CN112999429A - 用于抗纤维化材料的修饰的藻酸盐以及应用 - Google Patents

用于抗纤维化材料的修饰的藻酸盐以及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112999429A
CN112999429A CN202110289236.1A CN202110289236A CN112999429A CN 112999429 A CN112999429 A CN 112999429A CN 202110289236 A CN202110289236 A CN 202110289236A CN 112999429 A CN112999429 A CN 112999429A
Authority
CN
China
Prior art keywords
substituted
alkyl
group
amino
alkylthio
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110289236.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112999429B (zh
Inventor
A·J·维加斯
J·C·多拉夫
O·维萨
马明林
R·S·兰格
D·G·安德森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Childrens Medical Center Corp
Massachusetts Institute of Technology
Original Assignee
Childrens Medical Center Corp
Massachusetts Institute of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53872166&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN112999429(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Childrens Medical Center Corp, Massachusetts Institute of Technology filed Critical Childrens Medical Center Corp
Publication of CN112999429A publication Critical patent/CN112999429A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112999429B publication Critical patent/CN112999429B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/39—Pancreas; Islets of Langerhans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0024—Solid, semi-solid or solidifying implants, which are implanted or injected in body tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/5036—Polysaccharides, e.g. gums, alginate; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L29/00—Materials for catheters, medical tubing, cannulae, or endoscopes or for coating catheters
    • A61L29/08—Materials for coatings
    • A61L29/085—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/08—Materials for coatings
    • A61L31/10—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L33/00—Antithrombogenic treatment of surgical articles, e.g. sutures, catheters, prostheses, or of articles for the manipulation or conditioning of blood; Materials for such treatment
    • A61L33/06—Use of macromolecular materials
    • A61L33/08—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0084—Guluromannuronans, e.g. alginic acid, i.e. D-mannuronic acid and D-guluronic acid units linked with alternating alpha- and beta-1,4-glycosidic bonds; Derivatives thereof, e.g. alginates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/04—Alginic acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0012—Cell encapsulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C12N5/0677—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells

Abstract

本发明公开了具有增强的生物相容性和定制的物理化学性质的共价修饰的藻酸盐聚合物，以及其制备和使用方法。所述共价修饰的藻酸盐可用作涂覆需要减少纤维化的任何材料的基质，诸如用于移植的包封的细胞和植入或用于体内的医疗装置。

