CN112964817A - 用高效液相色谱同时测定七叶树及提取物中6种皂苷成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用高效液相色谱同时测定七叶树及提取物中6种皂苷成分的方法，用七叶皂苷标准溶液分别绘制七叶皂苷A、七叶皂苷B的标准曲线；将样品配制成待测溶液，使用高效液相色谱测定待测溶液；根据七叶皂苷A标准曲线计算待测溶液中七叶皂苷A、七叶皂苷C、七叶皂苷E的浓度，根据七叶皂苷B标准曲线计算待测溶液中七叶皂苷B、七叶皂苷D、七叶皂苷F的浓度；计算样品中六种成分的含量。本发明通过HPLC可以一次性检测六个特征性成分的含量，操作方便、结果准确可靠，可用于精准判断药材来源、批次差异、工艺方法对产品质量的影响。本发明的方法有利于对资源的充分利用和环境保护，对推动经济社会发展全面绿色转型具有重要意义。

Description

用高效液相色谱同时测定七叶树及提取物中6种皂苷成分的 方法

技术领域

本发明属于节能环保领域，具体涉及用高效液相色谱同时测定七叶树及提取物中6种皂苷成分的方法。

背景技术

绿色发展是以效率、和谐、持续为目标的经济增长和社会发展方式。当今世界，绿色发展已经成为一个重要趋势，绿色发展与可持续发展在思想上是一脉相承的，既是对可持续发展的继承，也是可持续发展中国化的理论创新，也是中国特色社会主义应对全球生态环境恶化客观现实的重大理论贡献，符合历史潮流的演进规律。中医药是中华文明的瑰宝，中医药作为我国独特的卫生资源、潜力巨大的经济资源、具有原创优势的科技资源、优秀的文化资源和重要的生态资源，在经济社会发展中发挥着重要作用。与化学合成的西药不同，中医药大量的以自然生长的动植物入药，因此中医药的发展和自然资源息息相关，生物多样性的保护也是国家生态文明和环境质量水平的重要标志。

近几年，医学研究中浪费问题受到了广泛的关注，造成浪费的问题包括研究问题重要性不足、研究方法设计不恰当等问题。很多中药成分比较复杂，缺乏有效的检测方法会阻碍药材的使用，大量未经充分利用、还含有不少药用成分的中药材被生生丢弃，不少生产企业为缩短周期，降低成本，减少中药提取次数或缩短提取时间，致使所丢掉的药渣中还留有很多有效成分，还有不少企业只提取药材中的一种或一类有效成分，缺乏应有的综合利用，造成资源的浪费。

七叶皂苷是从娑罗子中提取的含有30多种三萜皂苷类的混合物。2015版药典规定，娑罗子的来源有中华七叶树、浙江七叶树和天师栗，产地主要分布在陕西、湖北和浙江等地。不同品种、不同产地的原料来源，提取到的七叶皂苷组成比例和含量差别很大，七叶皂苷提取物的质控标准亟待提高。为了确保产品功效的稳定，需要保证其化学成分含量保持稳定，建立科学统一的质量控制标准至关重要。

2015版中国药典对中药材的质控方法是用HPLC方法检测七叶皂苷A的含量，不得少于0.7％，对其它皂苷成分未加控制。注射用七叶皂苷钠的原料药标准根据WS1-XG-004-99，采用滴定法检测七叶皂苷总量，无法对其中主要皂苷的含量进行控制。根据大量文献报道，尽管植物来源不同，七叶皂苷中有6个成分是其中含量最高、最具典型性代表的成分，分别是七叶皂苷A(也叫七叶皂苷(escin)Ia)、七叶皂苷B(也叫七叶皂苷(escin)Ib)、七叶皂苷C(异七叶皂苷(isoescin)Ia)、七叶皂苷D(异七叶皂苷(isoescin)Ib)、七叶皂苷E(也叫七叶皂苷(aesculuside)A)、七叶皂苷F(七叶皂苷(aesculuside)B)，现有文献中的方法并不能同时检测上述六种成分的含量，阻碍了七叶皂苷相关药品的发展，同时对环境和生态造成不良的影响。

发明内容

为了解决的上述问题，本发明提供了用高效液相色谱同时测定七叶树及提取物中6种皂苷成分的方法，可以一次性检测七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C、七叶皂苷D、七叶皂苷E、七叶皂苷F六种成分的含量，操作方便、结果准确可靠。

