CN112972777B - 用于口腔牙槽骨再生的电纺plga/pcl纤维膜复合壳聚糖海绵支架及其制备方法 - Google Patents

用于口腔牙槽骨再生的电纺plga/pcl纤维膜复合壳聚糖海绵支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于口腔牙槽骨再生的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架，该支架具有紧密结合的致密层和疏松层，所述致密层为电纺聚乳酸‑羟基乙酸/聚己内酯(PLGA/PCL)纤维膜，该纤维膜具有内部通透性，由无序的纤维丝组成；所述疏松层为壳聚糖海绵，具有疏松多孔结构；其中，所述壳聚糖海绵的孔隙率为91.14％‑95.74％。本发明还公开了一种用于口腔牙槽骨再生的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架的制备方法。本发明的支架具有一体化的致密‑疏松结构，电纺致密层有支撑作用，可以防止成纤维细胞穿透；疏松层具有良好的形状可复性以及吸水作用，可与血液结合后行成凝胶，十分适合细胞长入，有利于骨组织再生。

Description

用于口腔牙槽骨再生的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵 支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及组织工程材料技术领域，具体而言涉及一种用于口腔牙槽骨再生的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架及其制备方法。
背景技术
在口腔牙槽骨的改建中，新生骨的重建与软组织的侵犯一直处于动态的竞争中，软组织在不加干预的情况下，很大概率会抢先占领骨缺损区，从而使缺损区达不到骨的修复效果。目前，口腔临床上应对上述问题的方法是：在使用骨填充材料(如Bio-Oss，羟基磷灰石等)时，结合屏障膜(如bio-gide，胶原膜等)一起使用。虽然这种方法可使骨填充材料有足够的时间形成新骨，但该种方法的骨填充材料容易移动，添加了屏障膜后，骨填充材料也非常容易从膜和骨的边缘泄露，从而影响修复效果，并且手术的技术敏感性较高，术后炎症反应严重。
公开号为CN109395175A的中国专利文献公开了一种引导组织再生膜及其制备方法，该引导组织再生膜，包括基质为壳聚糖的致密层和基质为壳聚糖与钙磷盐复合物的疏松多孔层，该引导组织再生膜的疏松多孔层具备促成骨活性，可为细胞生长提供更多的结构空间及增殖和分化的良好微环境促进骨细胞的融合，同时致密层可对纤维组织起屏蔽作用。但该引导组织再生膜对骨缺损区缺乏填充作用，如面临较大面积骨缺损时，仍需配合骨粉等填充材料使用。
公开号为CN112190771A的中国专利文献公开了一种骨组织再生引导膜及其制备方法，该骨组织再生引导膜包括片式致密膜层和网式多孔疏松膜层，网式多孔疏松膜层与片式致密膜层微蚀的界面混溶后，以使网式多孔疏松膜层与片式致密膜层结合在一起。该骨组织再生引导膜中，网式多孔疏松膜层局部与片式致密膜层混溶为一体，使片式致密膜层和网式多孔疏松膜层牢固结合，同时不破坏片式致密膜层和网式多孔疏松膜层的结构，即具有屏蔽成纤维细胞长入的致密结构，又兼有供成纤维细胞和成血管细胞长入的多孔疏松结构，致密结构和多孔疏松结构协同作用能够更好地起到加速骨缺损愈合目的。但该材料仍缺乏对骨缺损的有效填充，形状不具有可复性和对不规则骨缺损形状的主动适应，操作性不佳；且该骨引导再生膜的疏松层具有孔隙率过低的特点，并不适合成骨细胞的长入并实现最终的新骨替代。
公开号为CN110141687A的中国专利文献公开了一种引导牙周硬软组织再生梯度材料及其制备方法，该梯度材料通过静电纺丝技术与生物3D打印技术结合制备出能够同时引导牙周硬软组织再生的一体化修复梯度材料，该梯度材料中纤维膜具有相对致密的微孔结构，能够作为机械屏障膜阻止牙龈成纤维细胞向根面迁移，同时引导牙周软组织修复；梯度材料中3D打印支架材料能引导牙槽骨再生，从而实现牙周硬软组织一体化修复。但该材料的孔隙率低，不适合细胞生长，其形状也不具有可复性和对不规则骨缺损形状的主动适应，且该材料中的骨缺损区填充材料的降解速度也有待提高。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于口腔牙槽骨再生的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架，该支架具有一体化的致密-疏松结构，电纺致密层有支撑作用，可以防止成纤维细胞穿透；疏松层具有良好的形状可复性以及吸水作，可与血液结合后行成凝胶，十分适合细胞长入，有利于骨组织再生。
本发明的另一目的在于提供一种用于口腔牙槽骨再生的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架的制备方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种用于口腔牙槽骨再生的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架，该支架具有紧密结合的致密层和疏松层，所述致密层为电纺聚乳酸-羟基乙酸/聚己内酯(PLGA/PCL)纤维膜，该纤维膜具有内部通透性，由无序的纤维丝组成；所述疏松层为壳聚糖海绵，具有疏松多孔结构；