Description

用于抗纤维化材料的修饰的藻酸盐以及应用
本发明为申请日2015年08月03日，申请号为“201580040466.7(PCT国际申请号为PCT/US2015/043495，PCT国际申请进入国家阶段日为2017.01.24)”，发明名称为“用于抗纤维化材料的修饰的藻酸盐以及应用”的发明专利申请的分案申请，通过引用将其全部内容结合到本发明。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在由国立卫生研究院(NIH)授予的资助EB000244、EB000351、DE013023和CA151884以及由国防部(DOD)授予的资助W81XWH-13-1-0215下的政府支持下进行的。政府对本发明具有一定的权利。
技术领域
本发明涉及经化学修饰以增强其生物相容性和抗纤维化性质的藻酸盐的用途；涉及将其应用于涂覆或包封诸如细胞、植入物和医疗装置的材料、产品和装置的用途；以及涉及通过植入所述修饰的藻酸盐和利用所述修饰的藻酸盐涂覆或由包封所述修饰的藻酸盐的材料来治疗疾病或病症(包括糖尿病)的方法。
背景技术
异物反应是免疫介导的反应，其影响植入的生物医学装置的保真度(Anderson等人，《免疫学研讨文辑(Semin.Immunol.)》20:86–100(2008)；Langer，《先进材料》(Adv.Mater.)21:3235–3236(2009)；Ward，《糖尿病科学与技术杂志》(J.DiabetesSci.Technol.)在线2:768–777(2008)；Harding和Reynolds，《生物技术动向》(TrendsBiotechnol.)32:140–146(2014))。巨噬细胞在这些装置中生物材料表面的识别发起一系列炎症事件，导致这些外来材料的纤维和胶原包封(Anderson等人(2008)；Ward(2008)；Harding和Reynolds(2014)；Grainger，《自然生物技术》(Nat.Biotechnol.)31:507–509(2013)；Williams，《生物材料》(Biomaterials)29:2941–2953(2008))。这种包封随着时间的推移常常导致装置故障并且能够导致接收者的不适(Anderson等人(2008)；Harding和Reynolds(2014)；Williams(2008))。这些不良结果强调了对不引起异物反应的生物材料的重要需求，以克服对长期生物医学装置功能的这个关键挑战。
对植入的生物材料的异物反应是炎症事件和伤口愈合过程的顶高峰并导致植入物包封(Anderson等人(2008))。这种反应的最终病理学产物是纤维化，其特征在于在炎症部位的过量细胞外基质的积累，并且是可植入医疗装置的关键障碍，因为细胞和胶原沉积将装置与宿主隔离(Anderson等人(2008)；Wick等人，《免疫学年评》(Annu.Rev.Immunol.)31:107–135(2013)；Wynn和Ramalingam，《自然医学》(Nat.Med.)18:1028-1040(2012))。这种装置隔离可以干扰对宿主环境的感测，导致疼痛的组织变形、切断营养(对于包含活的细胞的成分的植入物)，并且最终导致装置失效。现今通常用于医疗装置制造的材料引起导致植入材料的纤维化包封的异物反应(Langer(2009)；Ward(2008)；Harding和Reynolds(2014)；Williams(2008)；Zhang等人，《自然生物技术》(Nat.Biotechnol.)31:553–556(2013))克服对植入装置的异物反应可为实现新的医学进步铺平道路，使得具有抗炎和抗纤维化特性的材料的开发成为关键的医疗需要(Anderson等人(2008)；Langer(2009)；Harding和Reynolds(2014))。
巨噬细胞是物质识别的关键部分，并且有效地粘附于异物的表面(Anderson等人(2008)；Ward(2008)；Grainger，《自然生物技术》(Nat.Biotechnol.)31:507–509(2013)；Sussman等人，《生物医学工程学年鉴》(Ann.Biomed.Eng.)1–9(2013)(doi:10.1007/s10439-013-0933-0))。对于巨噬细胞吞噬作用太大的物体引发导致巨噬细胞融合成异体巨细胞的过程。这些多核体通过分泌细胞因子和趋化因子来放大免疫反应，导致积极沉积基质以隔离外来材料的成纤维细胞的聚集(Anderson等人(2008)；Ward(2008)；Rodriguez等人，《生物医学研究杂志A》(J.Biomed.Mater.)Res.A)89:152–159(2009)；Hetrick等人，《生物材料》(Biomaterials)28:4571–4580(2007))。已经对天然和合成来源的材料描述了这种反应，材料包括宽范围的物理化学性质，包括藻酸盐、壳聚糖、葡聚糖、胶原、透明质酸、聚(乙二醇)(PEG)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)(PHEMA)、聚氨酯、聚乙烯、硅橡胶、特氟隆、金、钛、二氧化硅和氧化铝(Ward(2008)；Ratner，《控制释放杂志》(J.Controlled Release)78:211–218(2002))。
从相同物种的遗传上不相同的成员(即同种异体移植)或从其它物种(即异种移植)移植激素或蛋白质分泌细胞是治疗许多疾病和病症的有希望的策略。使用藻酸盐微胶囊提供免疫隔离，可将激素或蛋白质分泌细胞移植到患者中，而不需要用免疫抑制剂药物进行广泛的治疗。该原理已经通过在糖尿病大鼠模型中移植藻酸盐包封的胰腺β-细胞而成功地被证明(Lim，F.和Sun，A.M.《科学》(Science)210，908-910(1980))。例如在Lim的美国专利号4,352,883中描述了生物材料包封在藻酸盐凝胶中的方法。在Lim的工艺中，将含有待包封的生物材料的水溶液悬浮在水溶性聚合物的溶液中。悬浮液形成液滴，通过与诸如Ca2+的多价阳离子接触将液滴构造成离散的微胶囊。微胶囊的表面随后与聚氨基酸交联，在包封的材料周围形成半透膜。
Lim的方法使用足够温和以包封细胞而不会不利地影响其随后的存活和功能的条件。由此得到的藻酸盐微胶囊是半透性的，具有足够的孔隙率以允许营养物质、废物及由包封的细胞分泌的激素和/或蛋白质自由地扩散进入和离开微胶囊，并且当植入动物宿主中时，藻酸盐微胶囊有效地将宿主的免疫系统与包封的细胞隔离。还参见Vacanti等人的美国专利7,807,150。
已经尝试了许多其它合成材料，包括诸如聚乙二醇-二丙烯酸酯聚合物、聚丙烯酸酯及热塑性聚合物的嵌段共聚物，如Hubbell的美国专利号6,129,761以及Aebischer等人的《生物医学工程学杂志》(J Biomech Eng.)，1991年5月，113(2):178-83所报道。有关这些材料的评述，参见Lesney的《现代药物发现》(Modern Drug Discovery)4(3)，45–46，49，50(2001)。
自从Lim首次报道了包封细胞的移植后，另有许多人已经尝试建立用于细胞之“生物反应器”，其可以在不存在血管重建的情况下通过营养物、气体和废物扩散穿过包封材料来维持细胞活力，并且仍然保护细胞免受机体对外来细胞和材料的免疫防御影响。不幸的是，将这些疗法转化用于人类受试者的尝试已经被证明是困难的。例如，移植到患有1型糖尿病的人类受试者中的藻酸盐包封的猪胰岛细胞最初表现出显著的改善并且需要减少胰岛素剂量。然而，到第49周，患者的胰岛素剂量恢复到移植前水平(Elliot，R.B.等人，《异种移植》(Xenotransplantation)。2007；14(2):157-161)。
在一些情况下，需要引起纤维化，例如，当细胞作为填充材料植入时，如美国专利号6,060,053所描述并且随后被食品和药物管理局(Food and Drug Administration)批准用于治疗膀胱输尿管反流。
植入细胞的功效随时间降低是藻酸盐胶囊的成纤维细胞过度生长的结果。藻酸盐凝胶基质在植入时引发炎症反应，导致藻酸盐基质被纤维组织包封。藻酸盐胶囊表面上的纤维组织减少营养物和氧气向包封的细胞的扩散，导致细胞死亡。使用其它材料没有获得更好的结果。
因此，本发明的目的是提供适合于涂覆产品、装置和表面的聚合物，其中在植入产品、装置和表面后，聚合物具有更大的长期生物相容性。
本发明的又一个目的是提供适合于涂覆产品、装置和表面的聚合物，其中聚合物在植入产品、装置和表面后具有较少的异物反应。
本发明的又一个目的是提供适合于包封和植入细胞的聚合物，其中聚合物在植入后具有更大的长期生物相容性。
本发明的又一个目的是提供适合于包封和植入细胞的聚合物，其中聚合物在植入后具有较少的异物反应。
本发明的又一个目的是提供具有改善的生物相容性和定制的物理化学性质(包括凝胶稳定性、孔径和疏水性/亲水性)的化学修饰的离子交联的藻酸盐。
本发明的又一个目的是提供具有较少异物反应的化学修饰的离子交联的藻酸盐。
本发明的又一个目的是提供使用修饰的藻酸盐聚合物涂覆产品、装置和表面的方法。
本发明的又一个目的是提供使用修饰的藻酸盐聚合物包封细胞的方法。
本发明的又一个目的是提供通过移植或植入用修饰的藻酸盐聚合物包覆的产品、装置和表面来治疗人类或动物患者的病症或疾病的方法。
本发明的又一个目的是提供通过移植包封在修饰的藻酸盐聚合物中的外源生物材料来治疗人类或动物患者的病症或疾病的方法。
本发明的又一个目的是提供用于表征修饰的藻酸盐聚合物的高通量方法。
发明内容
已经开发了经化学修饰的以定制其生物相容性和物理性质的藻酸盐。本文所描述的修饰的藻酸盐相对于未修饰的藻酸盐提供了增强的性质。而且，基于发现，起始材料以及化学修饰和反应的材料必须在植入之前被彻底纯化以除去污染物以防止被包封，这些材料在植入之后不太可能引起纤维囊形成。
在一些实施例中，修饰的藻酸盐是含有一个或多个由式I定义的共价修饰的单体的藻酸盐聚合物
Figure BDA0002981759510000051
其中，
X是氧、硫或NR4；
R1是氢或含有任何数量的碳原子、优选地为1-30个碳原子、更优选地为1-20个碳原子、更优选地为1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的R1基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；
Y1和Y2独立地为氢或-PO(OR5)2；或
Y2不存在，并且Y1与Y1和Y2所连接的两个氧原子一起形成如式II所展示的环状结构
Figure BDA0002981759510000061
其中；以及
R2及R3独立地为氢或含有任何数量的碳原子、优选地为1-30个碳原子、更优选地为1-20个碳原子、更优选地为1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的R2和R3基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或者
R2和R3与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；以及
R4及R5独立地为氢或含有任何数量的碳原子、优选地为1-30个碳原子、更优选地为1-20个碳原子、更优选地为1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的R4和R5基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，修饰的藻酸盐是含有一个或多个由式I定义的共价修饰的单体的藻酸盐聚合物
Figure BDA0002981759510000071
其中，
X是氧、硫或NR4；
R1在一个或多个修饰的单体中独立地为
Figure BDA0002981759510000072
Figure BDA0002981759510000073
或-R6-Rb，
其中a是1至30的整数，z是0至5的整数，n是1至12的整数，m是3至16的整数，并且Ra及Rb独立地选自烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烯基、炔基、被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；以及
其中
Y1和Y2独立地为氢或-PO(OR5)2；或
Y2不存在，并且Y1与Y1和Y2所连接的两个氧原子一起形成如式II所展示的环状结构
Figure BDA0002981759510000081
其中
R2和R3独立地为氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的R2和R3基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或者
R2和R3与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；以及
R4、R5、R6、R8及R9独立地为氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，修饰的藻酸盐是含有一个或多个由式I定义的共价修饰的单体的藻酸盐聚合物
Figure BDA0002981759510000091
其中，
X是氧、硫或NR4；
R1独立地在一个或多个修饰的单体中为
Figure BDA0002981759510000092
Figure BDA0002981759510000101
其中k是1至10的整数；其中z是0至5的整数；其中w是0至4的整数；其中Xd为不存在、O或S；
其中R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R39、R40及R41独立地为氢、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、被杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；
其中R37是C或Si；
其中Xg和R38独立地为烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、亚烷基、被取代的亚烷基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；以及
其中Ra和Rc独立地为烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烯基、炔基、被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环、杂环或
Figure BDA0002981759510000111
其中R8、R9或两者独立地为氢、烷基、被取代的烷基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烯基、炔基、被取代的烷基、被取代的烯基、取代的炔基、羰基、被取代的羰基、甲醇、
Figure BDA0002981759510000112
其中R31、R32、R33、R34、R35及R36独立地为氢、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、被杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；
其中y是0至11的整数；其中Rd和Re各自独立地为烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烯基、炔基、被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；
其中R18、R19、R20、R21、R22及R23独立地为C、O、N或S，其中介于相邻的R18与R23之间的键根据化合价为双键或单键，以及其中R18至R23根据化合价键合零个、一个或两个氢；并且
其中R24独立地为-(CR25R25)p-或-(CR25R25)p-Xb-(CR25R25)q-，其中p和q独立地为0至5的整数，其中Xb为不存在、-O-、-S-、-SO2-或NR4，其中每一个R25独立地为不存在、氢、＝O、＝S、-OH、-SH、-NR4，其中R4为烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；
其中R8和R9都不是氢；其中Rb或Rc的至少一个由式XIII定义；
其中
Y1和Y2独立地为氢或-PO(OR5)2；或
Y2不存在，并且Y1与Y1和Y2所连接的两个氧原子一起形成如式II所展示的环状结构
Figure BDA0002981759510000131
其中
R2和R3独立地为氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的R2和R3基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或者
R2和R3与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；以及
R4和R5独立地为氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，式IX中的y为0至3的整数；Re独立地为氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代或未被取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或者C1-C6烷硫基；
其中R18、R19、R20、R21、R22及R23独立地为C、O、N或S，其中介于相邻的R18和R23之间的键根据化合价为双键或单键，以及其中R18至R23根据化合价键合零个、一个或两个氢；并且
其中R24独立地为-(CR25R25)p-或-(CR25R25)p-Xb-(CR25R25)q-，其中p和q独立地为0至3的整数，其中Xb为不存在、-O-、-S-、-SO2-或NR4，其中每一个R25独立地为不存在、氢、＝O、＝S、-OH、-SH、-NR4，其中R4为被取代的或未被取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6烷硫基。
在一些实施例中，式IX中的y是2，R18是N，R19、R20、R21、R22或R23是S，两个Re是氧代并且与S键合，以及介于相邻的R18与R23之间的所有的键是单键。
在一些实施例中，式IX中的y是2，两个Re是氧代并且与R21键合，R18是N，R21是S，以及介于相邻的R18与R23之间的所有的键是单键。
在一些实施例中，式IX中的y是2，两个Re是氧代并且与R21键合，R18是N，R21是S，以及介于相邻的R18与至R23之间的所有的键是单键，Xb不存在，q为0，p为1并且每一个R25是氢。
在一些实施例中，式IX中的y是1，Re是氨基，以及介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是双键以及介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是单键。
在一些实施例中，式IX中的y是1，Re是氨基并且与R21键合，以及介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是双键以及介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是单键。
在一些实施例中，式IX中的y是1，Re是氨基并且与R21键合，以及介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是双键以及介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是单键，Xb不存在，p是0以及q是0。
在一些实施例中，式IX中的y是0，R19、R20、R21、R22或R23是O，以及介于相邻的R18与R23之间的所有键是单键。
在一些实施例中，式IX中的y是0，R19是O，以及介于相邻的R18与R23之间的所有键是单键。
在一些实施例中，式IX中的y是0，R19是O，介于相邻的R18与R23之间的所有的键是单键，Xb是氧，p是1，q是0以及每一个R25是氢。
在一些实施例中，式IX的R19和R23是O以及介于相邻的R18与R23之间的所有的键是单键。
在一些实施例中，式IX的R19和R23是O，介于R18和R19之间以及介于R21和R22之间的键是双键，以及环中其余的键是单键。
在一些实施例中，式IX中的y是1，Re是烷氧基并且与R19、R20、R21、R21、R22或R23键合，介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是双键以及介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是单键。
在一些实施例中，式IX中的y是1，Re是烷氧基并且与R19键合，介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是双键以及介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是单键。
在一些实施例中，式IX中的y式1，Re是甲氧基并且与R19键合，R18至R23是碳原子，介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是双键以及介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是单键，Xb不存在，p是0以及q是0。
在一些实施例中，式IX中的y是1，Re是羟基。
在一些实施例中，式IX中的y是1以及Re是亚甲基对位键合的羟基。
在一些实施例中，式IX中的y是1，Re是如下所展示的式XIII：
Figure BDA0002981759510000151
其中R8是被取代的烷基以及R9是二烷基氨基，或R8是二烷基氨基以及R9是被取代的烷基，其中被取代的烷基是羟甲基以及二烷基氨基是N,N-二乙基氨基。
在一些实施例中，式IX中的y是1，Re是式XIII，其中R8是氢以及R9是如下所展示的式IX：
Figure BDA0002981759510000161
或R8是式IX以及R9是氢。在一些实施例中，式IX中的y是0，R19、R20、R21、R22或R23是O，以及介于相邻的R18与R23之间的所有键是单键。在一些实施例中，式IX中的y是0，R19是O，以及介于相邻的R18与R23之间的所有键是单键。在一些实施例中，式IX中的y是0，R19是O，介于相邻的R18与R23之间的所有的键是单键，Xb是氧，p是1，q是0以及每一个R25是氢。
在一些实施例中，式IX中的y是1，Re是式XIII，其中R8是氢以及R9是式VII或如下所展示的式VIII：
Figure BDA0002981759510000162
其中R31、R32、R33、R34、R35及R36独立地为氢、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、被杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，式VII的R31是烷基。在一些实施例中，R31是甲基。
在一些实施例中，式VII的R31是甲基，R32和R33是氢。
在一些实施例中，式IX中的y是1以及Re是亚甲基对位键合的羟基。
在式XII的一些实施例中，k是1以及Rc是羟基。
在式XII的一些实施例中，k是1，Rc是羟基以及Xd不存在。
在式XII的一些实施例中，k是1，Rc是羟基，Xd不存在以及R10-R17是氢。
在式XII的一些实施例中，Rc是烷氧基。
在式XII的一些实施例中，Rc是甲氧基以及Xd是O。
在式XII的一些实施例中，Rc是甲氧基，Xd是O以及R10-R17是氢。
在式XII的一些实施例中，k是2以及Rc是烷基氨基。
在式XII的一些实施例中，k是2，Rc是甲基氨基以及Xd不存在。
在式XII的一些实施例中，k是2，Rc是甲基氨基，Xd不存在以及R10-R17是氢。
在式XII的一些实施例中，k是3，Xd是O以及Rc是如下所展示的式XIII：
Figure BDA0002981759510000171
其中R8和R9是烷基。
在式XII的一些实施例中，k是3，Xd是O以及Rc是式XIII，其中R8和R9是甲基。
在式XII的一些实施例中，k是3，Xd是O以及Rc是式XIII，其中R8是氢以及R9是羰基，或R8是羰基以及R9是氢。
在式XII的一些实施例中，k是3，Xd是O以及Rc是式XIII，其中R8是氢以及R9是乙酰基，或R8是乙酰基以及R9是氢。
在式XII的一些实施例中，k是3以及Rc是式XIII，R8是氢以及R9是如下所展示的式IX：
Figure BDA0002981759510000181
或R8是氢以及R9是式IX。
在式XII的一些实施例中，k是3以及Rc是式XIII，其中R8是氢以及R9是式IX，或R8是氢以及R9是式IX，其中式IX中的y是2，R18是N，R19、R20、R21、R22或R23是S，两个Re是氧代以及与S键合，以及介于相邻的R18与R23之间的所有的键是单键。
在式XII的一些实施例中，k是3以及Rc是式XIII，其中R8是氢以及R9是式IX，或R8是氢以及R9是式IX，其中式IX中的y是2，两个Re是氧代以及与R21键合，R18是N，R21是S，以及介于相邻的R18与R23之间的所有的键是单键。
在式XII的一些实施例中，k是3以及Rc是式XIII，其中R8是氢以及R9是式IX，或R8是氢以及R9是式IX，其中式IX中的y是2，两个Re是氧代以及与R21键合，R18是N，R21是S，以及介于相邻的R18与R23之间的所有的键是单键，Xb不存在，q是0，p是1，以及每一个R25是氢。
在式XII的一些实施例中，k是3以及Rc是式XIII，其中R8是氢以及R9是式IX，或R8是氢以及R9是式IX，其中式IX中的y是1，Re氨基，以及介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是双键以及介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是单键。
在式XII的一些实施例中，k是3以及Rc是式XIII，其中R8是氢以及R9是式IX，或R8是氢以及R9是式IX，其中式IX中的y是1，Re是氨基并且与R21键合，以及介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是双键以及介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是单键。
在式XII的一些实施例中，k是3以及Rc是式XIII，其中R8是氢以及R9是式IX，或R8是氢以及R9是式IX，其中式IX中的y是1，Re氨基并且与R21键合，以及介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是双键以及介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是单键，Xb不存在，p是0以及q是0。
在式XII的一些实施例中，k是3以及Rc是式XIII，其中R8是氢以及R9是式IX，或R8是氢以及R9是式IX，其中式IX中的y是0、R19、R20、R21、R22或R23是O，以及介于相邻的R18与R23之间的所有的键是单键。
在式XII的一些实施例中，k是3以及Rc是式XIII，其中R8是氢以及R9是式IX，或R8是氢以及R9是式IX，其中式IX中的y是0，R19是O，以及介于相邻的R18与R23之间的所有的键是单键。
在式XII的一些实施例中，k是3以及Rc是式XIII，其中R8是氢以及R9是式IX，或R8是氢以及R9是式IX，其中式IX中的y是0，R19是O，以及介于相邻的R18与R23之间的所有的键是单键，Xb是氧，p是1，q是0，以及每一个R25是氢。
在式XII的一些实施例中，k是3以及Rc是式XIII，其中R8是氢以及R9是式IX，或R8是氢以及R9是式IX，其中式IX中的y是1，Re是烷氧基并且与R19、R20、R21、R21、R22或R23键合，介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是双键以及介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是单键。
在式XII的一些实施例中，k是3以及Rc是式XIII，其中R8是氢以及R9是式IX，或R8是氢以及R9是式IX，其中式IX中的y是1，Re是烷氧基并且与R19键合，介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是双键以及介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是单键。
在式XII的一些实施例中，k是3以及Rc是式XIII，其中R8是氢以及R9是式IX，或R8是氢以及R9是式IX，其中式IX中的y是1，Re是诸如甲氧基的烷氧基并且与R19键合，R18至R23是碳原子，介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是双键以及介于相邻的R18与R23之间的键中有三个是单键，Xb不存在，p是0以及q是0。
在一些实施例中，式XIV中的y是0，R19、R20、R21、R21或R22是O，并且当化合价允许时，介于相邻的R18与R22之间的键的两个是双键，以及介于相邻的R18与R22之间的键的三个是单键。
在一些实施例中，式XIV中的y是0，R19是O，R18、R20、R21和R22是C，介于R18和R22之间以及介于R20和R21之间的键是双键，并且环中的其余的键是单键。
在一些实施例中，式XIV中的y是0，R19是O，R18、R20、R21和R22是C，介于R18和R22之间以及介于R20和R21之间的键是双键，并且环中的其余的键是单键，Xb不存在，p是1，q是0，以及每一个R25是氢。
在一些实施例中，式XIV中的y是0，R19、R20、R21或R22是O，以及，介于相邻的R18与R22之间的键是单键。
在一些实施例中，式XIV中的y是0，R19是O，R18、R20、R21和R22是C，以及介于相邻的R18与R22之间的键是单键。
在一些实施例中，式XIV中的y是0，R19是O，R18、R20、R21和R22是C，介于相邻的R18与R22之间的键是单键，Xb不存在，p是1，q是0，以及每一个R25是氢。
在一些实施例中，式XIV中的y是0，R19和R22是O，以及介于相邻的R18与R22之间的键是单键。
在一些实施例中，式XIV中的y是0，R19和R22是O，R18、R21和R22是C，介于相邻的R18与R22之间的键是单键。
在一些实施例中，式XIV中的y是0，R19和R22是O，R18、R21和R22是C，介于相邻的R18与R22之间的键是单键，Xb不存在，p是1，q是0，以及每一个R25是氢。
在一些实施例中，式XV的R37是Si，以及Xg是炔基。
在一些实施例中，式XV的R37是Si，Xg是乙炔基，以及R38是亚烷基。
在一些实施例中，式XV的R37是Si，Xg是乙炔基，R38是亚甲基，以及R39、R40和R41是烷基。
在一些实施例中，式XV的R37是Si，Xg是乙炔基，R38是亚甲基，以及R39、R40和R41是甲基。
修饰的藻酸盐能够是单一修饰的藻酸盐聚合物或者多重修饰的藻酸盐聚合物。单一修饰的藻酸盐聚合物是含有一个或多个共价修饰的单体的藻酸盐聚合物，其中基本上所有的共价修饰的单体具有相同的共价修饰(即聚合物含有一种“类型”或种类的共价修饰的单体)。多重修饰的藻酸盐聚合物是含有共价修饰的单体的藻酸盐聚合物，其中基本上所有的共价修饰的单体不具有相同的共价修饰(即聚合物含有两种或多种“类型”或种类的共价修饰的单体)。
在一些实施例中，修饰的藻酸盐聚合物是单一修饰的藻酸盐聚合物。在一些实施例中，修饰的藻酸盐聚合物是如下所展示的单一修饰的藻酸盐聚合物的一个：
Figure BDA0002981759510000211
在优选的实施例中，修饰的藻酸盐聚合物是多修饰的藻酸盐聚合物，其具有含有甘露糖醛酸(mannuronate)单体、古洛糖醛酸(guluronate)单体、第一种类或类型的由式I定义的共价修饰的单体以及第二种类或类型的由式I定义的共价修饰的单体。在一些实施例中，修饰的藻酸盐聚合物是下面所展示的多重修饰的藻酸盐聚合物之一个。
Figure BDA0002981759510000221
Figure BDA0002981759510000231
在一些实施例中，多重修饰的藻酸盐是含有一个或多个共价修饰的单体的藻酸盐聚合物，该单体具有根据式III的结构
Figure BDA0002981759510000241
其中
X是氧、硫或NR4；
R1、R6、R7、R8及R9独立地为氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；
其中
Y1和Y2独立地为氢或-PO(OR5)2；或
Y2不存在，并且Y1与Y1和Y2所连接的两个氧原子一起形成如式IV所展示的环状结构
Figure BDA0002981759510000251
其中
R2和R3独立地为氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地包括以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的R2和R3基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或者
R2和R3与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；以及
R4和R5独立地为氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的R4和R5基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，R8、R9或两者独立地为氢，
Figure BDA0002981759510000261
其中R31、R32、R33、R34、R35及R36独立地为氢、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、被杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，R1是
(A)
Figure BDA0002981759510000262
其中k独立地为1至30的整数；其中z是0至4的整数；其中Xd是O或S；其中R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16及R17独立地为氢、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；以及其中Ra和Rc独立地为烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烯基、炔基、被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环、杂环或者
Figure BDA0002981759510000271
其中R8、R9或两者独立地为氢、
Figure BDA0002981759510000272
其中R31、R32、R33、R34、R35及R36独立地为氢、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、被杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，修饰的藻酸盐是含有一个或多个由式I、式II、式III或式IV描述的共价修饰的藻酸盐单元的藻酸盐聚合物，其中对于每一式，R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8及R9独立地为氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地包括以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或R2和R3与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；以及其中R1不是氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，修饰的藻酸盐是含有一个或多个由式I、式II、式III或式IV描述的共价修饰的藻酸盐单元的藻酸盐聚合物，其中对于每一式，R1、R3、R4、R5、R6、R7、R8及R9独立地为氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或R2和R3与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；以及其中R2不是氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，修饰的藻酸盐是含有一个或多个由式I、式II、式III或式IV描述的共价修饰的藻酸盐单元的藻酸盐聚合物，其中对于每一式，R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8及R9独立地为氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或R2和R3与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；以及其中R3不是氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，修饰的藻酸盐是含有一个或多个由式I、式II、式III或式IV描述的共价修饰的藻酸盐单元的藻酸盐聚合物，其中对于每一式，R1、R2、R3、R5、R6、R7、R8及R9独立地为氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或R2和R3与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；以及其中R3不是氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，修饰的藻酸盐是含有一个或多个由式I、式II、式III或式IV描述的共价修饰的藻酸盐单元的藻酸盐聚合物，其中对于每一式，R1、R2、R3、R4、R6、R7、R8及R9独立地为氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或R2和R3与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；以及其中R3不是氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，修饰的藻酸盐是含有一个或多个由式I、式II、式III或式IV描述的共价修饰的藻酸盐单元的藻酸盐聚合物，其中对于每一式，R1、R2、R3、R4、R5、R7、R8及R9独立地为氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或R2和R3与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；以及其中R3不是氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，修饰的藻酸盐是含有一个或多个由式I、式II、式III或式IV描述的共价修饰的藻酸盐单元的藻酸盐聚合物，其中对于每一式，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8及R9独立地为氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或R2和R3与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；以及其中R7不是氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，修饰的藻酸盐是含有一个或多个由式I、式II、式III或式IV描述的共价修饰的藻酸盐单元的藻酸盐聚合物，其中对于每一式，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7及R9独立地为氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或R2和R3与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；以及其中R3不是氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，修饰的藻酸盐是含有一个或多个由式I、式II、式III或式IV描述的共价修饰的藻酸盐单元的藻酸盐聚合物，其中对于每一式，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7及R8独立地为氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或R2和R3与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；以及其中R3不是氢或含有任何数量的碳原子、1-30个碳原子、1-20个碳原子或1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的有机基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
修饰的藻酸盐聚合物能够含有任何比例的甘露糖醛酸单体、古洛糖醛酸单体及共价修饰的单体。在优选的实施例中，修饰的藻酸盐聚合物中大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、更优选地大于25％以及最优选地大于30％的单体是共价修饰的单体。
在优选的实施例中，修饰的藻酸盐聚合物能够使用诸如Ca2+、Sr2+或Ba2+的多价离子离子交联以形成水凝胶。修饰的藻酸盐在生理条件下形成稳定水凝胶的能力可以使用本文所描述的水凝胶形成测定来量化。在优选的实施例中，修饰的藻酸盐聚合物形成水凝胶，使得使用本文所描述的高通量测定法测量的荧光强度介于15,000和55,000之间、优选地介于20,000和55,000之间、更优选地介于25,000和55,000之间。
在优选的实施例中，修饰的藻酸盐是生物相容性的，并且诱导异物反应低于未修饰的藻酸盐。修饰的藻酸盐的生物相容性能够使用本领域已知的体外和体内测定法定量测定，包括本文所描述的体内生物相容性测定法。在优选的实施例中，修饰的藻酸盐聚合物是生物相容性的，使得使用本文所描述的体内生物相容性测定法测量的针对未修饰的藻酸盐标准化的荧光反应小于75％、70％、65％、60％、55％或50％。还描述了用于表征修饰的藻酸盐聚合物的测定法。
还描述了有用于表征修饰的藻酸盐聚合物形成水凝胶的能力的高通量测定法。在一些实施例中，本文所描述的水凝胶形成测定法用于量化由藻酸盐或修饰的藻酸盐形成的水凝胶的稳定性。在优选的实施例中，本文所描述的水凝胶形成测定法用作筛选工具以鉴定能够形成稳定水凝胶的修饰的藻酸盐。本文所描述的高通量体内生物相容性测定法用于鉴定相对于未修饰的藻酸盐诱导较低异物反应的修饰的藻酸盐。还提供了用于量化修饰的藻酸盐的生物相容性的测定法。
本文进一步描述了使用修饰的藻酸盐聚合物涂覆医药产品、装置和表面的方法。在具体实施例中，本文所描述的修饰的藻酸盐聚合物用于涂覆产品、装置和表面，以用于治疗人类或动物患者的疾病或病症的方法。在一些实施例中，通过移植或植入涂覆有修饰的藻酸盐聚合物的产品、装置和表面来治疗人类或动物患者的疾病或病症。在具体实施例中，通过移植或植入涂覆有修饰的藻酸盐聚合物的产品、装置和表面来治疗人类或动物患者的疾病或病症。
本文进一步描述了使用修饰的藻酸盐聚合物包封生物材料的方法。在具体实施例中，本文所描述的修饰的藻酸盐聚合物用于包封细胞，以用于治疗人类或动物患者的疾病或病症的方法。在一些实施例中，通过移植包封在修饰的藻酸盐聚合物中的外源生物材料来治疗人类或动物患者的疾病或病症。在具体实施例中，通过移植包封在修饰的藻酸盐聚合物中的细胞来治疗人类或动物患者的疾病或病症。在更具体实施例中，通过移植包封在修饰的藻酸盐聚合物中的胰岛细胞来治疗糖尿病。
适于包封和移植的细胞优选地是分泌或代谢细胞(即它们分泌治疗因子或代谢毒素或两者)或结构细胞(例如皮肤、肌肉、血管)或代谢细胞(例如它们代谢有毒物质)。在一些实施例中，细胞是自然分泌型(例如自然分泌胰岛素的胰岛细胞)或自然代谢型(例如自然解毒和分泌的肝细胞)。在一些实施例中，细胞被生物工程改造以表达重组蛋白，诸如分泌的蛋白或代谢酶。根据细胞类型，细胞可以被组织为单细胞、细胞聚集体、球状体或甚至天然或生物工程改造的组织。
附图说明
图1展示了使用实例1中所描述的组合合成方法获得的修饰的藻酸盐的通式结构。制备的具有每种通式结构的藻酸盐的数量如下所示。
图2是自实例2中所描述的水凝胶形成测定中获得的图。绘制了针对修饰的藻酸盐测量的平均荧光强度值。认为产生低于15,000的荧光值的修饰的藻酸盐不适用于其中水凝胶形成是关键的(即细胞的包封)的应用。
图3是显示与阳性对照(无藻酸盐)相比，选择的修饰的藻酸盐对HeLa细胞系存活率的影响的图。藻酸盐(Alg)的HeLa细胞系存活率是53％。几种聚合物显示比Alg更具细胞毒性，然而，大多数文库表现与Alg一样好或更好。
图4是使用实例5中描述的体内方法获得的图，其量化选择的修饰的藻酸盐的生物相容性。针对使用未修饰的藻酸盐测量的荧光反应标准化使用实例5中描述的体内方法对修饰的藻酸盐获得的荧光反应，以便以％荧光反应来量化修饰的藻酸盐的生物相容性。
图5是详述移植有包封在选定的修饰的藻酸盐以及两种不同的未修饰的藻酸盐(CMIT和CJOS)中的大鼠胰岛的小鼠的血糖水平的图。虚线表示小鼠中的血糖正常。在植入后5天，287_F4、CJOS、287_B4、263_C12和CMIT在虚线之上，而其它的在虚线下。在植入后205天，从顶部到底部的线是：CJOS、287_G3、287_F4、287B_B4、CMIT、287B_B8、263_C12、263_C6、287_B3、287_D3和263_A7。
图6是显示作为修饰的藻酸盐(与未修饰的藻酸盐结合)的函数的炎症反应(通过针对VLVG的标准化荧光测量)的条形图。
图7是用于藻酸盐的化学修饰的胺、醇、叠氮化物和炔的结构图。标志“N”表示酰胺化试剂，标志“O”表示酯化试剂，标志“Y”表示点击试剂。
图8是从在C57BL/6小鼠的IP空间中14天后回收的Z2-Y12、Z1-Y15、Z1-Y19、SLG20和V/S胶囊中分离的巨噬细胞(CD11b+，CD68+)和嗜中性粒细胞(CD11b+，Ly6g+)的FACS分析图***＝p<0.0001，ns＝不显著。
图9是用于合成774藻酸盐类似物的方案的图。
图10是从自STZ-C57BL/6J中回收的植入物中分离的α-SMA蛋白质的Western印迹量化图。
图11是显示来自配制为300μm胶囊的初始筛选的70个顶端修饰的藻酸盐的次级组织蛋白酶评价的图。针对VLVG胶囊的荧光标准化的数据。具有最低组织蛋白酶水平的十个藻酸盐类似物胶囊在右侧，具有较浅的阴影。
图12是自14天后从C57BL/6小鼠的IP空间回收的前十个藻酸盐类似物胶囊和对照藻酸盐胶囊(SLG20，V/S)的300μm胶囊中提取的蛋白质的细胞因子面板分析(Elispot)的图。每个群组n＝5。#表示p<0.01的平均值之间的显著性差异。
图13是三唑-硫代吗啉二氧化物(TMTD)藻酸盐的化学结构。
图14是显示为巨噬细胞和嗜中性粒细胞的在14天IP后自C57BL/6中回收的包封的人类细胞植入物的FACS分析的图。
图15是显示为B细胞和CD8 T细胞的在14天IP后在C57BL/6中回收的包封的人类细胞植入物的FACS分析的图。
图16是来自从STZ-C57BL/6J中回收的植入物的蛋白质分离物中检测到的蛋白质的蛋白质组量化的热图。热图中的每一列是来自相应群组的个体STZ-C57BL/6小鼠。
具体实施方式
藻酸盐是一类由1-4-糖苷连接的β-D-甘露糖醛酸(M)和其C-5差向异构体α-L-古洛糖醛酸(G)形成的线性多糖共聚物。藻酸盐是由包括海洋褐藻和至少两类细菌(假单胞菌(Pseudomonas)和固氮菌(Azotobacter))的多种生物体产生的天然存在的生物聚合物。通常，商业藻酸盐从海洋藻类，包括大叶藻(Macrocystis pyrifera)、泡叶藻(Ascophyllumnodosum)和各种类型的海带属(Laminaria)中分离。
Figure BDA0002981759510000381
β-D-甘露糖醛酸单体(M)
Figure BDA0002981759510000382
α-L-古洛糖醛酸单体(G)
三种类型的一级结构限定了藻酸盐的多糖骨架：连续的古罗糖醛酸酯单体(G-嵌段)的均聚区、连续的甘露糖醛酸单体(M-嵌段)的均聚区和含有交替的甘露糖醛酸和古罗糖醛酸酯单体(MG-嵌段)的区域。单体嵌段在溶液中具有不同的构象，自柔性延伸结构(M-嵌段)至刚性紧密结构(G-嵌段)的范围。在G-嵌段的情况下，紧密构象促进多价离子，特别是Ca2+离子的螯合，使得一个藻酸盐链中的G-嵌段可以与另一藻酸盐链中的G嵌段离子交联，形成稳定的凝胶。因此，单体嵌段的比例、长度和分布影响藻酸盐聚合物的物理化学性质。
在自藻类获得的商业生产的藻酸盐的情况下，藻酸盐聚合物中的糖醛酸单体的分子量、一级结构和总摩尔比(M/G比)取决于许多因素，包括产生藻酸盐的物种、收集物种的年份的时间以及藻体的位置和年龄。因此，具有一定范围的物理化学性质(如分子量和粘度)的藻酸盐是可商购的。
藻酸盐能够在室温和中性pH下离子交联以形成水凝胶。藻酸盐在生理上相容的条件下形成稳定的凝胶的能力使得藻酸盐凝胶可用于许多生物医学应用。例如，藻酸盐凝胶已经用作药物递送的基质以调节治疗剂、诊断剂和预防剂的药代动力学。
I.定义
如本文所用的“藻酸盐”是用于指由任何M/G比的β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸形成的线性多糖及其盐和衍生物的统称术语。如本文所用的术语“藻酸盐”包括具有以下所示结构的任何聚合物及其盐。
Figure BDA0002981759510000391
如本文所使用的“生物相容性”是指当引入生物体时发挥其所需功能而不诱导对天然细胞、组织或器官的显著炎症反应、免疫原性或细胞毒性的材料。本文所用的生物相容性可以使用本文实例5中所描述的体内生物相容性测定来量化。
如本文所用的“异物反应”是指生物组织对组织中任何外来物质的存在的免疫反应，其可包括蛋白质吸附、巨噬细胞、多核异源巨细胞、成纤维细胞和血管生成。
“化学修饰的藻酸盐”或“修饰的藻酸盐”在本文中可互换使用，并且是指含有一个或多个共价修饰的单体的藻酸盐聚合物。
如本文所用的“共价修饰的单体”是指通过化学方法从甘露糖醛酸和/或古洛糖醛酸单体获得的甘露糖醛酸和/或古洛糖醛酸单体的类似物或衍生物的单体。
在涂覆的上下文中所使用的“接触”是指用于将聚合物(诸如本文公开的修饰的藻酸盐聚合物)涂覆在基底或表面上的任何方式。接触可包括但不限于术中浸涂、喷雾、润湿、浸泡、浸渍、绘涂、粘合或粘附、逐步表面衍生化或以其它方式提供具有疏水性聚阳离子聚合物的化合物的基材或表面。聚合物能够共价或非共价地连接到基底或表面。在一些实施例中，聚合物与表面非共价联合。
本文所用的“涂层”是指任何临时的、半永久的或永久的层、覆盖物或表面。涂层能够作为气体、蒸气、流体、糊状物、半固体或固体使用。另外，涂层可以作为流体使用并且固化成硬涂层。能够将弹性设计进涂层中以适应待涂覆的基底或表面的柔韧性，例如膨胀或收缩。优选的涂层是本文公开的修饰的藻酸盐聚合物。
