CN113009152B - 一种糖基化cd59酶联免疫检测试剂盒及其制备方法与应用 - Google Patents

一种糖基化cd59酶联免疫检测试剂盒及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒，由设在盒体内的包被有抗gCD59抗体的酶标板、gCD59标准品梯度溶液、样品稀释液、过氧化物酶标记的抗CD59单克隆抗体酶结合物、20×浓缩洗涤液、显色剂、终止液及封板膜、密封袋和说明书构成。本发明还公开了所述试剂盒在检测含gCD59生物样品中的应用。实验证实本发明的试剂盒稳定性高、选择性强，检测速度快、费用低廉、易于操作，克服了现有技术中检测gCD59时，灵敏度不高，操作时长等缺点，操作时间由400分钟缩短至45分钟，定量限由18.75pg/mL提升至12.5pg/mL，具有极大的临床应用前景。

Description

一种糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种糖基化CD59(gCD59)的检测，尤其涉及一种糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒及其制备方法与应用，属于临床检验技术领域。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。在糖尿病患者人群中70％患者全身小血管和微血管出现增殖性病变，其发病机制与长期血糖升高、糖化蛋白终产物增多，细胞间粘附分子表达、某些细胞因子的增多及多糖类物质沉积与血管内皮下而引起的血管基底膜增厚有关。
糖基化CD59(gCD59)是一种新的生物标志物。CD59是一种补体调节蛋白，可保护“自身”细胞免受补体介导的损伤(Davies CS等。Glycation of CD59 impairs complementregulation on erythrocytes from diabetic subjects]。在糖尿病中，CD59被非酶糖基化物灭活，形成gCD59。血浆gCD59是一种可溶形式的CD59从细胞膜脱落。CD59是补体细胞溶解膜攻击复合物(MAC)分布广泛的膜结合抑制剂。CD59通过与新生MAC中的C8和/或C9结合而起作用，并干扰C9膜的插入和聚合。这种存在于所有细胞中的蛋白质通过一个脂尾锚定在膜的外表面。因此，它暴露于细胞外液和细胞外液中的葡萄糖水平。从细胞膜上脱落的可溶性CD59存在于循环和尿液中。已有研究表明，gCD59在糖尿病患者血液中的含量明显高于血糖正常人群。因此，检测人体液中gCD59的含量对于临床上糖尿病患者检测与筛查有指导意义。
文献报道的相关酶联免疫检测方法均为：抗CD59的单克隆抗体为捕捉抗体，抗gCD59的单克隆抗体为检测抗体，且通过酶标记二抗为羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(HRP)标记物或SA-HRP，试剂盒灵敏度不高，操作时长长达200分钟(G Biosciences公司产品，未在国内注册)到400分钟(Pamela Ghosh，A Specific And Sensitive Assay For BloodLevels Of Glycated Cd59:A Novel Biomarker For Diabetes)。有关以抗gCD59的单克隆抗体为捕捉抗体、抗CD59的单克隆抗体为标记二抗体的检测方法未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒及其制备方法与应用。
本发明所述的糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒，由设在盒体内的包被有抗gCD59抗体的酶标板、gCD59标准品梯度溶液、样品稀释液、过氧化物酶标记的抗CD59单克隆抗体酶结合物、20×浓缩洗涤液、显色剂、终止液及封板膜、密封袋和说明书构成；
其特征在于：
所述酶标板为透明聚苯乙烯96或48孔酶标板，且其各孔包被有浓度为10μg/mL的抗gCD59的鼠单克隆抗体Mab1；
所述gCD59标准品梯度溶液分别是：浓度梯度为0pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL的7个标准品溶液，其中0pg/mL为标准品缓冲液；
所述样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、SDS 0.1g、酪蛋白钠盐5g、TritonX-100 0.1mL、Proclin3001mL；
所述过氧化物酶标记的抗CD59单克隆抗体酶结合物是辣根过氧化物酶标记的抗CD59鼠单克隆抗体Mab2；该酶标抗CD59鼠单克隆抗体Mab2酶结合物工作效价为1:10000，稀释液为酶结合物稀释液；
所述20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2 O 2.9g、吐温20 0.5mL；
所述显色剂是浓度为0.3mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)溶液，命名为A液；浓度为0.74mg/mL的过氧化脲素溶液，命名为B液；使用时将A液与B液按体积比1﹕1混合；
所述终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
