结果分析，FT-DSG具有典型的半乳糖和岩藻糖骨架以及硫酸化的岩藻低聚糖支链 ，FT-DSG主链为1,3-α-L-岩藻糖和1,6-α-D-半乳糖交替连接构成，主要单元为岩藻糖。图4为FT-DSG的结构预测图。一般方法提取的天然海藻多糖因其独特的理化性质和复杂的组成成分使得其结构较难解析，采用水提法制得鼠尾藻粗多糖，并使用阴离子交换色谱法脱硫处理得到的半乳岩藻聚糖FT-DSG结构更加简单，更加稳定，方便进行结构分析和相应的抗氧化功能研究。

实施例2、半乳岩藻聚糖FT-DSG的抗氧化抗炎功能检测

半乳岩藻聚糖FT-DSG抗氧化试验模型选用猪肠道上皮细胞系（Porcineintestinal epithelial cells） IPEC-J2 ，首先利用IPEC-J2 通过梯度浓度的 H₂O₂ 处理建立了氧化应激（炎症）细胞模型，使IPEC-J2产生炎症反应。用半乳岩藻聚糖FT-DSG处理细胞之后，收集不同处理后的细胞样品。①用丙二醛（MDA） 试剂盒筛选能减少细胞内脂质过氧化水平的样品 ；②Western-blot检测铁蛋白(FTH1)、抗氧化蛋白谷胱甘肽过氧化物酶 4(GPX4)表达和铁自噬蛋白(NCOA4、LC3)的表达水平；③TEM观察不同处理后IPECJ-2细胞的形态变化；④免疫荧光观察不同处理后IPECJ-2细胞铁自噬蛋白 NCOA4 表达 。

试验结果如下，MDA试剂盒检测结果发现，脂质过氧化抑制剂 Liproxstatin-1 和FT-DSG均能缓解 H2O2 造成的 IPEC-J2细胞MDA升高及超氧化物歧化酶(SOD)活性下降（图5），通过TEM观察结果发现Liproxstatin-1 和 FT-DSG均能缓解 H2O2 造成的 IPEC 细胞线粒体皱缩 ，此外，FT-DSG还能缓解H2O2氧化应激后造成的细胞线粒体固缩（图6）。通过WB试验进一步研究发现，FT-DSG处理 IPEC-J2细胞能够提高铁蛋白(FTH1)和抗氧化蛋白谷胱甘肽过氧化物酶 4(GPX4)表达，并降低铁自噬蛋白(NCOA4、LC3)的表达量（图7），同时，免疫荧光（IF）试验结果也验证了FT-DSG 处理后 IPEC-J2 细胞内铁自噬蛋白 NCOA4 在蛋白水平表达下降 ，保护细胞免受游离铁过量的损害。以上结果表明，FT-DSG具有较好的抗氧化抗炎功能，其机制是通过抑制上皮细胞的铁自噬来缓解氧化损伤造成的细胞活性下降。

实施例3、含半乳岩藻聚糖FT-DSG口腔护理配方制备以及应用效果

口腔护理产品的制备方法如下：①解冻。将冷冻鸡胸肉进行低温解冻（-5~5℃），解冻时间10h左右；②前处理。将鸡胸肉进行斩拌、滚揉、拍板、切丁；③上料。将处理好的鸡胸肉与半乳岩藻聚糖FT-DSG、芦荟多糖、柿子提取物、牦牛骨粉、薄荷精油、溶菌酶、维生素B族、矿物质元素等添加物拌匀，成型；④速冻。将前处理好的冻干进行速冻，速冻温度为-35~25℃，速冻时间0.5-6h；⑤杀菌。制成品之后，将样品进行紫外杀菌。杀菌时间0.5min。样品放常温密封不透光保存（保持微量元素活性）。样品配方一：鸡胸肉80份、半乳岩藻聚糖FT-DSG（褐藻多糖）0.7份、芦荟多糖3份、柿子提取物0.3份、牦牛骨粉2份、薄荷精油0.03份、溶菌酶0.7份、维生素B族0.3份、矿物质0.3份。

选取12只具有口臭以及口腔炎症的成年英国短毛猫作为测试对象，每天饲喂10g冻干样品，饲喂周期为14天。试验结束后通过观察产品形态、适口性、口腔整洁程度以及口气来评估冻干的作用效果。