本发明第一方面提供了用高效液相色谱同时测定七叶树提取物中6种皂苷成分的方法，所述方法的步骤包括：

(1)将样品配制成待测溶液；

(2)用七叶皂苷标准溶液分别绘制七叶皂苷A、七叶皂苷B的标准曲线；

(3)使用高效液相色谱测定待测溶液；

(4)根据七叶皂苷A标准曲线计算待测溶液中七叶皂苷A、七叶皂苷C、七叶皂苷E的浓度，根据七叶皂苷B标准曲线计算待测溶液中七叶皂苷B、七叶皂苷D、七叶皂苷F的浓度；然后计算待测样品中七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C、七叶皂苷D、七叶皂苷E、七叶皂苷F的含量。

优选的，所述步骤(4)中计算待测样品中七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C、七叶皂苷D、七叶皂苷E、七叶皂苷F的含量的方法为：根据式(一)进行计算，

式中：

ω—样品中各待测组分的质量分数，％；

m—样品取样量，g；

ρ—根据标准曲线计算得到的待测溶液中各待测组分的浓度，mg/L；

V—样品定容体积，mL；

D—稀释倍数。

优选的，所述步骤(2)中所述标准曲线的制作方法为：取不同体积的七叶皂苷标准溶液分别进样，进行色谱分析，分别以七叶皂苷A、七叶皂苷B浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，分别得到七叶皂苷A、七叶皂苷B的标准曲线。

优选的，所述步骤(1)中所述待测溶液的具体配制方法为：称取样品，用体积分数40％～55％的甲醇水溶液溶解，定容，过滤，制得待测溶液。

进一步优选的，所述样品具体为七叶树的提取液。

优选的，所述步骤(3)中所述高效液相色谱使用的色谱柱为C18分析柱。

优选的，所述步骤(3)中所述高效液相色谱的色谱条件为：流速：0.5～1.5mL/min；检测波长：220nm；柱温：25℃～35℃；进样量：5μL～10μL。

优选的，所述高效液相色谱使用的流动相为乙腈：磷酸水溶液。

优选的，所述磷酸水溶液为体积分数为0.1％～0.4％磷酸水溶液。

优选的，所述乙腈：磷酸水溶液的体积比为30：70～40：60。

本发明第二方面提供了所述的方法的应用，应用于测定七叶树中七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C、七叶皂苷D、七叶皂苷E、七叶皂苷F六种成分的含量。

优选的，所述七叶树包括七叶树药材、七叶树制剂。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：

(1)本发明根据七叶皂苷提取物中六个成分的化学结构特点，以七叶皂苷A为对照品，建立标准曲线，分别计算七叶皂苷A、七叶皂苷C、七叶皂苷E的含量；以七叶皂苷B为对照品，建立标准曲线，分别计算七叶皂苷B、七叶皂苷D、七叶皂苷F的含量，然后以六种成分含量之和作为控制标准，六种成分含量(质量分数)之和应不低于95.0％，可保证原料药七叶皂苷钠的质量稳定，保证药品疗效的稳定可靠。

(2)本发明用HPLC一次性检测六个特征性成分的含量，不仅操作方便、结果准确可靠，可以分别精确计算六个成分的含量，还可用于精准判断药材来源、批次差异、工艺方法对产品质量的影响，具有很强的创新性和实用性。使用本发明的方法可以检测七叶皂苷药材中六个成分的含量，可以用来判断药材质量的好坏。

(3)只有做到源头清晰、过程可控、质量可检、数量可调、责任可追，中药才会最大限度发挥其效用，通过本发明的方法可以实现七叶皂苷成分的充分利用，同时保证原料药的质量稳定，通过可靠的设计和实施标准，最大限度的提高了研究方法的质量，对提高药效具有显著效果，有利于对资源的充分利用和环境保护，有助于推动经济社会发展全面绿色转型。

附图说明

为了进一步解释说明本发明中提供方法和应用的有益效果，提供了相应的附图，需要指出的是本发明中提供的附图只是所有附图中选出来的个别示例，目的也不是作为对权利要求的限定，所有通过本申请中提供的附图获得的其他相应图谱均应该认为在本申请保护的范围之内。

图1为实施例1的七叶皂苷钠标准品液相色谱图；

图2为实施例1的七叶树提取物的样品测定色谱图。

图3为实施例2的七叶树提取物的样品测定色谱图。

图4为实施例3的七叶树药材的测定色谱图。

具体实施方式

结合以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可进一步地理解本发明的内容。除非另有说明，本文中使用的所有技术及科学术语均具有与本申请所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。