本文在化学式的上下文中使用的“独立地”(并且除非上下文另有明确说明)是指所提及的基团的每个例子独立于该基团的其它例子而选择。例如，群组的每个例子能够不同于每个其它例子、一些其它例子或者群组的其它例子。当提及多个基团时，“独立地”是指每个给定基团的每个例子独立于相应基团的其它例子而选择，并且每个基团独立于其它基团而选择。例如，第一基团的每个例子能够不同于第二基团(或第三或第四等等基团)每一个例子、一些其它例子或无其它例子。
本文在医疗产品(诸如医疗装置)的上下文中使用的“组件”是与该产品结构上整合的产品的一部分。组件可以施加到产品的基底或表面，包含在产品的物质内、保留在产品的内部或任何其它布置，由此该部分是产品结构的整体元件。作为示例，围绕起搏器的机械部分的硅胶覆盖物是起搏器的组件。组件可以是产品的内腔，其中内腔执行产品的整体功能所必需的一些功能。组织扩张器端口的内腔是组织扩张器的组件。组件能够指在产品内部的贮存器或离散区域，其特别适于将流体输送至产品的表面。可植入药物输送装置内的贮存器是该装置的组件。
本文在涂层的上下文中使用的短语“有效量”通常是指施加到植入物上的涂层的量，以便提供一个或多个临床可测量的终点，诸如与未涂覆的植入物、涂覆有未修饰的涂层的植入物或另一种合适的对照物相比减少的异物反应。本文在细胞、胶囊、装置、组合物或化合物的上下文中使用的短语“有效量”是指提供所需结果的无毒但足够量的细胞、胶囊、装置、组合物或化合物。所需的确切量可以根据受试者而变化，取决于受试者的物种、年龄和一般状况；所治疗的疾病的严重程度；所使用的具体细胞、胶囊、装置、组合物或化合物；其实施模式；以及其它常规变量。合适的有效量能够由本领域普通技术人员仅使用常规实验确定。
如本文所用的“表面”或“多个表面”是指任何固体或半固体材料的任何表面，包括玻璃、塑料、金属、聚合物等。这包括由多于一种材料构成的表面，包括涂覆的表面。
本文所用的“单一修饰的藻酸盐聚合物”是指含有一个或多个共价修饰的单体的修饰的藻酸盐，其中基本上所有共价修饰的单体具有相同的共价修饰(即聚合物含有一种“类型”或种类的共价修饰的单体)。单一修饰的藻酸盐聚合物包括例如修饰的藻酸盐聚合物，其中修饰的藻酸盐聚合物中的基本上所有的单体由甘露糖醛酸单体、古洛糖醛酸单体和由式I定义的共价修饰的单体表示。并非所有单体都必须共价修饰。
本文所用的“胶囊”是指由平均直径为约150μm至约5cm、由交联的水凝胶形成、具有被一个或多个聚合物壳包围的交联的水凝胶核心、具有一个或多个交联的水凝胶层、具有交联的水凝胶涂层或其组合的颗粒。胶囊可以具有适合于例如细胞包封的任何形状。胶囊可以含有一个或多个分散在交联的水凝胶中的细胞，从而“包封”细胞。本文中提到的“胶囊”涉及并且包括微胶囊，除非上下文另有明确说明。优选的胶囊的平均直径为约150μm至约8mm。
本文所用的“微胶囊”和“微凝胶”可互换使用，涉及平均直径为约150μm至约1000μm的颗粒或胶囊。
如本文所用的“生物材料”是指任何生物物质，包括但不限于组织、细胞、生物小分子(诸如核苷酸、氨基酸、辅因子和激素)、生物大分子(诸如核酸、多肽、蛋白质(例如酶、受体、分泌蛋白、结构和信号蛋白、激素、配体等)、多糖和/或其任何组合)。
除非特别指出，本文所用的“细胞”是指个体细胞、细胞系、原代培养物或源自此类细胞的培养物。本文所用的“培养物”是指包含相同或不同类型的分离的细胞的组合物。本文所用的“细胞系”是指永久建立的细胞培养物，其将在适当的新鲜培养基和空间下无限增殖，从而使细胞系“永生”。本文所用的“细胞株”是指具有适于培养但具有有限分裂潜力的多个细胞的细胞培养物。本文所用的“细胞培养物”是在培养基诸如琼脂上生长的细胞群。
细胞可以是例如异种的、自体的或同种异体的。细胞也可以是原代细胞。细胞也可以是衍生自自受试者获得的细胞的培养和扩增的细胞。例如，细胞也可以是干细胞或衍生自干细胞。细胞也可以是永生化细胞。细胞也可以被基因工程改造的以表达蛋白质、核酸或其它产物。
如本文所用的“哺乳动物细胞”是指衍生自哺乳动物受试者的任何细胞。
如本文所用的“自体的”是指取自相同个体的移植的生物材料，诸如细胞。
如本文所用的“同种异体的”是指取自相同物种的不同个体的移植的生物材料，诸如细胞。
如本文所用的“异种的”是指来自不同物种的移植的生物材料，诸如细胞。
本文所用的“内分泌细胞”是指内分泌系统的细胞。如本文所用的“分泌内分泌细胞”是指分泌一个或多个激素的内分泌细胞。
本文所用的“胰岛细胞”是指源自哺乳动物胰腺的内分泌细胞。胰岛细胞包括分泌胰高血糖素的α细胞、分泌胰岛素和胰淀素的β细胞、分泌生长抑素的δ细胞、分泌胰多肽的PP细胞或分泌生长素释放肽的ε细胞。术语包括这些细胞的均质和异质群体。在优选的实施例中，胰岛细胞群至少含有β细胞。
本文所用的“激素产生细胞”是指产生一个或多个激素的细胞。优选的激素产生细胞响应于生理刺激产生激素，诸如引起激素自天然分泌激素的内分泌细胞分泌的生理刺激。分泌内分泌细胞、衍生自干细胞的激素产生细胞和被基因工程改造的以产生激素的细胞是激素产生细胞的示例。
本文所用的“胰岛素产生细胞”是指产胰岛素细胞。优选的胰岛素产生细胞响应于葡萄糖水平产生胰岛素。胰岛β细胞、衍生自干细胞的产胰岛素细胞和基因工程改造的以产生胰岛素的细胞是胰岛素产生细胞的示例。
如本文所用的“移植”是指细胞、组织或器官自另一来源转移至受试者。术语不限于转移的具体模式。包封的细胞可以通过任何合适的方法移植，诸如通过注射或手术植入。
如本文所使用的“原代细胞”、“原代细胞系”和“原代培养物”可互换使用，是指已经衍生自受试者并允许在体外生长有限次数的传代的细胞和细胞培养物，即培养物的分裂。
如本文所用的“间充质干细胞”或“MSC”是指存在于或衍生自间充质组织中的多能干细胞，其可分化成多种细胞类型，包括：成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。
如本文所用的关于细胞的“衍生自”是指自组织、细胞系或细胞获得的细胞，然后培养、传代、分化、诱导等以产生衍生的细胞。例如，诱导多能干细胞衍生自体细胞。
如本文所用的“多能性”是指细胞在生物体中分化成多种类型的细胞的能力。“多能干细胞”意味着能够自我更新和分化以在生物体中产生所有类型的细胞的细胞。“多潜能性”意味着细胞在生物体中分化成一些类型的细胞但不是全部，通常分化成具体组织或细胞谱系的细胞的能力。
如本文所用的“多潜能细胞”和“成体干细胞”是指不衍生自胚胎或胎儿的任何类型的干细胞，并且通常具有有限的产生新细胞类型的能力(称为“多潜能性”)并致力于具体的谱系。
本文所使用的“诱导多能干细胞”包括多能干细胞，如胚胎干(ES)细胞，能够长时间培养同时保持分化为生物体中所有类型细胞的能力，但是，不同于ES细胞(其衍生自胚泡的内部细胞团)，其是从体细胞衍生的。
为了本文的讨论清晰，单一修饰的藻酸使用示出并入骨架中的共价修饰的单体的结构并且忽略甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单体的式来定义。例如，单一修饰的藻酸盐聚合物由甘露糖醛酸单体、古罗糖醛酸单体和由式I定义的共价修饰的单体组成，其中X是NR4，R1是甲基，以及R4、Y1和Y2是氢，本文通过如下结构来说明。
Figure BDA0002981759510000431
本文所用的“多重修饰的藻酸盐聚合物”是指含有共价修饰的单体的修饰的藻酸盐，其中基本上所有共价修饰的单体不具有相同的共价修饰(即聚合物含有两种或多种不同的“类型”或种类的共价修饰的单体)。多重修饰的藻酸盐聚合物包括例如修饰的藻酸盐聚合物，其中修饰的藻酸盐聚合物中的基本上所有的单体由甘露糖醛酸单体、古洛糖酸单体和两种或多种不同类型的由式I定义的共价修饰的单体表示。如在本上下文中使用的，共价修饰的单体的“类型”或“种类”是指由式I定义的共价单体，其中所有可能的可变位置是化学上定义的。不是所有的单体都是共价修饰的。
为了本文的讨论清晰，修饰的藻酸盐使用示出并入骨架中的共价修饰的单体并且忽略甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单体的式来定义。例如，多重修饰的藻酸盐聚合物由甘露糖醛酸单体、古洛糖醛酸单体和两种不同类型的共价修饰的单体组成，其中第一类型的共价修饰的单体由式I定义，其中X是NR4，R1是甲基，以及R4、Y1和Y2是氢，以及第二类型的共价修饰的单体由式I定义，其中X是氧，R1是乙基，以及Y1和Y2是氢，通过如下结构来说明。
Figure BDA0002981759510000441
在化合物的上下文中，“类似物”和“衍生物”在本文中可互换使用，并且是指具有与母体化合物类似的结构的化合物，但是与母体化合物的差异在一个或多个某些成分。类似物或衍生物在一个或多个原子、官能团或亚结构中与母体化合物不同，该原子、官能团或亚结构被其它原子、基团或亚结构替代。类似物或衍生物能够被想象为至少在理论上由母体化合物通过一些化学或物理过程形成。术语类似物和衍生物包括保留与母体化合物相同的基本环结构但在环上具有一个或多个不同取代基的化合物。例如，甘露糖醛酸或古洛糖醛酸的类似物或衍生物是指保留单体核心(例如吡喃糖环)但在环上不同或多种取代基的化合物。
本文所用的“甘露糖醛酸”和“甘露糖醛酸单体”是指甘露糖醛酸单体及其盐。
Figure BDA0002981759510000451
本文所用的“古洛糖醛酸”和“古洛糖醛酸单体”是指古洛糖醛酸单体及其盐。
Figure BDA0002981759510000452
如本文所用的“基本上”规定95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或者99％或更多的量。
如本文所用的“玻璃化转变温度(Tg)”是指在无定形材料中观察到自硬并且相对脆的状态至熔融或类似橡胶状态的可逆转变的温度。藻酸盐聚合物的Tg值能够使用差示扫描量热法(DSC，以10K/min的速率加热和冷却)通过实验确定。在本文所有的情况下，使用粉末聚合物样品测量Tg值。
如本文所用的“点击化学”是指用于将两种化合物耦合在一起的化学反应，其高产率，范围广，仅产生可以无需色谱法除去的、立体特异性的、易于执行的副产物，并且能够在容易除去或良性溶剂中进行。满足这些标准的反应的示例包括环氧化物和氮丙啶的亲核开环、非醛醇型羰基反应(包括腙和杂环的形成)、碳-碳多键的加成(包括迈克尔(Michael)加成)和诸如1,3-偶极环加成反应(即胡伊斯根(Huisgen)环加成反应)的环加成反应。参见，例如，Moses和Moorhouse，《化学会评论》(Chem Soc.Rev.)36:1249-1262(2007)；Kolb和Sharpless，[当今药物发现](Drug Discovery Today).8(24):1128-1137(2003)；以及Kolb等人，《德国应用化学》(Angew.Chem.Int.Ed.)40:2004-2021(2001)。
本文所用的“多价阳离子”是指具有大于1的正电荷的阳离子。示例包括但不限于Ca2+、Ba2+和Sr2+。
本文所用的“被取代的”是指本文所描述的化合物或官能团的所有允许的取代基。在最广泛的意义上，允许的取代基包括有机化合物的无环和环状、支链和非支链、碳环和杂环、芳族和非芳族取代基。说明性的取代基包括但不限于卤素、羟基或含有任何数量的碳原子、优选1-14个碳原子的任何其其它有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团。代表性的取代基包括烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、被杂芳基、被取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、氰基、异氰基、被取代的异氰基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、肽和多肽基团。
诸如氮的杂原子可具有氢取代基和/或满足杂原子化合价的本文所描述的有机化合物的任何允许的取代基。应当理解，“取代”或“被取代的”包括隐含的条件，即这种取代根据被取代的原子和取代基的允许的化合价，并且取代产生稳定的化合物，即不自发进行重排、环化、消除等转化的化合物。
本文所使用的“芳基”是指C5-C10元芳族、杂环、稠合芳族、稠合杂环、双芳族或双杂环体系。本文所使用的广义定义的“芳基”包括可包括0至4个杂原子的5元、6元、7元、8元、9元和10元单环芳族基团，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。在环结构中具有杂原子的那些芳基也可以称为“芳基杂环”或“杂芳族化合物”。芳环能够在一个或多个环位置被一个或多个取代基取代，所述取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基(或季铵化的氨基)、硝基、巯基、亚氨基、酰氨基、膦酸酯、次膦酸盐、羰基、羧基、硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、亚磺酰氨基、酮、醛、酯、杂环基、芳香族或杂芳族部分、-CF3、-CN；及其组合。
“芳基”还包括具有两个或多个环的多环体系，其中两个或多个碳是两个相邻环共用的(即“稠环”)，其中至少一个环是芳族的，例如其它一个或多个环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环。杂环的实例包括但不限于：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并硫代苯基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH咔唑基、咔啉基、苯并二氢吡喃基、色烯基、噌啉基、十氢喹啉基、2H,6H--1,5,2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2,3-b]四氢呋喃、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、吲哚烯基、二氢吲哚基、中氮茚基、吲哚基、3H-吲哚基、靛红酰基、异苯并呋喃基、异色满基、异吲哚基、异吲哚啉基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、亚甲二氧基苯基、吗啉基、萘啶基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、羟吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基(pyridinyl)、吡啶基(pyridyl)、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基、6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、噻吩基和呫吨基。一个或多个环可以如上文对“芳基”所定义的那样被取代。
本文所使用的“烷基”是指饱和或不饱和脂肪族基团的基团，包括直链烷基、烯基或炔基基团，支链烷基、烯基或炔基基团，环烷基、环烯基或环炔基(脂环族)基团、烷基取代的环烷基、环烯基或环炔基基团以及环烷基取代的烷基、烯基或炔基基团。除非另有说明，直链或支链烷基在其骨架中具有30个或更少的碳原子(例如，对于直链为C1-C30，对于支链为C3-C30)，优选20个或更少，更优选10个或更少，最优选6个或更少。如果烷基是不饱和的，烷基链通常在链中具有2-30个碳，优选地在链中具有2-20个碳，更优选地在链中具有2-10个碳。同样，优选的环烷基在其环结构中具有3-20个碳原子，优选地在其环结构中具有3-10个碳原子，最优选地在环结构中具有5、6或7个碳原子。
术语“烯基”和“炔基”是指不饱和脂肪族基团，其长度和可能的取代类似于上述烷基，但分别含有至少一个双键或三键。
“烷基”包括在烃基的一个或任何数量的碳原子处的一个或多个取代以及杂烷基。合适的取代基包括但不限于：卤素，诸如氟、氯、溴或碘；羟；-NRR'，其中R和R'独立地为氢、烷基或芳基，以及其中氮原子任选地被季铵化；-SR，其中R是氢、烷基或芳基；-CN；-NO2；-COOH；羧酸；–COR，-COOR或-CON(R)2，其中R是氢、烷基或芳基；叠氮化物、芳烷基、烷氧基、亚氨基、膦酸酯、次膦酸盐、硅烷基、醚、磺酰基、亚磺酰氨基、杂环基、芳族或杂芳族部分，--CF3；-CN；-NCOCOCH2CH2；-NCOCOCHCH；-NCS；以及其组合。
如本文所使用的“氨基”和“胺”是本领域公认的，并且是指被取代的和未被取代的胺，例如可以由以下通式表示的部分：
Figure BDA0002981759510000481
其中R、R'和R"各自独立地表示氢、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的烯基、被取代的或未被取代的炔基、被取代的或未被取代的羰基、-(CH2)m-R”'，或R和R'与其所连接的N原子一起形成环结构中具有3至14个原子的杂环；R”'表示羟基、被取代的或未被取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环；以及m是0或者是1至8的整数。在优选的实施例中，只有R和R'中的一个可以是羰基，例如R和R'与氮一起不形成酰亚胺。在优选的实施例中，R和R'(以及任选地R")各自独立地表示氢原子、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的烯基或者-(CH2)m-R”'。因此，本文所使用的术语“烷基胺”是指具有连接到其上的被取代的或未被取代的烷基(即R、R'或R"中的至少一个是烷基)的如上所定义的胺基。
本文所使用的“羰基”是本领域公认的，并且包括可以由以下通式表示的这样的部分：
Figure BDA0002981759510000482
其中X是键或者表示氧或硫，以及R表示氢、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的烯基、被取代的或未被取代的炔基、-(CH2)m-R"或者药学上可接受的盐，R'表示氢、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的烯基、被取代的或未被取代的炔基或-(CH2)m-R”；R”表示羟基、被取代的或未被取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环；以及m是0或者是1至8的整数。当X是氧并且R如上所定义时，该部分也被称为羧基。当X是氧并且R是氢时，该式表示“羧酸”。当X是氧并且R'是氢时，该式表示“甲酸酯”。通常，当上式的氧原子被硫原子替代时，该式表示“硫代羰基”基团。当X是硫并且R或R'不是氢时，该式表示“硫酯”。当X是硫并且R是氢时，该式表示“硫代羧酸”。当X是硫并且R'是氢时，该式表示“硫代甲酸酯”。当X是键并且R不是氢时，上式表示“酮”。当X是键并且R是氢时，上式表示“醛”。
本文所使用的“杂烷基”是指含有至少一个杂原子的直链或支链或环状含碳基团或其组合。合适的杂原子包括但不限于O、N、Si、P和S，其中氮、磷和硫原子任选地被氧化，并且氮杂原子任选地被季铵化。
饱和烃基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基以及例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构体。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基和3-丁炔基。
“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”在本文中以其常规含义使用，并且是指分别通过氧原子、氨基或硫原子连接到分子其余部分的那些烷基。
本文所使用的“烷基芳基”是指被芳基(例如，芳族或杂芳族基团)取代的烷基。
本文所用的“杂环”或“杂环的”是指通过含有3-10个环原子，优选5-6个环原子的单环或双环的环碳或氮连接的环状基团，由碳和1-4个杂原子组成，每个杂原子选自非过氧化物氧、硫和N(Y)，其中Y不存在或为H、O、C1-C10烷基、苯基或苄基，并且任选地含有1-3个双键并任选地被一个或多个取代基取代。杂环的实例包括但不限于：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并硫代苯基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH-咔唑基、咔啉基、苯并二氢吡喃基、色烯基、噌啉基、十氢喹啉基、2H,6H--1,5,2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2,3-b]四氢呋喃、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、吲哚烯基、二氢吲哚基、中氮茚基、吲哚基、3H-吲哚基、靛红酰基、异苯并呋喃基、异色满基、异吲哚基、异吲哚啉基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、亚甲二氧基苯基、吗啉基、萘啶基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、羟吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基(pyridinyl)、吡啶基(pyridyl)、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基、6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、噻吩基以及呫吨基。杂环基团可以任选地被一个或多个如上对烷基和芳基所定义的取代基取代。
本文所使用的“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
II.修饰的藻酸盐
本文描述了已经被化学修饰的以改变它们的生物相容性和物理性质的藻酸盐聚合物，以及其制备方法。
A.修饰的藻酸盐聚合物的结构
修饰的藻酸盐含有一个或多个由式I定义的共价修饰的单体
Figure BDA0002981759510000501
其中，
X是氧、硫或NR4；
R1是氢或含有任何数量的碳原子、优选地为1-30个碳原子、更优选地为1-20个碳原子、更优选地为1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的R1基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；
Y1和Y2独立地为氢或-PO(OR5)2；或
Y2不存在，并且Y2与Y1和Y2所连接的两个氧原子一起形成如式II所展示的环状结构
Figure BDA0002981759510000511
其中；以及
R2及R3独立地为氢或含有任何数量的碳原子、优选地为1-30个碳原子、更优选地为1-20个碳原子、更优选地为1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的R2和R3基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或者
R2和R3与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；以及
R4及R5独立地为氢或含有任何数量的碳原子、优选地为1-30个碳原子、更优选地为1-20个碳原子、更优选地为1-14个碳原子的有机基团，并且任选地以直链、支链或环状结构形式包括一个或多个杂原子，诸如氧、硫或氮基团，代表性的R4和R5基团是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，修饰的藻酸盐聚合物是单一修饰的藻酸盐聚合物。在特定实施例中，单一修饰的藻酸盐聚合物含有一个或多个由式I定义的共价修饰的单体，其中R1包括叠氮基、炔基或1,2,3-三唑环。在某些实施例中，单一修饰的藻酸盐聚合物含有一个或多个由式I定义的共价修饰的单体，其中X不是氧以及R1不是未被取代的C1-C18烷基、聚(乙二醇)链或胆固醇基部分。在某些另外的实施例中，单一修饰的藻酸盐聚合物含有一个或多个由式I定义的共价修饰的单体，其中X不是NR4，R1不是被取代的或未被取代的C1-C6烷基或聚(乙二醇)链。
在替代实施例中，修饰的藻酸盐聚合物是多重修饰的藻酸盐聚合物。在优选的实施例中，多重修饰的藻酸盐聚合物具有含有甘露糖醛酸单体、古洛糖醛酸单体、第一种类或类型的由式I定义的共价修饰的单体以及第二种类或类型的由式I定义的共价修饰的单体的多糖骨架。在其它实施例中，多重修饰的藻酸盐聚合物具有含有甘露糖醛酸单体、古洛糖醛酸单体以及三种或多种不同类型的由式I定义的共价修饰单体的多糖骨架。
在一些实施例中，多重修饰的藻酸盐聚合物含有两种不同种类的由式I定义的共价修饰的单体，其中在两种单体中，X是NR4。在其它实施例中，多重修饰的藻酸盐聚合物含有两种不同种类的由式I定义的共价修饰的单体，其中在两种单体中，X是氧。在进一步的实施例中，多重修饰的藻酸盐聚合物含有两种不同种类的由式I定义的共价修饰的单体，其中在一种单体中X是氧，以及在第二种单体中，X是NR4。
在一些实施例中，多重修饰的藻酸盐聚合物含有两种不同种类的由式I定义的共价修饰的单体，其中在至少一种单体中，R1包括一个或多个环状部分。在优选的实施例中，多重修饰的藻酸盐聚合物含有两种不同种类的由式I定义的共价修饰的单体，其中在至少一种单体中，R1包括苯环、呋喃环、氧杂环戊烷环、二氧戊环或1,2,3-三唑环。
在某些实施例中，多重修饰的藻酸盐聚合物含有两种不同种类的由式I定义的共价修饰的单体，其中在至少一种单体中，R1包括一个或多个卤素部分、叠氮基团或炔烃。
在优选的实施例中，多重修饰的藻酸盐聚合物是下面所展示的多重修饰的藻酸盐聚合物的一种。
Figure BDA0002981759510000531
Figure BDA0002981759510000541
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基氨基、C1-C10烷基硫基、C1-C9烷基、C1-C9烷氧基、C1-C9烷基氨基、C1-C9烷基硫基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、C1-C8烷基氨基、C1-C8烷基硫基、C1-C7烷基、C1-C7烷氧基、C1-C7烷基氨基、C1-C7烷基硫基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基、C1-C6烷基硫基、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、C1-C5烷基氨基、C1-C5烷基硫基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基氨基、C1-C4烷基硫基、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3烷基氨基、C1-C3烷基硫基、C1-C2烷基、C1-C2烷氧基、C1-C2烷基氨基、C1-C2烷基硫基、C10烷基、C10烷氧基、C10烷基氨基、C10烷基硫基、C9烷基、C9烷氧基、C9烷基氨基、C9烷基硫基、C8烷基、C8烷氧基、C8烷基氨基、C8烷基硫基、C7烷基、C7烷氧基、C7烷基氨基、C7烷基硫基、C6烷基、C6烷氧基、C6烷基氨基、C6烷基硫基、C5烷基、C5烷氧基、C5烷基氨基、C5烷基硫基、C4烷基、C4烷氧基、C4烷基氨基、C4烷基硫基、C3烷基、C3烷氧基、C3烷基氨基、C3烷基硫基、C2烷基、C2烷氧基、C2烷基氨基、C2烷基硫基、C1烷基、C1烷氧基、C1烷基氨基或C1烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基氨基或C1-C10烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C9烷基、C1-C9烷氧基、C1-C9烷基氨基或C1-C9烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、C1-C8烷基氨基或C1-C8烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C7烷基、C1-C7烷氧基、C1-C7烷基氨基或C1-C7烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc及Rd为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、C1-C5烷基氨基或C1-C5烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基氨基或C1-C4烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3烷基氨基或C1-C3烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C2烷基、C1-C2烷氧基、C1-C2烷基氨基或C1-C2烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C10烷基、C10烷氧基、C10烷基氨基或C10烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C9烷基、C9烷氧基、C9烷基氨基或C9烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C8烷基、C8烷氧基、C8烷基氨基或C8烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C7烷基、C7烷氧基、C7烷基氨基或C7烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C6烷基、C6烷氧基、C6烷基氨基或C6烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C5烷基、C5烷氧基、C5烷基氨基或C5烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C4烷基、C4烷氧基、C4烷基氨基或C4烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C3烷基、C3烷氧基、C3烷基氨基或C3烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C2烷基、C2烷氧基、C2烷基氨基或C2烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1烷基、C1烷氧基、C1烷基氨基或C1烷基硫基。
在一些实施例中，R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基氨基、C1-C10烷基硫基、C1-C9烷基、C1-C9烷氧基、C1-C9烷基氨基、C1-C9烷基硫基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、C1-C8烷基氨基、C1-C8烷基硫基、C1-C7烷基、C1-C7烷氧基、C1-C7烷基氨基、C1-C7烷基硫基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基、C1-C6烷基硫基、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、C1-C5烷基氨基、C1-C5烷基硫基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基氨基、C1-C4烷基硫基、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3烷基氨基、C1-C3烷基硫基、C1-C2烷基、C1-C2烷氧基、C1-C2烷基氨基、C1-C2烷基硫基、C10烷基、C10烷氧基、C10烷基氨基、C10烷基硫基、C9烷基、C9烷氧基、C9烷基氨基、C9烷基硫基、C8烷基、C8烷氧基、C8烷基氨基、C8烷基硫基、C7烷基、C7烷氧基、C7烷基氨基、C7烷基硫基、C6烷基、C6烷氧基、C6烷基氨基、C6烷基硫基、C5烷基、C5烷氧基、C5烷基氨基、C5烷基硫基、C4烷基、C4烷氧基、C4烷基氨基、C4烷基硫基、C3烷基、C3烷氧基、C3烷基氨基、C3烷基硫基、C2烷基、C2烷氧基、C2烷基氨基、C2烷基硫基、C1烷基、C1烷氧基、C1烷基氨基或C1烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基氨基或C1-C10烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C9烷基、C1-C9烷氧基、C1-C9烷基氨基或C1-C9烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、C1-C8烷基氨基或C1-C8烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C7烷基、C1-C7烷氧基、C1-C7烷基氨基或C1-C7烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、C1-C5烷基氨基或C1-C5烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基氨基或C1-C4烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3烷基氨基或C1-C3烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氢、氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1-C2烷基、C1-C2烷氧基、C1-C2烷基氨基或C1-C2烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C10烷基、C10烷氧基、C10烷基氨基或C10烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C9烷基、C9烷氧基、C9烷基氨基或C9烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C8烷基、C8烷氧基、C8烷基氨基或C8烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C7烷基、C7烷氧基、C7烷基氨基或C7烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C6烷基、C6烷氧基、C6烷基氨基或C6烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C5烷基、C5烷氧基、C5烷基氨基或C5烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C4烷基、C4烷氧基、C4烷基氨基或C4烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C3烷基、C3烷氧基、C3烷基氨基或C3烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C2烷基、C2烷氧基、C2烷基氨基或C2烷基硫基。
在一些实施例中、R1至R17、R31至R36、Ra、Rb、Rc、Rd及Re独立地为氨基、羟基、硫醇、氧代或者被取代的或未被取代的C1烷基、C1烷氧基、C1烷基氨基或C1烷基硫基。
修饰的藻酸盐聚合物可以具有任何所需的分子量。通过凝胶渗透色谱法测定，藻酸盐的重均分子量优选地介于1,000和1,000,000道尔顿之间，更优选地介于10,000和500,000道尔顿之间。
修饰的藻酸盐聚合物能够含有任何比例的甘露糖醛酸单体、古洛糖醛酸单体及共价修饰的单体。在一些实施例中，大于2.5％、5％、7.5％、10％、12％、14％、15％、16％、18％、20％、22％、24％、25％、26％、28％、30％、32.5％、35％、37.5％、40％、45％、50％、55％或60％的修饰的藻酸盐聚合物中的单体是共价修饰的单体。优选地大于10％、更优选地大于20％以及最优选地大于30％的修饰的藻酸盐聚合物中的单体是共价修饰的单体。
可以掺入具有一系列不同氢键电位、疏水性/亲水性和电荷状态的共价修饰的单体生产修饰的藻酸盐聚合物。将共价修饰的单体包含在藻酸盐聚合物中改变了藻酸盐聚合物的物理化学性质。因此，藻酸盐的物理化学性质可以针对所需的应用通过选择性掺入共价修饰的单体来调节。
例如，玻璃化转变温度(Tg)可以通过引入共价修饰的单体而改变。在一些实施例中，通过差示扫描量热法(DSC)测量，修饰的藻酸盐聚合物粉末的Tg为大于50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、140℃、145℃、150℃、160℃、175℃、190℃或200℃。
藻酸盐的疏水性/亲水性能够通过掺入疏水和/或亲水共价修饰的单体而改变。在优选的实施例中，修饰的藻酸盐聚合物含有一个或多个疏水性共价修饰的单体。修饰的藻酸盐的相对疏水性/亲水性可以通过使用测角器测量修饰的藻酸盐聚合物膜上水滴的接触角来量化评价。在一些实施例中，修饰的藻酸盐的接触角小于90°(即它是亲水性的)。在优选的实施例中，修饰的藻酸盐的接触角大于90°(即它是疏水性的)。在一些实施例中，修饰的藻酸盐的接触角大于95°、100°、105°、110°、115°或120°。
在用于细胞包封的实施例中，修饰的藻酸盐聚合物可以通过多价阳离子如Ca2+、Sr2+或Ba2+离子交联以形成水凝胶。修饰的藻酸盐在生理条件下形成稳定水凝胶的能力可以使用实例2中所描述的水凝胶形成测定来量化。
在一些实施例中，修饰的藻酸盐聚合物形成水凝胶，使得使用本文所述的高通量水凝胶形成测定法测量的荧光强度大于10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000或55,000。在优选的实施例中，修饰的藻酸盐聚合物形成水凝胶，使得使用本文所述的高通量水凝胶形成测定法测量的荧光强度大于15,000。在优选的实施例中，修饰的藻酸盐聚合物形成水凝胶，使得使用本文所述的高通量水凝胶形成测定法测量的荧光强度介于15,000和55,000之间，优选地介于20,000和55,000之间，更优选地介于25,000和55,000之间。
在用于细胞包封的实施例中，修饰的藻酸盐聚合物形成具有足够多孔性的水凝胶，以允许营养物质、废物和从包封的细胞分泌的激素和/或蛋白质自由地扩散进入和离开胶囊，同时防止免疫细胞侵入凝胶基质。修饰的藻酸盐水凝胶的孔隙率和表面积可以使用BET分析测量。在BET分析之前，通过在真空下延长加热修饰的藻酸盐凝胶来除去溶剂和挥发性杂质。随后，将水凝胶样品在真空下冷却，例如通过液氮，并且通过测量在特定压力下吸附到水凝胶的气体(通常为N2、Kr、CO2或Ar气体)的体积进行分析。在可变压力下气体的物理吸附的分析用于表征由修饰的藻酸盐聚合物形成的凝胶的总表面积和孔隙率。测定水凝胶孔隙率的优选方法是BET分析。
在优选的实施例中，修饰的藻酸盐形成具有足够多孔性的水凝胶，以允许营养物质、废物和从包封的细胞分泌的激素和/或蛋白质自由地扩散进入和离开胶囊，同时防止免疫细胞侵入凝胶基质。在一些实施例中，由修饰的藻酸盐聚合物形成的水凝胶的孔隙率相对于由未修饰的藻酸盐聚合物形成的水凝胶的孔隙率增加5％、10％、15％或20％。在替代的实施例中，由修饰的藻酸盐聚合物形成的水凝胶的孔隙率相对于由未修饰的藻酸盐聚合物形成的水凝胶的孔隙率降低5％、10％、15％或20％。
在用于细胞包封的优选实施例中，修饰的藻酸盐是生物相容性的。修饰的藻酸盐的生物相容性可以使用实例5中所述的基于荧光的体内生物相容性测定来定量的测定。在这种测定中，使用体内荧光测定来测量组织蛋白酶活性，以量化对修饰的藻酸盐的异物反应。
在一些实施例中，修饰的藻酸盐聚合物是生物相容性的，使得使用本文所述的体内生物相容性测定法测量的针对未修饰的藻酸盐的标准化的荧光反应小于100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％或40％。在优选的实施例中，修饰的藻酸盐聚合物相对于未修饰的藻酸盐诱导较低的异物反应。这通过针对未修饰的藻酸盐标准化的荧光反应小于100％来指示。在一些实施例中，修饰的藻酸盐聚合物是生物相容性的，使得使用本文所描述的体内生物相容性测定法测量的针对未修饰的藻酸盐标准化的荧光响应小于75％，更优选地小于65％，以及最优选地小于50％。
B.胶囊和颗粒形态
胶囊是平均直径为约150μm至约5cm的颗粒。所公开的胶囊可以由交联的水凝胶形成。除了被包封的材料之外，举例来说，胶囊能够仅由交联的水凝胶形成、能够具有被一个或多个聚合物壳包围的交联的水凝胶核心、能够具有一个或多个交联的水凝胶层、能够具有交联的水凝胶涂层或其组合。胶囊可以具有适合于例如细胞包封的任何形状。胶囊可以含有一个或多个分散在交联的水凝胶中的细胞，从而“包封”细胞。优选的胶囊由一个或多个公开的修饰的藻酸盐形成或包括一个或多个公开的修饰的藻酸盐。优选的胶囊的平均直径为约150μm至约8mm。
胶囊的任何平均直径能够为有约150μm至约5cm。优选地，胶囊的平均直径大于1mm，优选地大于1.5mm或更大。在一些实施例中，胶囊的直径能够大至约8mm。例如，胶囊能够在约1mm至8mm、1mm至6mm、1mm至5mm、1mm至4mm、1mm至3mm、1mm至2mm、1mm至1.5mm、1.5mm至8mm、1.5mm至6mm、1.5mm至5mm、1.5mm至4mm、1.5mm至3mm或1.5mm至2mm的大小范围。
能够通过调节胶囊渗透性来选择细胞活力所需的分子进入胶囊的速率和治疗产物和废物材料离开胶囊膜的速率。还能够修改胶囊渗透性以限制免疫细胞、抗体和细胞因子进入胶囊。通常，如示例所示，形成水凝胶胶囊的已知方法可以生产胶囊，该胶囊的渗透性限制免疫细胞、抗体和细胞因子进入胶囊。由于不同的细胞类型具有不同的代谢要求，可以基于包封在水凝胶中的细胞类型优化膜的渗透性。胶囊的直径是影响对细胞胶囊的免疫应答以及穿过胶囊膜的质量传输的重要因素。
在体内驱动纤维化的参数的增长的识别已经应用于修饰的藻酸盐的性能的分析。修饰的藻酸盐胶囊的腹膜内(IP)植入显示，当使用对未修饰的藻酸盐定义的条件交联时，修饰的藻酸盐可导致异常形状的胶囊。这些异常形状的胶囊能够使植入IP的修饰的藻酸盐胶囊的实施和解释复杂化。为了改进胶囊形态，开发了与修饰的藻酸盐微粒一起使用的制剂方法，其中将修饰的藻酸盐与少量高分子量藻酸盐混合。由该混合物制备的颗粒产生具有改良的形态和稳定性的颗粒。
未修饰的藻酸盐的重均分子量通常为约50,000道尔顿至约500,000道尔顿；然而，也可以使用未修饰的藻酸盐的分子量。在一些实施例中，重均分子量为自约50,000至约250,000道尔顿，更优选地为自约50,000至约150,000道尔顿。在一些实施例中，重均分子量为约100,000道尔顿。
在其它实施例中，一个或多个另外的形成水凝胶的聚合物与未修饰的藻酸盐组合使用或代替未修饰的藻酸盐。这种聚合物是本领域已知的。示例包括但不限于PEG、壳聚糖、葡聚糖、透明质酸、丝、纤维蛋白、聚(乙烯醇)和聚(甲基丙烯酸羟乙酯)。
例如，将由用钡和甘露醇配制的修饰的藻酸盐263_A12微粒制备的颗粒与由与少量未修饰的SLG100藻酸盐(16重量％)混合的263_A12制备的颗粒进行比较。由修饰的藻酸盐和未修饰的藻酸盐的混合物制备的颗粒产生在通过扫描电子显微镜(SEM)评价的形状和尺寸方面的更均匀的微粒群。使用与SLG100混合的修饰的藻酸盐在几个时间点进行定量荧光分析显示，与对照藻酸盐相比，几个重新配制的修饰的藻酸盐在第7天显示较少的炎症反应。使用大胶囊(1.5mm直径)的初始实验在免疫活性C57BL6小鼠的IP空间中在2周后是相当干净的胶囊。随后的实验(实施9)显示，包封的人类细胞可以在没有免疫抑制的免疫能力的糖尿病动物中实现葡萄糖反应性的长期血糖校正(超过170天)。使用如公开的修饰的藻酸盐包封人类细胞完成该结果。所得的胶囊缓解对人类细胞植入物的免疫应答，有效地延迟导致植入组织坏死的纤维化沉积。尽管这些人类细胞在免疫活性的啮齿动物受体中表现出异种刺激，但该制剂提供了足够的免疫保护以能够进行长期血糖校正。
因为所公开的修饰的藻酸盐介导减少的纤维化，由其它材料制成但用修饰的藻酸盐包覆或包封的胶囊是用于实现减少的纤维化的胶囊的有用形式。这样，胶囊可以包括由各种材料制成的胶囊和颗粒，然后将其包覆或包封在修饰的藻酸盐或包含修饰的藻酸盐的藻酸盐中。
所公开的组合物可以制成人造器官，诸如含有包封的胰岛细胞的人工胰腺。在这些实施例的一些中，细胞被包封在单个水凝胶隔室中。在其它实施例中，组合物含有分散或包封在生物相容性结构中的多个包封的细胞。
C.制备修饰的藻酸盐聚合物
修饰的藻酸盐可以通过任何可用的藻酸盐聚合物的共价修饰来制备。可以使用本领域已知的多种合成过程将共价修饰的单体引入藻酸盐聚合物中。在一些实施例中，甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单体通过其羧酸部分的酯化和/或酰胺化共价修饰。在替代实施例中，甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单体通过磷酸化或缩醛形成共价修饰。在共价修饰期间反应物的化学计量变化可用以改变掺入修饰的藻酸盐中的共价修饰的单体的量。
除了下面讨论的反应之外，用于甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单体的共价修饰的替代性合成方法是本领域已知的。(参见，例如March，《高等有机化学》(Advanced OrganicChemistry)，第5版，2001，威利国际科学出版(Wiley-Interscience Publication)，纽约(New York)。
1.通过甘露糖醛酸和古洛糖酸单体的羧酸酯部分的修饰
Figure BDA0002981759510000641
方案1.代表性反应条件：i.HO-R1、2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)、N-甲基吗啉(NMM)；ii.HNR1R7、CDMT、NMM。
甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单体含有可以用作共价修饰点的羧酸部分。在优选的实施例中，存在于一个或多个甘露糖醛酸和/或古洛糖醛酸残基(1)上的羧酸部分如方案1所示进行反应。
甘露糖醛酸和/或古洛糖醛酸残基(A)可以通过本领域已知的多种方法容易地酯化，形成共价修饰的单体B。例如，使用Steglich酯化，甘露糖醛酸和古洛糖醛酸残基(A)可以在碳二亚胺(例如N，N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC))和二甲基氨基吡啶(DMAP)的存在下通过与任何合适的醇(HO-R1)反应而酯化。在优选的方法中，甘露糖醛酸和古洛糖醛酸残基(A)在2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)和N-甲基吗啉(NMM)的存在下通过与大摩尔过量的醇(HO-R1)反应而酯化。参见，例如，Garrett，C.E.等人，《四面体通讯》(Tetrahedron Lett.)2002；43(23):4161-4164。在酯化中用作试剂的优选的醇包括下面所示的那些。
Figure BDA0002981759510000651
甘露糖醛酸和古洛糖醛酸残基(A)也可以通过酰胺化共价修饰，形成修饰的单体C。例如，甘露糖醛酸和古洛糖醛酸残基(A)可以在碳二亚胺和DMAP的存在下通过与任何合适的胺(R1-NH2)反应而酰胺化。在优选的方法中，甘露糖醛酸和古洛糖醛酸残基(A)在CDMT和NMM的存在下通过与化学计量的合适的胺(R1-NH2)反应而酰胺化。在酰胺化反应中用作试剂的优选的胺包括下面所示的那些。
Figure BDA0002981759510000652
2.通过点击化学修饰甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单体
在一些实施例中，甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单体共价修饰以引入可以通过点击化学进一步反应的官能团。
在优选的实施例中，酰胺化和/或酯化用于引入可以使用1,3-偶极环加成反应(即Huisgen环加成反应)进一步反应的官能团。在1,3-偶极环加成反应中，含有叠氮部分的第一分子与含有末端或内部炔的第二分子反应。如下所示，叠氮化物和炔基经历分子内1,3-偶极环加成反应，将两个分子偶合在一起并且形成1,2,3-三唑环。
Figure BDA0002981759510000661
1,3-偶极环加成反应的区域化学可以通过加入铜(I)催化剂(通过用抗坏血酸钠还原CuSO4原位形成)或钌催化剂(诸如Cp*RuCl(PPh3)2、Cp*Ru(COD)或Cp*[RuCl4])控制。例如，使用铜催化剂，叠氮化物和末端炔可以反应以仅提供1,2,3-三唑的1,4-区域异构体。类似地，在合适的钌催化剂存在下，叠氮化物可以与内部炔或末端炔反应以仅形成1,2,3-三唑的1,5-区域异构体。
在一些实施例中，酰胺化和/或酯化用于形成含有炔部分的共价修饰的单体。在这些实施例中，存在于共价修饰的单体上的炔部分可以进一步与含有叠氮官能团的第二分子反应。在反应时，叠氮化物和炔基经历分子内1,3-偶极环加成反应，形成1,2,3-三唑环，将第二分子偶合到共价修饰的单体上。
含炔的酰胺化/酯化反应物的示例包括Xa-Rz-C≡C-Rx；其中Xa是-OH或-NH2；其中Rz是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、被杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷基硫基、被取代的烷基硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽和多肽基团；或与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；以及其中Rx是氢、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、被杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷基硫基、被取代的烷基硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽和多肽基团。
在一些实施例中，
(1)Rz是氢，
(A)
Figure BDA0002981759510000671
其中y是1至11的整数；其中Re独立地为烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烯基、炔基、被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷基硫基、被取代的烷基硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽和多肽基团；或与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；其中Re的一个例子是或含有Xa；其中R18、R19、R20、R21、R22及R23独立地为C、O、N或S，其中介于相邻的R18与R23之间的键根据化合价是双键或单键，以及其中R18至R23根据化合价键合零个、一个或两个氢；以及其中R24独立地为-(CR25R25)p-或-(CR25R25)p-Xb-(CR25R25)q-，其中p和q独立地为0至5的整数，其中Xb为不存在、-O-、-S-、-SO2-或NR4，其中每一个R25独立地为不存在、氢、＝O、＝S、-OH、-SH、-NR4，其中R4为烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷基硫基、被取代的烷基硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；