试验效果如下，产品硬度适中，碰撞过程中不会分散，形状保持良好，产品的适口性较好，12只英短均会主动采食冻干。饲喂周期14天之后，检查猫的口腔情况，受试猫的口气均有不同程度的减轻，因口腔炎症引起的红肿现在也明显减轻，口腔整体的整洁程度也较喂养之前改善许多。试验结果表明，配方一含半乳岩藻聚糖FT-DSG的冻干产品对猫口腔炎症以及口气具有一定的改善作用，硬度适中，试验期间没有出现咀嚼困难的情况。

实施例4、含半乳岩藻聚糖FT-DSG口腔护理配方制备以及应用效果

样品制备方法同实施例3：样品配方二：鸡胸肉90份、半乳岩藻聚糖FT-DSG（褐藻多糖）0.1份、芦荟多糖1份、柿子提取物0.1份、牦牛骨粉1份、薄荷精油0.01份、溶菌酶0.5份、维生素B族0.1份、矿物质0.1份。选取12只具有口臭以及口腔炎症的成年英国短毛猫作为测试对象，每天饲喂10g冻干样品，饲喂周期为14天。试验结束后通过观察产品形态、适口性、口腔整洁程度以及口气来评估冻干的作用效果。

试验效果如下，产品硬度较差，可能与芦荟多糖含量较低有关。运输过程中，颗粒损坏明显。饲喂周期14天之后，适口性一般，检查猫的口腔情况，口臭以及口腔清洁程度略微改善，整体效果不如实施例3中的配方一。

实施例5、含半乳岩藻聚糖FT-DSG口腔护理配方制备以及应用效果

样品制备方法同实施例3：样品配方三：鸡胸肉75份、半乳岩藻聚糖FT-DSG（褐藻多糖）1份、芦荟多糖5份、柿子提取物0.5份、牦牛骨粉3份、薄荷精油0.05份、溶菌酶1份、维生素B族0.5份、矿物质0.5份。选取12只具有口臭以及口腔炎症的成年英国短毛猫作为测试对象，每天饲喂10g冻干样品，饲喂周期为14天。试验结束后通过观察产品形态、适口性、口腔整洁程度以及口气来评估冻干的作用效果。

试验效果如下，产品硬度较硬，带有一定粘性，可能与芦荟多糖含量较高有关。饲喂周期14天之后，发现适口性一般，部分牙齿较差的受试猫出现咀嚼困难的情况，能摄入冻干的受试猫的口臭改善情况明显，但硬度较高存在加重牙齿损坏的风险，整体效果不如实施例3中的配方一。

Claims (3)

1.一种含半乳岩藻聚糖的犬猫口腔护理配方产品，其特征在于：由以下质量份数的原料组成，鸡胸肉70-90份、半乳岩藻聚糖FT-DSG0.5-1份、芦荟多糖1-5份、柿子提取物0.1-0.5份、牦牛骨粉1-3份、薄荷精油0.01-0.05份、溶菌酶0.5-1份、维生素B族0.1-0.5份、矿物质0.1-0.5份，其中半乳岩藻聚糖FT-DSG不超过口腔护理配方总质量的1%，芦荟多糖不超过口腔护理配方总质量的5%；

所述维生素B族的组分包括维生素B1、维生素B2、维生素B6和维生素B12 ；

所述矿物质的组分包括焦磷酸钠、硫酸锌和甘油磷酸钙。

2.一种根据权利要求1所述的犬猫口腔护理配方产品中半乳岩藻聚糖FT-DSG的制备方法，其特征在于：所述半乳岩藻聚糖FT-DSG提取自鼠尾藻，先通过水提法粗提鼠尾藻多糖，经离子交换层析柱DEAE-Bio Gel Agarose FF分离获得多个多糖组分，并使用Sephadex G-10柱对所属多个多糖组分进行脱盐纯化，最后通过液相进行单糖组分分析得到硫酸化半乳岩藻聚糖。

3.一种根据权利要求1所述的犬猫口腔护理配方产品的制备方法，其特征在于：

①解冻，将冷冻鸡胸肉进行低温解冻，-5~5℃，解冻时间10h；

②前处理，将鸡胸肉进行斩拌、滚揉、拍板、切丁；

③上料，将处理好的鸡胸肉与半乳岩藻聚糖、芦荟多糖、柿子提取物、牦牛骨粉、薄荷精油、溶菌酶、维生素B族、矿物质拌匀，成型；

④速冻，速冻温度为-35~25℃，速冻时间0.5-6h；

⑤杀菌，制成品之后，进行紫外杀菌，杀菌时间0.5min。

Images