上述糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒中，所述酶标板的制备方法是：
1.1)配制包被液：即配制0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液，并调整pH值为7.4；
Figure GDA0003544293200000021
1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方及制法是：
Figure GDA0003544293200000022
1.3)配制封闭液，封闭液的配方及制法是：
Figure GDA0003544293200000023
Figure GDA0003544293200000031
1.4)用包被液将抗gCD59的鼠单克隆抗体Mab1稀释至工作浓度10μg/mL，混匀，并静置15分钟；
1.5)取标记好的酶标板，用8孔道排枪点板，使抗体液达到200μL/孔，盖上盖板膜；
1.6)置于2℃-8℃冰箱，包被4-6小时，然后，每孔加入5μL 0.1％SDS水溶液，过夜包被12-16小时；
1.7)取出包被板，室温平衡30min，甩掉抗体液，吸水纸拍干，每孔每次加300μL洗涤液，洗涤2次，吸水纸拍干；
1.8)每孔加入250μL封闭液，2℃-8℃过夜封闭16小时；
1.9)取出包被板，室温平衡30min，甩掉封闭液，吸水纸拍干；放在硅胶干燥器中干燥，在室温条件下，湿度30％以下保持5小时；
1.10)以铝箔袋真空包装包被板，做好标记，2-8℃保存，备用。
上述糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒中：所述抗gCD59的鼠单克隆抗体Mab1和抗CD59鼠单克隆抗体Mab2优选山东莱博生物科技有限公司产品；其中抗体Mab1针对抗原表位的氨基酸序列是：DACLITKAGLQVYNKCWKFEHC，抗体Mab2针对抗原表位的氨基酸序列是：LQCYNCPNPTADCKTAVNCSS。
上述糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒中，所述gCD59标准品梯度溶液的配制方法是：用纯化的重组gCD59蛋白按0pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL的比例，制备模拟血清中gCD59标准品；再配制含5wt％牛血清白蛋白、0.85wt％氯化钠的pH＝7.0的1.0mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液获得标准品缓冲液；再以标准品缓冲液制备标准品浓度梯度为0pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL的7个标准品溶液，其中0pg/mL为标准品缓冲液。
上述糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒中，所述酶结合物稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、表面活性剂S9 3g、酪蛋白钠盐5g、BSA 10g、Proclin300 1mL。
上述糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒中，所述显色剂的配制方法是以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂配制浓度为0.3mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)溶液，命名为A液，以pH5.5、0.2mol/L磷酸氢二钠与0.1mol/L柠檬酸缓冲液为溶剂配制浓度为0.74mg/mL的过氧化脲素溶液，命名为B液，使用时将A液与B液按体积比1﹕1混合。
试剂盒的精密度和准确性验证是通过平行测试中值gCD59标准品，验证试剂盒的精密度；试剂盒的准确性从试剂盒的样本回收率方面进行验证；试剂盒灵敏度的测定是以gCD59浓度梯度检测不同量gCD59确定试剂盒反应灵敏度。
本发明所述糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒在检测含gCD59生物样品中的应用。
其中，所述检测含gCD59样品的方法是：
1)标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔依次按浓度梯度各加不同浓度的标准品10μL；
2)加样：将酶标包被板分别设空白孔、待测样品孔；在待测样品孔中先加样品稀释液190μL，然后再加待测样品10μL，使样品最终稀释度为20倍；加样时将样品加于板的孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同；
3)温育：用封板膜封板后置37℃温育20分钟；
4)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
5)加酶：每孔加入酶标试剂即酶标抗CD59鼠单克隆抗体Mab2酶结合物200μL，空白孔除外；
6)温育：用封板膜封板后置37℃温育15分钟；