(B)-(CH2)s-R26，其中is是0至20的整数；其中R26为-Xa、-O-R27、-S-R27、-(CH2)r-R27、-CO-R27或-CHR28R29，其中r是0至19的整数；其中R27为-Xa、-(CH2)u-R30，其中u是0至18的整数；其中R28为-(CH2)t-R30，R29为-(CH2)v-R30，以及t和v为0至18的整数，其中t和v之和为0至18；其中R30为-Xa、甲基、-OH、-SH或-COOH；或者
(C)
Figure BDA0002981759510000681
其中R31、R32、R33、R34、R35和R36独立地为氢、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、被杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；以及其中R31、R32、R33、R34、R35或R36的一个例子是Xa或含有Xa；
(2)Rx是氢，
(A)
Figure BDA0002981759510000691
其中y是0至11的整数；其中Re独立地为烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烯基、炔基、被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷基硫基、被取代的烷基硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽和多肽基团；或与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；其中R18、R19、R20、R21、R22和R23独立地为C、O、N或S，其中介于相邻的R18与R23之间的键根据化合价是双键或单键，以及其中R18至R23根据化合价键合零个、一个或两个氢；以及其中R24独立地为-(CR25R25)p-或-(CR25R25)p-Xb-(CR25R25)q-，其中p和q独立地为0至5的整数，其中Xb为不存在、-O-、-S-、-SO2-或NR4，其中每一个R25独立地为不存在、氢、＝O、＝S、-OH、-SH、-NR4，其中R4为烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷基硫基、被取代的烷基硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；
(B)-(CH2)s-R26，其中s是0至20的整数；其中R26为-O-R27、-S-R27、-(CH2)r-R27、-CO-R27或-CHR28R29，其中r是0至19的整数；其中R27为-(CH2)u-R30，其中u是0至18的整数；其中R28为-(CH2)t-R30，R29为-(CH2)v-R30，以及t和v是0至18的整数，其中t和v之和为0至18；其中R30是甲基、-OH、-SH或-COOH；或者
(C)
Figure BDA0002981759510000701
其中R31、R32、R33、R34、R35，和R36独立地为氢、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、被杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；并且
(3)其中Rz和Rx都不是氢。
含叠氮化物的第二分子的实例包括Rw-N3，其中Rw是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、被杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，Rw是
(A)
Figure BDA0002981759510000711
其中k独立地为1至30的整数；其中z是0至4的整数；其中Xd为O或S；其中Ra独立地为烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烯基、炔基、被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；以及其中R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17独立地为氢、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；以及
(B)
Figure BDA0002981759510000721
其中R31、R32、R33、R34、R35和R36独立地为氢、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、被杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在替代实施例中，酰胺化和/或酯化用于形成含有叠氮部分的共价修饰的单体。在这些实施例中，存在于共价修饰的单体上的叠氮部分可以进一步与含有末端炔或内部炔的第二分子反应。在反应时，叠氮化物和炔基经历分子内1,3-偶极环加成反应，形成1,2,3-三唑环，将第二分子偶合到共价修饰的单体上。
含叠氮化物的酰胺化/酯化反应物的实例包括Xc-Rw-N3，其中Xc是-OH或-NH2，以及Rw是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、被杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，Xc不是-NH2，以及Rw不是-CH2-Ar-或-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-。
在一些实施例中，Rw是
(A)
Figure BDA0002981759510000731
其中k独立地为1至30的整数；其中z是0至4的整数；其中Xd是O或S；其中Ra独立地为烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烯基、炔基、被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；其中Ra的一个例子是Xc或含有Xc；其中R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17独立地为氢、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；以及其R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16，或R17是Xc或含有Xc；以及
(B)
Figure BDA0002981759510000741
其中R31、R32、R33、R34、R35，和R36独立地为氢、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、被杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；以及其中R31、R32、R33、R34、R35或R36的一个例子是Xc或含有Xc。
含炔的第二分子的实例包括Rz-C≡C-Rx，其中Rz和Rx独立地为氢、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、被杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，Rz和Rx独立地为氢，
(A)
Figure BDA0002981759510000751
其中y是0至11的整数；其中Re独立地为烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烯基、炔基、被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；其中R18、R19、R20、R21、R22及R23独立地为C、O、N或S，其中介于相邻的R18与R23之间的键根据化合价为双键或单键，以及其中R18至R23根据化合价键合零个、一个或两个氢；以及其中R24独立地为-(CR25R25)p-或-(CR25R25)p-Xb-(CR25R25)q-，其中p和q独立地为0至5的整数，其中Xb为不存在、-O-、-S-、-SO2-或NR4，其中每一个R25独立地为不存在、氢、＝O、＝S、-OH、SH、-NR4，其中R4为烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷基硫基、被取代的烷基硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；
(B)-(CH2)s-R26，其中s是0至20的整数；其中R26为-O-R27、-S-R27、-(CH2)r-R27、-CO-R27或-CHR28R29，其中r是0至19的整数；其中R27为-(CH2)u-R30，其中u是0至18的整数；其中R28为-(CH2)t-R30，R29为-(CH2)v-R30，以及t和v是0至18的整数，其中t和v之和为0至18；其中R30是甲基、-OH、-SH或-COOH；或者
(C)
Figure BDA0002981759510000761
其中R31、R32、R33，R34、R35和R36独立地为氢、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、被杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；并且
其中Rz和Rx都不是氢。
在一些实施例中，叠氮部分可以添加到含有离去基团的共价修饰的单体中，离去基团诸如I、Br、OTs、OMs。在一些实施例中，酰胺化和/或酯化用于形成含有离去基团的共价修饰的单体。含离去基团的酰胺化/酯化反应物的实例包括Xc-Rw-L，其中Xc是-OH或-NH2，L是离去基团，以及Rw是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、被杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团。
在一些实施例中，Xc不是-NH2，以及Rw不是-CH2-Ar-或-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-。
在一些实施例中，Rw是
(A)
Figure BDA0002981759510000771
其中k独立地为1至30的整数；其中z是0至4的整数；其中Xd是O或S；其中Ra独立地为烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烯基、炔基、被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；或与其所连接的碳原子一起形成3元至8元未被取代的或被取代的碳环或杂环；其中Ra的一个例子是Xc或含有Xc；其中R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17独立地为氢、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；以及其R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16，或R17是Xc或含有Xc；以及
(B)
Figure BDA0002981759510000781
其中R31、R32、R33、R34、R35，和R36独立地为氢、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、苯基、被取代的苯基、芳基、被取代的芳基、被杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基被取代的烷氧基、苯氧基、被取代的苯氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、苯硫基、被取代的苯硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团；以及其中R31、R32、R33、R34、R35或R36的一个例子是Xc或含有Xc。
在一些实施例中，Xc不是-NH2以及Rw不是-CH2-Ar-或-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-。
在优选的实施例中，酰胺化用于形成含有叠氮部分的共价修饰的单体。随后，存在于共价修饰的单体上的叠氮部分与含有末端炔或内部炔的第二分子反应，形成1,2,3-三唑环，并且将第二分子偶合到共价修饰的单体上。
如方案2所示，可以使用不同的策略来制备含有叠氮部分的共价修饰的单体。
方案2.
Figure BDA0002981759510000791
例如，甘露糖醛酸和古洛糖醛酸残基(A)可以在碳二亚胺和DMAP存在下通过与被叠氮部分取代的胺(例如，11-叠氮基-3,6,9-三氧癸烷-1-胺)反应而酰胺化，在单一合成步骤中形成叠氮化物官能化修饰的单体F。或者，甘露糖醛酸和古洛糖醛酸残基(A)可以通过与被易于转化为叠氮化物的任何部分取代的胺反应而酰胺化。例如，甘露糖醛酸和古洛糖醛酸残基可以在碳二亚胺和DMAP的存在下通过与4-碘苄胺反应而酰胺化，形成碘官能化的单体D。然后能够容易地将碘部分转化为叠氮化物，例如通过用叠氮化钠处理。
随后，叠氮化物官能化的单体可以与含有炔官能团的分子反应。例如，叠氮官能化的单体F和E可以在铜(I)催化剂(通过用抗坏血酸钠还原CuSO4原位形成)的存在下与含有末端炔官能团的分子反应，形成共价修饰的单体G和H。
在1,3-偶极环加成反应中用作试剂的优选的炔包括下面所示的那些。
Figure BDA0002981759510000801
3.通过甘露糖醛酸和古洛糖酸单体的羟基部分的修饰
甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单体含有可以用作共价修饰点的羟基部分。在优选的实施例中，甘露糖醛酸和古洛糖醛酸残基(1)的羟基部分如方案3所示进行反应。
方案3.
Figure BDA0002981759510000811
代表性反应条件：i.I-PO(OR5)2、吡啶；ii.R2-CO-R3、H+。
甘露糖醛酸和古洛糖醛酸残基(A)可以通过本领域已知的多种方法磷酸化，形成共价修饰的单体I。例如，甘露糖醛酸和古洛糖醛酸残基可以通过在吡啶存在下与I-PO(OR5)2反应而磷酸化(Stowell，J.K.和Widlanski，T.S.《四面体通讯》(Tetrahedron Lett.)1995；36(11):1825-1826)。
甘露糖醛酸和古洛糖醛酸残基(A)也可以使用本领域已知的方法转化为环状缩醛。例如，可以通过甘露糖醛酸和古洛糖酸残基与任何合适的酮(R2-CO-R3)在酸性条件下反应形成环状缩醛。
4.制备多重修饰的藻酸盐聚合物的方法
在单一修饰的藻酸盐聚合物的情况下，仅进行单个反应或一系列反应，引入一种类型的共价修饰的单体。
在多重修饰的藻酸盐聚合物的情况下，进行一个或多个反应以将多种不同类型的共价修饰的单体引入修饰的藻酸盐聚合物中。在一些实施例中，多重修饰的藻酸盐聚合物使用多个顺序合成反应制备。例如，下面所示的多重修饰的藻酸盐聚合物可以使用两个顺序反应制备：(1)在CDMT和NMM的存在下，用甲胺使甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单体酰胺化；和(2)在CDMT和NMM的存在下，用乙醇酯化甘露糖醛酸和古洛糖醛酸残基。
Figure BDA0002981759510000821
在替代的实施例中，多重修饰的藻酸盐聚合物可以使用“一锅”合成制备。在这些实施例中，在单一合成步骤中将多种共价修饰的单体引入藻酸盐聚合物中。例如，上面所示的多重修饰的藻酸盐聚合物可以任选地在单一合成步骤中通过在CDMT和NMM的存在下使藻酸盐聚合物与甲胺和乙醇反应制备。
修饰的藻酸盐的任何类型或形式、藻酸盐修饰的任何类型或形式以及用于修饰藻酸盐的试剂的任何类型或形式可以独立地和以任何组合的方式特定地被包括或不包括在公开的修饰的藻酸盐、藻酸盐修饰、藻酸盐修饰的试剂、方法及试剂盒的任何项中，以及在任何上下文、组合或用途中。例如，诸如上面所述的那些和在示例中的酯化试剂、酰胺化试剂、点击试剂、含炔试剂、含叠氮化物试剂、磷酸化试剂和酮试剂的任何类型或形式可以独立地和以任何组合的方式特定地被包括或被不包括在使用中以修饰藻酸盐，并且包括或基于这些试剂的任何藻酸盐修饰物和任何修饰的藻酸盐可以独立地和以任何组合的方式特定地被包括或不包括在公开的修饰的藻酸盐、藻酸盐修饰物、用于藻酸盐修饰的试剂、方法和试剂盒的任何项中，以及在任何上下文中、组合或使用中。
作为另一个示例，表2中所述的任何试剂可以独立地和以任何组合的方式特定地被包括或不包括在使用中以修饰藻酸盐，并且包括或基于表2中所述的试剂的任何藻酸盐修饰物和任何修饰的藻酸盐可以独立地和以任何组合的方式特定地被包括或不包括在公开的修饰的藻酸盐、藻酸盐修饰物、用于藻酸盐修饰的试剂、方法和试剂盒的任何项中，以及在任何上下文中、组合或使用中。例如，表2中所述的所有试剂以组合的方式但不包括试剂Y3可以特定地被包括或不包括在使用中以修饰藻酸盐，并且包括或基于表2所述的所有试剂以组合的方式但不包括试剂Y3的任何藻酸盐修饰物和任何修饰的藻酸盐可以特定被包括或不包括在公开的修饰藻酸盐、藻酸盐修饰、用于藻酸盐修饰的试剂、方法和试剂盒的任何项中，以及在任何上下文、组合或使用中。
作为另一个示例，美国专利申请号20120308650中描述的任何修饰的藻酸盐、藻酸盐修饰物或用于藻酸盐修饰的试剂可以独立地和以任何组合的方式特定地被包括或不包括。美国专利申请公开号20120308650的全部内容以引用的方式并入本文，并且特别是修饰的藻酸盐、藻酸盐修饰物和用于藻酸盐修饰的试剂的描述。本文所述的任何R基团的任何R基团取代基可以独立地和以任何组合的方式作为各自R基团的选项或选择特定地被包括或不包括。
D.藻酸盐的纯化
商业藻酸盐通常从藻类获得。来自海藻的粗藻酸盐含有许多污染物，包括多酚、蛋白质和内毒素(de Vos，P,等人《生物材料》(Biomaterials)2006；27:5603-5617)。已经显示这些杂质的存在限制植入的藻酸盐的生物相容性。
为了优化本文所述的化学修饰的藻酸盐的生物相容性，开发了严格的纯化方法以消除潜在的刺激性杂质。在优选的实施例中，超纯低粘度藻酸盐(UPVLVG，FMC生物聚合物)用作共价修饰的底物。在每次共价修饰后，修饰的藻酸盐通过修饰的二氧化硅柱，例如氰基修饰的二氧化硅柱过滤，目的是捕获大量有机杂质。最后，在藻酸盐聚合物的共价修饰完成后，修饰的藻酸盐被透析以除去任何残留的小分子或低分子量杂质。在优选的方法中，修饰的藻酸盐针对10,000分子量截留(MWCO)膜透析以除去任何残留的小分子杂质。
多个修饰的藻酸盐可以通过1H NMR分析测定。在这种分析中，收集修饰的藻酸盐聚合物的1H NMR光谱，并且将对应于修饰的藻酸盐聚合物的峰和任何杂质的峰进行整合，以确定样品中每个种类的相对量。在一些实施例中，由1HnmR测定的修饰的藻酸盐聚合物的纯度大于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在优选的实施例中，由1H NMR测定的修饰的藻酸盐聚合物的纯度大于90％，更优选地大于95％。
III.生物材料
在所公开的藻酸盐中用于包封的生物材料可以是任何生物物质。例如，生物材料可以是组织、细胞、生物小分子或生物大分子。生物大分子的示例包括核苷酸、氨基酸、辅因子和激素。生物大分子的示例包括核酸、多肽、蛋白质和多糖。蛋白质的示例包括酶、受体、分泌蛋白、结构蛋白、信号蛋白、激素和配体。任何类别、类型、形式或具体生物材料可以与任何其它类别、类型、形式或具体生物材料一起使用。
A.细胞
选择用于在所公开的组合物中封装的细胞类型取决于所需的治疗效果。细胞可来自患者(自体细胞)、来自相同物种的另一供体(同种异体细胞)或来自另一物种(异源细胞)。异源细胞是容易获得的，但是排斥的可能性和病毒可能传播给患者的危险限制了它们的临床应用。任何这些类型的细胞可以来自天然来源、干细胞、衍生细胞或遗传工程改造的细胞。
在一些实施例中，该细胞分泌了治疗有效的物质，诸如蛋白质或核酸。在一些实施例中，该细胞产生了代谢产物。在一些实施例中，该细胞代谢了毒性物质。在一些实施例中，该细胞形成了结构组织，诸如皮肤、骨、软骨、血管或肌肉。在一些实施例中，该细胞是天然的细胞，诸如天然分泌胰岛素的胰岛细胞或天然解毒的肝细胞。在一些实施例中，该细胞是经基因工程化以表达异源蛋白质或核酸和/或过表达内源蛋白质或核酸的细胞。
在所公开的组合物中，用于囊化的细胞类型包括天然来源的细胞，诸如来自异种组织的细胞、来自尸体的细胞和初生细胞；干细胞，诸如胚胎干细胞、间充质干细胞以及诱导的多能干细胞；衍生细胞，诸如干细胞衍生的细胞、细胞系衍生的细胞、重编程的细胞、重编程的干细胞和重编程干细胞衍生的干细胞；和经基因工程化的细胞，诸如经基因过程化以表达蛋白质或核酸的细胞、经基因工程化以产生代谢产物的细胞和经基因工程化以代谢毒性物质的细胞。
在所公开的组合物中，用于囊化的细胞类型包括肝细胞、胰岛细胞、甲状旁腺细胞、内分泌细胞、肠源性细胞、肾衍生细胞和主要作用为合成和分泌或代谢材料的其它细胞。优选的细胞类型为胰岛细胞或其它产生胰岛素的细胞。产生激素的细胞可以产生一个或多个激素，诸如胰岛素、甲状旁腺激素、抗利尿激素、催产素、生长激素、催乳素、促甲状腺激素、促肾上腺皮质激素、促卵泡激素、促黄体激素、甲状腺素、降钙素、醛固酮、皮质醇、肾上腺素、胰高糖素、雌激素、黄体酮和睾酮。根据所公开的方法，经基因工程化的细胞也适合囊化。在一些实施例中，该细胞经工程化以产生一个或多个激素，诸如胰岛素、甲状旁腺激素、抗利尿激素、催产素、生长激素、催乳素、促甲状腺激素、促肾上腺皮质激素、促卵泡激素、促黄体激素、甲状腺素、降钙素、醛固酮、皮质醇、肾上腺素、胰高糖素、雌激素、黄体酮和睾酮。在一些实施例中，该细胞经工程化以分泌凝血因子(例如用于治疗血友病)或以分泌生长激素。在一些实施例中，该细胞包含在天然或生物工程的组织中。例如，在一些实施例中，用于囊化的细胞为生物人工肾小球。在一些实施例中，该细胞适合移植进用于治疗神经退行性疾病的中枢神经系统。
可以直接从供体中、从供体细胞的细胞培养中，或建立的细胞培养系中获得细胞。在优选的实施例中，直接从供体中获得细胞，冲洗并与聚合材料组合直接植入。使用组织培养领域技术人员所熟知的技术对该细胞进行培养。
使用标准技术，诸如组织学和荧光显微镜检查，可以对细胞活性进行评估。使用这些技术和功能试验的组合，可以确定植入细胞的功能。例如，在肝细胞的情况中，通过将套管置于受者的胆总管中，可以进行体内肝功能的研究。然后，可以增量地收集胆汁。通过高压液相色谱法寻找未衍生的四吡咯，或与P-葡萄糖醛酸酶处理的重氮化重氮二吡咯邻氨基苯甲酸甲酯反应转化为重氮二吡咯后的薄层色谱法，可以分析胆色素。共轭胆色素碱性醇解后，通过薄层色谱法，也可以确定双结合和单结合的胆红素。通常，随着功能化移植肝细胞数量的增加，结合胆红素的水平将会增加。也可以在血样(诸如白蛋白的产生)上完成简单的肝功能检查。使用本领域技术人员所熟知的技术，根据需要确定植入后细胞功能程度的需要，可以实施类似器官的功能研究。例如，可以植入胰岛细胞和其它产生胰岛素的细胞，通过适宜的胰岛素分泌以获得葡萄糖调节。也可以植入其它内分泌组织和细胞。
基于个体的要求，根据细胞的必要数量，确定细胞待植入的一个或多个位点。对于细胞更换或补充的器官或腺功能(例如，肝细胞或胰岛细胞)，可以将混合物注射进肠系膜、皮下组织、腹膜后腔、腹膜前空间和肌内空间。
在所公开的组合物(胶囊和微胶囊)中囊化细胞的数量和密度，将依赖于细胞、水凝胶和植入位点的选择而变化。在一些实施例中，单个细胞以0.1x106至4x106个细胞/ml，优选的0.5x106至2x106个细胞/ml的浓度存在于水凝胶。在其它实施例中，该细胞作为细胞集合体而存在。例如，对于150μm直径的每个集合体，胰岛细胞集合体(或整个胰岛)优选地包含约1500-2000个细胞，其被定义为一个胰岛当量(IE)。因此，在一些实施例中，胰岛细胞以100-10000IE/ml，优选地200-3000IE/ml，更优选地500-1500IE/ml的浓度存在。
1.胰岛细胞和其它产生胰岛素的细胞
在优选的实施例中，所公开的组合物包含胰岛细胞或其它产生胰岛素的细胞。分离胰岛细胞的方法是本领域中众所周知的。Field等人《移植》(Transplantation)61:1554(1996)；Linetsky等人，《糖尿病》(Diabetes)46:1120(1997)。新鲜的胰岛组织可以通过切碎、撕裂、粉碎和/或胶原酶消化进行分割。然后通过洗涤、过滤、离心或挑选操作，将胰岛从污染的细胞和材料中分离出来。分离和纯化胰岛细胞的方法和装置如Langley的美国专利号5,447,863、Scharp等的美国专利号5,322,790、Langley的美国专利号5,273,904及Scharp等的美国专利号4,868,121所述。在微囊化之前，可以使用本领域已知的培养胰岛细胞的任何合适方法，任选地培养分离的胰岛细胞。参见例如，Brothers的美国专利号5,821,121。可以在有助于消除抗原成分的条件下于培养基中培养分离的细胞。产生胰岛的细胞也可以来源于干细胞和细胞系，并且可以是经基因工程化以产生胰岛素的细胞。
2.经基因工程化的细胞
在一些实施例中，所公开的组合物包含经基因工程化以产生蛋白质或核酸(如治疗性蛋白质或核酸)的细胞。在这些实施例中，该细胞可以是例如干细胞(如多能干细胞)、祖细胞(如多能或寡能祖细胞)，或终末分化细胞(如单能细胞)。所公开的任何细胞类型都可以经基因工程化。例如，该细胞可以经工程化以包含例如编码多核苷酸(诸如miRNA或RNAi)的核酸或编码蛋白质的多核苷酸。例如，该核酸可以整合到细胞基因组DNA中以稳定的表达，或例如可以整合到表达载体(如质粒DNA)中。可以基于待治疗的疾病(或待实现的作用)和移植或植入的位点选择多核苷酸或蛋白质。在一些实施例中，该多核苷酸或蛋白质是抗肿瘤的。在另一些实施例中，该多核苷酸或蛋白质是激素、生长因子或酶。
B.激素
将包括在所公开胶囊中的激素，或最优选地，由所公开胶囊囊化的细胞产生的激素可以是任何目标激素。
内分泌激素的示例包括抗利尿激素(ADH)，其由脑垂体后叶产生，靶向肾，并影响水平衡和血压；催产素，其由脑垂体后叶产生，靶向子宫、乳房，并刺激子宫收缩和乳汁分泌；生长激素(GH)，其由脑垂体前叶产生，靶向体细胞、骨、肌肉，并影响生长和发育；催乳素，其由脑垂体前叶产生，靶向乳房，并维持乳汁分泌；促甲状腺激素(TSH)，其由脑垂体前叶产生，靶向甲状腺，并调节甲状腺激素；促肾上腺皮质激素(ACTH)，其由脑垂体前叶产生，靶向肾上腺皮质，并调节肾上腺皮质激素；促卵泡激素(FSH)，其由脑垂体前叶产生，靶向卵巢/睾丸，并刺激卵子和精子的产生；促黄体激素(LH)，其由脑垂体前叶产生，靶向卵巢/睾丸，并刺激排卵和性激素的释放；甲状腺素，其由甲状腺产生，靶向体细胞，并调节新陈代谢；降钙素，其由甲状腺产生，靶向肾上腺皮质，并降低血钙；甲状旁腺激素，其由甲状旁腺产生，靶向骨基质，并提高血钙；醛固酮，其由肾上腺皮质产生，靶向肾，并调节水平衡；皮质醇，其由肾上腺皮质产生，靶向体细胞，并削弱免疫系统和应激应答；肾上腺素，其由肾上腺髓质产生，靶向心脏、肺、肝和体细胞，并影响初级“对抗或逃逸”应答；胰高糖素，其由胰腺产生，靶向肝体，并升高血糖水平；胰岛素，其由胰腺产生，靶向体细胞，并降低血糖水平；雌激素，其由卵巢产生，靶向生殖系统，并影响的青春期、月经和生殖腺的发育；黄体酮，其由卵巢产生，靶向生殖系统，并影响的青春期、月经周期和生殖腺的发育；以及睾酮，其由肾上腺、睾丸产生，靶向生殖系统，并影响的青春期、生殖腺的发育和精子。
IV.表征修饰的藻酸盐聚合物的试验
藻酸盐聚合物的共价修饰改变了该藻酸盐的理化性质和生物相容性。
在一些实施例中，水凝胶形成试验用于量化由藻酸盐或修饰的藻酸盐形成的水溶胶的稳定性。在优选的实施例中，水溶胶形成试验用作鉴定修饰的藻酸盐的筛检工具，该修饰的藻酸盐能够形成稳定的水溶胶。
体内方法对于修饰的藻酸盐聚合物的表征可以是有用的。在一些实施例中，本文所述的高通量体内生物相容性试验用于鉴定修饰的藻酸盐，该修饰的藻酸诱导了比未修饰的藻酸盐更低的异物应答。
本文进一步描述的是量化修饰的藻酸盐生物相容性的体内方法。
该试验可以用于评估特定施用的修饰的和未修饰的藻酸盐的适用性和生物相容性。
A.高通量水溶胶的形成试验
该藻酸盐的共价修饰影响了该藻酸盐的物理性质，其包括藻酸盐形成适合细胞和生物分子囊化的水溶胶的能力。
该凝胶形成试验利用水溶胶的能力：捕获荧光化合物，并基于水溶胶稳定性，经冲洗差异保留荧光基团。在这一试验中，于包含可溶性荧光基团的水溶液中，通过离子交联的候选修饰的藻酸盐，形成了水溶胶。在这一试验中，可以使用各种荧光基团。在优选的实施例中，该荧光基团具有480nm和750nm之间的发射最大值。在优选的实施例中，该荧光基团是具有550nm和600nm之间发射最大值的罗丹明染料。
交联后，用水重复冲洗该水溶胶。没有有效交联的候选修饰的藻酸盐与任何存在的荧光基团一起被冲洗掉。有效交联的修饰的藻酸盐在冲洗期间保留了荧光基团。因此，通过测量冲洗后修饰的藻酸盐水溶胶的荧光，可以容易地鉴定能够形成稳定水溶胶的修饰的藻酸盐。
在一些实施例中，用于修饰的藻酸盐的测定的相对荧光强度值与用于阴性对照和未修饰藻酸盐的测定的荧光水平相比较，以确定该修饰的藻酸盐是否能形成水溶胶。在可替代的实施例中，本文中的水凝胶形成试验用于量化由藻酸盐或修饰的藻酸盐形成的水溶胶的稳定性。在这些实施例中，用于修饰的藻酸盐的测定的荧光强度用于表示藻酸盐形成的水溶胶的稳定性。
在优选的实施例中，该修饰的藻酸盐聚合物形成了水溶胶，从而使用本文所描述的高通量水溶胶形成试验测定的荧光基团强度大于10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000或55000。在优选的实施例中，修饰的藻酸盐聚合物形成水凝胶，使得使用本文所述的高通量水凝胶形成测定法测量的荧光强度大于15,000。在优选的实施例中，该修饰的藻酸盐聚合物形成了水溶胶，从而使用本文所描述的高通量水溶胶形成试验测定的荧光基团强度在15000和55000之间，更优选地在25000和55000之间。
B.高通量体内生物相容性试验
当前生物相容性分析方法很慢并且需要组织学分析。本文所描述的是一种高通量体内生物相容性试验，对评估藻酸盐聚合物的相对生物相容性是有用的。
在本文所描述的高通量体内生物相容性试验中，修饰的藻酸盐聚合物和未修饰的藻酸盐对照以阵列形式注射在动物实验受体的背上，以方便高通量的筛查。在优选的实施例中，动物实验受体是小鼠。注射后，使用体内荧光成像，将修饰的藻酸盐注射点的组织蛋白酶活性与未修饰的藻酸盐注射点的组织蛋白酶活性相比较，以比较对植入藻酸盐的异物应答。在优选的实施例中，使用体内荧光成像，在注射后第14天，评估该材料的生物相容性。
在优选的实施例中，本文所描述的高通量体内生物相容性试验用于鉴定修饰的藻酸盐，该修饰的藻酸盐诱导了比未修饰的藻酸盐更低的异物应答。将在修饰的藻酸盐植入位点测量的荧光强度与在未修饰的藻酸盐植入位点测量的荧光强度相比较。在优选的实施例中，修饰的藻酸盐，在植入位点上显示有比在未修饰的藻酸盐植入位点上测量的荧光强度更小的荧光强度，其被定性表征为生物相容的。反之，修饰的藻酸盐在植入位点上显示有比在未修饰的藻酸盐植入位点上测量的荧光强度更大，其被定性表征为生物不相容的。
以上所描述的高通量体内生物相容性试验也可以用于表征修饰的藻酸盐在体内形成机械上稳定的水溶胶的能力。在优选的实施例中，在注射后28天，评估了该藻酸盐凝胶的体内稳定性。
在优选的实施例中，第28天后，在注射位点留下的修饰的藻酸盐凝胶被表征为能够在体内形成机械上稳定的水溶胶。反之，第28天后，在注射位点上不存在的修饰的藻酸盐凝胶被视为不能在体内形成机械上稳定的水溶胶。
C.修饰的藻酸盐对量化生物相容性的体内筛查
本文进一步描述的是量化修饰的藻酸盐生物相容性的体内方法。
在这一方法中，将修饰的藻酸盐聚合物注射在动物实验受试者的背上。在优选的实施例中，动物实验受体是小鼠。注射后，使用体内荧光试验，测量了在修饰的藻酸盐注射点上组织蛋白酶的活性。在优选的实施例中，使用体内荧光成像，在注射后7天，实施了该荧光试验。在优选的实施例中，测量荧光强度并标准化为使用未修饰的藻酸盐测量的荧光应答，从而量化该修饰的藻酸盐的生物相容性。
在优选的实施例中，该修饰的藻酸盐聚合物包括比未修饰的藻酸盐更低的异物应答(即标准化为未修饰的藻酸盐的荧光应答小于100％)。在一些实施例中，该修饰的藻酸盐聚合物是生物相容的，从而使用本文所描述的体内生物相容性试验测量的，被标准化为未修饰的藻酸盐的荧光应答为小于95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％或40％。在优选的实施例中，该修饰的藻酸盐聚合物是生物相容的，从而使用本文所描述的体内生物相容性试验测量的，被标准化为未修饰的藻酸盐的荧光应答为小于75％，更优选地小于65％，以及最优选地小于50％。
V.使用方法
在食品、药物、化妆品、农业、印刷和纺织业中的各种应用中，使用了藻酸盐。藻酸盐在食品业被广泛地用为增稠剂、胶凝剂、稳定剂、增稠助剂、悬浮剂和乳化剂。藻酸盐可以用作控制治疗剂、预防剂和/或诊断剂传输的底物。藻酸盐可以作为赋形剂结合在药物组合物中，它们可以用作增粘剂、悬浮剂、乳化剂、粘结剂和崩解剂。藻酸盐也用作牙科印模材料、伤口敷料的成分，以及作为印花剂。本领域普通技术人员的一个将认识到，本文所公开的修饰的藻酸盐可以用在当前采用藻酸盐的任何施用中。
特别预期的是，本文所描述的修饰的藻酸盐可以用在改进生物相容性和物理性质(诸如抗纤维化)的施用中，与市售获得的藻酸盐相比较，是优选的。
A.细胞的囊化
在水中，于室温下，藻酸盐可以与二价阳离子离子交联，以形成水溶胶底物。例如，参见Lim的美国专利号4352883。在Lim的工艺中，将包含待囊化的生物材料的水溶液悬浮在水溶性聚合物的溶液中，悬浮物形成为液滴，通过与多价阳离子接触，该液滴被配置进离散的胶囊，然后，胶囊表面与聚氨基酸交联形成囊化材料周围的半渗透膜。
将该聚合物与包含相反电荷的多价离子(或是假如聚合物具有酸性侧基的多价阳离子或是假如聚合物具有碱性侧基的多价阴离子)的水溶液反应，使具有带电侧基的水溶性聚合物进行交联。具有酸性侧基的聚合物交联形成水溶胶的优选阳离子为二价的和三价的阳离子，诸如铜、钙、铝、镁、锶、钡和锡，尽管也可以使用二、三或四功能化的有机阳离子诸如烷基铵，如R3N+--\/\/\/--+NR3。将这些阳离子盐的水溶液添加至该聚合物中以形成柔性高度溶胀的水溶胶和膜。阳离子浓度越高或价态越高，该聚合物的交联度越大。已经证明，低至0.005M的浓度就会使该聚合物交联。盐溶解度限制了较高的浓度。
用于聚合物形成水溶胶的交联(该聚合物包含碱性侧链)的优选阴离子是二价的和三价的阴离子，诸如低分子量二羧酸，例如，对苯二甲酸、硫酸根离子和碳酸根离子。将这些阴离子的盐的水溶液添加至该聚合物中以形成柔性高度溶胀的水溶胶和膜，如阴离子中所描述的。
各种聚阳离子可以用于络合物，并且从而将聚合物水溶胶稳定在半渗透表面膜中。可以使用的材料的示例包括具有碱性活性基诸如胺或亚胺基的聚合物，该碱性活性基具有在3000和100000之间的优选分子量，诸如聚乙烯亚胺和聚赖氨酸。这些是市售获得的。一个聚阳离子是聚L-赖氨酸；合成聚胺的示例是：聚乙烯亚胺、聚乙烯胺和聚烯丙基胺。也存在天然的聚阳离子，诸如多糖、壳聚糖。
聚阴离子(其可以通过与聚合物上的碱性表面基团反应来用于形成半透膜)包括丙烯酸、甲基丙烯酸和其它丙烯酸的衍生物，具有SO3H侧基的聚合物诸如磺化聚苯乙烯，和具有羧酸基的聚苯乙烯。
在优选的方法中，在修饰的藻酸盐聚合物中，对细胞进行囊化。在优选的实施例中，使用胶囊机，从包含悬浮细胞的修饰的藻酸盐溶液中制造了修饰的藻酸盐胶囊。在一些实施例中，修饰的藻酸盐与多价阳离子进行离子交联，诸如Ca2+、Ba2+，或Sr2+。在特别优选的实施例中，使用BaCl2，对该修饰的藻酸盐进行交联。在一些实施例中，在形成之后，进一步纯化该胶囊。在优选的实施例中，例如，用HEPES溶液，Krebs溶液和/或RPMI-1640培养液，冲洗该胶囊。
可以直接从供体中获得细胞，直接从供体细胞的细胞培养中获得细胞，或直接从完成的细胞培养系中获得细胞。在优选的实施例中，直接从供体中获得细胞，冲洗并与聚合材料组合直接植入。使用组织培养领域技术人员所熟知的技术对该细胞进行培养。在优选的实施例中，该细胞是自体的，也就是说，由该细胞移植进的个体所衍生，但是该个体可为异体的或异源的。
使用扫描电子显微镜、组织学和具有放射性同位素的定量评估，可以评估细胞附着和活性。使用上述技术和功能分析的结合，可以确定植入细胞的功能。例如，在肝细胞的情况中，通过将套管置于受者的胆总管中，可以研究体内肝功能。然后，可以增量地收集胆汁。通过高压液相色谱法寻找未衍生的四吡咯，或与P-葡萄糖醛酸酶处理的重氮化重氮二吡咯邻氨基苯甲酸甲酯反应转化为重氮二吡咯后的薄层色谱法，可以分析胆色素。共轭胆色素碱性醇解后，通过薄层色谱法，也可以确定双结合和单结合的胆红素。通常，随着功能化移植肝细胞数量的增加，结合胆红素的水平将会增加。也可以在血样(诸如白蛋白的产生)上完成简单的肝功能检查。使用本领域技术人员所熟知的技术，根据需要确定植入后细胞功能程度的需要，可以实施类似器官的功能研究。例如，可以以类似的方式传输胰腺的胰岛细胞，以特异性用于植入肝细胞，以获得经适宜胰岛素分泌的葡萄糖调节从而治愈糖尿病。也可以植入其它内分泌组织。可以实行使用标记葡萄糖的研究和使用蛋白质试验的研究，以对该聚合物支架上的细胞群进行计数。然后，可以将细胞群的这些研究与细胞功能化研究相关联，以确定适宜的细胞群是什么。在软骨细胞的情况中，功能被定义为向周围的附着组织提供适宜的结构支撑物。
在用于细胞大量有效转移的三维支架和目的在于生成新组织或组织等效物的移植物移植效果提升之内，可以使用这一技术提供多重细胞类型(包括经基因改变的细胞)。也可用于细胞移植物的免疫保护，而通过排斥宿主免疫系统，新组织或组织等效物得到生长。
如本文中所描述的可以被植入的细胞的示例包括软骨细胞和形成软骨的其它细胞、成骨细胞和形成骨骼的其它细胞、肌肉细胞、成纤维细胞和起源细胞(organ cell)。如本文中使用的，“起源细胞”包括肝细胞、胰岛细胞、胰源性细胞、源自肾的细胞和主要作用为合成和分泌或代谢材料的其它细胞。优选的细胞类型为胰岛细胞。
可以将体液因子与聚合物基体联合以提升细胞移植和移植效果。例如，可以将该聚合物基体联合血管生成因子、抗生素、抗炎药、生长因子、引起分化的化合物和细胞培养领域技术人员所熟知的其它因子。
例如，在形成用于移植的植入物之前，能够以缓释的形式将体液因子与细胞-藻酸盐悬浮物混合。可选择地，在与分离的细胞悬浮物联合之前，可以对该水溶胶进行修饰以结合体液因子或信号识别序列。
本文所描述的技术可以用于许多不同细胞类型的传输，以获得不同的组织结构。在优选的实施例中，先于水溶胶的硬化，将该细胞与该水溶胶溶液混合，并直接注射进需要植入该细胞的位点。然而，该底物也可以模塑并被植入在身体的一个或多个不同区域，以适合特别的施用。这一施用特别相关的是：需要特异性结构的设计或细胞待植入的区域缺乏特异性结构或缺乏方便细胞生长和发育的支撑物。
基于个体的要求，根据细胞的必要数量，确定细胞待植入的一个或多个位点。对于具有器官功能的细胞，例如，肝细胞或胰岛细胞，可以将混合物注射进肠系膜、皮下组织、腹膜后腔、腹膜前空间和肌内空间。对于软骨的形成，将该细胞注射进需要形成软骨的位点。也可以施用外模以注射液定形。此外，通过控制聚合速率，可能模塑细胞-水溶胶注射的植入物，就像模塑黏土。可选择地，可以将混合物注射进模具，允许水溶胶硬化，随后植入该材料。
B.涂覆产品和表面
使用不同的技术(其示例包括喷涂、浸渍和刷涂)，可以使用所公开的修饰的藻酸盐聚合物涂覆医疗产品。将聚合物溶解在适宜的优选有机溶剂中，并通过喷涂、刷涂、浸渍、刷漆或其它类似技术的施用，典型地将聚合物涂层施用于待涂覆的表面。将涂膜沉积在表面上，经过非共价相互作用与表面相共轭。具体考虑并公开了结果所致的涂覆产品和表面。
在一些实施例中，可使用适宜的溶液或悬浮物对该表面进行预处理，以修饰表面性质，并且从而加强了该修饰表面和该涂层之间的非共价相互作用。
在适宜的温度下，将聚合物溶液施用至表面，并且经过足够的一段时间，在表面上形成了涂层，其中该涂层在形成抗纤维化表面中是有效的。典型的温度包括室温，尽管可以使用较高的温度。典型的一段时间包括5分钟或更短、30分钟或更短、60分钟或更短和120分钟或更短。在一些实施例中，可以施用该溶液120分钟或更长，以形成具有所需抗纤维化活性的涂层。然而，优选地使用较短的一段时间。可以以本文所公开的或本领域所熟知的方式中的任何一个，测定抗纤维化的活性。优选地，该抗纤维化的活性可以是如本文所描述确定的异物应答。
所公开的修饰的藻酸盐聚合物可以与产品、器械和表面共价地或非共价地共轭。对于修饰的聚合物与产品、器械和表面共价地或非共价地共轭的这些实施例，该聚合物可以附着至产品、器械和表面，例如，通过使用反应官能团诸如亲核基团对该产品、器械或表面进行功能化，以及将亲核基团与聚合物上的反应官能团诸如亲电基团反应。可选择地，可以使用亲核基团功能化该聚合物，该亲核基团与产品、器械或表面上的亲电基团反应。
在特定的实施例中，该修饰的藻酸盐聚合物与该产品、器械或表面非共价地共轭。通过喷涂、湿涂、浸涂、浸渍、刷漆、结合或粘附或使用提供具有修饰的藻酸盐聚合物化合物的产品、器械或表面的其它方面，可以将该聚合物施用至该产品、器械或表面上。在一个实施例中，通过喷涂、刷漆或浸渍或浸涂，施用该聚合物。例如，通过将该修饰的藻酸盐溶解在适合的溶剂中(通常水性的)中，并可选地对该溶液进行超声处理以保证该聚合物完全溶解，可以制备聚合物涂料。待涂覆的产品、器械或表面可以浸入聚合物溶液中合适的一段时间，例如，5秒，随后干燥诸如风干。该程序可根据需要重复很多次以获得足够的覆盖率。该涂层的厚度通常从约1nm至约1cm，优选地约10nm至1mm，更优选地约100nm至约100微米。
可以在制备该产品、器械或表面的时候施用该涂层，或制备该产品、器械或表面之后施用该涂层。在一些实施例中，在瞬时前施用该产品、器械或表面的时候，将该涂层施用至该产品、器械或表面上。这被称为术中涂覆。“瞬时前(Immediately prior)”，如本文所使用的，是指1分钟、2分钟、5min、10min、15min、20min、30min、45min、60min、75min、90min、120min、150min、180min或更大时间内的植入或使用。在一些实施例中，使用20min、15min、10min或5min的植入或使用，在医院里(例如，在手术室内)涂覆该产品、器械或表面。瞬时使用的涂覆可以克服制备时涂覆产品、器械和表面的限制，诸如在产品、器械或表面储藏和/或移植期间涂层的损伤，和/或超过涂层暴露在环境条件时间涂层效力的降低，该环境条件可以是恶劣的(如高温、湿度、暴露在紫外光中等等)。
涂覆的医疗产品可以用于医疗产品的未涂覆或难涂覆形式的已知使用和目的。
1.医疗产品
对涂覆有用的医疗产品包括(至少部分地)用于患者身体植入的医疗器械的任何类型。示例包括但不限于植入物、可植入医疗产品、可植入器械、导管和其它管(包括泌尿管和胆管、气管内管、伤口引流管、针注射导管、外周插入中心静脉导管、透析导管、长期隧道式中央静脉导管、短期隧道式中央静脉导管、动脉导管、肺动脉导管、Swan-Ganz导管、尿导管、腹透导管)、血管导管药盒(vascular catheter port)、血块过滤器、泌尿器械(包括长期泌尿器械、组织粘合泌尿器械、人工尿道括约肌、泌尿扩张器)、分流器(包括室性或动静脉分流器、支架移植物、胆支架、肠支架、支气管支架、食管支架、输尿管支架和脑积水支架)、球囊、起搏器、可植入除颤器、骨科产品(包括销、板、螺钉和植入物)、移植物(包括器官、血管移植物、血管、主动脉、心瓣和器官备件)、假体(包括乳房植入物、阴茎假体、血管移植假体、心瓣、人工关节、人工喉、耳植入物、人工心脏、人工血管和人工肾)、动脉瘤填充线圈和其它线圈器械、经心肌血运重建器械、经皮心肌血管再建器械、管、纤维、中空纤维、膜、贮血器、滴度板、吸附器介质、渗析器、连接件、传感器、阀、内窥镜、过滤器、泵室、手术刀、针、剪刀(和在微创手术的、治疗的或诊断程序中使用的其它器械)，以及意在具有抗纤维化性质的其它医疗产品和器械。表达语“医疗产品”是非常宽泛并且特别是指与血液短暂(如内窥镜)接触或永久(如支架)接触的产品。
有用的医疗产品是气泡式导管和血管内假体，特别是支架。传统设计的支架具有由金属杆构成的镶嵌支撑结构。该支撑结构最初提供在插入身体的未膨胀的状态下，并且然后在施用位点变宽为膨胀状态。在其卷曲在球囊之前或之后，涂覆该支架。高度多样化施用的各种医疗假体或医疗产品或植入物是已知的。例如，它们用于支撑血管、中空器官和导管系统(血管内植入物)，以附着并临时固定组织植入物和组织移植物和用于骨科的目的，诸如销、板或螺钉。
该修饰的藻酸盐聚合物可以施用于、吸收进或耦合至各种不同的底物和表面。合适材料的示例包括金属、金属材料、陶瓷、聚合物、纤维、惰性材料(诸如硅)和它们的组合。
合适的聚合物材料包括但不限于苯乙烯和被取代的苯乙烯、乙烯、丙烯、聚氨酯、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺、聚酯、聚硅氧烷、聚醚、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚羟基脂肪酸酯、它们的共聚物和它们的组合。
底物可以是以下形式或部分形式：膜、颗粒(纳米颗粒、微米颗粒或毫米直径的微球)、纤维(伤口敷料、绷带、纱布、胶带、纱布块、海绵、包括纺布或无纺布海绵和特别设计用于牙科或眼睛手术的那些底物)、传感器、起搏器导联、导管、支架、隐形眼镜、骨植入物(髋关节置换、销、铆钉、板、骨水泥等)或组织再生或细胞培养器械，或其它医疗设备，或在医疗装置中使用的其它医疗器械，或在与身体接触内或中使用的其它医疗器械。
本文所描述的是，使用修饰的藻酸盐聚合物涂层涂覆植入物。“植入物”是意在哺乳动物(诸如人类)的身体内安放的任何物体，也就是说不是活组织。植入物为医疗产品的形式。植入物包括已经处理的天然衍生的物体，从而它们的活组织已经被灭活。作为一个示例，可以处理植骨从而除去它们的活细胞，但是从而保留了它们的形状以作为宿主骨长入的模板。作为另一个示例，可以处理天然产生的珊瑚，以出产羟磷灰石制剂，可以将该制剂施用特定骨科和牙科疗法的身体上。植入物也可以是包含人工成分的物品。术语“植入物”可以施用于意在人体或哺乳动物身体安放医疗器械的整个范围，包括骨科施用；牙科施用、耳、鼻和喉(ENT)施用；和心血管施用。
在一些实施例中，本文中使用的“植入物”是指宏观组合物，其包括用于植入的器械或用于植入的器械表面和修饰的藻酸盐聚合物涂层。在这些实施例中，术语“植入物”没有包括纳米颗粒和/或微米颗粒。如本文使用的“宏观”通常是指肉眼可见的器械、植入物或组合物。
可植入医疗器械和医疗器械和机械结构的示例包括但不限于支架、管、托架、心瓣阀瓣、心血管阀、起搏器、髋关节置换器械、植入的传感器器械、食管支架、心脏植入物、用于心瓣的生物相容性内衬、透析设备和用于心肺旁路系统的氧合器管。
通常，支架是器械，典型地在形状上管状的，也就是说插入身体的管腔(诸如血管或输送管)以防止或抵消局部流量的缩窄。支架的目的，在一些情况下，机械地支撑打开体液管。支架经常用于减轻器官和四肢的减小的血流量，以便维持足够的含氧血传输。支架最普遍的使用是在冠状动脉中，但是它们也广泛用在其它身体管中，诸如外周动脉和静脉、胆管、食管、克隆、气管、大支气管、输尿管和尿道。频繁地，插入管腔的支架在插入之后能够膨胀或自膨胀。例如，使用气囊导管，金属支架被配置在闭塞动脉中，并且膨胀以恢复血流量。例如，不锈钢线网支架从马萨诸塞州纳蒂克的波科公司(Boston Scientific，Natick，Mass)市售购得。
在一些实施例中，该植入物是骨科植入物。“骨科植入物”被定义为一种植入物，其代替骨或提供骨固定、代替关节的关节连接表面、为假体提供基台或它们的组合，或辅助进行了代替骨或提供骨固定、代替关节的关节连接表面、为假体提供基台或它们的组合。
“骨科植入物”可以用于代替骨或提供骨固定、代替关节的关节连接表面、为假体提供基台或它们的组合，或辅助进行了代替骨或提供骨固定、代替关节的关节连接表面、为假体提供基台或它们的组合。
合适的骨科植入物包括但不限于线、Kirschner线、接骨板、螺钉、销、tacs、棒、钉、螺母、螺栓、垫圈、刺针、纽扣、丝、骨折板、重建和稳定器械、内用和外用假体(关节连接的和非关节连接的)、骨内经皮假体、垫片、网、植入基台、锚固件、倒钩、夹具、缝合线、椎间融合器械、任何几何学的管、托架和它们的组合。
在其它的实施例中，该植入物是耳、鼻和/或喉(“ENT”)植入物。示例性的ENT植入物包括但不限于耳管、气管内管、通气引流管、耳蜗植入物和骨锚固听力器械。
在其它的实施例中，该植入物是心血管植入物。示例性的心血管植入物是心脏瓣膜或异质血管壁支撑物、全人工心脏植入物、心室辅助器械、血管移植物、支架、电信号承载器械诸如起搏器和神经系统引线，除颤器引线等等。
植入物可以由不同材料制成。在一些实施例中，该材料是生物相容性的。在一些实施例中，该材料是生物相容性的和非生物相容性的。示例性的材料包括金属材料、金属氧化物、聚合物材料(包括降解的和非降解的)、陶瓷、瓷器、玻璃、异体骨、异种骨或骨基质；经基因工程化的骨；和它们的组合。
合适的金属材料包括但不限于、钛基金属和合金(诸如镍钛诺、镍钛合金、热记忆合金材料)、不锈钢、钽、钯、锆、铌、钼、镍铬合金或特定的钴合金(包括钴铬和钴铬镍合金诸如
Figure BDA0002981759510000971
和
Figure BDA0002981759510000972
)。有用的示例包括不锈钢级316(SS 316L)(由Fe、<0.3％的C、16-18.5％的Cr、10-14％的Ni、2-3％的Mo、<2％的Mn、<1％的Si、<0.45％的P，和<0.03％的S构成)，钽、铬钼合金、镍钛合金(诸如镍钛诺)和钴铬很久(诸如MP35N、ASTM材料名称35Co-35Ni-20Cr-10Mo)。目前在支架中应用的典型金属包括SS 316L钢和MP35N。也参见“Comparing and Optimizing Co-Cr Tubing for Stent Applications”，Poncin，P，Millet，C.，Chevy，J和Profit，J.L.，Materials&Processes for Medical DevicesConference，2004年8月，美国金属学会(ASM International)。
合适的陶瓷材料包括但不限于过渡元素的氧化物、碳化物或氮化物(诸如氧化钛、氧化铪、氧化铱、氧化铬、氧化铝和氧化锆)。也使用硅基材料，诸如二氧化硅。
合适的聚合物材料包括但不限于聚苯乙烯和被取代的聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙炔、聚苯乙烯、
Figure BDA0002981759510000981
聚氯乙烯(PVC)、聚烯烃共聚物、聚氨酯、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺、聚酯、聚硅氧烷、聚醚、聚原酸酯、聚碳酸酯(poly(carbonates))、聚羟基脂肪酸酯、聚碳氟化合物、
Figure BDA0002981759510000982
(聚四氟乙烯，PTFE)、硅酮、环氧树脂、