其中，所述壳聚糖海绵的孔隙率为91.14％-95.74％。
进一步地，所述壳聚糖海绵的孔径尺寸平均为50-200μm。
进一步地，所述电纺PLGA/PCL纤维膜的厚度为150-250μm，纤维丝的直径为500-820nm。
进一步地，PLGA的相对分子量为10-15万，PCL的相对分子质量为6-10万。
进一步地，壳聚糖脱乙酰度≥95％，粘度100-200mpa。
一种用于口腔牙槽骨再生的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1：将PLGA和PCL溶于三氟乙醇得到第一混合溶液，再将第一混合溶液放入微量注射器中，按照一定的速度注射，通过静电纺丝法制备PLGA/PCL纤维膜，将收集后的纤维膜冷冻干燥保存；
S2：将多巴胺粉剂溶解于Tri-HCl溶液得到第二混合溶液，取一定量的步骤S1所得的纤维膜置于第二混合溶液中，并避光浸泡一段时间，取出后使用去离子水冲洗至表面无明显沉积物，完成后将PLGA/PCL纤维膜冷冻干燥保存；
S3：壳聚糖粉剂溶解于乙酸，搅拌均匀，得到第三混合溶液；聚乙二醇二缩水甘油醚用去离子水稀释，搅拌均匀得到第四混合溶液；将第四混合溶液加入第三混合溶液中得到第五混合溶液，搅拌均匀待用；其中，第五混合溶液中，聚乙二醇二缩水甘油醚与壳聚糖质量浓度比为1∶5～1∶20；
S4：将步骤S2制得的纤维膜置于模板底部固定，将步骤S3制得的第五混合溶液滴注于纤维膜表面，立刻放入冰箱冷冻一段时间，再将样品放入冷冻干燥机避光冷冻干燥，取出后立即放入烘箱避光烘一段时间，取出后进行避光干燥保存；
S5：将步骤S4所得的样品进行环氧乙烷消毒，消毒完毕后密封干燥保存；消毒完毕后，即得所需的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架。
进一步地，步骤S1中，聚乳酸-羟基乙酸和聚己内酯按体积比1∶1～3∶1溶于三氟乙醇，且聚乳酸-羟基乙酸和聚己内酯在第一混合溶液中的浓度均为0.1～0.4g/mL；
注射速度为0.5～0.8mL/h，电纺变压器的工作电压设置为20～25kv，接收距离为15-20cm，电纺时的室内温度为25±1℃，空气相对湿度为20％-50％；
纤维膜冷冻干燥的温度为-35～-45℃，冷冻干燥的时间为2～3h。
进一步地，步骤S2中，多巴胺粉剂溶解于Tri-HCl溶液后的搅拌时间为30～60s，第二混合溶液的温度为20～30℃，多巴胺在第二混合溶液中的浓度为10～15mg/mL，纤维膜在第二混合溶液中的浸泡时间为2～3h，浸泡时的室温为25±1℃；去离子水冲洗3～5次，每次冲洗时间为30～60s。
进一步地，步骤S3在避光条件下进行，且第三溶液的搅拌温度为20～25℃，搅拌速度为1000～1500r/min，搅拌时间为5～8h；聚乙二醇二缩水甘油醚粘度为5～25mpa。
进一步地步骤S4中，纤维膜在冰箱中的冷冻温度为-35～-45℃，冷冻时间为4～6h；纤维膜冷冻干燥的时间为24～36h，在烘箱中的温度为35～45℃，烘干时间为24～72h；
所述模板为直径6.0～7.0mm的圆孔板，每个圆孔板里滴注的溶液体积为100～110μL。
本发明的有益效果在于：
1、本发明通过静电纺丝法得到聚乳酸-羟基乙酸/聚己内酯纤维膜，在通过化学交联的方法，通过特定的条件控制，使纤维膜和壳聚糖海绵发生结合，从而形成特定的致密-疏松结构，且致密层和疏松层结合紧密，形成一体化修复材料。在紧密结合的致密-疏松结构中，电纺致密层具有支撑作用，可以防止成纤维细胞穿透，避免缺损区被软组织占领而造成不发生骨修复；疏松层作为填塞骨缺损区材料，形成凝块并进一步形成新骨，避免了传统骨粉类填塞剂容易泄漏的问题，且该支架的疏松层具有吸水作用，可与血液结合后形成具有较大孔隙的凝胶支架，孔隙率达91.14％-95.74％，适宜的孔隙有利于细胞代谢物质的运输和交换，从而拥有更高的生物相容性，在骨的修复形成过程中，孔隙还可有利于新生血管和骨组织的长入，且该支架孔隙之间相互连通，从而可以提供更多的空间让骨组织长入；另一方面，高的孔隙率也意味着壳聚糖原料使用量少，从而提高了骨缺损区填充材料的降解速度，避免因其降解过慢影响新骨的形成；而在具有高孔隙率的同时，该支架还具有较大的孔径尺寸，大于100μm的孔径分布达94％-99％，为细胞及骨组织生长的提供有利的条件，有利于细胞及骨组织的长入。
2、本发明的壳聚糖海绵具有良好的形状可复性，当特有的海绵结构被压缩变薄后，遇水或血液可迅速吸水充盈，再次恢复形态，形成凝胶状；且海绵结构还具有可塑性，当遇到不规则或较深的骨缺损时，海绵吸收血液后自发充盈形成凝胶，并适应缺损区的形态，填塞至缺损区各个区域，从而使得该支架可以满足临床上不规则形态骨腔或较深骨缺损的充填需求，具有更广阔的应用前景；另一方面，该材料的壳聚糖海绵具有良好的凝血作用，在使用中可以帮助机体形成血凝块，从而能够更有效形成牙槽成骨，促进牙槽骨修复。