在本文中使用的，除非上下文中明确地另有指示，否则没有限定单复数形式的特征也意在包括复数形式的特征。还应理解的是，如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义，“包括”、“包括有”、“具有”、“包含”和/或“包含有”，当在本说明书中使用时表示所陈述的组合物、步骤、方法、制品或装置，但不排除存在或添加一个或多个其它组合物、步骤、方法、制品或装置。此外，当描述本申请的实施方式时，使用“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。除此之外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。

以下实施例中使用的试剂及实验用具均为常规使用的试剂及实验用具，均可从市场上购买获得。具体使用试剂和仪器：

本发明使用的试剂包括磷酸(分析纯)、乙腈(色谱纯)、甲醇(分析纯)；使用的仪器为高效液相色谱仪。

甲醇是一种比乙醇更好的溶剂，可以溶解许多无机盐。本发明使用体积分数40％～55％的甲醇水溶液配制七叶皂苷标准溶液，发明人发现甲醇水溶液对七叶皂苷钠的溶解效果更好，并且使用甲醇水溶液对后续使用液相色谱检测各组分含量不会产生不良影响，出峰更加稳定。

C18分析柱是一种反相色谱柱，它以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，因此有较高的碳含量和更好的疏水性，发明人发现使用C18分析柱测定七叶皂苷提取物各组分具有高分离度、分析时间短、高灵敏度。色谱柱的好坏关系到分离的效果，色谱条件的设置又影响着色谱柱的分离，色谱柱和色谱条件是相辅相成的关系。发明人结合C18分析柱，确定了色谱条件，包括流速：0.5～1.5mL/min；检测波长：220nm；柱温：25℃～35℃；进样量：5μL～10μL。进样量要根据样品浓度、色谱柱容量和检测器灵敏度来确定；对于反相色谱柱，柱温的改变会影响流动相粘度，进而影响保留时间；发明人确定了检测波长，利于确定其余的检测条件的确定。

乙腈是一种有机化合物，是一种无色液体，极易挥发，有类似于醚的特殊气味，有优良的溶剂性能，能溶解多种有机、无机和气体物质。与水和醇无限互溶。乙腈能发生典型的腈类反应，并被用于制备许多典型含氮化合物，是一个重要的有机中间体。磷酸或正磷酸，是一种常见的无机酸，是中强酸，不易挥发，不易分解，几乎没有氧化性。具有酸的通性，是三元弱酸，其酸性比盐酸、硫酸、硝酸弱，但比醋酸、硼酸等强。磷酸主要用于制药、食品、肥料等工业，也可用作化学试剂，磷酸盐是所有生命形式的营养。本发明通过实验发现乙腈和磷酸水溶液作为流动相七叶皂苷提取物各组分的检测效果更准确，出峰时间短。

所述七叶皂苷A、七叶皂苷C、七叶皂苷E均为α类皂苷，具有相同的相应因子强度，七叶皂苷B、七叶皂苷D、七叶皂苷F均为β类皂苷，具有相同的响应因子强度，因此，七叶皂苷A、七叶皂苷C、七叶皂苷E使用同一条标准曲线，七叶皂苷B、七叶皂苷D、七叶皂苷F使用同一条标准曲线。七叶皂苷A标准曲线计算待测溶液中七叶皂苷A、七叶皂苷C、七叶皂苷E的浓度，根据七叶皂苷B标准曲线计算待测溶液中七叶皂苷B、七叶皂苷D、七叶皂苷F的浓度。

七叶树在中国分布广泛，不同产地药材中各皂苷成分的含量有所差异。根据大量文献报道，湖北的天师栗、陕西的娑罗子和浙江的中华七叶树中皂苷含量最高，据此2015版《中华人民共和国药典》将以上三种来源的药材视为七叶树正品，其中七叶皂苷A和七叶皂苷B是七叶皂苷中含量最高的两个代表性成分，中国食品药品检定研究院也将七叶皂苷A、七叶皂苷B作为标准物质向全国供应。另外七叶皂苷A、七叶皂苷C、七叶皂苷E是同分异构体，七叶皂苷B、七叶皂苷D、七叶皂苷F也是同分异构体，它们结构类型相同，紫外吸收光谱一致；用七叶皂苷A、七叶皂苷B做检测用的标准品，可有效检测七叶皂苷C、七叶皂苷D、七叶皂苷E、七叶皂苷F的含量。