Figure BDA0002981759510000983
Figure BDA0002981759510000984
(由乙二醇和对苯二甲酸得到的缩聚物)、尼龙、聚烯、酚醛树脂、天然和合成的弹性体、粘合剂和密封剂、聚烯烃、聚砜、聚丙烯腈、生物聚合物诸如多糖和天然乳胶、壳聚糖、纤维素聚合物(如烷基纤维素等)、多糖、聚乙醇酸、聚L-乳酸(PLLA)、聚对二氧环己酮(PDA)，或外消旋聚乳酸、聚碳酸酯(polycarbonates)、(如聚酰胺(尼龙)；氟塑料、碳纤维，和它们的共混物或共聚物。
该聚合物可以与表面共价地或非共价地共轭；然而，在特别的实施例中，该聚合物与表面非共价地共轭。通过各种本领域的技术，可以施用该聚合物，该技术包括但不限于喷涂、湿涂、浸涂、浸渍诸如浸渍涂敷(如术中浸渍涂敷)、刷漆，或将疏水聚阳离子聚合物施用至该植入物的表面的其它技术。
使用高压灭菌、杀虫剂的暴露、辐射或发泡技术，能够对适于医疗环境应用的产品的表面进行灭菌，例如环氧乙烷的暴露。在医疗环境中发现的表面包括不同仪器和器械的内外方面，无论是一次性的还是意于重复使用的。
2.水溶胶
医疗产品也可以由水溶胶制成或使用水溶胶。所公开的修饰的藻酸盐聚合物可以形成这一目的和其它目的的水溶胶。由其它水溶胶制成的产品也可以涂覆有所公开的修饰的藻酸盐聚合物。因此，所公开的修饰的藻酸盐聚合物可以用作产品或表面的涂层或可以用作产品本身。水溶胶是三维亲水聚合物网络，其能够吸收大量的水或生物流体(Peppas等人，Eur.J.Pharm.Biopharm.2000，50，27-46)。这些网络由均聚物或共聚物构成，并且是不溶的，由于存在化学交联或物理交联，诸如缠结或微晶。水溶胶可以被分类为中性的或离子的，基于侧基的本质。此外，它们可以是非晶的、半结晶的、氢键结构、超分子结构和水胶骨料(Peppas，N.A.Hydrogels.In:Biomaterials science：an introduction to materialsin medicine；Ratner，B.D.，Hoffman,A.S.，Schoen，F.J.，Lemons，J.E.，Eds；AcademicPress，1996，pp，60-64；Peppas等人Eur.J.Pharm.Biopharm.2000，50，27-46)。水溶胶可以由合成的或天然的单体或聚合物制成。本文优选的水溶胶是所公开的修饰的藻酸盐聚合物。
水溶胶可以由合成聚合物制得，该聚合物诸如聚丙烯酸及其衍生物(如聚甲基丙烯酸羟乙酯(pHEMA))、聚N-异丙基丙烯酰胺、聚乙二醇(PEG)和它的共聚物和聚乙烯醇(PVA)，以及其它合成的聚合物(Bell和Peppas，Adv.Polym.Sci.122:125-175(1995)；Peppas等人，Eur.J.Pharm.Biopharm.50：27-46(200)；Lee和Mooney，Chem.Rev.101：1869-1879(2001))。由合成聚合物制得的水溶胶在生理条件下通常是不降解的。水溶胶也可以由天然聚合物制得，该天然聚合物包括但不限于多糖、蛋白质和多肽。所公开的修饰的藻酸盐聚合物是优选的示例。通过化学或酶手段，这些网络在生理条件下通常是降解的。
在一些实施例中，在相关体内和体内条件下，该水溶胶是不降解的。对于特定施用，稳定的水溶胶涂层是必要的，该施用包括中心静脉导管涂覆、心瓣、起搏器和支架涂覆。在其它的情况下，水溶胶降解可以是优先的途径，诸如在组织工程构建中。
在一些实施例中，该水溶胶可以由右旋糖酐形成。右旋糖酐是细菌多醣，本质上由具有几个百分点的α-1,2,α-1,3或α-1,4连接侧基的α-1,6连接的D-吡喃葡萄糖残基构成。右旋糖酐广泛用于生物医学的施用，由于它的生物相容性、低毒性、相对低的成本和简单的修饰。这一多糖作为血容量扩充药、外周流启动子和抗溶血栓剂在临床上已经使用超过50年，(Mehvar,R.，J.Control.)Release 2000，69，1-25)。而且，它已经用作药物和蛋白质传输的大分子载体，首先用于增加治疗剂在循环中的寿命。通过使用化学或酶的手段，用乙酰基对右旋糖酐进行修饰以制备凝胶(Ferreira等人Biomaterials 2002，23，3957-3967)。
右旋糖酐基水溶胶防止血管内皮、平滑肌细胞和成纤维细胞的粘附(Massia，S.P.；Stark，J.J.Biomed.Mater.)Res.2001，56，390-399。Ferreira等人2004，J.Biomed.Mater.)Res.68A，584-596)以及右旋糖酐表面阻止蛋白质的吸收(
Figure BDA0002981759510000991
等人J.Biomed.Mat.Res.1995，29，741-747)。
如本文中所描述的，所公开的修饰的藻酸盐聚合物可以用于囊化细胞。在一些实施例中，该囊化细胞可以制造成宏观器械。例如，在一些实施例中，在修饰的藻酸盐水溶胶中囊化的细胞可以被涂覆在表面诸如平面上。在一些实施例中，使用生物相容性的粘附，包含细胞的胶囊可以粘附在受试者的组织上。在其它的实施例中，包含细胞的胶囊可以涂覆在植入用的医疗器械上。
C.疾病或障碍的治疗
囊化细胞可以移植至需要治疗疾病或障碍的患者中。在一些实施例中，该囊化细胞由相同物种的基因非识别构件所获得。在替换的实施例中，该囊化细胞由除患者之外的不同物种所获得。在优选的实施例中，囊化激素或蛋白质分泌细胞并将其移植至需要治疗疾病或障碍的患者。
在优选的实施例中，疾病或障碍由患者中激素或蛋白质分泌细胞的失效所致或涉及疾病或障碍由患者中激素或蛋白质分泌细胞。在优选的实施例中，该疾病或障碍是糖尿病。
涂覆修饰的藻酸盐的医疗产品、器械和表面可以移植或植入移植进需要治疗疾病或障碍的患者中。
在给药或植入后，所公开的胶囊、产品、器械和表面可以本质上保持没有纤维化的效果，或可以继续表现2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年，或更长时间的降低的异物应答。
所公开的胶囊、产品、器械和表面可以是单独地给药或植入，或与任何合适的药物或其它疗法组合来进行给药或植入。在胶囊、产品、器械和表面存在于患者中的期间，这类药物和疗法也可以分别地给药(也就是说平行地使用)。尽管所公开的胶囊、产品、器械和表面降低了对胶囊、产品、器械和表面的纤维化和免疫应答，抗炎和免疫系统抑制药物与该胶囊、产品、器械和表面一起或与胶囊、产品、器械和表面平行使用，而没被排除。然而，在优选的实施例中，没有使用抗炎药和免疫系统抑制药物，使用了所公开的胶囊、产品、器械和表面。在优选的实施例中，纤维化在使用后保持降低，所使用的任何抗炎药或免疫系统抑制药物的浓度、效果或它们的组合落在有效水平以下。例如，纤维化在使用后可以保持2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年或更长时间的降低，所使用的任何抗炎药或免疫系统抑制药物的浓度、效果，或它们的组合落在有效水平以下。
通过参考以下非限定的示例，将会进一步理解本发明。
实例
实例1：化学修饰的藻酸盐的组合合成
对于调节材料生物相容性的确定参数所知甚少。因此，具有改进生物相容性的修饰的藻酸盐的理性设计和合成变得具有挑战性。为了鉴定具有改进生物相容性和物理性质的修饰的藻酸盐，使用了组合途径，以制备具有一系列共价修饰的修饰的藻酸盐的库。
1.一般组合策略
12个醇、9个氨、2个用于引入叠氮部分的胺(一个胺包含叠氮部分和另一个胺包含碘化物部分，其酰胺化之后将被转化为叠氮部分)，和具有一系列不同化学结构、疏水性/亲水性、氢键势能和电荷状态的19个炔的池被选择作为修饰的藻酸盐组合合成的试剂。根据知识，已经显示存在于藻酸盐聚合物的杂质限制了植入藻酸盐的生物相容性、超高纯，低粘度藻酸盐(UPLVG，FMC生物聚合物)被选择作为修饰实验的起始原料。
所使用的炔作为1,3-偶极环加成的试剂
Figure BDA0002981759510001011
所使用的醇作为酯化的试剂
Figure BDA0002981759510001021
所使用的胺作为酰胺化的试剂
Figure BDA0002981759510001022
所使用的胺作为引入叠氮部分的试剂
Figure BDA0002981759510001023
通过以组合方式与如上所示的酯、胺和/或炔烃的1个、2个或3个反应，对未修饰的藻酸盐进行了共价修饰。图1显示了使用这一方法获得的修饰的藻酸盐的一般结构。
2.代表性的反应条件
由于修饰工艺的平行和组合本质，使用机器人核心模块，实行了合成反应。选择UPLVG藻酸盐作为修饰实验的起始原料。在第一个组合反应中，在2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)和N-甲基吗啡(NMM)的存在下，将未修饰的藻酸盐与该醇、胺和/或用于引入叠氮部分的胺的一个反应。在第二结合步骤中，在2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)和N-甲基吗啡(NMM)的存在下，将以上形成的修饰的藻酸盐聚合物与该醇、胺和/或用于引入叠氮部分的胺的另一个反应。在最终组合步骤中，使用1，3-偶极环加成反应，进一步对与用于引进叠氮部分的胺反应的该库的所有组分进行功能化。已经与4-碘苄胺反应的该库的那些组分首先与叠氮化钠反应，以将碘部分转化为叠氮部分。随后，在CuSO4/抗坏血酸钠的存在下，与用于引入叠氮部分的胺反应的该库的所有组分与用作1,3-偶极环加成反应试剂的炔的一个反应。
为了优化化学修饰的藻酸盐的生物相容性，开发了严格的纯化工艺条件，以消除潜在的刺激性杂质。在每个共价修饰后，通过氰基修饰的硅胶柱，过滤修饰的藻酸盐，目的是捕获大多数有机杂质。最后，完成所有共价修饰步骤后，用10000的MWCO膜，对该修饰的藻酸盐进行透析以除去任何保留的小分子或低分子量杂质。
由1H NMR分析，确定该修饰的藻酸盐的杂质。收集每个修饰的藻酸盐聚合物的1HNMR光谱，并将对应于该修饰的藻酸盐聚合物和对应于任何杂质的峰进行积分，以确定样品中每个物种的相对数量。
实例2：使用水溶胶形成试验的修饰的藻酸盐的高通量筛查
该藻酸盐的共价修饰影响了该藻酸盐的物理性质，其包括藻酸盐形成适合细胞和生物分子囊化的水溶胶的能力。为了消除已经失去形成水溶胶能力并进一步致力于筛查更强候选者的修饰的藻酸盐，使用了基于荧光的交联试验，以量化修饰的藻酸盐形成水溶胶的能力。
本文所描述的水溶胶形成试验利用水溶胶捕荧光化合物并且通过基于水溶胶稳定性的冲洗差异保留荧光基团的能力。使用实例1所描述的组合途径，将该修饰的藻酸盐的每个溶解在水中。将在580nm处发荧光的罗丹明染料添加进每个样品中。然后，通过添加钡盐或钙盐，例如BaCl2，对该修饰的藻酸盐样品进行交联，以诱导水溶胶的形成。培养10min后，用水重复冲洗每个样品。使用荧光计，测定每个样品的荧光强度。
对每个修饰的藻酸盐筛查三次，并且平均三次实验所得的结果。将每个修饰的藻酸盐的平均荧光强度值与阴性对照(水)和未修饰的藻酸盐(UPLVG)的荧光水平相比较。得到低于阴性对照荧光值的修饰的藻酸盐被认为是不能用于施用，而水溶胶形成是临界的(也就是细胞的囊化)。
自实例2中所描述的水凝胶形成测定中获得的图如图2所示。
实例3：生物相容性的修饰的藻酸盐的体内筛查
将该藻酸盐聚合物在HeLa细胞上的细胞毒性进行评定以筛查体内的生物相容性。将在实例2中鉴定的作为能够形成水溶胶的修饰的藻酸盐负载在96孔板的孔内，该96孔板涂覆有聚L-赖氨酸。也将未修饰的藻酸盐和盐水负载在96孔板的孔内作为对照，该96孔板涂覆有聚L-赖氨酸。将100mm的BaCl2交联溶液分配在96孔板的所有孔内。随后吸出过量的交联剂。将HeLa细胞接种在孔内并在37℃下于潮湿箱中培养3天。
使用溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-联苯基四唑(MTT)，进行细胞活性试验，其中从所有孔中吸出培养基，并且将100μL没有酚红的DMEM培养基10μLMTT(5mg/ml)添加在96孔板的所有孔内。将该板在37℃下于潮湿箱中培养4小时。培养后，吸出85μl的溶液并添加100μl的DMSO。在试验期间形成的紫色甲臜晶体，与每个孔内的活性HeLa细胞的数目成比例。反复用移液管吸取每个孔的所含体，以在测量之前溶解甲臜晶体。搅拌除去气泡后，将该板在37℃下培养10min。使用紫外/可见光读板仪，在540nm对板进行读数，700nm作为参比。将没有藻酸盐的孔内接种细胞的活性进行标准化。
细胞活性的结果显示在图3中，其绘制了所选择修饰的藻酸盐在HeLa细胞系活性上与阳性对照(没有藻酸盐)作比较的效果。藻酸盐(Alg)的HeLa细胞系存活率是53％。该试验确定了修饰的藻酸盐聚合物，其显示有相对于未修饰的藻酸盐的降低的细胞毒性。选择这些聚合物用于进一步的分析。
实例4：评估生物相容性的修饰的藻酸盐的高通量体内筛查
当前生物相容性分析方法很慢并且需要组织学分析。为了筛查使用本文所描述的组合合成方法制备的大量修饰的藻酸盐，使用高通量体内方法以评估藻酸盐聚合物的相对生物相容性。
1.高通量体内筛查方案
8-12周大的雄性SKH1小鼠购自北卡罗来纳州威尔明顿的查尔斯河实验室(Charles River Laboratories(Wilmington，MA))。将小鼠供养在经过美国实验动物管理鉴定协会认证的麻省理工学院的动物实验室中，在12小时光暗循环的标准条件下饲养。不限量地提供水和食物。
根据ISO 10993-6：2001，实行了注射。在注射之前，经0.22μm过滤，对所有材料进行灭菌。经吸入1-4％异氟醚/平衡O2浓度的异氟醚，对小鼠进行麻醉以使运动减到最少。用70％异丙醇擦洗小鼠的背部，并以阵列形式在该动物背部上将修饰的藻酸盐注射该动物，从而进行高通量筛查。对每个小鼠进行6次注射，而该注射中的一个是未修饰的藻酸盐对照。注射体积为100μl。
在注射后1、3、7、14、21、28天，使用荧光整个动物成像，对响应于修饰的藻酸盐植入的宿主细胞活性进行动力学成像。体内荧光成像前24小时，将溶解在150μl灭菌PBS的2nmol的ProSense-680(VisEn Medical，Woburn，MA，激发波长680±10nm，发射波长700±10nm)注射进每个小鼠的尾静脉，以使组织蛋白酶活性成像。
使用IVIS光谱测试系统(Xenogen公司，Hopkinton，MA)，进行了体内荧光成像。在2.5L/min的流速下，使用1-4％异氟烷的100％氧气，在吸入麻醉下对该动物进行供养。8×8的分箱和13.1cm的视场用于成像。为了每个所需的图像，对暴露时间和F光圈(即缝隙开口的相对尺寸)进行了优化。使用制造商专有的Living Image 3.1软件，捕获数据并对其进行分析。所有图像以荧光效率来存在，其被定义为所收集荧光强度与入射强度内部标准在所选成像结构上的比值。目标区域(ROI)是指每个注射位点的周围。
注射后14天，检查了材料的生物相容性。将在修饰的藻酸盐植入位点测量的荧光强度与在未修饰的藻酸盐植入位点测量的荧光强度相比较。修饰的藻酸盐在植入位点上显示有比在未修饰的藻酸盐植入位点上测定的荧光强度更小的荧光强度，其被表征为生物相容的。修饰的藻酸盐在植入位点上显示有比在未修饰的藻酸盐植入位点上测定的荧光强度更大的荧光强度，其被表征为生物不相容的。
在注射后28天，评估了该藻酸盐凝胶的体内稳定性。28天后保留在注射位点上的修饰的藻酸盐凝胶被表征为能够在体内形成机械上稳定的水溶胶。28天后在注射位点上不存在的修饰的藻酸盐凝胶被视为不能在体内形成机械上稳定的水溶胶，并被分类为“失败”。
表征为生物相容的和在体内能够形成机械上稳定水溶胶的修饰的藻酸盐被分类为“命中”，并选择用于进一步的研究。
2.高通量体内筛查方案的验证
为了验证上述的高通量体内筛查试验，随后以阵列的形式，皮下注射修饰的藻酸盐进小鼠中并如上所描述进行原位交联。在注射后1、3、7、14、21和28天，使用荧光整个动物成像，对小鼠进行成像，并且在用于组织学分析的成像之后，收集组织样品。为了获得组织学分析的组织样品，经CO2窒息，对小鼠进行安乐死，并且切除注射的生物材料和周围的组织。随后将该组织固定在10％的福尔马林中，嵌入石蜡中，切成5μm的小段，并且由委员会认证的病理学家使用组织学分析的苏木精和伊红(H&E)进行染色。
纤维化被定级，零级是指没有纤维化，一级显示使用纤维化的一个至两个层的部分覆盖，二级被指定为基本覆盖植入物的较厚纤维层，以及三级被表示为聚合物的同心纤维化覆盖。多形(PMN)细胞和巨噬细胞被定级，没有观察的细胞显示为零级，分散细胞被评分为一级，在聚合物的一侧上的许多细胞的集群被评为二级，以及材料周围的许多细胞的结果是三级。检查标准化为藻酸盐的组织学分数和荧光响应的整个库，并且性能优于未修饰的藻酸盐的材料被判定为生物相容性的。这对应于<100％的标准化的荧光信号和<3的纤维化评分。
在吞噬细胞对生物材料(与组织学分析相比较)进行细胞募集中，将使用整个动物成像捕获的数据演示为显示类似的时间趋势。因此，对上述的高通量体内筛查方法进行了验证。
实例5：修饰的藻酸盐对量化生物相容性的体内筛查
8-12周大的雄性SKH1小鼠购自北卡罗来纳州威尔明顿的查尔斯河实验室(Charles River Laboratories(Wilmington，MA))。将小鼠供养在经过美国实验动物管理鉴定协会认证的麻省理工学院的动物实验室中，在12小时光暗循环的标准条件下饲养。不限量地提供水和食物。
根据ISO 10993-6：2001，实行了注射。在注射之前，经0.22μm过滤，对所有材料进行灭菌。经吸入1-4％异氟醚/平衡O2浓度的异氟醚，对小鼠进行麻醉以使运动减到最少。用70％异丙醇擦洗小鼠的背部，并以阵列形式将修饰的藻酸盐注射该动物。注射体积为100μl。
在注射后7天，使用体内荧光试验，测定组织蛋白酶活性，以量化对修饰的藻酸盐的异物应答。体内荧光成像前24小时，将溶解在150μl灭菌PBS的2nmol的ProSense-680(VisEn Medical，Woburn，MA，激发波长680±10nm，发射波长700±10nm)注射进每个小鼠的尾静脉，以使组织蛋白酶活性成像。
使用IVIS光谱测试系统(Xenogen公司，Hopkinton，MA)，进行了体内荧光成像。在2.5L/min的流速下，使用1-4％异氟烷的100％氧气，在吸入麻醉下对该动物进行供养。8×8的分箱和13.1cm的视场用于成像。为了每个所需的图像，对暴露时间和F光圈(即缝隙开口的相对尺寸)进行了优化。使用制造商专有的Living Image 3.1软件，捕获数据并对其进行分析。所有图像以荧光效率来存在，其被定义为所收集荧光强度与入射强度内部标准在所选成像结构上的比值。目标区域(ROI)是指每个注射位点的周围。
在注射后7天，捕获荧光图像，这说明了在所选择修饰的藻酸盐的注射点上相对组织蛋白酶活性。在优选的实施例中，测定荧光强度并标准化为使用未修饰的藻酸盐测定的荧光应答，从而量化该修饰的藻酸盐的生物相容性。所选择的修饰的藻酸盐获得的结果包括在图4中。
实例6：STZ诱导糖尿病小鼠中糖尿病的治疗
生物相容性藻酸盐囊化的β细胞的移植为治疗糖尿病提供了可能。使用14个生物相容的修饰的藻酸盐聚合物囊化大鼠的胰岛细胞，使用上文详述的试验鉴定该修饰的藻酸盐聚合物(包括PF_N287_B_B4、PF_N287_F2、PF_N287_G3、PF_N287_B3、PF_N287_B_B8、PF_N287_A4、PF_N287_B1、PF_N287_E3、PF_N263_C12、PF_N63_A12、PF_N287_E1、PF_N287_D3、PF_N263_A7和PF_N263_C6)。使用具有300μm喷嘴的Inotech的胶囊机(Inotech)，其设置1.05kV的电压，1225Hz的振动和10-25ml/min的流速，由750μL的4％(w/v)的每个修饰的藻酸盐离子水溶液制造了藻酸盐囊化的胰岛胶囊，该离子水包含悬浮的1000个悬浮胰岛。在20mmBaCl2溶液中交联藻酸盐。囊化后，用HEPES溶液冲洗胶囊2次，用Krebs溶液冲洗4次，并用RPMI-1640培养液冲洗2次。
将囊化的大鼠胰岛细胞移植进STZ诱导的糖尿病小鼠内。移植之前，在0.5L/min的具有氧的1-4％异氟烷的连续流下，对小鼠进行麻醉。将使用具有#40尺寸刀片的电动剃刀，除去毛发，以在该动物腹部的腹中线露出约2cm x 2cm的区域。使用聚维酮擦洗最小3周，随后用70％的醇冲洗，无菌制备整个剃掉的区域。也施用了具有聚维酮的最终皮肤涂料。使用无菌一次性纸包覆手术位点，以排除周围毛发接触手术位点。使用锋利的手术刀片，以切割通过皮肤和白线进入腹部的0.5-0.75cm的中线切口。使用无菌塑料吸管，将藻酸盐胶囊转移至腹腔。通过使用5-0个Ethicon黑丝或PDS可吸收5.0-6.0单丝可吸收线的缝合，对腹部肌肉进行闭合。使用缝合夹，闭合外皮肤层。确认完全愈合后，在术后7-10天，移除这些缝合夹。
使用血滴(由70％异丙醇擦洗尾巴并使尾巴皮肤上微切口产生血滴而获得)，日常监护移植后20和30天之间STZ诱导的糖尿病小鼠中的血糖水平。在取样期间，将小鼠约束在旋转尾注射器上。
胰岛移植后STZ诱导的糖尿病小鼠的血糖水平如图5所示。黑虚线代表小鼠中的血糖量正常。在修饰的藻酸盐囊化的大鼠胰岛细胞能够降低所有情况下的血糖水平，并且在一些情况下，甚至能够诱导血糖量正常。
实例7：由修饰的藻酸盐和未修饰的藻酸盐制备的颗粒
在体内驱动纤维化的参数的增长的识别已经应用于修饰的藻酸盐的性能的分析。修饰的藻酸盐胶囊的腹膜内(IP)植入显示，当使用对未修饰的藻酸盐定义的条件交联时，修饰的藻酸盐可导致异常形状的胶囊。这些异常形状的胶囊能够使植入IP的修饰的藻酸盐胶囊的实施和解释复杂化。为了改进胶囊形态，开发了与修饰的藻酸盐微粒一起使用的制剂方法，其中将修饰的藻酸盐与少量高分子量藻酸盐混合。由该混合物制备的颗粒产生具有改良的形态和稳定性的颗粒。
将修饰的藻酸盐的6％溶液(w/w)按1:1的体积与未修饰的藻酸盐的1.15％溶液合并。混合后，将这一溶液通过静电液滴发生器后，接着通过聚合物在20mm氯化钡水溶液中的交联，形成了胶囊。
将由修饰的藻酸盐263_A12微粒与钡和甘露醇配制制备的颗粒与263_A12与少量未修饰SLG100藻酸盐(16重量％)共混制备的颗粒相比较。由修饰的藻酸盐和未修饰的藻酸盐的混合物制备的颗粒产生了更多均质的微粒群。在几个具有共混SLG100的修饰的藻酸盐的时间点，实行了具有前感官(prosense)的量化荧光分析。结果显示在表6中。几个新配方的修饰的藻酸盐在第7天与对照藻酸盐相比较，显示了更少的炎症应答。在免疫活性C57BL6小鼠的IP空间内，使用大胶囊(1.5mm的直径)的初始实验在2周后显示类似清洁的胶囊。
这些控制胶囊的日期，控制日期的数据，显示新配方和胶囊形态学可以对炎症具有明显的效果，如通过prosense所测得的。在一些聚合物中观察到改进的炎症应答(图6)，而其它受到不利的影响。
实例8：修饰的藻酸盐的抗纤维化活性的证明
在这一实例中，发生化学修饰的途径缓解藻酸盐微粒在临床前纤维化模型中的免疫识别，该模型包括NHP，其与人类的翻译相关。引线材料躲避了免疫识别以及在C57BL/6小鼠和食蟹猴的IP空间的纤维化。这一藻酸盐阻断巨噬细胞粘附，异物应答的萎缩激活，并且提供必需的表面性质的理解，以克服植入材料的纤维化。
I.方法
A.藻酸盐的化学修饰
1.藻酸盐的酰胺化
将藻酸盐(NovaMatrix公司的Pronova UPVLVG，1当量，100mg＝0.52mmol可用于反应的COOH)溶解作为2％藻酸盐的3:2的水:乙腈混合物溶液(5ml总体积)。随后将胺(N1至N9、Z1、Z2)(1当量，Sigma Aldrich公司或TCI美国公司)与偶联剂2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三唑(CDMT，0.5当量，45mg，Sigma Aldrich公司)与4-甲基吗啉(NMM，1当量，56μl，SigmaAldrich公司)添加进混合物。在55℃下，搅拌过夜，并且在减压下除去溶剂。将所得到的固体溶解在水中，并通过氰基修饰硅胶(硅循环)过滤，以除去不溶沉积物。然后，使用DI水，经10000的MWCO裂解膜对得到的溶液进行过夜透析，以进一步纯化聚合物。然后，冻干所得到的溶液，以得到纯的化合物。
2.藻酸盐的酯化
将藻酸盐(NovaMatrix公司的Pronova UPVLVG，1当量，100mg＝0.52mmol可用于反应的COOH)溶解作为2％藻酸盐的3:2的水:醇混合物溶液(5ml的总体积)。随后添加偶联剂2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三唑(CDMT，0.5当量，45mg，Sigma Aldrich公司)与4-甲基吗啉(NMM，1当量，56μl，Sigma Aldrich公司)，并且在55℃下对混合物搅拌过夜。第二天，减压下除去溶剂。将所得到的固体溶解在水中，并通过氰基修饰硅胶(硅循环)过滤，以除去不溶沉积物。然后，使用DI水，经10000的MWCO裂解膜对得到的溶液进行过夜透析，以进一步纯化聚合物。然后，冻干所得到的溶液，以得到纯的化合物。
3.Huisgen环加成(“点击”)
在第二步中，将与Z2反应的藻酸盐溶解在水:甲醇1:1溶液中(总共5ml)。添加叠氮化钠(0.25当量，19mg，Sigma Aldrich公司)、L-型抗坏血酸钠盐(0.05当量，19mg，SigmaAldrich公司)、反-N,N'-二甲基环己烷-1,2-二胺(0.25当量，典型地20μl，Sigma Aldrich公司)、碘化亚铜(I)(0.25当量，10mg，Sigma Aldrich公司)作为偶联剂。然后，添加0.51mmol的各自炔(Y1至Y20)，并在55℃下对该混合物搅拌过夜。减压下除去溶剂。将所得到的固体溶解在水中，并通过氰基修饰硅胶过滤，以除去不溶沉积物。冻干该澄清溶液，并溶解在5ml水中，并进行透析。然后，使用DI水，经10000的MWCO裂解膜对得到的溶液进行过夜透析，以进一步纯化聚合物。然后，冻干所得到的溶液，以得到纯的化合物。
在第二步中，将与Z1反应的藻酸盐溶解在水:甲醇1:1溶液中(总共5ml)。添加三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA，0.2当量，50mg，Sigma Aldrich公司)、三乙胺(0.25当量，典型地15μl，Sigma Aldrich公司)、碘化亚铜(I)(0.25当量，5mg，SigmaAldrich公司)作为偶联剂。随后，添加0.51mmol的各自炔，并在55℃下对该混合物搅拌过夜。减压下除去溶剂。将所得到的固体溶解在水中，并通过氰基修饰硅胶过滤，以除去不溶沉积物。冻干该澄清溶液，并溶解在5ml水中，并进行透析。然后，使用DI水，经10000的MWCO裂解膜对得到的溶液进行过夜透析，以进一步纯化聚合物。然后，冻干所得到的溶液，以得到纯的化合物。
4.Z2-Y12、Z1-Y15和Z1-Y19制剂的优化合成：
Z2-Y12胺：
将10g 2-(2-丙炔氧基)四氢吡喃(1当量，71.36mmol)添加进5.1g叠氮化钠(1.1当量，78.5mmol)、1.41g抗坏血酸钠盐(0.1当量，7.14mmol)、2.29ml反-N,N'-二甲基环己烷-1,2-二胺(0.25当量，17.83mmol)、3.4g碘化亚铜(I)(0.25当量，17.83mmol)的75ml甲醇溶液中。将19.97g盐酸4-吲哚苄胺添加进这一混合物。在55℃下，对反应搅拌过夜。在减压下除去溶剂。通过液相色谱法，在硅胶上使用二氯甲烷:尿素(具有3％的NH4OH的22％的MeOHDCM溶液)混合物0％-->40％，纯化原反应，然后，将产品与下述的藻酸盐反应。
Z1-Y15胺：
将3.5g的4-炔丙基硫代吗啉1,1-二氧化物(1当量，20mmol)添加进2.5gTBTA(0.2当量，4mmol)、750μl三乙胺(0.5当量，10mmol)、250mg碘化亚铜(I)(0.06当量，1.3mmol)的50ml甲醇溶液中。将混合物冷却至0℃，并且添加5.25ml的11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷基-1-胺(1当量，20mmol)。在55℃下，对反应搅拌过夜。在减压下除去溶剂。通过液相色谱法，在C18柱上使用二氯甲烷:尿素(具有3％的NH4OH的22％的MeOH的DCM溶液)混合物0％-->100％，纯化原反应。然后，将产品与下述的藻酸盐反应。
Z1-Y19胺：
3g的4-乙炔苯胺(1当量20.2mmol)添加进2.5gTBTA(0.2当量，4mmol)、750μl三乙胺(0.5当量，10.1mmol)、250mg碘化亚铜(I)(0.06当量，1.31mmol)的50ml甲醇溶液中。将混合物冷却至0℃，并且添加5.25ml的11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷基-1-胺(1当量，20mmol)。在55℃下，对反应搅拌过夜。在减压下除去溶剂。通过液相色谱法，在氰基功能化的C18柱上使用二氯甲烷:尿素(具有3％的NH4OH的22％MeOH的DCM溶液)混合物0％-->30％，纯化原反应。然后，将产品与下述的藻酸盐反应。
藻酸盐的反应：
将1.5g的UPVLVG(1当量)溶解在45ml的水中，并且添加675mg的2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三唑(CDMT，0.5当量)和840μl的N--甲基吗啡(NMM，1当量)。然后，将7.65mmol的Z2-Y12、Z1-Y15或Z1-Y19胺溶解在22.5ml乙腈中并且添加进混合物中。在55℃下，对反应搅拌过夜。在减压下除去溶剂，并且将固体溶解在水中。氰基功能化硅胶垫过滤该溶液，并且减压下除去水以浓缩该溶液。然后用10000的MWCO膜在DI水中透析过夜。减压下除去水，以得到功能化的藻酸盐。
B.胶囊的形成
静电液滴发生器如下设置：ES系列0-100kV，20瓦高压发电机(Gamma ES系列，Gamma High Voltage Research，FL，USA)，其连接在钝尖针(SAI Infusion Technologies公司，IL，USA)的上下部。这一针粘附至5ml厄式锁注射器(BD公司，NJ，USA)，该注射器锁有垂直方向的注射泵(Pump 11Pico Plus，Harvard Apparatus，MA，USA)。注射泵将藻酸盐泵出至包含20mm的5％钡的甘露醇溶液(Sigma Aldrich公司，MO，USA)的玻璃皿中，PicoPlus注射泵的设置参数为12.06mm直径和0.2ml/min的流速。形成胶囊后，然后收集它们，并且然后用hepes缓冲液(2L去离子水中NaCl 15.428g，KCl 0.70g，MgCl2*6H2O 0.488g，50ml的hepes(1M)缓冲液(Gibco，Life Technologies公司，California，USA))4次。将藻酸盐胶囊在4℃下静置过夜。随后在0.8％的盐水中冲洗胶囊2次，并保存在4℃下直至使用。
增溶的藻酸盐：将SLG20(NovaMatrix公司，Sandvika，Norway)以1.4％重量体积比溶解在0.8％的盐水中。将SLG100(NovaMatrix公司，Sandvika，Norway)以1.2％重量体积比溶解在0.8％的盐水中。将UPVLVG(NovaMatrix公司，Sandvika，Norway)以5％重量体积比溶解在0.8％的盐水中。将所有修饰的藻酸盐以5％重量体积比初溶解在0.8％的盐水中。随后使用3％重量体积比SLG100共混修饰物，溶解在0.8％的盐水中(参见表1中的比值)。
形成不同尺寸的胶囊：对于300μm直径的胶囊，使用具有7-8kV电压的30号钝尖针(SAI Infusion Technologies公司)。对于500μm直径的胶囊，使用具有5-7kV电压的25号钝尖针(SAI Infusion Technologies公司)。对于1.5mm直径的胶囊，使用具有5-7kV电压的18号钝尖针(SAI Infusion Technologies公司)。
表1修饰的藻酸盐与SLG100的共混体积比值
修饰的藻酸盐 ％体积修饰溶液 ％体积SLG100
361_E9 70 30
411_RN8 80 20
411_OH6 60 40
411_OH9 60 40
411_OH11 50 50
411_OH3 80 20
411_RZA15 80 20
411_RZA2 50 50
411_RZA19 70 30
411_RN7 80 20
VLVG/SLG100* 80 20
表1的说明：修饰的藻酸盐与SLG100共混以制得胶囊。将修饰的藻酸盐和SLG100投入5ml的注射器并且在囊化前进行涡旋搅拌。不同的修饰的藻酸盐需要添加不同百分比体积的SLG100，以制得球形胶囊。*VLVG/SLG100是对照共混物。将未修饰的VLVG与SLG100进行共混。
C.水溶胶胶囊和其它材料球的移植
所有动物方案由麻省理工学院动物保护委员会(MIT Committee on AnimalCare)批准，并且所有手术程序和术后护理由MIT的比较医学部(MIT Division ofComparative Medicine)的兽医人员进行管理。使用3％异氟烷的氧，对免疫感受态的雄性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)进行麻醉，并将它们的腹部刮净并使用聚维酮碘(betadine)和异丙醇灭菌。沿腹部的中线，产生了0.5mm的切口，并使用钝器解剖使腹膜内层暴露。然后，用镊子抓住腹膜壁，并且沿腹白线，产生了0.5-1mm的切口。然后，将所需的胶囊体积负载在灭菌吸管，并且通过切口移植进腹膜腔。然后，使用5-0的锥度的尖的聚二恶烷酮(PDS II)可吸收缝合线，闭合该切口。然后，使用缝合夹和组织胶，闭合切口上的皮肤。术前地，所有小鼠也皮下地接受0.05mg/kg剂量的丁丙诺啡，作为预手术的止痛剂，与皮下接受的0.3ml的0.9％的盐水一起预防脱水。
D.细胞、组织和材料的回收
在移植后的所需时间点，如图和结果所指定的，使用CO2给药对小鼠进行麻醉，随后进行颈椎脱位。在特定的例子中，首先注射5ml的冰冷PBS，为了实行腹腔灌洗，清洗并收集自由漂动的腹膜内免疫细胞。然后使用镊子和剪刀，沿腹部皮肤和腹膜壁，产生切口，并且将腹腔灌洗体积冲洗进15ml的离心管(每个是用5ml的RPMI细胞培养基制备的)。接下来，将冲洗瓶的尖端插入腹腔。然后，用KREBS缓冲液冲洗掉腹部的所有材料胶囊，并冲进收集的培养皿中。保证清洗掉所有胶囊或手动回收，如果其直接纤维化为腹膜内的组织，它们将被转移至50ml锥形管中，以用于下游处理和成像。腹腔灌洗和胶囊回收后，也切除了下游FACS和表达分析中的保持纤维化腹膜内的组织。
E.回收材料胶囊的成像
对于相衬成像，用Krebs温柔地冲洗回收的材料，并将其转移至35mm的培养皿，使用Evos Xl显微镜(Advanced Microscopygroup)相衬成像。
F.ProSense试验
将雌性SKH1小鼠(6周大)用于这一试验。再将100μl的胶囊悬浮在200μl的盐水中，并且在上背的左侧上，皮下注射进小鼠。在AIN-93G纯化啮齿动物饲料(TD 94045，Harlan)，饲养小鼠，以使注射后的荧光背景最小。6天后，经过尾静脉，将100μl(4nmol)的ProSence750FAST(NEV11171，PerkinElmer公司)每个小鼠进行皮下注射。在第7天(也就是说，ProSense 750FAST静脉注射给药后的24小时)，通过IVIS光谱系统(Xenogen，CaliperLifeScience)扫描小鼠。使用3％的异氟烷氧并在整个操作中维持相同速率，且IVIS光谱系统的设置参数：暴露的系统＝7.50，分箱＝培养基，FStop＝2，激发＝605和发射＝660。使用LivingImage软件，分析图像，并且在相同小鼠上背的右侧用作信号量化期间的对照。
G.细胞染色和共聚焦免疫荧光法
将回收的样品在4％的多聚甲醛中保存过夜(稀释在1x PBS中)。随后在Krebs缓冲液(1000ml的7.889g NaCl、0.35g KCl、5.958g HEPES(Sigma-Aldrich公司，Montana，USA)、0.163g KH2PO4、0.144gMGSO4*7H2O的DiH2O溶液)冲洗样品。用10ml的PBS冲洗样品。吸出PBS，并且使用20ml的1％Triton X-100(Sigma-Aldrich公司，Montana，USA)溶液渗透细胞。在室温下培养样品10min。随后在室温下于15ml的在1x PBS中稀释的1％白蛋白溶液(Sigma-Aldrich公司，Montana，USA)中培养30min。将3ml都用1％白蛋白溶液稀释的抗体溶液(1:200CD68 488抗小鼠(BioLegend公司，California，USA)、1:200抗小鼠肌动蛋白α-平滑肌-Cy3(Sigma-Aldrich公司，Montana，USA)，1:30鬼笔环肽抗小鼠647(Life Technologies公司，California，USA)，DAPI(NucBlue Live Cell Stain ReadyProbes，Life Technologies公司，California，USA)2滴每mL)添加至每个样品。在室温下于染色溶液中培养样品45min。随后吸出染色溶液。随后用20ml用1xPBS稀释的0.1％吐温20溶液(Sigma-Aldrich公司，Montana，USA)冲洗样品2次。随后用20ml的1xPBS冲洗样品。随后将样品转移至24孔玻璃底板上。吸出过量的PBS，并且添加1ml的50％甘油溶液(Sigma-Aldrich公司，Montana，USA)。使用带有ZEN显微镜软件的Zeiss LSM 700系统，对染色样品进行成像和分析。使用Photoshop(Adobe公司，Seattle，WA)，调整所获的图像为线性以供显示。
H.蛋白质提取物
在70％振幅(QSonica超声发生器，型号Q125，QSonica有限责任公司)，于冰上，在NP40细胞裂解液缓冲液(目录号FNN0021，Invitrogen)中，以100μl胶囊与200μl裂解液缓冲液的比值，使用100mm PMSF和1x蛋白酶抑制剂(Halt Protease inhibitor single-usecocktail，目录号78430，Thermo Scientific公司)，进行3次30s接通30s断开为周期的超声，将在回收胶囊上对细胞进行裂解。将溶解产物在4℃下于12000rpm离心20min；将包含蛋白质的上清液吸出至冰中保存的新试管中。用相同体积的裂解缓冲液冲洗小球(也就是说，用200μl的裂解缓冲液冲洗100μl胶囊的小球)，并且随后在4℃下于12000rpm离心20min，将上清液与先前的上清液合并。将蛋白质保存在-80℃以便将来使用。
I.酶联斑点法(小鼠的细胞因子陈列)
使用蛋白质组分析器小鼠细胞因子陈列板试剂盒(Proteome Profiler MouseCytokine Array Panel A kit)(目录号ARY006，R&D系统)，完成了这一试验。对于每个膜，将200μl的蛋白质溶液与100μl的样品缓冲液(缓冲液陈列4)和1.2ml的阻断缓冲液(缓冲液陈列6)混合，然后添加15μl的重组小鼠细胞因子阵列板检测抗体混合物(Mouse CytokineArray Panel A Detection Antibody Cocktail)并在室温下培养1小时。在摇床振荡器上，使用阻断缓冲液(缓冲液陈列6)培养阵列膜2小时，同时，并且然后吸出阻断缓冲液，将制备的样品/抗体混合物添加在膜上，并在4℃下于摇床振荡器上培养过夜。在摇床振荡器上，用20ml1x冲洗缓冲液冲洗膜3次，10min，并且用离子水清洗一次，然后在摇床振荡器上，使用荧光团共轭的链霉亲和素(1:5000稀释，目录号926-32230，Li-Cor)在室温下进行探测30min，用冲洗缓冲液冲洗3次并用去离子水清洗1次，再按上述步骤进行一次。使用OdysseyDetection(Li-Cor，系列号ODY-2329)，在800nm波长，可视化抗体抗原复合物。通过Image J软件，分析斑点的密度。
J.免疫印迹
对于每个通道，在95℃下，煮沸12μl蛋白质溶液与1x负载的缓冲液(SDS-样品缓冲液，目录号BP-111R，Boston BioProducts公司)20min，并且使SDS聚丙烯胺凝胶电泳(任何Kd15孔，Biorad，目录号456-9036))，并且使用3μl的Precision Plus Protein Dual XtraStands(目录号161-0377，Bio-rad公司)作为用于显示带的位置的梯状物，并且然后印迹在硝化纤维膜(目录号162-0213，Biorad公司)上。使用抗-α平滑肌肌动蛋白抗体(1:400稀释，α平滑肌肌动蛋白的兔多克隆体；目录号ab5694，AbCam公司)和抗-β肌动蛋白抗体(1:4000稀释，在小鼠中产生的多克隆的抗β-肌动蛋白抗体；目录号A1978，Sigma Aldirch公司)作为驴抗兔(1:15000稀释，目录号926-32213，Li-Cor公司)和羊抗小鼠(1:15000稀释，目录号926-68070，Li-Cor公司)的荧光基团共轭二级抗体的负载对照，探测印迹。使用OdysseyDetection(Li-Cor，序列号ODY-2329)，在700和800nm的波长，可视化抗体抗原复合物。通过Image J软件，分析带的密度。
K.NanoString分析
移植后，在不同时间点上，从组织样品中分离假移植(MT)对照或有500或1500μm藻酸盐胶囊的小鼠(n＝5/每组)的RNA。量化各自的RNA，稀释至适宜的浓度(100ng/μl)，并且然后根据NanoString制造商对表达分析的方案，经我们定制的多重53基因小鼠巨噬细胞亚型板，处理500ng的每个样品。通过n计数器(NanoString Technologies公司，Seattle，WA)的量化，获得RNA水平(绝对复制数目)，并且使用n解算器分析软件(NanoStringTechnologies公司，Seattle，WA)，分析组样品。
L.FACS分析
根据制造商的方案，使用温和的MACS分离器(Miltenyi Biotec公司，Auburn，CA)，制备新鲜切除组织的单细胞悬浮物。在PEB分离缓冲液(1X PBS，pH 7.2，0.5％BSA和2mmEDTA)中制备单细胞悬浮物，并将悬浮物通过70μm的过滤器(目录号22363548，FisherScientific，Pittsburgh，PA)。然后，使用5ml的1XRBC裂解缓冲液(目录号00-4333，eBioscience，San Diego，CA，USA)，在4℃下，将所有组织和材料样品衍生的单细胞群体进行红细胞裂解5min。通过添加20ml的灭菌1X PBS，终止反应。在300-400g，在4℃下，对保留的细胞离心，并且重新悬浮在eBioscience染色缓冲液(目录号00-4222)的最小体积(～50μl)以用于抗体培养。然后，使用对细胞标志物CD68特异性的荧光标记单克隆抗体(1μl(0.5μg)/样品；CD68-Alexa647，Clone FA-11，目录号11-5931，BioLegend公司)、Ly-6G(Gr-1)(1μl(0.5μg)/样品；Ly-6G-Alexa-647，Clone RB6-8C5，目录号108418，BioLegend公司)、CD11b(1μl(0.2μg)/样品；或CD11b-Alexa-488，Clone M1/70，目录号101217，BioLegend公司)中的两个，将所有样本在暗处于4℃下共染色25分钟。然后添加2ml的eBioscience流式细胞仪染色缓冲液(目录号00-4222，eBioscience公司)，并且在400-500g，于4℃，离心样品5min。通过吸出除去上清液，并且用染色缓冲液重复这一清洗步骤2次或多次。进行第三次清洗，重新将每个样品悬浮在500μl的流式细胞仪染色缓冲液中，并且通过40μm的过滤器(目录号22363547，Fisher Scientific公司)，使用BD FACSCalibur(目录号342975，BDBiosciences公司，San Jose，CA，USA)，用于最后FACS分析。对于合适背景和激光强度的设置参数，也进行了未染色、单抗，和IgG(用Alexa-488或Alexa-647标记的，BioLegend公司)对照。
M.活体成像
对于活体成像，将500μm和1500μm尺寸的SLG20水溶胶负载在Qdot 605(Lifetechnologies，Grand Island，NY)，并且手术植入进C57BL/6-Tg(Csf1r-EGFP-NGFR/FKBP1A/TNFRSF6)2Bck/J的上述小鼠中。在移植后7天，将小鼠置于异氟烷麻醉中，并且在暴露珠的原始手术位点处，产生小切口。将小鼠置于倒置显微镜上，并使用25x、N.A.1.05物镜在860nm的激发波长于Olympus FVB-1000MP多光子显微镜上成像。依赖于图像，在20-45min的时间序列的每2min间隔处得到200μm(10μm的步进)的Z-堆积。将小鼠保持在持续异氟烷麻醉中，并且在整个成像段进行监护。使用Velocity 3D图像分析软件(Perkin Elmer，Waltham，MA)分析获得的图像。
N.共焦拉曼光谱
样品制备：在石英盖玻片(043210-KJ，Alfa Aesar公司)上，干燥一滴具有缓冲溶液的水溶胶胶囊。为了除去干燥缓冲溶液中的盐，将一滴蒸馏水温和地施用在干燥样品的顶部并立即被组织吸收。这样，制备了用于拉曼绘图的干燥的水溶胶胶囊。
仪器：如先前所报道的，定制NIR共焦拉曼显微镜系统(Kang等人，Combinedconfocal Raman and quantitative phase microscopy system for biomedicaldiagnosis。Biomed.Opt.Exp.2(9)：2484-2492(2011)；Kang等人，Measuring uptakedynamics of multiple identifiable carbon nanotube species via high-speedconfocal Raman imaging of live cells。Nano Letters 12(12)：6170-6174(2012))。简单的说，使用785nm波长的Ti：Sapphire激光(3900S，Spectra-Physics)用于样品激发。通过带通滤波器(BPF，LL01-785-12.5，Semrock)，过滤准直束并且用双轴检流计反光镜重新定向。通过检流计反光镜(CT-6210，Cambridge Technology公司)，实行了高速XY扫描。使用1.2NA水浸物镜(Olympus UPLSAPO60XWIR60X/1.20)，以将激光聚焦在样品上并收集反向散射的光。使用与差示测微计(DRV517，Thorlabs)联合的压电致动器，以分别实行样品聚焦的粗调节和细调节。将回转镜置于管透镜之后，从而使用带有75X放大倍率的摄像机，观察非相干传输源的样品焦平面。样品中的反向散射拉曼光通过两个双色镜(DM1：SemrockLPD01-785RU-25，DM2：Semrock LPD01-785RU-25×36×1.1)，并通过多模光纤(ThorlabsM14L01)收集。将所收集的信号传输至光谱仪(Holospec f/1.8i，Kaiser光学系统)，并且通过热电冷却进行背照和深度耗尽CCD(PIXIS：100BR_eXcelon，Princeton Instruments)来进行确定。使用LabView 8.6软件(National Instruments)、数据采集板(PCI-6251，National Instruments)和MATLAB2013软件(Mathworks)，以控制系统，采集数据和分析数据。
拉曼光谱测量：将785nm的60mW的激光功率聚焦在微米斑点尺寸并且用于光栅扫描水溶胶样品。使用积分时间1.0s/pixel，在45μm×45μm的区域，采集30×30的光谱。总测量时间约为15min。
数据处理：基于两个拉曼谱带的强度，生成了两张拉曼图像。对这些拉曼图像进行调整大小和调整尺寸，以作为相同区域相应明视场图像顶部的红色和绿色。
II.聚合物和化合物表征
N7:1H(400MHz；D2O)：3.10–4.10(m，藻酸盐的质子)，4.20(2H，s，H2N-CH2-Ph)，4.40–5.20(m，藻酸盐的质子)，7.41(2H，m，苯基)，7.49(3H，m，苯基)
IR(ATR):3234、1579、1465、1407、1368、1078、810、692、517。
N8:1H(400MHz；D2O)：3.00–3.20(m，藻酸盐的质子)，3.60(8H，m，乙氧基)，3.60–5.10(m，藻酸盐的质子)。
IR(ATR):3233、2927、2358、1591、1405、1318、1022、945、810。
O3:1H(400MHz；D2O)：1.90-2.10(m，4H，糠基)，3.23(m，2H，糠基)3.26–4.00(m，藻酸盐的质子)4.03(3H，m，O-CH2-C[糠基])，4.10–5.20(m，藻酸盐的质子)
IR(ATR):3202、3070、2344、1711、1594、1398、1021、715、549。
O6:1H(400MHz；D2O)：3.60–4.52(m，藻酸盐的质子)，4.59(2H，m，O-CH2-C[呋喃甲基])，4.6–5.2(m，藻酸盐的质子)，6.45(2H，m，CH-CH＝CH-OFurfuryl)，7.53(1H，m，CH-CH＝CH-O呋喃甲基)。
IR(ATR):3232、2360、1614、1410、1028、538。
O9:1H(400MHz；D2O)：0.20(s，9H，呋喃甲基)3.10–5.20(m，藻酸盐的质子)
IR(ATR):3310、2939、2360、1592、1406、1316、1081、1020、902、770。
O11:1H(400MHz；D2O)：3.05-4.50(m，藻酸盐的质子)，4.52(2H，s，O-CH2-Ph)，4.52-5.2(m，藻酸盐的质子)，6.88(2H，m，苯基)，7.26(2H，m，苯基)
IR(ATR):3370、3089、1597、1517、1454、1235、1207、989、835、801、561。
Z1-Y2:1H(400MHz；D2O)：3.05-3.40(m，藻酸盐的质子)，3.40-3.66(16H，m，ethoxy)，3.75(3H，s，甲氧基)，3.8–5.1(m，藻酸盐的质子)，7.19(1H，m，苯基)，7.50(1H，m，苯基)，7.94(1H，m，苯基)，8.00(1H，m，苯基)，8.49(1H，s，三唑)。
IR(ATR):3144、2922、1592、1400、1329、1019、943。
Z1-Y15:1H(400MHz；D2O)：3.07(4H，s，N-CH2-CH2-S)，3.17-3.40(m，藻酸盐的质子)，3.46(4H，s，N-CH2-CH2-S)，3.50-3.70(16H，m，ethoxy)，3.7–5.2(m，藻酸盐的质子)，8.08(1H，s，三唑)。
IR(ATR)：3268、2933、2250、1602、1409、1292、1119、1023、946。
Z1-Y19:1H(400MHz；D2O)：3.05-3.40(m，藻酸盐的质子)，3.40-3.66(16H，m，O-乙氧基)，4.4-5.1(m，藻酸盐的质子)，6.96(2H，m，苯基)，7.63(3H，m，苯基)，8.23(1H，s，三唑)。
IR(ATR):3234、2929、2361、1593、1406、1317、1024、947、810。
Z2-Y12:1H(400MHz；D2O)：1.57-1.78(m，6H，吡喃)，3.10-4.40(m，藻酸盐的质子)，4.48(4H，m，吡喃)，4.50-5.10(m，藻酸盐的质子)，7.56(2H，m，苯基)，7.76(3H，m，苯基)，8.51(1H，s，三唑)。
IR(ATR):3235、2933、2111、1592、1405、1290、1023、946。
N4-N2:1H(400MHz；D2O)：2.72(s，3H，N-CH3二氧戊烷)2.77(s，3H，N-CH3苄基)，3.36(2H，d，N-CH2-二氧戊烷)，3.55-4.20(m，藻酸盐的质子)，4.22(2H，m，N-CH2-Ph)，4.50–5.10(m，藻酸盐的质子)，5.19(1H，m，CH2-CH-O二氧戊烷)，7.51(5H，m，苯基)。