附图说明
图1是本发明的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架横截面场发射扫描电镜图片。
图2是本发明的电纺PLGA/PCL纤维膜的纤维直径统计图。
图3是实施例1的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架接种大鼠脂肪间充质干细胞一周后，荧光染色后共聚焦显微镜下图片。
图4实施例1的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架接种大鼠脂肪间充质干细胞一周后，场发射扫描电镜图片。
图5是实施例1的壳聚糖海绵的血液凝结测试图。
具体实施方式
为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。
根据本发明提供的一种电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架，该支架具有紧密结合的致密层和疏松层，所述致密层为电纺聚乳酸-羟基乙酸/聚己内酯纤维膜，该纤维膜具有内部通透性，由无序的纤维丝组成；所述疏松层为壳聚糖海绵，具有疏松多孔结构。其中，该支架的孔隙率为91.14％-95.74％，孔径尺寸平均为50-200μm；电纺PLGA/PCL纤维膜的厚度为150-250μm，纤维丝的直径为500-820nm。
作为本发明的示例性实施，前述材料的制备过程包括：
S1：将PLGA和PCL按体积比1∶1～3∶1溶于三氟乙醇得到第一混合溶液，且PLGA和PCL在第一混合溶液中的浓度均为0.1～0.4g/mL，再将第一混合溶液放入微量注射器中，按照0.5～0.8mL/h的速度注射，通过静电纺丝法制备PLGA/PCL纤维膜，将收集后的纤维膜置于-35～-45℃下冷冻干燥2～3h并保存；其中，电纺变压器的工作电压设置为20～25kv，接收距离为15-20cm，电纺时的室内温度为25±1℃，空气相对湿度为20％-50％。
S2：将多巴胺粉剂溶解于Tri-HCl溶液，搅拌30～60s，得到多巴胺浓度为10～15mg/mL第二混合溶液，保持第二混合溶液的温度为20～30℃，取面积为100-1000mm2，厚度为50-500μm的步骤S1所得的纤维膜置于第二混合溶液中，并避光浸泡2～3h，浸泡时的室温为25±1℃，取出后使用去离子水冲洗3～5次，每次冲洗时间为30～60s，完成后将纤维膜冷冻干燥保存。
S3：避光条件下，壳聚糖粉剂溶解于乙酸，搅拌均匀，搅拌温度为20～25℃，搅拌速度为1000～1500r/min，搅拌时间为5～8h，得到第三混合溶液；粘度为5～25mpa的聚乙二醇二缩水甘油醚用去离子水稀释，搅拌均匀得到第四混合溶液；将第四混合溶液加入第三混合溶液中得到第五混合溶液，搅拌均匀待用；其中，第五混合溶液中，聚乙二醇二缩水甘油醚与壳聚糖质量浓度比为1∶5～1∶20。
S4：将步骤S2制得的纤维膜置于直径6.0～7.0mm的圆孔板底部固定，每个圆孔板里滴注的溶液体积为100～110μL，将步骤S3制得的第五混合溶液滴注于纤维膜表面，立刻放入-35～-45℃冰箱冷冻4-6h，再将样品放入冷冻干燥机避光冷冻干燥24～36h，取出后立即放入35～45℃烘箱避光烘24～72h，取出后进行避光干燥保存。
S5：将步骤S4所得的样品进行环氧乙烷消毒，消毒完毕后密封干燥保存；消毒完毕后，即得所需的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架。
为了便于更好的理解，下面结合几个具体实例对本发明进行进一步说明，但制备工艺不限于此，且本发明内容不限于此。
以下实施例中使用的PLGA和PCL购于济南岱罡生物工程有限公司，PLGA的相对分子量为10-15万，PCL相对分子质量为6-10；壳聚糖购于麦克林公司，脱乙酰度≥95％，粘度100-200mpa；聚乙二醇二缩水甘油醚粘度为5～25mpa。
实施例1
S1：将PLGA和PCL按体积比1∶1溶于三氟乙醇得到第一混合溶液，第一混合溶液中的PLGA和PCL的浓度为0.1g/mL；将第一混合溶液放入注射器中，置于微量注射器，注射速度为0.5mL/h，电纺变压器的电压设置为20kv，接收距离为15cm，电纺时的室内温度为25℃，空气相对湿度为35％，将收集后的纤维膜冷冻干燥保存。
S2：将多巴胺粉剂溶解于Tri-HCl溶液，搅拌30s，得到多巴胺浓度为10mg/mL的第二混合溶液，第二混合溶液的温度为20℃，取面积为100-1000mm2，厚度为50-500μm的步骤S1所得的纤维膜，避光浸泡于该溶液中，浸泡时间2h，浸泡时的室温为25℃，浸泡完成后取出纤维膜，去离子水冲洗3遍，每遍30s，完成后将纤维膜冷冻干燥保存。
S3：壳聚糖粉剂溶解于0.5％乙酸，在温度为20℃的条件下，以1000r/min的转速搅拌5h，得到壳聚糖浓度为10mg/mL的第三混合溶液；聚乙二醇二缩水甘油醚用去离子水稀释至10mg/mL，搅拌均匀得到第四混合溶液；将第四混合溶液加入第三混合溶液中得到第五混合溶液，搅拌均匀待用；其中，第五混合溶液中，聚乙二醇二缩水甘油醚的质量浓度为0.1wt.％，壳聚糖的质量浓度为1wt.％。
