CN112964769A - 一种快速检测叶酸含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测叶酸含量的方法，属于分析检测领域。本发明利用特定制备的铁酸锰材料修饰玻碳电极，然后以叶酸作为模板分子、多巴胺为功能单体，通过电化学聚合法在铁酸锰修饰过的玻碳电极表面制备对模板分子叶酸具有特异性识别响应的分子印迹电化学传感器。本发明利用该对叶酸分子具有特异性识别响应的分子印迹电化学传感器在中性条件下进行叶酸含量的检测，具有操作简单，成本低廉，较好的灵敏度和较强的抗干扰性。

Description

一种快速检测叶酸含量的方法
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种快速检测叶酸含量的方法。
背景技术
叶酸，又称蝶酰谷氨酸，是一种水溶性维生素B，广泛存在于一些新鲜水果，绿色蔬菜，动物肝脏和豆类中。由于人体无法自行合成叶酸，只能通过肠道吸收外源性叶酸，往往会导致叶酸缺乏症的出现。叶酸的缺乏会导致生理功能障碍和某些疾病，如新生儿神经管畸形、骨质疏松和精神退行性疾病等，因此叶酸的摄入和补充逐渐成为一个全世界都在关注的健康问题。随着对叶酸研究的不断深入，一些因为摄入过量叶酸而出现的健康问题也渐渐多了起来，如：缺锌，恶心，厌食等一系列肠胃综合症状。因此，叶酸的合理摄入就显得尤为重要，快速准确地检测叶酸含量，是指导叶酸摄入并保证其安全性和有效性的重要技术手段，同时也是诊断各种疾病的有效指标，对临床诊断具有重要意义。
目前，许多叶酸的检测方法已被开发且日趋完善，在已被报道过的方法中，微生物法因其测量范围广，成本低，而通常被公认为首选方案，但是需要较长的检测周期。高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法具有良好的选择性，但是在分析过程中仍存在设备昂贵，耗时长等问题。毛细管电泳法具有样品量少，分离效率高的优点，但是存在重现性差，有机物有毒等问题。比色法和酶联免疫吸附测定法在检测是速度较快，但灵敏度低，需要进行预处理除去基质中的干扰。
发明内容
为了解决上述问题，能够简便且精确的检测叶酸的含量，本发明开发检测也叶酸用的分子印迹电化学传感器。本发明旨在提供一种叶酸样品中叶酸含量的电化学检测方法，以铁酸锰为电极的修饰材料，用于改善电极的导电性和电活性面积。以叶酸为检测对象，制备对叶酸具有特异性响应的电化学传感电极。该电极具有良好的稳定性，导电性和较高的灵敏度。
本发明采用一步溶剂热法制备铁酸锰材料，用铁酸锰材料修饰玻碳电极，以多巴胺为功能单体，通过电化学聚合法在铁酸锰修饰过的玻碳电极表面制备对模板分子叶酸具有特异性识别响应的分子印迹电化学传感器。本发明结合分子印迹技术，制备出对叶酸分子具有特异性识别响应的分子印迹电化学传感器，并将其应用于在中性条件下叶酸含量的检测，具有操作简单，成本低廉，较好的灵敏度和较强的抗干扰性。
本发明基于对叶酸样品含量的快速检测，影响电化学性能的因素主要有：铁酸锰材料，模板分子与功能单体的比例，以及所制备的电化学传感器对目标分子的选择性等。对以上条件进行优化，构建对叶酸具有特异性识别的分子印迹电化学传感器。
本发明的目的在于提供一种制备用于检测叶酸的分子印迹电化学传感器的方法，所述方法包括：
(1)铁酸锰材料制备：将铁盐、锰盐和乙酸钠均匀分散在溶剂中，混匀、进行溶剂热反应，反应结束后，固液分离、收集固体，干燥，即得铁酸锰材料；
(2)修饰电极制备：将步骤(1)所得铁酸锰材料、固定剂分散在水中，形成混合液；然后将混合液滴涂在玻碳电极上，干燥，即得修饰电极；
(3)分子印迹电化学传感器的制备：以叶酸作为模板分子、多巴胺作为功能单体，将叶酸和多巴胺加入到含乙醇的磷酸盐缓冲液中，形成聚合体系；然后将步骤(2)所得修饰电极放置于聚合体系中进行电化学聚合成膜，结束后，取出电极、洗脱模板分子，干燥，即得分子印迹电化学传感器。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，铁盐与锰盐的摩尔比为1：2-4：1。优选2：1。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，铁盐可选：FeCl3﹒6H2O、FeSO4中任意一种或多种；锰盐可选：MnCl2﹒4H2O、MnSO4中任意一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，乙酸钠的添加量为2：1：(15-25)；优选：铁盐、锰盐与乙酸钠的摩尔比为2：1：20。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，溶剂为乙二醇；所述溶剂与乙酸钠的用量比为：(1-2)L/mol乙酸钠；优选1.2L/mol乙酸钠。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，溶剂热反应的温度为160℃-200℃；时间为10h-14h。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，固液分离后，收集固体，然后利用去离子水过滤水洗三次，之后用乙醇水洗至中性；在40℃-80℃下干燥12h-48h。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)具体包括如下过程：
将FeCl3﹒6H2O和MnCl2﹒4H2O(摩尔比为1：2-4：1)放入60mL乙二醇中，进行磁力搅拌，在搅拌过程中加入0.05mol乙酸钠，继续搅拌30分钟，放入100mL聚四氟乙烯的高压反应釜中进行反应，反应时间为10h-14h，反应时间为160℃-200℃。反应结束后，用去离子水过滤水洗三次，之后用乙醇水洗至中性，放入真空干燥箱中用40℃-80℃干燥12h—48h，干燥后制的铁酸锰材料。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，固定剂为0.5％-3％的壳聚糖溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，先将铁酸锰材料分散在水中形成铁酸锰分散液，然后加入固定剂，混匀后获得混合液；其中，铁酸锰分散液与固定剂的体积比为1：1-5：1。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，铁酸锰分散液的浓度为1mg/mL-20mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，取6μL-10μL滴涂在玻碳电极上，放置于30℃-70℃下干燥10min-30min，即可得修饰电极。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)具体包括如下过程：
将上述铁酸锰材料用去离子水进行分散，浓度为10mg/mL，分散后的溶液中加入固定剂，两者的体积比为3：1。取6μL-10μL滴涂在打磨好的玻碳电极上，放置于30℃—70℃的烘箱中干燥10min-30min，即可得修饰电极。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中，含乙醇的磷酸盐缓冲液中乙醇的质量分数为20％。磷酸盐缓冲液的pH＝7。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中，叶酸和多巴胺的摩尔比为1：5-1：20。优选1：10。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中，聚合体系中，叶酸的浓度为0.1mM-1mM。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中，电化学聚合成膜的过程参数为：扫描电位：-0.5V-0.5V、扫描圈数：40圈、扫描速率：0.05V﹒s-1。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中，洗脱模板分子的过程是将电极放入0.25M NaOH和9×10-4M CTAB的混合溶液中进行洗脱。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)具体包括如下过程：
将修饰电极放置于叶酸，多巴胺，含有20％乙醇的磷酸盐缓冲液中(pH＝7)，进行电化学聚合成膜，之后将上述电极自然放置干燥，之后将电极放入0.25M NaOH和9×10-4MCTAB的混合溶液中进行洗脱，即得分子印迹电化学传感器。并将上述制得的分子印迹电化学传感器用于叶酸含量的测试。
本发明基于上述方法提供了一种用于检测叶酸的分子印迹电化学传感器。
本发明还提供上述分子印迹电化学传感器在叶酸含量检测中的应用。
本发明还提供一种电化学检测叶酸含量的方法，所述方法包括如下过程：
配置一系列已知浓度的叶酸样品，利用上述分子印迹电化学传感器作为工作电极，用差分脉冲伏安法检测叶酸样品的电化学信号，测得相应的电流值I以及叶酸浓度为0时的电流值I0，得到电流差值△I＝I-I0；利用电流差值△I与相应叶酸浓度构建线性关系，得到叶酸检测模型。
在本发明方法中，一系列叶酸样品的浓度范围为6μM-600μM。
在本发明方法中，通过制备分子印迹传感器测定叶酸的含量。为了评价所制备铁酸锰材料的电化学性能，以裸玻碳电极、铁酸锰修饰电极、电聚合后的电极、洗脱叶酸分子后的印迹电极在铁氰化钾中的循环伏安行为来证实(见图1)。进一步对模板分子和功能单体的比例进行优化，发现在模板分子和功能单体比例的摩尔比为1：10时，所制备的分子印迹电化学传感器对叶酸的检测性能较优(见图2)。
本发明所制备的分子印迹电化学传感器是基于铁酸锰，用于高灵敏识别叶酸的分子印迹电化学传感器，具有较好的灵敏度(见图3)，以及较强的抗干扰性(见图4)。可应用于叶酸样品中叶酸含量的检测。
本发明有益效果：
本发明所制备的分子印迹电化学传感器用于对叶酸的特异性识别分析技术，叶酸传统的检测方法周期长，过程繁琐，故提出一种分子印迹电化学传感器研制，用于在中性环境中对叶酸有高灵敏识别，特异性响应。本发明中，修饰电极的材料制备简单，价格低廉，所提出的检测方法是差分脉冲伏安法，可以快速检测叶酸的浓度，具有较好的灵敏度(见实施例附图3)，在6μM-600μM浓度范围内叶酸浓度对数和电流差值成线性关系，检出限为1.16μM；以及较强的抗干扰性(见图4)。
附图说明
图1为不同修饰电极分子印迹电化学传感器图；其中，A为修饰电极，B为裸电极，C为洗脱后分子印迹电化学传感器，D为电聚合后分子印迹膜。
图2为不同模板分子和功能单体比例制备的分子印迹电化学传感器信号对比图；其中，a为裸电极，b为叶酸/多巴胺比例1：20，c为叶酸/多巴胺比例1：10，d为叶酸/多巴胺比例1：5。
图3为不同摩尔比例的铁酸锰材料制备的分子印迹电化学传感器信号对比图；其中，1为裸电极；2为FeCl3﹒6H2O和MnCl2﹒4H2O的摩尔比为4：1；3为FeCl3﹒6H2O和MnCl2﹒4H2O的摩尔比为2：1；4为FeCl3﹒6H2O和MnCl2﹒4H2O的摩尔比为1：1。
图4为本发明叶酸检测方法的线性关系图。
图5为分子印迹电化学传感器抗干扰性能比对图。
具体实施方式
实施例1
铁酸锰材料制备：将FeCl3﹒6H2O(2.5mmol)和MnCl2﹒4H2O(2.5mmol)(摩尔比为1：1)放入60mL乙二醇中，进行磁力搅拌，在搅拌过程中加入0.05mol乙酸钠，继续搅拌30分钟，放入100mL聚四氟乙烯的高压反应釜中进行反应，反应时间为12h，反应时间为200℃。反应结束后，用去离子水过滤水洗三次，之后用乙醇水洗至中性，放入真空干燥箱中用60℃干燥24h，干燥后制得铁酸锰材料a。
实施例2
铁酸锰材料制备：将FeCl3﹒6H2O(10mmol)和MnCl2﹒4H2O(2.5mmol)(摩尔比为4：1)放入60mL乙二醇中，进行磁力搅拌，在搅拌过程中加入0.05mol乙酸钠，继续搅拌30分钟，放入100mL聚四氟乙烯的高压反应釜中进行反应，反应时间为12h，反应时间为200℃。反应结束后，用去离子水过滤水洗三次，之后用乙醇水洗至中性，放入真空干燥箱中用60℃干燥24h，干燥后制得铁酸锰材料b。
实施例3
制备修饰电极：利用实施例1所得铁酸锰材料a来制备得到修饰电极a：将上述铁酸锰材料用去离子水进行分散，浓度为10mg/mL，分散后的溶液中加入固定剂1％壳聚糖溶液，两者的体积比为1：1。取8μL滴涂在打磨好的玻碳电极上，放置于60℃的烘箱中干燥15min，即可得修饰电极。
实施例4
制备修饰电极：利用实施例2所得铁酸锰材料b来制备得到修饰电极b：将上述铁酸锰材料用去离子水进行分散，浓度为10mg/mL，分散后的溶液中加入固定剂1％壳聚糖溶液，两者的体积比为5：1。取8μL滴涂在打磨好的玻碳电极上，放置于60℃的烘箱中干燥15min，即可得修饰电极。
实施例5
分子印迹电化学传感器的制备：将上述实施例3所得修饰电极放置于含有叶酸、多巴胺、以及20％乙醇的磷酸盐缓冲液中(叶酸与多巴胺的摩尔比为1：5，叶酸在缓冲液中的浓度为0.5mM，缓冲液pH＝7)，进行电化学聚合成膜(电聚合条件：扫描电位：-0.5V-0.5V、扫描圈数：40圈、扫描速率：0.05V·s-1)，之后将聚合后的电极自然放置干燥，然后放入0.25MNaOH和9×10-4M CTAB的混合溶液中进行洗脱，即得分子印迹电化学传感器。
实施例6
分子印迹电化学传感器的制备：将上述实施例3所得修饰电极放置于含有叶酸、多巴胺、以及20％乙醇的磷酸盐缓冲液中(叶酸与多巴胺的摩尔比为1：10，叶酸在缓冲液中的浓度为0.5mM，缓冲液pH＝7)，进行电化学聚合成膜(电聚合条件：扫描电位：-0.5V-0.5V、扫描圈数：40圈、扫描速率：0.05V·s-1)，之后将聚合后的电极自然放置干燥，然后放入0.25MNaOH和9×10-4M CTAB的混合溶液中进行洗脱，即得分子印迹电化学传感器。
实施例7分子印迹电化学传感器对叶酸检测性能研究
铁酸锰修饰的玻碳电极：
铁酸锰材料制备：将FeCl3﹒6H2O(5.0mmol)和MnCl2﹒4H2O(2.5mmol)(摩尔比为2：1)放入60mL乙二醇中，进行磁力搅拌，在搅拌过程中加入0.05mol乙酸钠，继续搅拌30分钟，放入100mL聚四氟乙烯的高压反应釜中进行反应，反应时间为12h，反应时间为200℃。反应结束后，用去离子水过滤水洗三次，之后用乙醇水洗至中性，放入真空干燥箱中用60℃干燥24h，干燥后制得铁酸锰材料。
利用所得铁酸锰材料来制备得到修饰电极：将上述铁酸锰材料用去离子水进行分散，浓度为10mg/mL，分散后的溶液中加入固定剂1％壳聚糖，两者的体积比为1：1。取8μL滴涂在打磨好的玻碳电极上，放置于60℃的烘箱中干燥15min，即可得经铁酸锰修饰的玻碳电极。
分子印迹电化学传感器的制备：将所得经铁酸锰修饰的玻碳电极放置于含有叶酸、多巴胺、以及20％乙醇的磷酸盐缓冲液中(叶酸与多巴胺的摩尔比为1：10，叶酸在缓冲液中的浓度为0.5mM，缓冲液pH＝7)，进行电化学聚合成膜(电聚合条件：扫描电位：-0.5V-0.5V、扫描圈数：40圈、扫描速率：0.05V·s-1)，之后将聚合后的电极自然放置干燥，然后放入0.25M NaOH和9×10-4M CTAB的混合溶液中进行洗脱，即得分子印迹电化学传感器。
应用分子印迹电化学传感器检测叶酸：
在5mM K3[Fe(CN)6]和0.1M KCl混合液中，以所得分子印迹电化学传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极。用差分脉冲伏安法检测电化学信号，测得相应的电流值I以及叶酸浓度为0时的电流值I0，得到电流差值△I＝I-I0；利用电流差值△I与相应叶酸浓度构建线性检测模型，如图4所示。可见，在6μM-600μM浓度范围内，随着叶酸浓度的增加，电流值降低，叶酸浓度对数和电流差值成线性关系，检出限为1.16μM。
实施例8探究不同叶酸与多巴胺摩尔比对构建得到的分子印迹传感器的影响
分子印迹电化学传感器的制备：将上述实施例7中所得的经铁酸锰修饰的电极放置于含有叶酸、多巴胺、以及20％乙醇的磷酸盐缓冲液中(叶酸与多巴胺的摩尔比为1：20或者1：5，叶酸在缓冲液中的浓度均为0.5mM，缓冲液pH＝7)，进行电化学聚合成膜(电聚合条件：扫描电位：-0.5V-0.5V、扫描圈数：40圈、扫描速率：0.05V﹒s-1)，之后将聚合后的电极自然放置干燥，然后放入0.25M NaOH和9×10-4M CTAB的混合溶液中进行洗脱，即得分子印迹电化学传感器。
将叶酸与多巴胺的摩尔比为1：20，1：10，1：5相应制得的分子印迹电化学传感器分别放入1×10-4M的叶酸溶液中进行吸附，吸附时间为6min，取出电化学传感器，测试电化学响应信号。
结果如图2所示。其中，a为裸电极，b为叶酸/多巴胺比例1：20所得的分子印迹电化学传感器，c为叶酸/多巴胺比例1：10的分子印迹电化学传感器，d为叶酸/多巴胺比例1：5的分子印迹电化学传感器。
不同叶酸/多巴胺摩尔比所制传感器进行电化学测试，将不同叶酸/多巴胺摩尔比所制传感器放入在5mM K3[Fe(CN)6]和0.1M KCl混合液中，采用循环伏安法进行电化学信号测试，结果表明，摩尔比为1：5时，电化学信号较低，无法进行有效的信号利用；当摩尔比为1：20时，电化学信号与玻碳电极相近，但分子印迹膜被破坏，无法用于后续的特异性含量检测。只有摩尔比为1：10时制得的具有显著电信号且分子印迹不受损的传感器，可构建获得实施例7中所示的高灵敏检测模型。
实施例9探究不同摩尔比例的铁酸锰材料对传感器的影响
参照实施例7的过程，替换不同FeCl3﹒6H2O和MnCl2﹒4H2O摩尔比例(1：1、2：1、4：1)制得的铁酸锰材料修饰玻碳电极，然后将修饰电极放入在5mM K3[Fe(CN)6]和0.1M KCl混合液中，采用循环伏安法和电化学阻抗测试材料的电化学信号。
结果如图3所示。其中，1为裸电极；2为FeCl3﹒6H2O和MnCl2﹒4H2O的摩尔比为4：1；3为FeCl3﹒6H2O和MnCl2﹒4H2O的摩尔比为2：1；4为FeCl3﹒6H2O和MnCl2﹒4H2O的摩尔比为1：1。通过循环伏安法检测电化学信号，当摩尔比较低为1：1或者高至4：1时，所得电信号均无法有效用于统计构建线性检测模型；而摩尔比为2：1时，电化学信号最高，可构建获得实施例7中所示的高灵敏检测模型，因此，材料的比例优选2：1。
实施例10分析方法的抗干扰评价
在5mM K3[Fe(CN)6]和0.1M KCl混合液中，以实施例8中分子印迹电化学传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，构建的分子印迹电化学传感器。
用差分脉冲伏安法检测电化学信号，检测叶酸，对乙酰氨基苯酚，L-半胱氨酸的电化学响应信号，以电流变化量评价方法的抗干扰性能。
结果如图5所示，从图中可以看到，检测到叶酸的电流差值较大，而检测到对乙酰氨基苯酚的电流差值为仅为叶酸电流信号差值的十分之一，L-半胱氨酸的电流信号差值为叶酸电流差值的三分之一，后两者相对较小。说明所制备的分子印迹电化学传感器对叶酸具有特异性识别功能，该检测方法具有较强的抗干扰性，能够实现对叶酸的特异性检测。

Claims (10)

1.一种制备用于检测叶酸的分子印迹电化学传感器的方法，所述方法包括：
(1)铁酸锰材料制备：将铁盐、锰盐和乙酸钠均匀分散在溶剂中，混匀、进行溶剂热反应，反应结束后，固液分离、收集固体，干燥，即得铁酸锰材料；
(2)修饰电极制备：将步骤(1)所得铁酸锰材料、固定剂分散在水中，形成混合液；然后将混合液滴涂在玻碳电极上，干燥，即得修饰电极；
(3)分子印迹电化学传感器的制备：以叶酸作为模板分子、多巴胺作为功能单体，将叶酸和多巴胺加入到含乙醇的磷酸盐缓冲液中，形成聚合体系；然后将步骤(2)所得修饰电极放置于聚合体系中进行电化学聚合成膜，结束后，取出电极、洗脱模板分子，干燥，即得分子印迹电化学传感器。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，铁盐与锰盐的摩尔比为1：2-4：1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，铁盐可选：FeCl3﹒6H2O、FeSO4中任意一种或多种；锰盐可选：MnCl2﹒4H2O、MnSO4中任意一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，先将铁酸锰材料分散在水中形成铁酸锰分散液，然后加入固定剂，混匀后获得混合液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，铁酸锰分散液与固定剂的体积比为1：1-5：1。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，铁酸锰分散液的浓度为1mg/mL-20mg/mL。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，叶酸和多巴胺的摩尔比为1：5-1：20。
8.权利要求1-7任一项所述方法制备得到的一种用于检测叶酸的分子印迹电化学传感器。
9.权利要求8所述分子印迹电化学传感器在叶酸含量检测中的应用。
10.一种电化学检测叶酸含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下过程：
配置一系列已知浓度的叶酸样品，利用权利要求8所述的分子印迹电化学传感器作为工作电极，用差分脉冲伏安法检测叶酸样品的电化学信号，测得相应的电流值I以及叶酸浓度为0时的电流值I0，得到电流差值△I＝I-I0；利用电流差值△I与相应叶酸浓度构建线性关系，得到叶酸检测模型。
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