IR(ATR):3250、2894、1601、1409、1127、1088、1029、946。
O3-O10:1H(400MHz；D2O)：1.60-2.20(m，4H，四氢呋喃甲基)，3.55-5.10(m，藻酸盐的质子)，3.78(2H，m，CH2-CH2-O四氢呋喃甲基)，3.85(3H，s，COO-CH3)，4.13-4.30(3H，m，N-CH2-四氢呋喃甲基)。
IR(ATR):3448、2926、2111、1618、1420、1290、1096、948、904。
N9-O8:1H(400MHz；D2O)：1.28(m，3H，N-CH2-CH3)，1.32(m，3H，O-CH2-CH3)，1.63(m，3H，N-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)，1.74(m，3H，N-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)，3.09-3.40(m，6H，CH3-CH2-N-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)，3.55-5.10(m，藻酸盐的质子)，4.06(m，3H，O-CH2-CH3)。
IR(ATR):3422、1709、1655、1611、1474、1395、1042、798。
小分子的制备：
Z2-Y12胺：
Figure BDA0002981759510001201
1H(400MHz；MeOD)：1.57(m，4H，吡喃)，1.72(m，1H，吡喃)，1.82(m，1H，吡喃)，3.58(m，1H，吡喃)，3.87(s，1H，NH2-CH2-Ph)，3.92(m，1H，吡喃)，4.68(d，1H，J＝12Hz，O-CH2-三唑)，4.79(m，1H，O-CH-O，吡喃)，4.97(d，1H，J＝12Hz，O-CH2-三唑)，7.54(m，2H，芳基)，7.80(m，2H，芳基)，8.49(s，1H，三唑)。
13C(400MHz；MeOD):20.3(CH2吡喃)，26.5(CH2吡喃)，31.5(CH2吡喃)，46.1(NH2CH2)，61.0(O-CH2-C)，63.3(CH2–O吡喃)，99.5(O-CH-O吡喃)，121.6(CH芳基)，123.17(CH三唑)，129.9(CH芳基)，137.1(Cq-N芳基)，144.9(Cq-C芳基)，146.9(C三唑)。
高分辨MS：M+1＝289.1665+3.1ppm。
Z1-Y15胺：
Figure BDA0002981759510001211
1H(400MHz；D2O)：2.86(2H，s，NH2)，3.01(4H，m，N-CH2-CH2-S)，3.10(4H，m，N-CH2-CH2-S)，3.55(2H，t，J＝5.2Hz，NH2-CH2)，3.61(8H，m，PEG)，3.85(2H，s，硫代吗啉-CH2-三唑)，3.90(2H，t，J＝5.2Hz，N-CH2-CH2-O)，4.59(t，2H，J＝5.2，N-CH2-CH2-O)，7.99(1H，s，三唑)。
13C(400MHz；MeOH):41.7(NH2-CH2)，51.42(N-CH2)，51.48(N-CH2硫代吗啉)，52.1(S-CH2 Thiomorpholine)，52.4(硫代吗啉-CH2-三唑)，70.4-72.1(m，PEG)，126.0(CH三唑)，144.5(C三唑)。
高分辨MS：M+1＝392.1968-6.1ppm。
Z1-Y19胺：
Figure BDA0002981759510001212
1H(400MHz；MeOD)：2.79(t，2H，J＝5.2Hz，NH2-CH2)，3.46(t，2H，J＝5.2，NH2-CH2-CH2)，3.53(m，4H，PEG)，3.61(m，4H，PEG)，3.91(t，2H，J＝5.2，N-CH2-CH2-O)，4.58(t，2H，J＝5.2，N-CH2-CH2-O)，6.76(m，2H，芳基)，7.54(m，2H，芳基)，8.14(s，1H，三唑)。
13C(400MHz；MeOD):41.6(NH2-CH2)，51.4(N-CH2)，70.3-71.9(m，PEG)，116.4(CH芳基)，121.1(Cq-C)，121.5(CH三唑)，127.7(CH芳基)，149.4(C-NH2芳基)，149.5(C三唑)。
高分辨MS：M+1＝336.2036-8.3ppm.
III.结果
使用表2中所列的胺和醇制备修饰的藻酸盐。在第一个组合反应中，在2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)和N-甲基吗啡(NMM)的存在下，UPLVG藻酸盐与表2中化合物的一个反应。为了制备多重修饰的藻酸盐，使用表2中不同的醇或胺，重复第一步。然后，将使用胺Z2修饰的藻酸盐与叠氮化钠反应以制备对应叠氮修饰的藻酸盐。然后，在CuSO4和抗坏血酸钠的存在下，将这些藻酸盐与胺Z1修饰的藻酸盐一起与表2所列的炔的一个反应，以便制备四唑修饰的藻酸盐。
在每个共价修饰后，通过氰基修饰的硅胶柱，过滤修饰的藻酸盐，以捕获大多数有机杂质。最后，完成所有共价改性步骤后，用10000的MWCO膜，对该修饰的藻酸盐进行透析以除去任何保留的小分子或低分子量杂质。
由1H NMR分析，确定该修饰的藻酸盐的杂质。收集每个修饰的藻酸盐聚合物的1HNMR光谱，并将对应于该修饰的藻酸盐聚合物和对应于任何杂质的峰进行积分，以确定样品中每个物种的相对数量。
表2 73种胶囊配方的化学修饰物
Figure BDA0002981759510001221
Figure BDA0002981759510001231
A.藻酸盐的化学修饰缩短了C57BL/6小鼠中的异物应答
对于抗纤维化性质的理化参数所知甚少，这使得合理设计的途径变得有挑战性(Williams，Biomaterials 29：2941–2953(2008))。为了更好地理解具有恰当抗纤维化性质的结构特征，选择不同的化合物的池，该化合物可以对聚合物藻酸盐骨架的潜在功能和性质进行修饰(图7)。使用各种胺、醇、叠氮化物和炔，构建了774个藻酸盐类似物的库(图9)。在774个藻酸盐类似物中，35个类似物导致不能接受的低收率以及634个类似物被确定能够在修饰后凝胶。然后，将这些藻酸盐评估为皮下高通量小鼠中测量急性炎症水平的大多数水溶胶(表3-表7)。200个藻酸盐类似物显示了比对照藻酸盐UPVLVG更低的组织蛋白酶活性水平，该藻酸盐UPVLVG用作库合成的起始原料。成分名称是指表2和图7中的成分。这一试验监测了使用成像剂的皮下嗜中性白细胞的激活，该成像剂产生了增加的荧光，其对应于增加的嗜中性白细胞介导的组织蛋白酶活性。两百个类似物显示了比基本未修饰的超纯VLVG藻酸盐更低的荧光水平(图11)。
因为微胶囊在药物传输和细胞微囊化施用中具有优选的藻酸盐几何学，上面200个实行最初筛选的聚合物的70个(表2)被制成300μm的胶囊并在皮下炎症试验中被再次评估(图12)。使用化学修饰的藻酸盐证明在构建微球中有问题，通过将超纯SLG100藻酸盐的少量与藻酸盐类似物溶液共混，保存了好的胶囊形态学。
表3异常修饰的藻酸盐聚合物的组织蛋白酶活性
Figure BDA0002981759510001232
Figure BDA0002981759510001241
表4多重修饰的藻酸盐聚合物的组织蛋白酶活性
N8 N9 N3 N6 N4 N5 N2 N1 N7
N7 - - 0.20 - - - - - -
N9 0.51 - - - 0.42 0.54 0.92 - 1.37
N4 1.37 0.48 2.40 - -1.14 - 2.17 0.76 1.17
N2 - 0.81 - - 0.86 0.80 -2.40 - -
N6 - 0.60 - -- - - - 0.91 1.37
N8 0.87 0.97 - - - 1.17 0.86 - 0.97
O3 0.71 0.88 0.60 0.72 0.6 0.58 0.58 0.64 0.76
O2 0.63 0.99 0.78 0.69 0.91 0.64 0.75 0.72 1.17
O10 1.17 0.72 0.95 0.78 0.92 0.88 0.82 0.88 0.69
O1 0.97 0.91 0.80 0.76 0.92 0.89 0.88 0.88 0.75
O8 0.87 0.92 0.81 0.93 0.78 0.80 0.84 0.81 0.89
O12 0.76 0.88 0.79 0.87 0.81 0.75 0.82 0.75 0.76
O9 0.88 0.92 1.17 0.85 0.84 0.78 1.17 1.17 0.89
O7 1.17 0.97 0.99 0.96 1.17 1.17 1.17 0.84 1.37
O4 0.89 0.71 1.17 0.78 1.37 1.14 0.76 0.91 1.60
O5 - 0.88 0.54 0.96 0.96 1.37 0.60 0.69 1.17
O11 1.00 1.37 - 1.17 1.17 - 0.75 0.69 1.17
N1 2.57 1.77 - 1.17 - 0.56 - -0.50 1.17
N3 1.37 1.17 -0.82 0.75 - - 1.57 - -
N5 0.75 1.60 0.69 1.60 - -- 0.63 - 0.24
O6 0.75 - 0.63 - 0.69 0.89 0.82 0.81 -
表5多重修饰的藻酸盐聚合物的组织蛋白酶活性
Figure BDA0002981759510001242
Figure BDA0002981759510001251
表6多重修饰的藻酸盐聚合物的组织蛋白酶活性
N1 N4 N7 N3 N2 N8 N5 N9 N6
Z1-Y4 0.63 0.51 1.17 0.51 0.60 1.37 1.37 1.37 1.17
Z1-Y6 1.17 0.88 1.17 0.84 0.75 0.87 0.75 1.57 0.99
Z1-Y17 0.72 0.78 0.91 0.58 0.79 0.56 0.76 0.81 0.69
Z1-Y1 0.63 0.58 1.17 0.50 0.54 0.50 0.50 1.17 1.17
Z1-Y2 1.00 1.37 1.17 1.37 1.37 1.37 1.37 1.37 1.37
Z1-Y11 1.00 1.37 1.37 1.37 1.37 1.00 1.17 1.34 1.37
Z1-Y10 1.14 1.00 1.37 1.37 1.14 1.37 1.37 0.97 1.37
Z1-Y12 1.37 1.17 1.37 1.37 1.37 1.17 1.37 1.17 1.17
Z1-Y13 1.14 0.99 1.14 1.37 1.17 1.17 1.17 1.17 1.17
Z1-Y16 1.37 1.14 1.17 1.37 1.17 1.00 1.17 0.97 0.96
Z1-Y9 0.97 0.94 0.94 0.97 0.93 0.84 0.96 0.87 0.84
Z1-Y14 0.89 0.99 0.85 0.88 1.17 0.76 0.78 0.85 0.86
Z1-Y15 0.94 0.92 0.99 0.89 1.17 1.17 1.37 0.89 1.37
Z1-Y7 1.37 0.77 1.00 0.76 1.37 0.76 0.75 1.14 1.17
Z1-Y5 1.14 0.99 1.17 0.96 1.00 1.37 1.57 1.17 1.17
Z1-Y20 0.75 0.84 1.14 0.97 1.14 1.37 1.17 0.81 0.79
Z1-Y3 1.37 1.17 0.86 1.17 1.37 1.37 0.94 0.58 0.96
Z1-Y18 0.75 0.82 - 0.77 - - - 0.63 0.63
Z1-Y19 1.17 - 0.99 - - - - - 1.17
Z1-Y8 - 1.17 1.00 0.94 0.92 0.94 1.14 1.37 0.97
表7多重修饰的藻酸盐聚合物的组织蛋白酶活性
Figure BDA0002981759510001252
Figure BDA0002981759510001261
所有修饰的微胶囊配方需要这一共混：由未修饰的藻酸盐VLVG和SLG100(V/S)共混溶液构成的胶囊，以及作为对照的传统SLG20胶囊配方。在70个配制的藻酸盐微胶囊中，使用一些聚合物，观察到改进的炎症应答(图12)。前10个修饰的微胶囊显示了10-40％的炎症水平，其低于对照藻酸盐的低。为了看急性发炎的这些较低水平是否转换为纤维化的较低水平，在28天后，对这个前10藻酸盐的植入位点进行取样、分段并组织学上处理。三个修饰的藻酸盐，Z2-Y12、Z1-Y15和Z1-Y19，与能够完全从周围组织中分离的胶囊，显示了最小的纤维化过度生长。
为了皮下结果是否转移至其它植入位点，将前10带头的修饰的藻酸盐的300μm胶囊植入C57BL/6小鼠的腹膜内(IP)空间。在第14天后回收胶囊，并且评估胶囊对细胞和纤维化组织的累积。回收的对照胶囊的相衬成像显示出激烈的纤维化应答，在具有黄色胶囊结块的胶囊上观察到白色纤维化胶原沉积。通过比较，前十个带头的藻酸盐显示出不同程度的纤维化，修饰的藻酸盐Z2-Y12、Z1-Y15和Z1-Y19显示出几乎没有纤维化沉积并作为具有抗纤维化性质的材料出现。
Z2-Y12、Z1-Y15和Z1-Y19胶囊的细胞染色和共聚焦显微镜显示出很小的巨噬细胞(CD68)、肌成纤维细胞(SMA)或一般细胞沉积(DAPI)的不存在。然而，传统的微胶囊藻酸盐显示出这些细胞群体在回收胶囊中明显的数量。细胞沉积是材料识别的关键机械成分和成胶沉积的引发剂，并且细胞不存在于胶囊表面还证明了这些修饰的藻酸盐的抗纤维化性质。为了确认这些结果，通过免疫印迹，量化了Z2-Y12、Z1-Y15、Z1-Y19和对照胶囊的SMA水平。也对40个不同的从回收微胶囊中提取的蛋白质样品的细胞因子进行了简述。Z2-Y12微胶囊的细胞因子的简述显示出所有实验样品最低的细胞因子水平。更重要地，回收的Z2-Y12胶囊具有TNF-α、IL-13、IL-6、G-CSF、GM-CSF、IL-4、CCL2和CCL4的低蛋白质水平，这些是异物应答和纤维化的炎症介质(Rodriguez等人，J.Biomed.Mater.)Res.A 89：152–159(2009))。已知的发炎因子和从回收胶囊中分离出的免疫细胞标记物的七十九个RNA序列的量化也支持Z2-Y12植入物炎症的较低水平。在周围IP流体和Z2-Y12植入小鼠的脂肪组织的RNA图谱比使用对照胶囊植入的小鼠也更接近类似模拟治疗，还证明了这一材料较低的发炎潜力。
B.抗纤维化藻酸盐显示较低的巨噬细胞粘附
IP14天后，对回收胶囊实行FACS分析，以表征不同免疫群体，这些群体补充进入与对照胶囊相比较的Z2-Y12胶囊中(图8)。Z2-Y12胶囊显示巨噬细胞和嗜中性细胞群体明显较低的百分比，表明Z2-Y12胶囊可以干涉免疫细胞群体的补充或发炎应答的放大。为了看较低的巨噬细胞补充在体内是否明显、在荧光Z2-Y12胶囊在MAFIA小鼠(巨噬细胞表达GFP)中植入7天后，实行IP活体成像并将它们与荧光SLG20胶囊相比较。SLG20胶囊显示出在这些胶囊表面活性聚合巨噬细胞的大群体，其指示异物巨细胞的形成和明显朝纤维化发展的步骤。通过比较，Z2-Y12胶囊显示出胶囊附近巨噬细胞甚至更低的水平，并且没有可见的巨噬细胞聚合。
免疫细胞补充/激活在Z2-Y12胶囊表面上的缺乏与创造差异表面的聚合物链的化学修饰一致。实行共焦拉曼光谱绘图，以确定Z2-Y12化学修饰物在微胶囊中的分布。显著地，对于四氢吡喃修饰，诊断的拉曼特征码在微胶囊表面上具有比在核心处更高的强度。然后，实行Z2-Y12微胶囊上的冷冻断裂低温SEM，以检查藻酸盐类似物微胶囊表面和核心的拓扑学并将它们与对照胶囊配方相比较。Z2-Y12胶囊在整个胶囊核心与共混对照或传统SLG20胶囊相比较时，显示更可变的透气量，其具有在尺寸上从1μm至10μm范围的孔。不同胶囊配方之间的表面特征非常明显；Z2-Y12胶囊的表面显示出更少的多坑特征。这些表面差异很可能是由修饰的聚合物链与周围水溶液之间边界层处的相互作用来创造。
C.Z2-Y12、Z1-Y15和Z1-Y19在非人灵长类动物中的抗纤维化
带头的材料，Z2-Y12、Z1-Y15和Z1-Y19，被推进灵长类动物研究中，以实验它们在NHP模型中的抗纤维化性质。我们实验室的先前报道已经完成球形体尺寸也是减轻纤维化的重要参数，更大的球体(>1mm)显示抗纤维化性质。使用微创腹腔镜程序，将传统SLg20胶囊和Z2-Y12、Z1-Y15和Z1-Y19配制的胶囊的1.5mm的胶囊分别移植进非人类灵长类动物中(n＝3，每个)。通过第2和4周的IP灌洗，回收胶囊，每群中的一个灵长动物允许持续6个月。在移植14天后，SLG20 1.5mm的胶囊也很大程度上游离并在第2周也没有被嵌入组织中。然而，许多胶囊是纤维化的并聚集在一起。1.5mm的Z2-Y12、Z1-Y15和Z1-Y19保留了高补充率和周围组织中的最小嵌入。在第2和4周，与1.5mmSLG20胶囊相比较，Z2-Y12、Z1-Y15和Z1-Y19胶囊在相衬成像中显示明显降低的纤维化应答。回收胶囊的共聚焦成像和FACS分析显示出大的1.5mm的SLG20胶囊具有更多的广泛免疫巨噬细胞和纤维化相关的激活肌成纤维细胞的覆盖，与相衬成像中可见纤维化过度生长一致。
为了调查增加的胶囊尺寸和/或修饰化学是否在更长的一段时间上维持改进的抗纤维化活性，也在6个月后从NHP中回收的胶囊上实行共聚焦染色。SLG20胶囊显示出明显的和广泛的纤维化过度生长，而Z2-Y12胶囊仍然是清洁的，其显示出无关联的巨噬细胞或肌成纤维细胞。FACS分析显示了类似的结果，其具有与回收的Z2-Y12胶囊相关的较低巨噬细胞组合物。
增加的胶囊尺寸(1.5mm)和修饰化学(Z2-Y12)的联合基本上改进了生物相容性，甚至在6月的时间点上。大的1.5mm的Z2-Y12胶囊看上去具有在所有时间点上纤维化的最小的(几乎不存在)水平，其指明大胶囊尺寸与修饰Z2-Y12化学的协同的抗纤维化效果。
在这一样品中的结果证明了最广泛使用的生物材料、藻酸盐的一个化学修饰，在啮齿动物和非人类灵长动物中产生了能够抗异物反应的水溶胶。带头的藻酸盐类似物，Z2-Y12、Z1-Y15和Z1-Y19，显示出巨噬细胞和其它免疫细胞的最低识别，发炎细胞因子的低水平，以及在啮齿动物和非人类灵长动物中甚至6个月后几乎不可见的纤维化沉积。Z2-Y12化学修饰结果的分布导致独特的抑制巨噬细胞粘附的水溶胶表面，有效地减轻了生物材料的异物应答。结果显示出现有生物材料的化学修饰是克服它们异物应答的可行策略。这些是在非人类灵长动物以及它们功能化中抗异物应答的第一生物材料，因为藻酸盐基材料允许其在多种生物医疗施用中的使用。
实例9：在免疫活性动物中囊化人类细胞的修饰的藻酸盐的抗纤维化活性的证明
这一实例证明了囊化人类细胞的修饰的藻酸盐的抗纤维化性质，该修饰的藻酸盐被植入强力免疫活性的STZC57BL/6J小鼠内很长的一段时间。囊化的人类细胞积极地分泌异种物质，该异种物质包括但不限于蛋白质。该异种物质应该引起小鼠强烈的免疫应答。因此，这一检查代表了对植入修饰的藻酸盐的严重免疫挑战(immune challenge)。尽管如此，植入的修饰的藻酸盐抗异物应答，并保护囊化的人类细胞不受宿主异物应答很长一段时间。作为结果，人类细胞的有益效果发挥了很长一段时间。这一实例描述了囊化人类细胞的修饰的藻酸盐的检验，该人类细胞分泌胰岛素，而胰岛素的能力是降低STZ-诱导糖尿病小鼠中的血糖水平并维持STZ-诱导糖尿病小鼠中的血糖量正常。这一植入物长期降低了STZC57BL/6J小鼠中的血糖水平并维持STZ C57BL/6J小鼠中的血糖量正常，而不需要免疫抑制剂。
糖尿病是全球性的流行病，其折磨着超过3亿人(Shaw等人，DiabetesRes.Clin.Pract.87:4-14(2010))。尽管血糖监测与外源性胰岛素日常注射相结合的严格养生法仍然是1型糖尿病的主要治疗方法，但是患者仍然忍受疾病的影响，这是由于与日常依从性相关的挑战(Pickup等人，N.Engl.J.Med.366:1616-1624(2012))。此外，响应于血糖水平的郎格罕氏胰岛β细胞的胰岛素分泌的调节是高动态的过程，其受到周期性胰岛素注射不完全地刺激(Robertson等人，N.Engl.J.Med.350:694-705(2004))。供体组织的移植，或者以胰腺移植形式或者以尸体胰岛灌输的形式，作为一种获得1型糖尿病的胰岛素独立性的策略，目前在临床上得以实施(Shapiro等人，Engl.J.Med.355：1318-1330(2006)；Shapiro等人，N.Engl.J.Med.343:230-238(2000)；Qi等人，Acta Diabetologica 51：833-843(2014))。这一途径已经受到限制，由于以下两个主要缺点：(1)可用供体组织的限制供应，以及(2)与终生免疫抑制相关的副作用(Hirshberg等人，Current Diabetes Reports7:301-303(2007)；Gibly等人，Diabetologia，54:2494-2505(2011)；O'Sullivan等人，Endocrine Reviews 32:827-844(2011))。必须开发减轻对终身免疫抑制需要的方法，以允许最宽泛的临床实施(Hirshberg等人，Current Diabetes Reports 7：301-303(2007)；Shapiro等人，The Review of Diabetic Studies：RDS9：385-406(2012)；Vogel等人，Diabetologia 56：1605-1614(2013))。
细胞囊化是一种保护治疗组织不受宿主排斥以克服免疫抑制需要的很有希望的技术(Dolgin，Nat.Med.20：9-11(2014)；Jacobs-Tulleneers-Thevissen等人，Diabetologia 56：1605-1614(2013))胰岛囊化疗法中最常用的研究方法是在藻酸盐微球中分离胰岛的配方(Jacobs-Tulleneers-Thevissen等人，Diabetologia 56：1605-1614(2013)；Scharp等人，Advanced Drug Delivery Reviews 67-68:35-73(2014))。在使用尸体人类胰岛的糖尿病患者中，这一技术的临床评价仅仅得到短期的血糖矫正(Jacobs-Tulleneers-Thevissen等人，Diabetologia 56：1605-1614(2013)；Basta等人，DiabetesCare 34：2406-2409(2011)；Calafiore等人，Diabetes Care 29：137-138(2006))。通过强免疫介导的异物应答，表征了这些研究中的植入物，该异物应答导致了纤维化沉积、营养分离和供体组织坏死(degroot等人，Journal of Surgical Research 121：141-150(2004)；Tuch等人，Diabetes Care32:1887-1889(2009))。在临床前糖尿病小鼠或非人类模型中，使用囊化的异体胰岛和胰腺祖细胞，观察到类似的结果，其中，由于免疫应答(Elliot等人，Transplantation Proceedings 37：3505-3508(2005)；Omer等人，Diabetes 52：69-75(2003)；Schneider等人，Diabetes 54：687-693(2005))，阻碍了囊化的尸体人类胰腺和猪胰腺两者的疗效(Hirshberg等人；Current Diabetes Reports 7：301-303(2007))。
大多数捐助者，由于囊化细胞植入物的性能，对于细胞囊化中使用的生物材料是免疫应答的(Lim等人，Science 210：908-910(1980)；Jacobs-Tulleneers-Thevissen等人，Diabetologia 56：1605-1614(2013)；Scharp等人，Advanced Drug Delivery Reviews 67-68：35-73(2014))。对植入材料免疫介导的异物应答常常引起导致植入物失败的组织胶囊的形成(King等人，Journal of Biomedical Materials Research 57：374-383(2001))。当植入具有健全免疫系统的非人类灵长类动物或啮齿动物(诸如C57BL/6J)的腹膜内空间内的时候(King等人，Journal of Biomedical Materials Research 57：374-383(2001)；Dang等人，Biomaterials 32：4464-4470(2011))，藻酸盐微球引起异物反应和纤维化(King等人，Journal of Biomedical Materials Research 57：374-383(2001)；Dang等人，Biomaterials 32：4464-4470(2011))。
最近开发了大型的化学修饰的藻酸盐的库，并且评估了它们在啮齿动物和非人类灵长类动物模型中抗植入物排斥的潜力。这一实例延续了工作，以显示出三唑-硫吗啉二氧化物(TMTD；图13)藻酸盐囊化的人类细胞能够减轻免疫活性C57BL/6小鼠中的异物应答(图14至图16)。结果是，TMTD藻酸盐囊化的人类细胞能够提供长期的血糖矫正和葡萄糖应答度。这些结果证明这些新材料可以用于在整个微囊化的人类细胞植入中提供长期的血糖矫正，从而改进这类植入细胞的治疗效果。
这一实例证明囊化的人类细胞在免疫活性动物中恢复血糖量正常而不需要免疫抑制的成功使用的潜力。这显示出期望：所公开的修饰的藻酸盐可以用于囊化细胞和涂覆材料并保持对受试者(被困细胞和材料被植入)中被困细胞和材料的免疫反应。为了保证这些研究中合适的生物相容性评估，使用了免疫活性链脲佐菌素诱导的糖尿病C57BL/6小鼠模型，由于已知这一菌株可以产生强纤维化和异物应答，这类似于人类患者中得到的观察(Kolb等人，J.Respir.Cell.Mol.Biol.27:141-150(2002))。配方，其已经显示了利用其它组织源的血糖矫正(诸如与藻酸盐的传统囊化(Lim等人，Science 210：908-910(1980)；Calafiore等人，Diabetes Care 29：137-138，(2006))和更大球体的配方(Veiseh等人，Nat.Mater.,DOI：10.1038/NMAT4290))不能支持人类细胞的血糖矫正。
根据批准的方案和联邦法律，所有材料是腹腔内植入的并且在指定时间上从免疫活性链脲佐菌素诱导的糖尿病C57BL/6或B6.129S6-Ccr6tm1(EGFP)Irw/J小鼠中回收。如下详述，实行样品的处理、染色、FACS和成像。
I.材料
所有化学品购自Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)并且细胞培养试剂购自LifeTechnologies公司(Grand Island，NY)，除非另作说明。抗体：Alexa Fluor488-共轭的抗小鼠CD68(目录号137012，Clone FA-11)和Alexa Fluor 647-共轭的抗小鼠Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)(目录号137012，Clone RB6-8C5)购自BioLegend公司(San Diego，CA)。Cy3-结合的抗小鼠α平滑肌肌动蛋白抗体采购自Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)。丝状肌动蛋白(F-肌动蛋白)特异性的Alexa Fluor488-结合的鬼笔环肽采购自Life Technologies公司(GrandIsland，NY)。抗胰高糖素目录号ab82270，抗胰岛素目录号ab7842，山羊抗豚鼠IgG H&L结合的Alexa
Figure BDA0002981759510001311
488目录号ab150185和山羊抗小鼠IgG H&L结合的Alexa
Figure BDA0002981759510001312
594目录号ab150116采购自abcam公司(Cambridge，MA)。抗人类c肽目录号GN-1D4采购自Developmental Studies Hybridoma Bank(University of Iowa，Iowa City，Iowa)。将这一研究中球体的取样接受供应商(Charles River，Wilmington，MA)的内毒素检查，并且结果显示球体包含<0.05EU/ml的内毒素水平。
II.方法
A.藻酸盐水溶胶的胶囊和细胞囊化的制造
所有缓冲液是经高压灭菌器灭菌的，并且藻酸盐溶液是经0.2μm过滤器的过滤来灭菌的。溶液灭菌后，通过在II型A2类生物安全柜中通过实行胶囊形成，实施了无菌处理，以维持用于后续植入的所制造微胶囊/球体的无菌。该方案的水溶胶胶囊如实例8所描述。
为了溶解藻酸盐，将SLG20(NovaMatrix公司，Sandvika，Norway)以1.4％重量体积比溶解在0.8％的盐水中。将TMTD藻酸盐以5％重量体积比初溶于0.8％的盐水中，并且然后以80％TMTD藻酸盐与20％SLG100的体积比与3％重量体积比的SLG100共混(也溶解在0.8％的盐水中)。
对于0.5mm球体的形成，是使用25g的钝针、5kV的电压和200μl/min的流速来生成。对于1.5mm球体的形成，使用具有5-7kV电压的18号钝尖针(SAI Infusion Technologies公司)。
培养的人类细胞用于囊化。瞬时前的囊化，将培养的人类细胞簇于1400rpm离心1min，并用无钙Krebs-Henseleit(KH)缓冲液(4.7mm KCl、25mm HEPES、1.2mm KH2PO4、1.2mmmgSO4×7H2O、135mm NaCl、pH≈7.4、≈290mOsm)冲洗。冲洗后，将人类细胞再次离心，并且吸出所有的上清液。然后，再次将人类细胞小球以1000、250和100簇/0.5ml藻酸盐溶液的簇密度悬浮在SLG20或TMTD藻酸盐溶液中(如上所描述的)。使用BaCl2的胶凝液，对球体进行交联，并且如上所描述控制它们的尺寸。交联后的瞬间，用50ml的CMRLM培养液冲洗囊化的人类细胞簇4次，并且在移植之前，在旋式烧瓶中于37℃培养过夜。由于人类细胞簇在囊化过程中的不可避免的损失，囊化簇的总数目在囊化后重新计数。
B.移植手术
所有动物方案由麻省理工学院动物保护委员会(MIT Committee on AnimalCare)批准，并且所有手术程序和术后护理由MIT的比较医学部(MIT Division ofComparative Medicine)的兽医人员进行管理。使用3％的异氟烷氧，对免疫活性的雄性STZ诱导的糖尿病C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)或雄性B6.129S6-Ccr6tm1(EGFP)Irw/J小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)进行麻醉，并将它们的腹部刮净并使用聚维酮碘(betadine)和异丙醇灭菌。术前地，所有小鼠也皮下地接受0.05mg/kg剂量的丁丙诺啡，作为预手术的止痛剂，与皮下接受的0.3ml的0.9％的盐水一起预防脱水。沿腹部的中线，产生了0.5mm的切口，并使用钝器解剖使腹膜内层暴露。然后，用镊子抓住腹膜壁，并且沿腹白线，产生了0.5-1mm的切口。然后，将所需体积的球体(除胰岛以及囊化大鼠胰岛的SLG20球体之外的所有材料)负载在灭菌吸管中，并通过切口将其植入腹膜空腔。随后使用5-0锥度的尖聚二恶烷酮(PDS II)可吸收缝合线，闭合该切口。然后，使用缝合夹和组织胶，闭合切口上的皮肤。
C.血糖监测
为了创造胰岛素依赖的糖尿病小鼠，在装运至MIT之前，供应商(JacksonLaboratory，Bar Harbor，ME)使用链脲霉素(STZ)处理健康的C57BL/6小鼠。在移植之前，重新检查所有小鼠的血糖水平。只有未禁食血糖水平连续两天超过400mg/dL的小鼠被认为使糖尿病的小鼠并进行移植。
在包含胰腺的藻酸盐胶囊移植后，每周监测血糖水平3次。使用刺血针，收集尾静脉的小血滴，并使用市售的血糖仪(Clarity One，Clarity Diagnostic Testgroup，BocaRaton，FL)检查小血滴。具有未禁食血糖水平低于200mg/dL的小鼠被认为是血糖量正常的。连续的监测直到到达实验时间点，在该点麻醉小鼠并且回收球体。
D.人类c肽的监测
包含人类细胞的藻酸盐胶囊移植后，每三周监测人类c肽水平。在血液收集之前，对小鼠禁食1小时，在点上，在眶后将约100-150μl的血液收集进血清收集管中。将收集的血液于13000rpm下离心10min，移除血清，并且保存在20℃直到进行试验。根据制造商的说明，使用Alpco人类c肽试剂盒(目录号：80-CPTHU-E10)对用于人类c肽的血清进行试验。
E.细胞、组织和材料的回收
细胞、组织和材料的回收如以上实例8中所描述。
F.回收材料球体的成像
对于回收材料的相衬成像，使用实例8中所描述的方案来实行成像。
对于回收材料的明视场图像，用Krebs温柔地冲洗回收材料，并将其转移至35mm的培养皿，使用Evos Xl显微镜来进行明视场图像。
G.共聚焦免疫荧光
免疫荧光成像用于确定附着在球体上的免疫群体。从小鼠中回收材料，并使用4％的多聚甲醛在4℃下固定过夜。然后，用KREBS缓冲液冲洗样品2次，使用0.1％Triton X-100溶液渗透30min，并且随后使用1％的牛血清蛋白质(BSA)溶液阻断1小时。接下来，在由DAPI(500nm)特异性标记物探针的BSA(1:200稀释)构成的免疫染色混合物溶液中培养球体1小时。染色后，用0.1％的吐温20溶液冲洗球体3次，并维持在50％甘油溶液中。然后，将球体转移至玻璃表面皿上，并使用装备有5和10X物镜的LSM 700点扫描共聚焦显微镜(Carl ZeissMicroscopy，Jenagermany)成像。使用Photoshop(Adobe公司，Seattle，WA)，线性地调整所获的图像以供显示。
H.蛋白质组分析
1.还原、烷基化和胰蛋白酶消化
将回收样品悬浮在尿素细胞裂解缓冲液(8M尿素，Tris pH 8.0)中，并且在4℃下培养过夜。等量的蛋白质被还原(10mm二硫苏糖醇，56℃45min)，并且烷基化(50mm碘乙酰胺，室温暗处下1h)。随后在1:50的酶/底物比上，100mm乙酸铵中，室温下，pH 8.9，使用胰蛋白酶(sequencinggrade，Promega，Madison，WI)消化蛋白质。通过添加5％最终浓度的甲酸，淬灭胰蛋白酶。使用C18 Spin Tips(Protea，Morgantown，WV)，将多肽进行脱盐，然后冻干并保存在-80℃。
2.TMT标记
经制造商的说明，使用TMT 6plex，对肽进行标记。将冻干样品溶解在70μL甲醇和500mM中的30μl的三乙基碳酸氢铵中，并且将TMT试剂溶解在30μL的无水乙腈中。涡旋搅拌包含肽和TMT试剂的溶液，室温下培养1小时。使用6个不同同位素的TMT试剂标记的样品合并并浓缩，以在真空离心机中完成。对于第一分析样品，使用TMT 6plex通道进行以下标记：126-RZA 1.5mm 250生物复制1；127-RZA 1.5mm 250生物复制2；128-SLG20 1.5mm 250生物复制1；129-SLG20 1.5mm 250生物复制2；130-SLG20 500μm 250生物复制1；和131-SLG20500μm 250生物复制2。对于第二分析样品，使用TMT 6plex通道进行如下标记：126-RZA1.5mm 250生物复制3；127-RZA 1.5mm 250生物复制4；128-SLG20 1.5mm 250生物复制3；129-SLG20 1.5mm 250生物复制4；130-SLG20500μm 250生物复制3；和131-SLG20 500μm250生物复制4。
3.LC-MS/MS
然后，使用QExactive质谱仪(Thermo)在纳升电喷雾之前，将肽负载在预柱上并通过反相HPLC(Thermo Easy nLC1000)在超过140min的梯度内分离。在数据依赖模式下操作质谱仪。全扫描MS的参数是：跨过350-2000m/z的70000的分辨率，AGC 3e6和最大IT 50ms。在每个循环中的前10的前驱体离子，进行32s的NCE和30s的动态排斥，通过MS/MS，全MS扫描。使用Proteome Discoverer(.raw)和Mascot version 2.4.1(Matrix Science)。Mascot的研究参数：10ppm前驱体离子的质量公差；0.8Dathe片段离子的质量公差；2个胰蛋白酶的裂解；固定修饰的半胱氨酸的脲基甲基化；蛋氨酸氧化的可变改性。使用ProteomeDiscoverer获得TMT量化，按制造商的证明，并且收集同位素。
I.H&E和Masson氏三色染色的组织学处理
并使用4％的多聚甲醛在4℃下，固定回收材料过夜。固定后，用70％的醇，冲洗藻酸盐球体或回收的组织样品。然后，将该材料与4度的钙冷却Histogel混合(VWR，目录号60872-486)。模具硬化后，根据标准组织学的方法，处理该块以用于石蜡嵌入、切片和染色。
J.组织学的免疫染色
对石蜡嵌入的分段样品进行染色，以用于以下：人类胰岛素(抗胰岛素目录号ab7842，abcam)、人类c肽(c肽目录号GN-1D4，Developmental Studies Hybridoma Bank，University of Iowa)、人类胰高糖素(抗胰高糖素目录号ab82270，abcam)。用DAPI(目录号D1306，Life Technologies)对细胞核进行染色。
通过后续的培养，将石蜡滑片在以下溶剂(二甲苯5min 2x，100％ETOH 2min x2，95％2min x2，70％2min x2，d-水)中脱蜡。通过在冰块降温的PBS中培养片段30min，并且然后使用3％马血清阻断30min，完成抗原的回收。然后如下施用抗原混合物：主要A-将1比200的胰高糖素与1比500的c肽混合在一起。主要B-将1比500的人类胰岛素与1比200的胰高糖素混合在一起，培养2小时然后在PBS冲洗10min，重复冲洗4次。次级A-添加1比500的抗小鼠AF594和1比500的抗大鼠AF488。次级B-添加1比500的抗豚鼠AF488和1比500的抗小鼠AF594，培养30min然后冲洗10min，重复冲洗4次。然后，使用DADI对滑片染色，使用prolonggold antifade(Life Technologies，Carlsbad，CA)安装盖玻片。
K.免疫印迹
蛋白质直接从材料中提取以用于免疫印迹的分析。对于蛋白质分析，将材料浸入在冰上具有蛋白酶抑制剂(Halt蛋白酶抑制剂一次性混合物，目录号78430，ThermoScientific公司)的Pierce RIPA缓冲液(目录号89901，Thermo Scientific)中，制备回收材料，然后通过超声来裂解该回收材料(30秒接通，30秒断开，70％振幅下两次)。然后，将样品于4℃下稳定搅拌2小时。然后将裂解物在12000rpm、4℃下离心20min，并且将包含蛋白质的上清液收集在保持冰上的新管中。在脂肪组织的样品中，在转移上清液之前，首先除去过量的脂肪(上清液的顶层)。在95℃下，煮沸每个通道的20μg的蛋白质(由BCA试验量化的，Pierce BCA蛋白质试验试剂盒，目录号23225，Thermo Scientific)5分钟并在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳(任何kD 15孔的comb mini-gel，Biorad，目录号456-9036)，并且然后印迹在硝酸纤维素膜(Biorad，目录号162-0213)上。使用抗-α平滑肌肌动蛋白抗体(1:400稀释，α平滑肌肌动蛋白的兔多克隆体；目录号ab5694，AbCam)，抗PDX1抗体(1:1000稀释，胰腺和十二指肠同源盒1的兔多克隆体；目录号06-1379，EMD Millipore)和抗-β-肌动蛋白抗体(1:4000稀释，小鼠中产生的单克隆抗-β-肌动蛋白抗体；目录号A1978，Sigma Aldrich)作为负载对照，随后驴抗兔(1:15000稀释，目录号926-32213，Li-Cor)和羊抗小鼠(1:15000稀释，目录号926-68070，Li-Cor)荧光团共轭的二级抗体，探测印迹。使用Odysseydetection(Li-Cor，序列号ODY-2329)，在700和800nm的波长，可视化抗体抗原复合物。
L.FACS分析
根据制造商的方案，使用温和的MACS分离器(Miltenyi Biotec公司，Auburn，CA)，制备新鲜切除组织的单细胞悬浮物。在无源PEB解离缓冲液(1X PBS，pH 7.2，0.5％BSA和2mm的EDTA)中制备单细胞悬浮物，并且将悬浮物通过70μm的过滤器(目录号22363548，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)。这一过程除去了粘附在表面上的细胞的大多数(>90％)。然后，使用5ml的1X RBC裂解缓冲液(目录号00-4333，eBioscience，San Diego，CA，USA)于4℃下，将所有组织和材料样品衍生的单细胞群体进行红细胞裂解5min。通过添加20ml的灭菌1X PBS，终止反应。在300-400g，在4℃下，对保留的细胞离心，并且重新悬浮在eBioscience染色缓冲液(目录号00-4222)的最小体积(～50μl)以用于抗体培养。然后，使用对细胞标志物CD68特异性的荧光标记的单克隆抗体(1μl(0.5μg)/样品；CD68-Alexa647，Clone FA-11，目录号11-5931，BioLegend公司)、Ly-6G(Gr-1)(1μl(0.5μg)/样品；Ly-6G-Alexa-647，Clone RB6-8C5，目录号108418，BioLegend公司)、CD11b(1μl(0.2μg)/样品；或CD11b-Alexa-488，Clone M1/70，目录号101217，BioLegend公司)、CD19(1μl(0.2μg)/样品；CD19-Alexa-647、Clone HIB19，目录号302222，BioLegend公司)或IgM(1μl(0.2μg)/样品；IgM-FITC，Clone RMM-1，目录号406505，BioLegend公司)、CD8+(1μl(0.2μg)/样品，BioLegend公司)中的两个，将所有样本在暗处于4℃下共染色25分钟。然后添加2ml的eBioscience流式细胞仪染色缓冲液(目录号00-4222，eBioscience公司)，并且在400-500g，于4℃，离心样品5min。通过吸出除去上清液，并且用染色缓冲液重复这一清洗步骤2次或多次。进行第三次清洗，重新将每个样品悬浮在500μl的流式细胞仪染色缓冲液中，并且通过40μm的过滤器(目录号22363547，Fisher Scientific公司)，使用BD FACSCalibur(目录号342975，BD Biosciences公司，San Jose，CA，USA)，用于最后FACS分析。对于合适背景和激光强度的设置参数，也进行了未染色、单抗，和IgG(用Alexa-488或Alexa-647标记的，BioLegend公司)对照。
M.活体成像
对于活体成像，将0.5mm和1.5mm尺寸的包含人类细胞的水溶胶制成Qdot605(Lifetechnologies，Grand Island，NY)，并且手术植入上述的B6.129S6-Ccr6tm1(EGFP)Irw/J小鼠中。
在植入后14天，将小鼠置于异氟烷麻醉中，并且在暴露珠的原始手术位点处，产生小切口。将小鼠置于倒置显微镜上，并使用25x、N.A.1.05物镜在860nm的激发波长于Olympus FVB-1000MP多光子显微镜上成像。依赖于图像，在20-45min的时间序列中每2min间隔处，得到200μm(10μm的步进)的Z堆积。将小鼠保持在持续异氟烷麻醉中，并且在整个成像段进行监护。使用Velocity 3D图像分析软件(Perkin Elmer，Waltham，MA)分析获得的图像。
N.体内葡萄糖挑战(GSIS)
在葡萄糖挑战之前，对小鼠禁食过夜(12小时)。在挑战天，测量禁食的血糖水平，并且然后，通过尾静脉，用30g/L的葡萄糖溶液以200mg/kg的剂量对小鼠进行注射。然后，每15分钟监视血糖一次直到2小时。
O.胰腺的移除和胰岛素的量化
在174天后，将TMTD藻酸盐中囊化的人类细胞治疗的小鼠麻醉，并且移除每个小鼠的胰腺。对每个胰腺进行称重，并且然后将其置于具有不锈钢球的小瓶中，同时将样品在液氮中保持冷冻。在每个小瓶中添加3ml体积的酸性乙醇，在GenoGrinder上，于1000rpm、1min的增量下，使样品均匀化直到粉碎组织。通过铝块夹住样品小瓶，该铝块在每个周期之间置于液氮中以保持其是冷的。然后，将小瓶在2400rpm下于4℃离心30min。移除上清液(现在包含胰岛素)并保存，而在小瓶中填充更多的酸性乙醇并进行涡旋。将小瓶于4℃下振摇过夜。再次将小瓶在2400rpm下于4℃离心30min，并且收集上清液，且将其添加至先前保存的上清液中。再次在小瓶中添加酸性乙醇并进行涡旋，培养过夜，离心，以及收集上清液并合并。使用Genevac EZ-2plus，蒸发上清液的溶液。将样品保存在-80℃下直到使用。在胰岛素量化之前，在PBS中重新悬浮样品，并根据制造商的说明使用小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Alpco目录号80-INSMS-E10)进行量化。重复这一相同的程序，以用于健康的野生型C57BL/6小鼠和STZ处理的C57BL/6小鼠。
P.统计分析
数据被表达为平均±SEM和N＝5个小鼠/(时间点和治疗组)。对于大鼠的研究，N＝3/治疗。基于以前的参考文献，对这些样品的尺寸进行选择。所有动物包括在分析中，除了未预见的疾病或病状的例子。随机选择动物组群。研究者不盲目地实行实验。或通过不成对的双尾t检验或通过具有Bonferroni多重比较校正的单向ANOVA，分析了FACS数据的统计显著性，除非另外指出，当在GraphPad Prism5中实施的时候，*：p<0.05，**：p<0.001和***：p<0.0001。
所显示的量化数据为组平均值±SEM。
II.结果
A.TMTD藻酸盐对胶囊化人类细胞的免疫应答。
已经证明的是，微球尺寸可以对植入藻酸盐和TMTD藻酸盐的抗免疫应答具有有益的影响，该植入藻酸盐具有1.5mm直径和更大的球体，TMTD藻酸盐在啮齿动物和非人类灵长类动物中都减轻了纤维化应答(Veiseh等人出版中和Vegas等人投稿)。TMTD的化学结构如图13所示。
为了评估这些球体的免疫应答，囊化的人类细胞被植入C57BL/6小鼠的IP中，并在14天后得以回收。分离与球体外部相关的细胞，并通过FACS来进行分析(图14和图15)。对于与SLG20对照(配方1、2)相比较的TMTD藻酸盐囊化的人类细胞(配方3)，测量巨噬细胞、neutrophils、B细胞和CD8+T细胞在统计学上显著的较低水平。在STZ-C57BL/6J小鼠中80-90天后回收的植入物，显露出TMTD藻酸盐球体具有低得多水平的纤维化沉积。这些用于细胞沉积(DAPI，F-肌动蛋白)和肌成纤维细胞(α-SMA)的回收球体的免疫荧光染色在TMTD藻酸盐球体上显示出显著更低水平的细胞沉积。这些蛋白质提取物的蛋白质组分析检测了18种抗原亚型，并且这18种被检测抗原蛋白质中的10种在TMTD藻酸盐移植物中有显著的降低，这进一步显示出这些材料能够减轻纤维化应答(图16)。
从回收的植入物中提取的α-SMA蛋白质的免迹印迹量化与TMTD球体上较低的纤维化水平相一致(图10)。
最终，与这些结果相一致，在STZ-C57BL/6小鼠中TMTD囊化的人类簇经组织蛋白酶处理和免疫染色，在超过90天后回收，这显露出细胞簇具有成熟人类细胞标记物人类胰岛素和c-肽的阳性共定位染色。在c肽和胰高糖素之间或人类胰岛素和胰高糖素之间，观察到无阳性共定位染色的最小值，这与在整个研究中保留它们差异状态的人类细胞相一致。
接下来表征了TMTD藻酸盐球体提供囊化人类细胞免疫分离的能力。球体的冷冻断裂低温扫描电子显微镜(cryo-SEM)显示具有尺寸上从亚微米至1-3μm范围的孔尺寸的异源孔结构，这一范围能够防止细胞和大蛋白质的渗透。在B6.129S6-Ccr6tm1(EGFP)Irw/J小鼠(T细胞、B细胞和树突细胞表达EGFP)中，移植14天后的球体的活体成像显示出CCR6+细胞对包含人类细胞的球体的区域的定位，但是这些细胞不能接触和启动细胞毒素事件。
B.具有三唑-硫代吗啉二氧化物(TMTD)藻酸盐的人类细胞的囊化使得STZ-C57BL/6J中血糖矫正的变得可能。
为了研究人类细胞微囊化提供血糖矫正的潜力，细胞在三种不同配方中所使用：(1)传统用于胰岛囊化的500μm的藻酸盐微胶囊(Lim等人，Science 210：908-910(1980)；Calafiore等人，Diabetes Care 29：137-138(2006)),(2)1.5mm的藻酸盐球体(Veiseh等人，出版中)，和(3)1.5mm的TMTD藻酸盐球体。这些配方中的每个以三个不同剂量的人类细胞簇被移植在链脲霉素(STZ)治疗的C57BL/6J小鼠中，并评估了它们对修复血糖量正常的能力。在这一糖尿病模型中，尽管有植入位点，裸露的非囊化的人类细胞不能提供血糖矫正。
500μm的藻酸钡微胶囊的囊化通常是实施胰岛移植的植入配方(Lim等人，Science210，908-910(1980)；Calafiore等人，Diabetes Care 29：137-138，(2006))。移植有500μm微胶囊中囊化的人类细胞的小鼠显示有血糖控制的最低水平，只有最高剂量的移植簇能够修复血糖量正常15天。较好地实行了在1.5mm的藻酸盐球体中囊化的人类细胞，相比于具有血糖量正常的500μm微胶囊配方，与先前使用大鼠胰岛获得的结果相一致，该血糖量正常维持20-30天，两个较高的剂量(Veiseh等人出版中)。使用1.5mm的TMTD藻酸盐球体，在所有三个检测剂量处，获得超过70天的持久的血糖量正常。在这个研究过程期间，于第21天、第43天和第63天，测量了健全的人类c肽水平，其与人类细胞功能相一致，而TMTD藻酸盐球体显示出人类c肽的最高水平。
C.囊化人类细胞支持STZ-C57BL/6J中持久的血糖量正常和葡萄糖应激性。
为了评价TMTD藻酸盐囊化的人类细胞植入物维持血糖量正常的实力，对一群移植的糖尿病小鼠6个月进行跟踪。移植的小鼠成功维持了血糖矫正超过6个月的时间，并且5个与类似时间内所跟踪的野生型C57BL/6J小鼠的血糖水平相匹配。此外，在整个研究的多个点上，记录了超过100pmol/L的强烈的人类c肽水平。在移植后150天，在这些小鼠上也实行了葡萄糖挑战(glucose challenge)，并且与野生型小鼠相比较，囊化的人类细胞维持了血糖量正常。也分析了每群的宿主胰岛素水平，以确认成功的STZ治疗和内源性胰腺细胞的再生不足。6个月后，回收的人类细胞植入物显示没有纤维化过度生长的信号，这证明了在胶囊上很少的成胶沉积和细胞沉积。由于3个月后的回收的球体显示出最低水平的纤维化，这指明TMTD藻酸盐减轻了由改变免疫识别/激活动力学所致的免疫应答。
结果显示出囊化的人类细胞可以在免疫活性的糖尿病动物中获得葡萄糖响应的长期的血糖矫正(超过170天)而没有免疫抑制。通过实施新的TMTD藻酸盐配方，完成了这一结果，该TMTD藻酸盐配方减轻对人类细胞植入物的免疫应答，有效延迟了造成植入物组织纤维化的纤维化沉积。尽管这些人类细胞在免疫活性的啮齿动物受体中表现出异种刺激，但该制剂提供了足够的免疫保护以能够进行长期血糖校正。这些结果支持了预期：在所公开的修饰的藻酸盐中囊化的人类细胞可以为患有1型糖尿病的患者提供胰岛素的独立性。这些结果支持了预期：在所公开的修饰的藻酸盐中囊化的人类细胞可以为患者提供很长一段时间由囊化细胞产生的产品。