S4：将步骤S2制得的纤维膜置于模板底部固定，模板为直径6.5mm的圆孔板，每个圆孔板里滴注的溶液体积为100μL，将步骤S3制得的第五混合溶液滴注于纤维膜表面，立刻放入-40℃冰箱冷冻4h，再将样品放入冷冻干燥机避光冷冻干燥24h，取出后立即放入40℃烘箱避光烘48h，取出后进行避光干燥保存。
S5：将步骤S4所得的样品进行环氧乙烷消毒，消毒完毕后密封干燥保存；消毒完毕后，即得所需的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架。
实施例2
S1：将PLGA和PCL按体积比2∶1溶于三氟乙醇得到第一混合溶液，第一混合溶液中的PLGA和PCL的浓度为0.3g/mL；将第一混合溶液放入注射器中，置于微量注射器，注射速度为0.7mL/h，电纺变压器的电压设置为25kv，接收距离为20cm，电纺时的室内温度为25℃，空气相对湿度为50％，将收集后的纤维膜冷冻干燥保存。
S2：将多巴胺粉剂溶解于Tri-HCl溶液，搅拌60s，得到多巴胺浓度为15mg/mL的第二混合溶液，第二混合溶液的温度为30℃，取面积为100-1000mm2，厚度为50-500μm的步骤S1所得的纤维膜，避光浸泡于该溶液中，浸泡时间3h，浸泡时的室温为25℃，浸泡完成后取出纤维膜，去离子水冲洗5遍，每遍30s，完成后将纤维膜冷冻干燥保存。
S3：壳聚糖粉剂溶解于0.5％乙酸，在温度为25℃的条件下，以1500r/min的转速搅拌7h，得到壳聚糖浓度为10mg/mL的第三混合溶液；聚乙二醇二缩水甘油醚用去离子水稀释至10mg/mL，搅拌均匀得到第四混合溶液；将第四混合溶液加入第三混合溶液中得到第五混合溶液，搅拌均匀待用；其中，第五混合溶液中，聚乙二醇二缩水甘油醚的质量浓度为0.1wt.％，壳聚糖的质量浓度为1wt.％。
S4：将步骤S2制得的纤维膜置于模板底部固定，模板为直径6.5mm的圆孔板，每个圆孔板里滴注的溶液体积为100μL，将步骤S3制得的第五混合溶液滴注于纤维膜表面，立刻放入-35℃冰箱冷冻6h，再将样品放入冷冻干燥机避光冷冻干燥36h，取出后立即放入45℃烘箱避光烘24h，取出后进行避光干燥保存。
实施例3
S1：将PLGA和PCL按体积比3∶1溶于三氟乙醇得到第一混合溶液，第一混合溶液中的PLGA和PCL的浓度为0.4/mL；将第一混合溶液放入注射器中，置于微量注射器，注射速度为0.8mL/h，电纺变压器的电压设置为20kv，接收距离为15cm，电纺时的室内温度为25℃，空气相对湿度为20％，将收集后的纤维膜冷冻干燥保存。
S2：将多巴胺粉剂溶解于Tri-HCl溶液，搅拌60s，得到多巴胺浓度为10mg/mL的第二混合溶液，第二混合溶液的温度为30℃，取面积为100-1000mm2，厚度为50-500μm的步骤S1所得的纤维膜，避光浸泡于该溶液中，浸泡时间2h，浸泡时的室温为25℃，浸泡完成后取出纤维膜，去离子水冲洗3遍，每遍60s，完成后将纤维膜冷冻干燥保存。
S3：壳聚糖粉剂溶解于0.5％乙酸，在温度为20℃的条件下，以1000r/min的转速搅拌8h，得到壳聚糖浓度为10mg/mL的第三混合溶液；聚乙二醇二缩水甘油醚用去离子水稀释至10mg/mL，搅拌均匀得到第四混合溶液；将第四混合溶液加入第三混合溶液中得到第五混合溶液，搅拌均匀待用；其中，第五混合溶液中，聚乙二醇二缩水甘油醚的质量浓度为0.1wt.％，壳聚糖的质量浓度为1wt.％。
S4：将步骤S2制得的纤维膜置于模板底部固定，模板为直径6.5mm的圆孔板，每个圆孔板里滴注的溶液体积为100μL，将步骤S3制得的第五混合溶液滴注于纤维膜表面，立刻放入-45℃冰箱冷冻4h，再将样品放入冷冻干燥机避光冷冻干燥24h，取出后立即放入40℃烘箱避光烘36h，取出后进行避光干燥保存。
S5：将步骤S4所得的样品进行环氧乙烷消毒，消毒完毕后密封干燥保存；消毒完毕后，即得所需的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架。
实施例4
S1：将PLGA和PCL按体积比1∶1溶于三氟乙醇得到第一混合溶液，第一混合溶液中的PLGA和PCL的浓度为0.1g/mL；将第一混合溶液放入注射器中，置于微量注射器，注射速度为0.5mL/h，电纺变压器的电压设置为25kv，接收距离为20cm，电纺时的室内温度为25℃，空气相对湿度为50％，将收集后的纤维膜冷冻干燥保存。
S2：将多巴胺粉剂溶解于Tri-HCl溶液，搅拌30s，得到多巴胺浓度为15mg/mL的第二混合溶液，第二混合溶液的温度为20℃，取面积为100-1000mm2，厚度为50-500μm的步骤S1所得的纤维膜，避光浸泡于该溶液中，浸泡时间3h，浸泡时的室温为25℃，浸泡完成后取出纤维膜，去离子水冲洗3遍，每遍30s，完成后将纤维膜冷冻干燥保存。