7)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
8)显色：每孔加入显色剂A液100μL，显色剂B液100μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；
9)终止：每孔加终止液50μL，终止反应；
10)测定：加终止液后15分钟以内，以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度即OD值；
11)以标准品的各浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，待测样品根据测得的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度；或用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将待测样品的OD值代入方程式，计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度。
本发明提供的糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒是基于酶联免疫吸附法制备而得的检测试剂盒，经过测试临床样本，表明本发明糖基化CD59检测试剂盒(酶联免疫法)可以有效检测人体内gCD59的含量并与临床糖尿病患者判断结果一致，因此，具有较好的临床应用价值。其显著优点在于：
1、因gCD59与CD59在蛋白结构上只有极小的差异，因而，制备能够特异性识别gCD59而不识别CD59的特异性单克隆抗体尤为重要。通过大量、反复的筛选和验证，本发明中所述gCD59检测抗体为特异性识别gCD59而不结合CD59的单克隆抗体，这为本发明特异性检测gCD59提供可靠的生物原料。
2、在检测方法上，本发明利用的是gCD59单克隆抗体为捕捉抗体，从方法学上采用第一步即特异性捕捉gCD59蛋白，极大降低了非特异性吸附现象，检测方法更加直接，结果更加准确。这克服了已报道的检测方法中第一步非特异性结合的弊端。
3、本发明的试剂盒操作简单且标记物稳定、灵敏度高，完全克服了现有酶联免疫检测方法操作步骤繁琐、不稳定的缺陷。
4、通过在包被过程中加入SDS，与包被抗体形成一种带静电的复合物，增加了抗体的活性，改善包被效果，从而增加了本试剂盒的灵敏度。
本发明的糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒，提供了一种基于ELISA法更便捷的检测方法，该方法具有稳定性高、灵敏度高、选择性强，检测速度快、费用低廉、易于操作等优点。克服了现有技术中检测gCD59时，灵敏度不高，操作时长等缺点，操作时间由400分钟缩短至45分钟，定量限由18.75pg/mL提升至12.5pg/mL，具有极大的临床应用前景。
附图说明
图1：本发明的糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒定量线性分析图。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
实施例1：gCD59蛋白的制备
利用已公布的gCD59氨基酸序列(DACLITKAGLQVYNKCWKFEHC)、CD59氨基酸序列(LQCYNCPNPTADCKTAVNCSS)，采用生物领域技术人员公知的蛋白表达技术，分别获得gCD59和CD59相应核苷酸序列。
构建表达gCD59的质粒即pcDNA3.1-gCD59表达载体，转染CHO细胞后，筛选阳性克隆，培养后纯化即制得gCD59蛋白。
相似方法同样可制得CD59蛋白。
实施例2：抗gCD59鼠单克隆抗体Mab1和抗CD59鼠单克隆抗体Mab2的制备
将已得到的gCD59和CD59蛋白分别免疫健康的BALB/c小鼠(8周龄)，待小鼠产生抗体后通过常规骨髓瘤融合细胞技术，分别制备抗gCD59鼠单克隆抗体Mab1和抗CD59鼠单克隆抗体Mab2。
实验验证，制备的抗体Mab1针对抗原表位的氨基酸序列是：DACLITKAGLQVYNKCWKFEHC，抗体Mab2针对抗原表位的氨基酸序列是：LQCYNCPNPTADCKTAVNCSS。
其中，所得Mab1经过验证证实不与CD59发生交叉反应，Mab2经过验证证实不与gCD59发生交叉反应。具体过程采用生物领域人员常知的杂交瘤抗体制备技术。
进一步的，所述抗体Mab2用过碘酸钠标记HRP方法制备酶结合物。
实施例3：本发明所述糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒的制备
1、酶标板的制备：
配制包被液：配制0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液，并调整pH值为7.4；
Figure GDA0003544293200000061
配制洗涤液，洗涤液的配方及制法是：
Figure GDA0003544293200000062
配制封闭液，封闭液的配方及制法是：
Figure GDA0003544293200000063
用包被液将抗gCD59的鼠单克隆抗体Mab1稀释至工作浓度10μg/mL，混匀，并静置15分钟；
取标记好的酶标板，用8孔道排枪点板，使包被抗体液达到200μL/孔，盖上盖板膜；
置于2℃-8℃冰箱，包被4-6小时，然后，每孔加入5μL 0.1％SDS水溶液，过夜包被12-16小时；
取出包被板，室温平衡30min，甩掉抗体液，吸水纸拍干，每孔每次加300μL洗涤液，洗涤2次，吸水纸拍干；
每孔加入250μL封闭液，2℃-8℃过夜封闭16小时；
取出包被板，室温平衡30min，甩掉封闭液，吸水纸拍干；放在硅胶干燥器中干燥，在室温条件下，湿度30％以下保持5小时；
以铝箔袋真空包装包被板，做好标记，2-8℃保存，备用；
2、试剂盒溶液的配制：
基础溶液的配制
样本稀释液配方是：
Figure GDA0003544293200000071
20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、吐温20 0.5mL；
gCD59标准品梯度溶液以如下方法制得：用纯化的重组gCD59蛋白按0pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL的比例，制备模拟血清中gCD59标准品；再配制含5wt％牛血清白蛋白、0.85wt％氯化钠的pH＝7.0的1.0mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液获得标准品缓冲液；再以标准品缓冲液制备标准品浓度梯度为0pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL的7个标准品溶液，其中0pg/mL为标准品缓冲液；
酶结合物稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、表面活性剂S9 3g、酪蛋白钠盐5g、BSA 10g、Proclin300 1mL；
显色剂是以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂配制浓度为0.3mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)溶液为A液，以pH5.5、0.2mol/L磷酸氢二钠与0.1mol/L柠檬酸缓冲液为溶剂配制浓度为0.74mg/mL的过氧化脲素溶液，为B液；
终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
实施例4：利用本发明的试剂盒检测含gCD59样品的方法
1)标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔依次按浓度梯度各加不同浓度的标准品10μL；
2)加样：将酶标包被板分别设空白孔、待测样品孔；在待测样品孔中先加样品稀释液190μL，然后再加待测样品10μL，使样品最终稀释度为20倍；加样时将样品加于板的孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同；
3)温育：用封板膜封板后置37℃温育20分钟；
4)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
5)加酶：每孔加入酶标试剂即酶标抗CD59鼠单克隆抗体Mab2酶结合物200μL，空白孔除外；
6)温育：用封板膜封板后置37℃温育15分钟；
7)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
8)显色：每孔加入显色剂A100μL，显色剂B 100μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；
9)终止：每孔加终止液50μL，终止反应；
10)测定：加终止液后15分钟以内，以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度即OD值；
11)以标准品的各浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，待测样品根据测得的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度；或用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将待测样品的OD值代入方程式，计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度。
实施例5：本发明所述糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒的线性、准确性、回收率、精密度的检测
1)试剂盒的线性
采用所述标准品溶液为7个浓度梯度，分别是：0pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL，用本发明的标准操作步骤进行标准溶液的OD值读数，根据记录的测试数值画出本发明所述糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒线性分析曲线，见图1。
由图1可知，本发明所述糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒线性良好。
2)试剂盒的准确性以样本回收率进行验证。
分别在标准品缓冲液中添加gCD59，使得gCD59最终浓度为15ng/mL、205ng/mL、1005ng/mL，每个样本平行测试3次，计算回收率统计结果见表1。
表1：回收率
Figure GDA0003544293200000081
Figure GDA0003544293200000091
结果表明，高、中、低浓度的gCD59样本，回收率在85.7％～92.6％之间，平均回收率在86.9％～91.2％之间，总体回收率88.8％。
3)精密性试验：
以100ng/mL标准品平行测试10次，结果统计见表2。
表2：精密性试验结果
板孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
吸光度 0.522 0.556 0.534 0.513 0.533 0.524 0.546 0.539 0.527 0.521
精密性：CV％＝2.4％
实施例6：本发明所述糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒在糖尿病临床样本筛查中的应用
利用试剂盒检测gCD59，同时应用该指标在糖尿病患者中筛查。
通过与合作医院合作，医院收集糖尿病临床血清样本100例和非糖尿病临床血清样本200例。将上述样本用本发明试剂盒检测血清样本中gCD59，结果显示gCD59在有糖尿病的个体中显著高于无糖尿病的个体，与糖化血红蛋白独立相关，确定糖尿病患者具有高特异性和敏感性。见表3。
表3：糖尿病患者筛查
Figure GDA0003544293200000092

Claims (1)

1.一种糖基化CD59酶联免疫检测试剂盒，由设在盒体内的包被有抗gCD59抗体的酶标板、gCD59标准品梯度溶液、样品稀释液、过氧化物酶标记的抗CD59单克隆抗体酶结合物、20×浓缩洗涤液、显色剂、终止液及封板膜、密封袋和说明书构成；
其中：
所述酶标板为透明聚苯乙烯96或48孔酶标板，且其各孔包被有抗gCD59的鼠单克隆抗体Mab1；所述酶标板的制备方法是：
1.1)配制包被液：即配制0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液，并调整pH值为7.4；
Figure FDA0003544293190000011
过滤除菌，4℃保存；
1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方及制法是：
Figure FDA0003544293190000012
过滤除菌，4℃保存；
1.3)配制封闭液，封闭液的配方及制法是：
Figure FDA0003544293190000013
过滤除菌，4℃保存；
1.4)用包被液将抗gCD59的鼠单克隆抗体Mab1稀释至工作浓度10μg/mL，混匀，并静置15分钟；
1.5)取标记好的酶标板，用8孔道排枪点板，使抗体液达到200μL/孔，盖上盖板膜；
1.6)置于2℃-8℃冰箱，包被4-6小时，然后，每孔加入5μL 0.1％SDS水溶液，过夜包被12-16小时；
1.7)取出包被板，室温平衡30min，甩掉抗体液，吸水纸拍干，每孔每次加300μL洗涤液，洗涤2次，吸水纸拍干；
1.8)每孔加入250μL封闭液，2℃-8℃过夜封闭16小时；
1.9)取出包被板，室温平衡30min，甩掉封闭液，吸水纸拍干；放在硅胶干燥器中干燥，在室温条件下，湿度30％以下保持5小时；
1.10)以铝箔袋真空包装包被板，做好标记，2-8℃保存，备用；
所述gCD59标准品梯度溶液分别是：浓度梯度为0pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL的7个标准品溶液，其中0pg/mL为标准品缓冲液；
所述样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、SDS 0.1g、酪蛋白钠盐5g、TritonX-100 0.1mL、Proclin300 1mL；
所述过氧化物酶标记的抗CD59单克隆抗体酶结合物是辣根过氧化物酶标记的抗CD59鼠单克隆抗体Mab2；该酶标抗CD59鼠单克隆抗体Mab2酶结合物工作效价为1:10000，稀释液为酶结合物稀释液；所述酶结合物稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、表面活性剂S9 3g、酪蛋白钠盐5g、BSA 10g、Proclin300 1mL；
所述20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、吐温20 0.5mL；
所述显色剂是浓度为0.3mg/mL的四甲基联苯胺TMB溶液，命名为A液；浓度为0.74mg/mL的过氧化脲素溶液，命名为B液；使用时将A液与B液按体积比1﹕1混合；
所述终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液；
其特征在于：
所述酶标板各孔中包被的抗gCD59的鼠单克隆抗体Mab1的浓度为10μg/mL；
所述抗gCD59的鼠单克隆抗体Mab1和抗CD59鼠单克隆抗体Mab2选山东莱博生物科技有限公司产品；其中抗体Mab1针对抗原表位的氨基酸序列是：DACLITKAGLQVYNKCWKFEHC，抗体Mab2针对抗原表位的氨基酸序列是：LQCYNCPNPTADCKTAVNCSS。
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