Claims (10)

1.一种植入物，其中所述植入物的全部或一部分涂覆有
修饰的藻酸盐，所述修饰的藻酸盐包含一个或多个由式I定义的共价修饰的单体
Figure FDA0002981759500000011
其中
X是氧、硫或NR4；
Y1和Y2独立地为氢或-PO(OR5)2；
R4和R5独立地为氢、烷基或被取代的烷基；
R1是-R6-Rb，
R6是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团，以及其中Rb是
Figure FDA0002981759500000012
其中R8、R9或两者独立地为氢、被取代的烷基、被取代的杂芳基、被取代的羰基或
Figure FDA0002981759500000021
其中y是0至11的整数；其中Re独立地为氧代、烷氧基、氨基、烷基氨基、羟基、烯基、炔基、被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、被取代的烷氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷基硫基、被取代的烷基硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团；
其中R18、R19、R20、R21、R22和R23独立地为C、O、N或S，其中介于相邻的R18与R23之间的键根据化合价是双键或单键，以及其中R18至R23根据化合价键合零个、一个或两个氢；
以及其中R24独立地为-(CR25R25)p-或-(CR25R25)p-Xb-(CR25R25)q-，其中p和q独立地为0至5的整数，其中Xb为不存在、-O-、-S-、-SO2-或NR4’，其中每一个R25独立地为不存在、氢、＝O、＝S、-OH、-SH、-NR4’，其中R4’为烷基或被取代的烷基。
2.根据权利要求1所述的植入物，其中-R6-Rb独立地在一种或多种改性单体中是
Figure FDA0002981759500000022
其中a是1至30的整数。
3.根据权利要求1或2所述的植入物，其中
R4是氢；R5是氢、烷基或取代的烷基；
R8是氢；以及
R9是
Figure FDA0002981759500000031
4.一种包含胶囊的组合物，
其中所述胶囊包含交联的水凝胶，其直径在1mm至8mm之间，并且包封生物材料，
其中所述交联水凝胶包含
修饰的藻酸盐，所述修饰的藻酸盐包含一个或多个由式I定义的共价修饰的单体
Figure FDA0002981759500000032
其中
X是氧、硫或NR4；
Y1和Y2独立地为氢或-PO(OR5)2；
R4和R5独立地为氢、烷基或被取代的烷基；
R1是-R6-Rb，
R6是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团，以及其中Rb是
Figure FDA0002981759500000041
其中R8、R9或两者独立地为氢、被取代的烷基、被取代的杂芳基、被取代的羰基或
Figure FDA0002981759500000042
其中y是0至11的整数；其中Re独立地为氧代、烷氧基、氨基、烷基氨基、羟基、烯基、炔基、被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、被取代的烷氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷基硫基、被取代的烷基硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团；
其中R18、R19、R20、R21、R22和R23独立地为C、O、N或S，其中介于相邻的R18与R23之间的键根据化合价是双键或单键，以及其中R18至R23根据化合价键合零个、一个或两个氢；
以及其中R24独立地为-(CR25R25)p-或-(CR25R25)p-Xb-(CR25R25)q-，其中p和q独立地为0至5的整数，其中Xb为不存在、-O-、-S-、-SO2-或NR4’，其中每一个R25独立地为不存在、氢、＝O、＝S、-OH、-SH、-NR4’，其中R4’为烷基或被取代的烷基。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中-R6-Rb独立地在一种或多种改性单体中是
Figure FDA0002981759500000051
其中a是1至30的整数。
6.根据权利要求4或5所述的组合物，其中
R4是氢；R5是氢、烷基或取代的烷基；
R8是氢；以及
R9是
Figure FDA0002981759500000052
7.一种组合物在制备用于治疗人或动物患者的疾病或病症的医疗产品中的应用，其中所述组合物可以被植入或移植到人或动物患者中，其中所述组合物包含胶囊，
其中所述胶囊包含交联的水凝胶，其直径在1mm至8mm之间，并且包封生物材料，
其中所述交联水凝胶包含
修饰的藻酸盐，所述修饰的藻酸盐包含一个或多个由式I定义的共价修饰的单体
Figure FDA0002981759500000053
其中
X是氧、硫或NR4；
Y1和Y2独立地为氢或-PO(OR5)2；
R4和R5独立地为氢、烷基或被取代的烷基；
R1是-R6-Rb,
R6是烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、被取代的烷氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷硫基、被取代的烷硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、氨基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、磺酰基、被取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、被取代的磷酰基、膦酰基、被取代的膦酰基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团、氨基酸、聚(乙二醇)、肽或多肽基团，以及其中Rb是
Figure FDA0002981759500000061
其中R8、R9或两者独立地为氢、被取代的烷基、被取代的杂芳基、被取代的羰基或
Figure FDA0002981759500000062
其中y是0至11的整数；其中Re独立地为氧代、烷氧基、氨基、烷基氨基、羟基、烯基、炔基、被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、被取代的烷氧基、芳氧基、被取代的芳氧基、烷基硫基、被取代的烷基硫基、芳硫基、被取代的芳硫基、羰基、被取代的羰基、羧基、被取代的羧基、被取代的氨基、酰氨基、被取代的酰氨基、聚芳基、被取代的聚芳基、C3-C20环状基团、被取代的C3-C20环状基团、杂环基团、被取代的杂环基团；
其中R18、R19、R20、R21、R22和R23独立地为C、O、N或S，其中介于相邻的R18与R23之间的键根据化合价是双键或单键，以及其中R18至R23根据化合价键合零个、一个或两个氢；
以及其中R24独立地为-(CR25R25)p-或-(CR25R25)p-Xb-(CR25R25)q-，其中p和q独立地为0至5的整数，其中Xb为不存在、-O-、-S-、-SO2-或NR4’，其中每一个R25独立地为不存在、氢、＝O、＝S、-OH、-SH、-NR4’，其中R4’为烷基或被取代的烷基。
8.根据权利要求7所述的应用，其中-R6-Rb独立地在一种或多种改性单体中是
Figure FDA0002981759500000071
其中a是1至30的整数。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其中
R4是氢；R5是氢、烷基或取代的烷基；
R8是氢；以及
R9是
Figure FDA0002981759500000072
10.一种修饰的藻酸盐，所述修饰的藻酸盐包含一个或多个由式I定义的共价修饰的单体
Figure FDA0002981759500000073
其中
X是氧、硫或NR4；
Y1和Y2独立地为氢或-PO(OR5)2；
R4和R5独立地为氢、烷基或被取代的烷基；以及
R1独立地在一个或多个化学修饰位点中是
Figure FDA0002981759500000081
或者
Figure FDA0002981759500000082
其中所述修饰的藻酸盐是单一修饰的。
CN202110289236.1A 2014-08-01 2015-08-03 用于抗纤维化材料的修饰的藻酸盐以及应用 Active CN112999429B (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462032148P 2014-08-01 2014-08-01
US62/032,148 2014-08-01
US201562180415P 2015-06-16 2015-06-16
US62/180,415 2015-06-16
PCT/US2015/043495 WO2016019391A1 (en) 2014-08-01 2015-08-03 Modified alginates for anti-fibrotic materials and applications
CN201580040466.7A CN106795225B (zh) 2014-08-01 2015-08-03 用于抗纤维化材料的修饰的藻酸盐以及应用