S3：壳聚糖粉剂溶解于0.5％乙酸，在温度为25℃的条件下，以1500r/min的转速搅拌7h，得到壳聚糖浓度为10mg/mL的第三混合溶液；聚乙二醇二缩水甘油醚用去离子水稀释至10mg/mL，搅拌均匀得到第四混合溶液；将第四混合溶液加入第三混合溶液中得到第五混合溶液，搅拌均匀待用；其中，第五混合溶液中，聚乙二醇二缩水甘油醚的质量浓度为0.1wt.％，壳聚糖的质量浓度为1wt.％。
S4：将步骤S2制得的纤维膜置于模板底部固定，模板为直径6.5mm的圆孔板，每个圆孔板里滴注的溶液体积为100μL，将步骤S3制得的第五混合溶液滴注于纤维膜表面，立刻放入-40℃冰箱冷冻4h，再将样品放入冷冻干燥机避光冷冻干燥36h，取出后立即放入40℃烘箱避光烘72h，取出后进行避光干燥保存。
S5：将步骤S4所得的样品进行环氧乙烷消毒，消毒完毕后密封干燥保存；消毒完毕后，即得所需的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架。
实施例5
S1：将PLGA和PCL按体积比1∶1溶于三氟乙醇得到第一混合溶液，第一混合溶液中的PLGA和PCL的浓度为0.1g/mL；将第一混合溶液放入注射器中，置于微量注射器，注射速度为0.5mL/h，电纺变压器的电压设置为25kv，接收距离为20cm，电纺时的室内温度为25℃，空气相对湿度为50％，将收集后的纤维膜冷冻干燥保存。
S2：将多巴胺粉剂溶解于Tri-HCl溶液，搅拌30s，得到多巴胺浓度为15mg/mL的第二混合溶液，第二混合溶液的温度为20℃，取面积为100-1000mm2，厚度为50-500μm的步骤S1所得的纤维膜，避光浸泡于该溶液中，浸泡时间2h，浸泡时的室温为25℃，浸泡完成后取出纤维膜，去离子水冲洗3遍，每遍30s，完成后将纤维膜冷冻干燥保存。
S3：壳聚糖粉剂溶解于0.5％乙酸，在温度为20℃的条件下，以1000r/min的转速搅拌5h，得到壳聚糖浓度为10mg/mL的第三混合溶液；聚乙二醇二缩水甘油醚用去离子水稀释至10mg/mL，搅拌均匀得到第四混合溶液；将第四混合溶液加入第三混合溶液中得到第五混合溶液，搅拌均匀待用；其中，第五混合溶液中，聚乙二醇二缩水甘油醚的质量浓度为0.05wt.％，壳聚糖的质量浓度为1wt.％。
S4：将步骤S2制得的纤维膜置于模板底部固定，模板为直径6.5mm的圆孔板，每个圆孔板里滴注的溶液体积为100μL，将步骤S3制得的第五混合溶液滴注于纤维膜表面，立刻放入-40℃冰箱冷冻4h，再将样品放入冷冻干燥机避光冷冻干燥24h，取出后立即放入40℃烘箱避光烘48h，取出后进行避光干燥保存。
S5：将步骤S4所得的样品进行环氧乙烷消毒，消毒完毕后密封干燥保存；消毒完毕后，即得所需的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架。
实施例6
S1：将PLGA和PCL按体积比1∶1溶于三氟乙醇得到第一混合溶液，第一混合溶液中的PLGA和PCL的浓度为0.1g/mL；将第一混合溶液放入注射器中，置于微量注射器，注射速度为0.5mL/h，电纺变压器的电压设置为20kv，接收距离为15cm，电纺时的室内温度为25℃，空气相对湿度为35％，将收集后的纤维膜冷冻干燥保存。
S2：将多巴胺粉剂溶解于Tri-HCl溶液，搅拌30s，得到多巴胺浓度为10mg/mL的第二混合溶液，第二混合溶液的温度为20℃，取面积为100-1000mm2，厚度为50-500μm的步骤S1所得的纤维膜，避光浸泡于该溶液中，浸泡时间2h，浸泡时的室温为25℃，浸泡完成后取出纤维膜，去离子水冲洗3遍，每遍30s，完成后将纤维膜冷冻干燥保存。
S3：壳聚糖粉剂溶解于0.5％乙酸，在温度为20℃的条件下，以1000r/min的转速搅拌5h，得到壳聚糖浓度为10mg/mL的第三混合溶液；聚乙二醇二缩水甘油醚用去离子水稀释至10mg/mL，搅拌均匀得到第四混合溶液；将第四混合溶液加入第三混合溶液中得到第五混合溶液，搅拌均匀待用；其中，第五混合溶液中，聚乙二醇二缩水甘油醚的质量浓度为0.2wt.％，壳聚糖的质量浓度为1wt.％。
S4：将步骤S2制得的纤维膜置于模板底部固定，模板为直径6.5mm的圆孔板，每个圆孔板里滴注的溶液体积为100μL，将步骤S3制得的第五混合溶液滴注于纤维膜表面，立刻放入-40℃冰箱冷冻4h，再将样品放入冷冻干燥机避光冷冻干燥24h，取出后立即放入40℃烘箱避光烘48h，取出后进行避光干燥保存。
S5：将步骤S4所得的样品进行环氧乙烷消毒，消毒完毕后密封干燥保存；消毒完毕后，即得所需的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架。
实施例7
S1：将PLGA和PCL按体积比1∶1溶于三氟乙醇得到第一混合溶液，第一混合溶液中的PLGA和PCL的浓度为0.1g/mL；将第一混合溶液放入注射器中，置于微量注射器，注射速度为0.5mL/h，电纺变压器的电压设置为20kv，接收距离为15cm，电纺时的室内温度为25℃，空气相对湿度为35％，将收集后的纤维膜冷冻干燥保存。
S2：将多巴胺粉剂溶解于Tri-HCl溶液，搅拌30s，得到多巴胺浓度为13mg/mL的第二混合溶液，第二混合溶液的温度为20℃，取面积为100-1000mm2，厚度为50-500μm的步骤S1所得的纤维膜，避光浸泡于该溶液中，浸泡时间2h，浸泡时的室温为25℃，浸泡完成后取出纤维膜，去离子水冲洗3遍，每遍30s，完成后将纤维膜冷冻干燥保存。
S3：壳聚糖粉剂溶解于0.5％乙酸，在温度为20℃的条件下，以1000r/min的转速搅拌5h，得到壳聚糖浓度为10mg/mL的第三混合溶液；聚乙二醇二缩水甘油醚用去离子水稀释至10mg/mL，搅拌均匀得到第四混合溶液；将第四混合溶液加入第三混合溶液中得到第五混合溶液，搅拌均匀待用；其中，第五混合溶液中，聚乙二醇二缩水甘油醚的质量浓度为0.1wt.％，壳聚糖的质量浓度为1.5wt.％。
S4：将步骤S2制得的纤维膜置于模板底部固定，模板为直径6.5mm的圆孔板，每个圆孔板里滴注的溶液体积为100μL，将步骤S3制得的第五混合溶液滴注于纤维膜表面，立刻放入-40℃冰箱冷冻4h，再将样品放入冷冻干燥机避光冷冻干燥24h，取出后立即放入40℃烘箱避光烘48h，取出后进行避光干燥保存。
S5：将步骤S4所得的样品进行环氧乙烷消毒，消毒完毕后密封干燥保存；消毒完毕后，即得所需的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架。
实施例8
S1：将PLGA和PCL按体积比1∶1溶于三氟乙醇得到第一混合溶液，第一混合溶液中的PLGA和PCL的浓度为0.1g/mL；将第一混合溶液放入注射器中，置于微量注射器，注射速度为0.5mL/h，电纺变压器的电压设置为20kv，接收距离为15cm，电纺时的室内温度为25℃，空气相对湿度为35％，将收集后的纤维膜冷冻干燥保存。
S2：将多巴胺粉剂溶解于Tri-HCl溶液，搅拌30s，得到多巴胺浓度为10mg/mL的第二混合溶液，第二混合溶液的温度为20℃，取面积为100-1000mm2，厚度为50-500μm的步骤S1所得的纤维膜，避光浸泡于该溶液中，浸泡时间2h，浸泡时的室温为25℃，浸泡完成后取出纤维膜，去离子水冲洗3遍，每遍30s，完成后将纤维膜冷冻干燥保存。
S3：壳聚糖粉剂溶解于0.5％乙酸，在温度为20℃的条件下，以1000r/min的转速搅拌5h，得到壳聚糖浓度为10mg/mL的第三混合溶液；聚乙二醇二缩水甘油醚用去离子水稀释至10mg/mL，搅拌均匀得到第四混合溶液；将第四混合溶液加入第三混合溶液中得到第五混合溶液，搅拌均匀待用；其中，第五混合溶液中，聚乙二醇二缩水甘油醚的质量浓度为0.15wt.％，壳聚糖的质量浓度为1.5wt.％。
S4：将步骤S2制得的纤维膜置于模板底部固定，模板为直径6.5mm的圆孔板，每个圆孔板里滴注的溶液体积为100μL，将步骤S3制得的第五混合溶液滴注于纤维膜表面，立刻放入-40℃冰箱冷冻4h，再将样品放入冷冻干燥机避光冷冻干燥24h，取出后立即放入40℃烘箱避光烘48h，取出后进行避光干燥保存。
S5：将步骤S4所得的样品进行环氧乙烷消毒，消毒完毕后密封干燥保存；消毒完毕后，即得所需的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架。
实施例9
S1：将PLGA和PCL按体积比1∶1溶于三氟乙醇得到第一混合溶液，第一混合溶液中的PLGA和PCL的浓度为0.1g/mL；将第一混合溶液放入注射器中，置于微量注射器，注射速度为0.5mL/h，电纺变压器的电压设置为20kv，接收距离为15cm，电纺时的室内温度为25℃，空气相对湿度为35％，将收集后的纤维膜冷冻干燥保存。
S2：将多巴胺粉剂溶解于Tri-HCl溶液，搅拌30s，得到多巴胺浓度为10mg/mL的第二混合溶液，第二混合溶液的温度为20℃，取面积为100-1000mm2，厚度为50-500μm的步骤S1所得的纤维膜，避光浸泡于该溶液中，浸泡时间2h，浸泡时的室温为25℃，浸泡完成后取出纤维膜，去离子水冲洗3遍，每遍30s，完成后将纤维膜冷冻干燥保存。
S3：壳聚糖粉剂溶解于0.5％乙酸，在温度为20℃的条件下，以1000r/min的转速搅拌5h，得到壳聚糖浓度为10mg/mL的第三混合溶液；聚乙二醇二缩水甘油醚用去离子水稀释至10mg/mL，搅拌均匀得到第四混合溶液；将第四混合溶液加入第三混合溶液中得到第五混合溶液，搅拌均匀待用；其中，第五混合溶液中，聚乙二醇二缩水甘油醚的质量浓度为0.1wt.％，壳聚糖的质量浓度为2wt.％。
S4：将步骤S2制得的纤维膜置于模板底部固定，模板为直径6.5mm的圆孔板，每个圆孔板里滴注的溶液体积为100μL，将步骤S3制得的第五混合溶液滴注于纤维膜表面，立刻放入-40℃冰箱冷冻4h，再将样品放入冷冻干燥机避光冷冻干燥24h，取出后立即放入40℃烘箱避光烘48h，取出后进行避光干燥保存。
S5：将步骤S4所得的样品进行环氧乙烷消毒，消毒完毕后密封干燥保存；消毒完毕后，即得所需的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架。
实施例10
S1：将PLGA和PCL按体积比1∶1溶于三氟乙醇得到第一混合溶液，第一混合溶液中的PLGA和PCL的浓度为0.1g/mL；将第一混合溶液放入注射器中，置于微量注射器，注射速度为0.5mL/h，电纺变压器的电压设置为20kv，接收距离为15cm，电纺时的室内温度为25℃，空气相对湿度为35％，将收集后的纤维膜冷冻干燥保存。
S2：将多巴胺粉剂溶解于Tri-HCl溶液，搅拌30s，得到多巴胺浓度为10mg/mL的第二混合溶液，第二混合溶液的温度为20℃，取一定量的步骤S1所得的纤维膜，避光浸泡于该溶液中，浸泡时间2h，浸泡时的室温为25℃，浸泡完成后取出纤维膜，去离子水冲洗3遍，每遍30s，完成后将纤维膜冷冻干燥保存。
S3：壳聚糖粉剂溶解于0.5％乙酸，在温度为20℃的条件下，以1000r/min的转速搅拌5h，得到壳聚糖浓度为10mg/mL的第三混合溶液；聚乙二醇二缩水甘油醚用去离子水稀释至10mg/mL，搅拌均匀得到第四混合溶液；将第四混合溶液加入第三混合溶液中得到第五混合溶液，搅拌均匀待用；其中，第五混合溶液中，聚乙二醇二缩水甘油醚的质量浓度为0.2wt.％，壳聚糖的质量浓度为2wt.％。
S4：将步骤S2制得的纤维膜置于模板底部固定，模板为直径6.5mm的圆孔板，每个圆孔板里滴注的溶液体积4h，再将样品放入冷冻干燥机避光冷冻干燥24h，取出后立即放入40℃烘箱避光烘48h，取出后进行避光干燥保存。
S5：将步骤S4所得的样品进行环氧乙烷消毒，消毒完毕后密封干燥保存；消毒完毕后，即得所需的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架。
【表征】
如图1是实施例1制备的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架的场发射扫描电镜照片，可以发现电纺膜与壳聚糖海绵紧密结合，形成致密-疏松结构，其中电纺膜较为致密，壳聚糖海绵疏松多孔，内部孔隙相互连通。
使用游标卡尺对实施例1-实施例10制备得到的电纺PLGA/PCL纤维膜的厚度进行测量，统计结果电纺PLGA/PCL纤维膜的厚度为150-250μm，并通过测量统计，如图2所示，纤维丝的直径为500-820nm。
使用压泵仪测实施例1-实施例10制备得到的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架的孔隙率，使用显微镜拍照检测电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架的孔径，其结果如表1所示：
表1
Figure BDA0002949245590000121
从表1可以看出，本方法制备的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架具有高孔隙率，孔隙率达91.14％-95.74％，且孔隙直径较大，直径大量分布于100-200μm之间，其中，大于100μm的孔径分布达94％-99％，十分适合细胞及骨组织的生长。
【应用测试】
1、细胞粘附生长测试
将实施例1制备的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架置于24孔细胞培养板中，每孔接种大鼠脂肪间充质干细胞2×105个。培养1周后，避光条件下，将dead/live染料与培养液1∶1混合，浸没材料15分钟，滤纸吸干后，于共聚焦显微镜下拍照观察。
如图3是大鼠脂肪间充质干细胞接种于电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架一周后的荧光染色图片，发现细胞可以在电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架表面黏附生长，说明该电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架有着良好的细胞学特性。
2、细胞长入孔内测试
将实施例1制备的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架置于24孔细胞培养板中，每孔接种大鼠脂肪间充质干细胞2×105个。培养1周后，以2.5％戊二醛固定30min，以30％、50％、70％、90％的乙醇梯度脱水，再以无水乙醇脱水三遍，干燥，喷金，场发射扫描电镜下拍照观察。
如图4是大鼠脂肪间充质干细胞接种于电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架一周后的场发射扫描电镜图片，发现细胞可以长入壳聚糖海绵的孔隙之中(如图3箭头所示)，说明该电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架的孔隙可以容纳细胞的生长。
3、凝血性能测试
将血液滴加在实施例1制备的壳聚糖海绵表面，在37℃下放置30min，再加入100ml去离子水稀释，测量稀释液中的血红蛋白浓度，无材料作为空白对照组。
如图5所示，结果显示，以不加干预的空白对照组为参照，稀释液中材料组的血红蛋白量下降了约95％，表明壳聚糖海绵具有较强的凝血性能。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

Claims (9)

1.一种用于口腔牙槽骨再生的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架，其特征在于：该支架具有紧密结合的致密层和疏松层，所述致密层为电纺聚乳酸-羟基乙酸/聚己内酯（PLGA/PCL）纤维膜，该纤维膜具有内部通透性，由无序的纤维丝组成；所述疏松层为壳聚糖海绵，具有疏松多孔结构；
其中，所述壳聚糖海绵的孔隙率为91.14%-95.74%，大于100um的孔径分布达94%-99%；
制备方法包括以下步骤：
S1：将PLGA和PCL溶于三氟乙醇得到第一混合溶液，再将第一混合溶液放入微量注射器中，按照一定的速度注射，通过静电纺丝法制备PLGA/PCL纤维膜，将收集后的纤维膜冷冻干燥保存；
S2：将多巴胺粉剂溶解于Tri-HCl溶液得到第二混合溶液，取一定量的步骤S1所得的纤维膜置于第二混合溶液中，并避光浸泡一段时间，取出后使用去离子水冲洗至表面无明显沉积物，完成后将PLGA/PCL纤维膜冷冻干燥保存；
S3：壳聚糖粉剂溶解于乙酸，搅拌均匀，得到第三混合溶液；聚乙二醇二缩水甘油醚用去离子水稀释，搅拌均匀得到第四混合溶液；将第四混合溶液加入第三混合溶液中得到第五混合溶液，搅拌均匀待用；其中，第五混合溶液中，聚乙二醇二缩水甘油醚与壳聚糖质量浓度比为1:5~1:20；
S4：将步骤S2制得的纤维膜置于模板底部固定，将步骤S3制得的第五混合溶液滴注于纤维膜表面，立刻放入冰箱冷冻一段时间，再将样品放入冷冻干燥机避光冷冻干燥，取出后立即放入烘箱避光烘一段时间，取出后进行避光干燥保存；其中，纤维膜在冰箱中的冷冻温度为-35~-45℃，冷冻时间为4~6h；纤维膜冷冻干燥的时间为24~36h，在烘箱中的温度为35~45℃，烘干时间为24~72h；
S5：将步骤S4所得的样品进行环氧乙烷消毒，消毒完毕后密封干燥保存；消毒完毕后，即得所需的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架。
2.根据权利要求1所述的用于口腔牙槽骨再生的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架，其特征在于：所述壳聚糖海绵的孔径尺寸平均为50-200um。
3.根据权利要求1所述的用于口腔牙槽骨再生的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架，其特征在于：所述电纺PLGA/PCL纤维膜的厚度为150-250um，纤维丝的直径为500-820nm。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用于口腔牙槽骨再生的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架，其特征在于：PLGA的相对分子量为10-15万，PCL的相对分子质量为6-10万。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的用于口腔牙槽骨再生的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架，其特征在于：壳聚糖脱乙酰度≥75%，粘度100-500mpa。
6.根据权利要求1所述的用于口腔牙槽骨再生的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架，其特征在于：步骤S1中，聚乳酸-羟基乙酸和聚己内酯按体积比1:1~3:1溶于三氟乙醇，且聚乳酸-羟基乙酸和聚己内酯在第一混合溶液中的浓度均为0.1~0.4g/mL；
注射速度为0.5~0.8mL/h，电纺变压器的工作电压设置为20~25kv，接收距离为15-20cm，电纺时的室内温度为25±1℃，空气相对湿度为20%-50%；
纤维膜冷冻干燥的温度为-35~-45℃，冷冻干燥的时间为2~3h。
7.根据权利要求1所述的用于口腔牙槽骨再生的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架，其特征在于：步骤S2中，多巴胺粉剂溶解于Tri-HCl溶液后的搅拌时间为30~60s，第二混合溶液的温度为20~30℃，多巴胺在第二混合溶液中的浓度为10~15mg/mL，纤维膜在第二混合溶液中的浸泡时间为2~3h，浸泡时的室温为25±1℃；去离子水冲洗3~5次，每次冲洗时间为30~60s。
8.根据权利要求1所述的用于口腔牙槽骨再生的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架，其特征在于：步骤S3在避光条件下进行，且第三溶液的搅拌温度为20~25℃，搅拌速度为1000~1500r/min，搅拌时间为5~8h；聚乙二醇二缩水甘油醚粘度为5~25mpa。
9.根据权利要求1所述的用于口腔牙槽骨再生的电纺PLGA/PCL纤维膜复合壳聚糖海绵支架，其特征在于：步骤S4中，所述模板为直径6.0~7.0mm的圆孔板，每个圆孔板里滴注的溶液体积为100~110μL 。
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