实施例1

1、七叶皂苷标准溶液的配制

称取七叶皂苷钠0.01g(精确到0.0001g)，放入5mL容量瓶中，以体积分数为50％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，超声溶解30min，将溶液用0.45μm滤膜过滤，滤液作为七叶皂苷标准溶液，备用。

七叶皂苷标准溶液的液相色谱图见图1。图中保留时间：Rt＝16.661min的峰，为七叶皂苷E；Rt＝19.689min的峰，为七叶皂苷F；Rt＝27.258min的峰，为七叶皂苷A；Rt＝33.090min的峰，为七叶皂苷B；Rt＝40.979min的峰，为七叶皂苷C；Rt＝47.246min的峰，为七叶皂苷D。

2、标准曲线的绘制

取上述方法配制的七叶皂苷标准溶液，分别进样1μL、2μL、4μL、8μL、10μL进行色谱分析，以七叶皂苷A浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制七叶皂苷A的标准曲线。以七叶皂苷B浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制七叶皂苷B的标准曲线。

3、样品处理

称取发明人自行提取的得到的七叶树提取物的样品0.10g(精确到0.0001g)，放入5mL容量瓶中，加入50％甲醇水(v/v)溶液，超声溶解30min，并定容。将溶液用0.45μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液，备用。

4、样品含量的测定

取待测溶液10μL进样，色谱分析的色谱条件为：色谱柱：Agilent Extend-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈：0.3％磷酸水溶液(33：67，v/v)；流速：1.0mL/min；检测波长：220nm；柱温：35℃；进样量：10μL；运行时间：90min。

图2为七叶树提取物的样品测定色谱图，其中七叶树皂苷E：16.466min；七叶树皂苷F：19.324min；七叶树皂苷A：27.255min；七叶树皂苷B：33.315min，七叶树皂苷C：41.708min；七叶树皂苷D：48.220min。

根据保留时间和紫外光谱图定性，测得峰面积，根据七叶皂苷A标准曲线得到待测溶液中七叶皂苷A、七叶皂苷C、七叶皂苷E的浓度，根据七叶皂苷B标准曲线得到待测溶液中七叶皂苷钠B、七叶皂苷D、七叶皂苷F的浓度，按式(一)计算样品中七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C、七叶皂苷D、七叶皂苷E、七叶皂苷F的含量。

式中：

ω—样品中各测定组分的质量分数，％；

m—样品取样量，g；

ρ—从标准曲线得到的待测溶液中各测定组分的浓度，mg/L；

V—样品定容体积，mL；

D—稀释倍数(不稀释则D为1)。

测定结果如表1所示。本发明的回收率，相对标准偏差是连续测定6次样品得到的含量计算得到。以下实施例和对比例的计算方法与本实施例相同。

表1.七叶树提取物中六种组分的含量

组分	含量/质量分数	相对标准偏差
			七叶树皂苷A	35.50％	0.68％
七叶树皂苷B	28.7％	0.97％
			七叶树皂苷C	11.58％	1.05％
七叶树皂苷D	10.62％	1.08％
			七叶树皂苷E	6.37％	1.13％
七叶树皂苷F	3.28％	1.26％
			含量之和	96.05％	1.01％

实施例2

本实施例与实施例1的不同之处在于测定的样品不同，所述样品2020年7月购自亳州市奉天药业，提取物的提取工艺及检测方法均与实施例1相同，图3为实施例2中七叶树提取物的样品测定色谱图，测定的结果如表2所示。

表2.七叶树提取物中六种组分的含量

组分	含量/质量分数	相对标准偏差
			七叶树皂苷A	30.68％	0.86％
七叶树皂苷B	26.85％	1.03％
			七叶树皂苷C	12.92％	1.17％
七叶树皂苷D	11.86％	1.01％
			七叶树皂苷E	7.58％	0.98％
七叶树皂苷F	5.63％	1.43％
			含量之和	95.52％	1.12％

实施例3

本实施例与实施例1的不同之处在于实施例1测定的是七叶树提取物，本实施例测的是的七叶树药材，2020年7月购自安国芳草佳商贸城。所述七叶树药材的处理方法为将七叶树药材粉碎过10目筛，然后用8倍量体积50％酒精在80℃条件下提取3次，每次1h，合并提取液，用0.45um滤膜过滤作为七叶树药材的提取物样品。

检测方法与实施例1相同，图4为实施例3中七叶树药材的样品测定色谱图，测定的结果如表3所示。

表3.七叶树药材中六种组分的含量

组分	含量/质量分数	相对标准偏差
			七叶树皂苷A	1.43％	0.97％
七叶树皂苷B	1.26％	0.84％
			七叶树皂苷C	0.41％	1.01％
七叶树皂苷D	0.36％	0.95％
			七叶树皂苷E	0.28％	0.57％
七叶树皂苷F	0.19％	1.04％
			含量之和	3.93％	0.89％

对比例1

本对比例使用《中华人民共和国药典》(2015版)中的方法，使用高效液相色谱测定实施例1中七叶树提取物的样品，得到七叶树皂苷A的质量分数1.90％。

对比例2

本对比例使用《中华人民共和国药典》(2015版)中的方法，使用高效液相色谱测定实施例2中七叶树提取物的样品，得到七叶树皂苷A的质量分数1.75％。

对比例3

本对比例使用《中华人民共和国药典》(2015版)中的方法，使用高效液相色谱测定实施例3中七叶树药材的样品，得到七叶树皂苷A的质量分数1.43％。

综上所述，现有检测方法只能检测七叶树中七叶皂苷A的含量，并不能检测其余五种七叶皂苷的含量，而通过本发明的方法，可以同时准确检测七叶皂苷提取物中的七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C、七叶皂苷D、七叶皂苷E、七叶皂苷F的含量，通过本发明的方法可以检测七叶树药材、七叶树提取物、七叶树制剂中的七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C、七叶皂苷D、七叶皂苷E、七叶皂苷F的含量，解决了现有技术中七叶皂苷提取物的质控标准不稳定的问题，可以用于确保其化学成分含量保持稳定，以达到产品功效的稳定目的。本发明的方法具有较高的回收率和精密度，方法的回收率为在80％～120％之间，相对标准偏差小于10％。中药质量的好坏对中药治疗效果产生直接影响，因此中药行业十分注重中药质量研究。随着科学技术的不断发展,现代科学技术方法在中药质量检验中获得了广泛的运用，且中药质量研究越来越依赖于现代科学技术方法。中药的化学成分在性质上非常复杂，中药有效成分的测定对于保障中药的安全性和医疗功效至关重要，通过现代化科学技术进行中药质量研究具有重要意义，本发明提供的同时测定七叶树及其提取物中六种皂苷成分的方法，既有助于七叶皂苷相关药物的研发，也有利于资源的充分利用，符合绿色发展理念，对环境保护具有重要意义。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.用高效液相色谱同时测定七叶树提取物中6种皂苷成分的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(1)将样品配制成待测溶液；

(2)用七叶皂苷标准溶液分别绘制七叶皂苷A、七叶皂苷B的标准曲线；

(3)使用高效液相色谱测定待测溶液；

(4)根据七叶皂苷A标准曲线计算待测溶液中七叶皂苷A、七叶皂苷C、七叶皂苷E的浓度，根据七叶皂苷B标准曲线计算待测溶液中七叶皂苷B、七叶皂苷D、七叶皂苷F的浓度；然后计算待测样品中七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C、七叶皂苷D、七叶皂苷E、七叶皂苷F的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中计算待测样品中七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C、七叶皂苷D、七叶皂苷E、七叶皂苷F的含量的方法为：根据式(一)进行计算，

式中：

ω—样品中各待测组分的质量分数，％；

m—样品取样量，g；

ρ—根据标准曲线计算得到的待测溶液中各待测组分的浓度，mg/L；

V—样品定容体积，mL；

D—稀释倍数。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中标准曲线的制作方法为：取不同体积的七叶皂苷标准溶液分别进样，进行色谱分析，分别以七叶皂苷A、七叶皂苷B浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，分别得到七叶皂苷A、七叶皂苷B的标准曲线。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中待测溶液的具体配制方法为：称取样品，用体积分数40％～55％的甲醇水溶液溶解，定容，过滤，制得待测溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中高效液相色谱使用的色谱柱为C18分析柱。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中所述高效液相色谱的色谱条件为：流速：0.5～1.5mL/min；检测波长：220nm；柱温：25℃～35℃；进样量：5μL～10μL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中所述高效液相色谱使用的流动相为乙腈：磷酸水溶液。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述磷酸水溶液为体积分数为0.1％～0.4％磷酸水溶液。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述乙腈：磷酸水溶液的体积比为30：70～40：60。

10.一种根据权利要求1～9任一所述的方法的应用，其特征在于：应用于测定七叶树中七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C、七叶皂苷D、七叶皂苷E、七叶皂苷F六种成分的含量。

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