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580040466.7A Division CN106795225B (zh) 2014-08-01 2015-08-03 用于抗纤维化材料的修饰的藻酸盐以及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112999429A true CN112999429A (zh) 2021-06-22
CN112999429B CN112999429B (zh) 2022-07-22

Family

ID=53872166

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110289236.1A Active CN112999429B (zh) 2014-08-01 2015-08-03 用于抗纤维化材料的修饰的藻酸盐以及应用
CN201580040466.7A Active CN106795225B (zh) 2014-08-01 2015-08-03 用于抗纤维化材料的修饰的藻酸盐以及应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580040466.7A Active CN106795225B (zh) 2014-08-01 2015-08-03 用于抗纤维化材料的修饰的藻酸盐以及应用

Country Status (9)

Country Link
US (3) US10426735B2 (zh)
EP (1) EP3174906A1 (zh)
JP (3) JP6723169B2 (zh)
KR (1) KR20170055960A (zh)
CN (2) CN112999429B (zh)
AU (2) AU2015295986B2 (zh)
CA (1) CA2956075C (zh)
IL (1) IL250277B (zh)
WO (1) WO2016019391A1 (zh)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112999429B (zh) 2014-08-01 2022-07-22 麻省理工学院 用于抗纤维化材料的修饰的藻酸盐以及应用
AU2016344041B2 (en) * 2015-11-01 2019-11-07 Massachusetts Institute Of Technology Materials with improved properties
RU2018120104A (ru) 2015-11-01 2019-12-02 Массачусетс Инститьют Оф Текнолоджи Модифицированные альгинаты в качестве противофиброзных материалов и их применения
JP2019513723A (ja) * 2016-04-04 2019-05-30 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 結晶化された疎水性化合物の組成物ならびにその作製および使用の方法
US10730983B2 (en) 2016-06-13 2020-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Biocompatible coatings and hydrogels for reducing foreign body response and fibrosis
WO2018005964A1 (en) * 2016-07-01 2018-01-04 Wake Forest University Health Sciences Modified carbohydrates, compositions comprising the same, and methods of making and using the same
US10766970B2 (en) 2016-07-01 2020-09-08 Wake Forest University Health Sciences Modified carbohydrates, compositions comprising the same, and methods of making and using the same
TR201611332A2 (tr) * 2016-08-11 2018-02-21 Mehmet Dogan Asik Bi̇r mi̇krokapsül ve üreti̇m yöntemi̇
CA3039203A1 (en) 2016-10-03 2018-04-12 Sigilon Therapeutics, Inc. Compounds, devices, and uses thereof
BR112019015141A2 (pt) 2017-01-27 2020-03-24 Cornell University Polímeros e hidrogéis modificados com zwitteríon
US20180353650A1 (en) 2017-06-13 2018-12-13 Massachusetts Institute Of Technology Biocompatible microfabricated macrodevices for transplanting cells
KR20200057051A (ko) * 2017-09-27 2020-05-25 시질론 테라퓨틱스, 인크. 활성 세포를 포함하는 방법, 조성물 및 이식 가능한 요소
US11318231B2 (en) 2017-11-06 2022-05-03 Massachusetts Institute Of Technology Anti-inflammatory coatings to improve biocompatibility of neurological implants
WO2019169089A1 (en) * 2018-03-01 2019-09-06 Seraxis, Inc. Macro-encapsulated therapeutic cells, devices, and methods of using the same
US20210002433A1 (en) 2018-03-02 2021-01-07 Sigilon Therapeutics, Inc. Biocompatible hydrogel capsules and process for preparing same
CA3092121A1 (en) * 2018-03-02 2019-09-06 Sigilon Therapeutics, Inc. Afibrotic compounds, devices, and uses thereof
WO2019195056A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Sigilon Therapeutics, Inc. Methods, compositions, and implantable elements comprising stem cells
CA3096038A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Sigilon Therapeutics, Inc. Implantable particles and related methods
WO2020131181A2 (en) 2018-09-21 2020-06-25 Massachusetts Institute Of Technology Surface-modified cells, methods of making and using
UY38389A (es) * 2018-09-27 2020-04-30 Sigilon Therapeutics Inc Dispositivos implantables para terapia celular y métodos relacionados
EP3903881A4 (en) * 2018-12-25 2022-01-19 FUJIFILM Corporation CELL TRANSPLANT KIT, METHOD FOR MAKING POUCH-LIKE STRUCTURE, AND THERAPEUTIC AGENT FOR DIABETES
SG11202108790SA (en) 2019-02-15 2021-09-29 Univ Rice William M Vascularizing devices and methods for implanted diagnostics and therapeutics
WO2020198685A1 (en) * 2019-03-27 2020-10-01 Sigilon Therapeutics, Inc. Compositions, devices and methods for treating fabry disease
EP4079339A4 (en) * 2019-12-18 2023-12-27 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. NEW CROSS-LINKED ALGINIC ACID
WO2021146393A1 (en) * 2020-01-14 2021-07-22 William Marsh Rice University High throughput genetic barcoding and analysis methods
WO2022026606A2 (en) * 2020-07-28 2022-02-03 Sigilon Therapeutics, Inc. Genetically modified cell lines expressing an exogenous substance and uses thereof
CA3190689A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 The Board Of Trustees Of University Of Illinois Alginate-coated mesenchymal stromal and progenitor cells and methods for using the same
US20220089537A1 (en) 2020-09-18 2022-03-24 Massachusetts Institute Of Technology High-throughput method to rapidly add chemical moieties to a small molecule library
WO2022266086A2 (en) * 2021-06-14 2022-12-22 William Marsh Rice University Triazole containing polymers and methods of use thereof
WO2023230524A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions of secretory and/or catalytic cells and methods using the same
WO2023235884A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods
WO2024006544A2 (en) * 2022-07-01 2024-01-04 Sigilon Therapeutics, Inc. Covalently crosslinked polysaccharides and methods of use thereof
WO2024006528A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Sigilon Therapeutics, Inc. Covalently photocrosslinked polysaccharides and methods of use thereof
WO2024006551A2 (en) * 2022-07-01 2024-01-04 Sigilon Therapeutics, Inc. Covalently crosslinked polysaccharides and methods of use thereof
WO2024081309A1 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Sigilon Therapeutics, Inc. Engineered cells and implantable elements for treatment of disease

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU6185801A (en) * 1996-09-19 2001-11-15 Regents Of The University Of Michigan, The Polymers containing polysaccharides such as alginates or modified alginates
CN101094613A (zh) * 2003-11-10 2007-12-26 血管技术国际股份公司 医用植入物和抗瘢痕形成剂
US20120308650A1 (en) * 2011-06-02 2012-12-06 Massachusetts Institute Of Technology Modified alginates for cell encapsulation and cell therapy
JP2013017631A (ja) * 2011-07-11 2013-01-31 Sumitomo Electric Ind Ltd 手洗いモニタおよび手洗いモニタ方法
CN102911380A (zh) * 2012-10-29 2013-02-06 北京爱美客生物科技有限公司 透明质酸与生物可降解高分子改性材料及制备方法
AU2013202496A1 (en) * 2008-06-27 2013-05-02 Celgene Car Llc Heteroaryl compounds and uses thereof

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB676618A (en) 1947-09-12 1952-07-30 Kelco Co Alkylene glycol esters of alginic acid
GB768309A (en) 1954-03-27 1957-02-13 Henkel & Cie Gmbh Process for the production of amides of alginic acid
US2860130A (en) 1954-11-01 1958-11-11 Kelco Co Methyl alginate
US2881161A (en) 1955-03-25 1959-04-07 Henkel & Cie Gmbh Amides of alginic acid
US4352883A (en) * 1979-03-28 1982-10-05 Damon Corporation Encapsulation of biological material
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4868121A (en) 1985-02-07 1989-09-19 Mcdonnell Douglas Corporation Islet isolation process
IT1203814B (it) * 1986-06-30 1989-02-23 Fidia Farmaceutici Esteri dell'acido alginico
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
WO1991007951A1 (en) 1989-12-05 1991-06-13 Trancel Corporation Homologous guluronic acid alginate coating composition for in-vivo application and implantation and method of using same
US5821121A (en) 1991-06-24 1998-10-13 Pacific Biomedical Research, Inc. Hormone-secreting cells maintained in long-term culture
US5876452A (en) 1992-02-14 1999-03-02 Board Of Regents, University Of Texas System Biodegradable implant
US5273904A (en) 1992-03-18 1993-12-28 Cobe Laboratories, Inc. Apparatus for purifying islets of Langerhans
GB2270920B (en) 1992-09-25 1997-04-02 Univ Keele Alginate-bioactive agent conjugates
FR2699545B1 (fr) 1992-12-18 1995-01-27 Oreal Agent gélifiant résultant de l'association d'un chitosane et d'un alginate d'alkyle ou d'hydroxyalkyle et son utilisation dans la préparation de compositions cosmétiques et pharmaceutiques.
US5709854A (en) 1993-04-30 1998-01-20 Massachusetts Institute Of Technology Tissue formation by injecting a cell-polymeric solution that gels in vivo
EP2025353A2 (en) 1993-04-30 2009-02-18 Massachusetts Institute of Technology Injectable polysaccharide-cell compositions
US5443505A (en) 1993-11-15 1995-08-22 Oculex Pharmaceuticals, Inc. Biocompatible ocular implants
US6129761A (en) 1995-06-07 2000-10-10 Reprogenesis, Inc. Injectable hydrogel compositions
US6171232B1 (en) 1997-06-26 2001-01-09 Cordis Corporation Method for targeting in vivo nitric oxide release
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US6159531A (en) 1999-08-30 2000-12-12 Cardiovasc, Inc. Coating having biological activity and medical implant having surface carrying the same and method
US6932894B2 (en) 2001-05-15 2005-08-23 Therasense, Inc. Biosensor membranes composed of polymers containing heterocyclic nitrogens
US6977138B2 (en) 2001-07-24 2005-12-20 Massachusetts Institute Of Technology Reactive polymer coatings
MXPA04008640A (es) * 2002-03-08 2004-12-06 Valspar Sourcing Inc Revestimientos que tienen un contenido bajo de compuesto organico volatil.
US7008476B2 (en) 2003-06-11 2006-03-07 Az Electronic Materials Usa Corp. Modified alginic acid of alginic acid derivatives and thermosetting anti-reflective compositions thereof
US7329531B2 (en) 2003-12-12 2008-02-12 Scimed Life Systems, Inc. Blood-tight implantable textile material and method of making
US20060286141A1 (en) * 2003-12-15 2006-12-21 Campbell Todd D Systems for gel-based medical implants
WO2005063147A1 (en) * 2003-12-23 2005-07-14 Fmc Biopolymer As Use of alginate matrices to control cell growth
ITMI20041373A1 (it) 2004-07-09 2004-10-09 Lima Lto S P A N-metil-ammidi di carbossimetilcellulosa acido alginico o carbossimetalamido
DE102005008434A1 (de) 2005-02-24 2006-09-07 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Modifizierung eines Substrats
FR2889952A1 (fr) 2005-07-22 2007-03-02 Oreal Procede de revetement des cils
WO2007038982A1 (en) 2005-09-27 2007-04-12 Universite Joseph Fourier - Grenoble 1 Hydrogel functionalized with a polymerizable moiety and their uses as biosensors or bioreactors
DE102005049833A1 (de) 2005-10-14 2007-04-19 Beiersdorf Ag Hydrophob modifizierte Alginate
WO2007070660A2 (en) 2005-12-13 2007-06-21 President And Fellows Of Harvard College Scaffolds for cell transplantation
FR2894585B1 (fr) 2005-12-14 2012-04-27 Rhodia Recherches Et Tech Copolymere comprenant des unites zwitterioniques et d'autres unites, composition comprenant le copolymere, et utilisation
US20080003250A1 (en) 2006-06-21 2008-01-03 Margulies Barry J Novel therapy for herpesvirus infection
US8211361B2 (en) 2007-03-26 2012-07-03 Board Of Regents, The University Of Texas System N-halamine-based rechargeable biofilm-controlling tubular devices, method of making and using
KR20100063744A (ko) * 2007-08-28 2010-06-11 에프엠씨 코포레이션 지연된 자가-겔화 알기네이트 시스템 및 이의 용도
US7998524B2 (en) 2007-12-10 2011-08-16 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Methods to improve adhesion of polymer coatings over stents
EP2127689A1 (en) 2008-05-27 2009-12-02 RevisiOs B.V. i.o. Novel homogenous osteoinductive nanocomposites
CN101565469B (zh) 2008-10-28 2011-05-11 中国海洋大学 酰胺接枝的海藻酸钠纳米材料及其制备方法与应用
EP2356167A4 (en) 2008-12-12 2012-07-11 Univ Massachusetts POLYESTER WITH POTTED TWITTERS
ES2476140T3 (es) 2009-02-09 2014-07-11 St. Jude Medical, Inc. Mejora de la biocompatibilidad de un dispositivo m�dico
WO2010096649A1 (en) 2009-02-21 2010-08-26 Tyco Healthcare Group Lp Medical devices having activated surfaces
WO2012009377A2 (en) 2010-07-12 2012-01-19 University Of Southern California Biocompatible substrate for facilitating interconnections between stem cells and target tissues and methods for implanting same
US9127038B2 (en) * 2011-08-04 2015-09-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Kisspeptide-pentasaccharide conjugates
US20130149351A1 (en) 2011-12-09 2013-06-13 University Of Southern California Polymer scaffolds and their use in the treatment of vision loss
JP5963130B2 (ja) * 2012-02-16 2016-08-03 学校法人同志社 生体組織補強材料キット及び生体組織補強材料
SE537635C2 (sv) 2012-09-18 2015-08-25 Corticalis As Metod för att producera en alginatbelagd titandioxidscaffold, denna titandioxidscaffold samt medicinskt implantatinnefattande scaffolden
DE102012217078B4 (de) 2012-09-21 2015-03-05 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren zum Herstellen einer photovoltaischen Solarzelle
US9788765B2 (en) 2012-09-28 2017-10-17 Dexcom, Inc. Zwitterion surface modifications for continuous sensors
EP3323884A1 (en) 2013-02-01 2018-05-23 The United States Of America as Represented by the Secretary, Department of Health an Human Service Method for generating retinal pigment epithelium (rpe) cells from induced pluripotent stem cells (ipscs)
CN112999429B (zh) 2014-08-01 2022-07-22 麻省理工学院 用于抗纤维化材料的修饰的藻酸盐以及应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU6185801A (en) * 1996-09-19 2001-11-15 Regents Of The University Of Michigan, The Polymers containing polysaccharides such as alginates or modified alginates
CN101094613A (zh) * 2003-11-10 2007-12-26 血管技术国际股份公司 医用植入物和抗瘢痕形成剂
AU2013202496A1 (en) * 2008-06-27 2013-05-02 Celgene Car Llc Heteroaryl compounds and uses thereof
US20120308650A1 (en) * 2011-06-02 2012-12-06 Massachusetts Institute Of Technology Modified alginates for cell encapsulation and cell therapy
JP2013017631A (ja) * 2011-07-11 2013-01-31 Sumitomo Electric Ind Ltd 手洗いモニタおよび手洗いモニタ方法
CN102911380A (zh) * 2012-10-29 2013-02-06 北京爱美客生物科技有限公司 透明质酸与生物可降解高分子改性材料及制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARTURO J VEGAS等: "Combinatorial hydrogel library enables identification of materials that mitigate the foreign body response in primates", 《NATURE BIOTECHNOLOGY》 *
JI-SHENG YANG等: "Research progress on chemical modification of alginate: A review", 《CARBOHYDRATE POLYMERS》 *
张东等: "藻酸盐三维细胞培养在骨组织工程中应用的研究进展", 《生物技术通报》 *
秦益民主编: "《海藻酸》", 30 June 2008, 中国轻工业出版社 *

Also Published As

Publication number Publication date
IL250277A0 (en) 2017-03-30
AU2019200810B2 (en) 2020-07-30
KR20170055960A (ko) 2017-05-22
US20180360765A1 (en) 2018-12-20
JP2017524768A (ja) 2017-08-31
US11266606B2 (en) 2022-03-08
EP3174906A1 (en) 2017-06-07
US20160030360A1 (en) 2016-02-04
JP2020023582A (ja) 2020-02-13
CN112999429B (zh) 2022-07-22
WO2016019391A8 (en) 2017-03-02
US20200016085A1 (en) 2020-01-16
AU2019200810A1 (en) 2019-02-28
CN106795225B (zh) 2021-03-19
AU2015295986B2 (en) 2018-11-08
JP6723169B2 (ja) 2020-07-15
CA2956075A1 (en) 2016-02-04
US10898443B2 (en) 2021-01-26
US10426735B2 (en) 2019-10-01
CA2956075C (en) 2020-03-10
AU2015295986A1 (en) 2017-01-12
IL250277B (en) 2020-03-31
WO2016019391A1 (en) 2016-02-04
JP6915224B2 (ja) 2021-08-04
CN106795225A (zh) 2017-05-31
JP2021080481A (ja) 2021-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106795225B (zh) 用于抗纤维化材料的修饰的藻酸盐以及应用
US20220031913A1 (en) Modified alginates for anti-fibrotic materials and applications
US11337930B2 (en) Modified alginates for cell encapsulation and cell therapy
AU2018212895B2 (en) Zwitterionically modified polymers and hydrogels
WO2022266086A2 (en) Triazole containing polymers and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant