CN112941052A

CN112941052A - 壳聚糖酶ouc-t613及其应用

Info

Publication number: CN112941052A
Application number: CN202110196389.1A
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 孙建安; 苏海鹏; 刘振; 黄海燕
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2021-02-22
Filing date: 2021-02-22
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2041-02-22
Also published as: CN112941052B

Abstract

本发明公开了壳聚糖酶突变体OUC‑T613，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码壳聚糖酶突变体OUC‑T613的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述壳聚糖酶OUC‑T613在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用。本发明的壳聚糖酶OUC‑T613，是通过DNA基因重组技术改造并筛选获得的，相比壳聚糖酶OUC‑CsnPa，催化活性提高了1.92倍，比酶活达到1576.36U/mg。酶解1h的转化率提高46％，相比野生型，达到完全转化的时间提前3h。是特异性制备部分paCOS的理想催化剂。利用本发明的壳聚糖酶OUC‑T613在催化活性和效率方面具有明显的优势。

Description

壳聚糖酶OUC-T613及其应用

技术领域

本发明涉及一种经DNA重组得到的壳聚糖酶突变体OUC-T613，及其在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用，属于功能酶技术和基因工程领域。

背景技术

壳聚糖是β-(1,4)糖苷键联结的N-乙酰基-D-葡萄糖胺(GlcNAc，A)和D-葡萄糖胺(GlcN，D)单元的聚合物，它们是部分N-乙酰化的生物聚合物，可溶于酸性水性介质，被认为是功能最全，最有前途的功能性生物聚合物之一。壳聚糖的更生态，可持续和有效利用非常重要，而低成本且易于控制的酶水解是将大量生物质转化为寡聚降解产物的关键，寡聚降解产物的生物活性功能是壳聚糖的升华和延续，而壳聚糖具有特殊的结构和功能。部分乙酰壳寡糖(paCOS)被证明具有多种生物活性，例如改善食品质量，抗菌活性，抗肿瘤特性以及免疫调节作用，并且已经在食品，营养，制药，化妆品和农业等多种应用中得到应用，例如一种通过脱乙酰壳聚糖生产paCOS的有前途的工具是来自不同糖苷水解酶(GH)家族的壳聚糖酶(E.C.3.2.1.132)，其不仅可以在温和的条件下进行，而且可能产生大量的低聚物,同时对不同的乙酰底物有着不同的偏好性。因此，对paCOS的利用与壳聚糖酶的可利用数量有关。考虑到环境，经济和工业生产的需求，迫切需要一种用于有效地水解壳聚糖的更理想壳聚糖酶突变体，其具有出色的催化效率。基于现有壳聚糖酶的蛋白质工程策略为获得具有优异性能的候选基因提供了很好的选择。

蛋白质催化剂的定向进化，DNA改组，在表型改良方面取得了重大突破，模仿了同源重组的自然过程。通过结合多亲本的全部优势，它是有效而可靠地产生所需候选人的强大工具。此外，DNA改组提供了文库的序列多样化，并偶发地在不同点诱导突变，从而导致复杂的表型。此外，作为一种很有前途的技术，DNA改组与传统方法相比，具有更快的传播有益突变的速率，被广泛用于快速增加DNA文库的大小。DNA改组被证明在多种应用中非常有效。革兰氏阴性菌作为宿主的全细胞催化显示出筛选重组蛋白文库的巨大潜力，这使得筛选改良的突变体是可行的。因此，可以采用上述策略来增强壳聚糖酶的催化活性和酶促性质。

发明内容

针对上述现有技术，本发明通过DNA基因重组技术筛选，得到了一种壳聚糖酶突变体，其具有高催化活性，用该突变体催化制备paCOS，可弥补现有酶活力低，表达水平不高的不足。

本发明是通过以下技术方案实现的：

壳聚糖酶突变体OUC-T613，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MMLSGLSGPSPAKAFAEENGTTVQETVDLNEGDNSNEASTESLSLTNEEATSQAAVTATDHDANFSPSTLQFLKANTGLDGEQWDNIMKLVNKPEQDSLKWTEFYGYAEDIGDNRGYTIGIFGATTGGSNDTGPDGPDLFKAFDAASGASSPSIAGGLTRAGLKGKMSGSILKLSDSDSVIKKKIKALQNNEAWREAMWRTFYDTYIKYSVQQAQKRGFNTALTIGSFVDTALNQGATGDSGSLEGILSRSGSSTNEKTFMTNFYAKRTLIVDTNDYNQPPNGKNRVKQWSSLLASGETDLKNADAAVIKVTNWEMK。

一种编码上述壳聚糖酶突变体OUC-T613的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

5’-ATGATGCTGAGTGGCCTGAGTGGTCCGAGTCCGGCCAAAGCATTTGCCGAAGAAAATGGTACAACCGTTCAGGAAACCGTTGATCTGAATGAAGGCGATAATAGCAATGAAGCAAGCACCGAAAGCCTGAGTCTGACCAATGAAGAAGCAACCAGTCAGGCCGCAGTGACCGCCACCGATCATGATGCAAATTTTAGCCCGAGCACCCTGCAGTTTCTGAAAGCCAATACCGGCCTGGATGGTGAACAGTGGGATAATATTATGAAACTGGTTAATAAGCCGGAACAGGATAGCCTGAAATGGACCGAATTTTATGGTTATGCCGAAGATATTGGTGACAATCGCGGTTATACCATTGGCATTTTTGGCGCCACCACCGGCGGTAGTAATGATACCGGCCCGGATGGCCCGGATCTGTTTAAAGCATTTGATGCCGCAAGTGGCGCCAGCAGTCCGAGTATTGCAGGTGGTCTGACCCGTGCCGGTCTGAAAGGTAAAATGAGCGGTAGCATTCTGAAACTGAGCGATAGCGATAGCGTGATTAAGAAAAAGATTAAGGCACTGCAGAATAATGAAGCCTGGCGTGAAGCCATGTGGCGCACCTTTTATGATACCTATATTAAGTATAGCGTGCAGCAGGCCCAGAAACGTGGCTTTAATACCGCACTGACCATTGGTAGTTTTGTTGATACCGCACTGAATCAGGGCGCCACCGGTGACAGCGGTAGCCTGGAAGGTATTCTGAGTCGTAGTGGCAGCAGTACCAATGAAAAAACCTTTATGACCAATTTCTACGCCAAACGTACCCTGATTGTGGATACCAATGATTATAATCAGCCGCCGAATGGCAAAAATCGCGTTAAACAGTGGAGTAGTCTGCTGGCCAGCGGTGAAACCGATCTCAAAAATGCAGATGCAGCCGTGATTAAGGTTACCAATTGGGAAATGAAA-3’。

所述壳聚糖酶OUC-T613在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用；在制备降解壳聚糖/制备壳寡糖的酶制剂中的应用。

进一步地，在降解壳聚糖时，生成乙酰基壳寡糖。

一种酶制剂，包含有上述的壳聚糖酶OUC-T613。该酶制剂在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用。

一种降解壳聚糖/制备壳寡糖的方法，采用上述壳聚糖酶OUC-T613降解壳聚糖。

一种重组工程菌，其基因组中插入有上述编码壳聚糖酶OUC-T613的基因，其能表达壳聚糖酶OUC-T613。该工程菌在制备壳聚糖酶OUC-T613中的应用。

本发明的壳聚糖酶OUC-T613，是通过DNA基因重组技术改造并筛选获得的新型壳聚糖酶。本发明的壳聚糖酶OUC-T613，相比壳聚糖酶OUC-CsnPa，催化活性提高了1.92倍，比酶活达到1576.36U/mg。酶解1h的转化率提高46％，相比野生型，达到完全转化的时间提前3h。是特异性制备部分paCOS的理想催化剂。利用本发明的壳聚糖酶OUC-T613在催化活性和效率方面具有明显的优势。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：本发明中壳聚糖酶DNA重组过程琼脂糖凝胶电泳图。

图2：筛选到的重组酶高密度发酵酶活测定图。

图3：高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613和亲本的性质比较图。

图4：高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613催化水解转化率图。

图5：高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613和野生型壳聚糖酶OUC-CsnPa结构对其图。

图6：高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613和野生型壳聚糖酶OUC-CsnPa结构对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1重组壳聚糖酶的制备

(1)壳聚糖酶亲本的扩增

首先通过PCR方法扩增申请人已获得的三种壳聚糖酶蛋白，分别为Paenibacillussp.1-18(OUC-CsnPa)、Paenibacillus tyrfis(OUC-CsnPT)和Chromobacterium sp.ATCC53434(OUC-CsnCA)，大小约为1000bp左右，其中OUC-CsnPa的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码基因的序列如SEQ ID NO.4所示；OUC-CsnPT的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码基因的序列如SEQ ID NO.6所示；OUC-CsnCA的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码基因的序列如SEQ ID NO.8所示。然后将PCR产物回收，用微量核酸测定仪测定亲本三个片段的浓度。将三个亲本片段在优化的消化体系下用消化酶DNsae I进行消化，切成100-200bp左右的片段，将酶切产物于琼脂糖凝胶电泳检测并回收(图1)。

其中，OUC-CsnPa的详细情况记载在申请人同日申请的另一项发明专利申请中，壳聚糖酶OUC-CsnPa，在50℃和pH＝7条件下其比酶活达539.95U/mg。可作用乙酰度较高的壳聚糖底物，壳聚糖酶OUC-CsnPa酶解产物为壳单糖(DP1)到壳三糖(DP3)。该酶作用高乙酰度壳聚糖底物(DDA 95％、90％、85％、75％)时，可产生更多的乙酰产物，尤其是作用75％脱乙酰度的壳聚糖，有部分甲壳二糖的产生，对乙酰基的A单元展现了相比于一般壳聚糖酶更优的偏好性。

SEQ ID NO.3：

MILLSFTVIA SFSSLSGPSP AKAFAEENGT TVQETVDLNE GDNSNEASTE SLSLTNEEATSQAAVTATDH DANFSPSTLQ FLKANTGLDG EQWDNIMKLV NKPEQDSLKW TEFYGYAEDI GDNRGYTIGIFGATTGGSND TGPDGPDLFK AFDAASGASS PSIAGGLTRA GLKGKMSGSI LKLSDSDSVI KKKIKALQNNEAWREAMWRT FYDTYIKYSV QQAQKRGFNT ALTIGSFVDT ALNQGATGDS GSLEGILSRS GSSTNEKTFMTNFYAKRTLI VDTNDYNQPP NGKNRVKQWS SLLASGETDL KNADAAVIKV TNWEMK。

SEQ ID NO.4：

5’-ATGATCCTGCTGAGCTTTACCGTTATTGCAAGTTTTAGTAGCCTGAGTGGTCCGAGTCCGGCCAAAGCATTTGCCGAAGAAAATGGTACAACCGTTCAGGAAACCGTTGATCTGAATGAAGGCGATAATAGCAATGAAGCAAGCACCGAAAGCCTGAGTCTGACCAATGAAGAAGCAACCAGTCAGGCCGCAGTGACCGCCACCGATCATGATGCAAATTTTAGCCCGAGCACCCTGCAGTTTCTGAAAGCCAATACCGGCCTGGATGGTGAACAGTGGGATAATATTATGAAACTGGTTAATAAGCCGGAACAGGATAGCCTGAAATGGACCGAATTTTATGGTTATGCCGAAGATATTGGTGACAATCGCGGTTATACCATTGGCATTTTTGGCGCCACCACCGGCGGTAGTAATGATACCGGCCCGGATGGCCCGGATCTGTTTAAAGCATTTGATGCCGCAAGTGGCGCCAGCAGTCCGAGTATTGCAGGTGGTCTGACCCGTGCCGGTCTGAAAGGTAAAATGAGCGGTAGCATTCTGAAACTGAGCGATAGCGATAGCGTGATTAAGAAAAAGATTAAGGCACTGCAGAATAATGAAGCCTGGCGTGAAGCCATGTGGCGCACCTTTTATGATACCTATATTAAGTATAGCGTGCAGCAGGCCCAGAAACGTGGCTTTAATACCGCACTGACCATTGGTAGTTTTGTTGATACCGCACTGAATCAGGGCGCCACCGGTGACAGCGGTAGCCTGGAAGGTATTCTGAGTCGTAGTGGCAGCAGTACCAATGAAAAAACCTTTATGACCAATTTCTACGCCAAACGTACCCTGATTGTGGATACCAATGATTATAATCAGCCGCCGAATGGCAAAAATCGCGTTAAACAGTGGAGTAGTCTGCTGGCCAGCGGTGAAACCGATCTGAAAAATGCAGATGCAGCCGTGATTAAGGTTACCAATTGGGAAATGAAA-3’。

OUC-CsnPT记载在申请人之前的发明专利申请中，公开号为：CN 111471667 A。

SEQ ID NO.5：

MSNARPSKSQTKFLLAFLCFTLVASLFGATALFQPSKAAAASPDDNFSPETLQFLRNNTGLDGEQWNNIMKLINKPEQDDLNWIEYYGYCEDITDERGYTIGLFGATTGGSRDTHPDGPELFKAYDAAKGASNPSADGALKRLGINGKMNGSILEIKDSEKVFCGKIKKLQNDAAWRKAMWETFYNVYIRYSVEQARQRGFASAVTIGSFVDTALNQGATGGSNTLQGLLARSGSSSNEKTFMKNFHAKRTLVVDTNKYNKPPNGKNRVKQWDTLVDMGKMNLKNVDSEIAKVTDWEMK。

SEQ ID NO.6：

5’-ATGAGCAATGCCCGCCCGAGCAAAAGCCAGACCAAATTTCTGCTGGCCTTTCTGTGTTTTACCCTGGTGGCCAGCCTGTTTGGCGCAACCGCCCTGTTTCAGCCGAGTAAAGCAGCAGCAGCAAGCCCGGATGATAATTTTAGTCCGGAAACCCTGCAGTTTCTGCGTAATAATACCGGTCTGGATGGCGAACAGTGGAATAATATTATGAAACTGATCAACAAGCCGGAACAGGATGATCTGAATTGGATTGAATATTATGGCTATTGCGAAGATATCACCGATGAACGTGGCTATACCATTGGTCTGTTTGGTGCAACCACCGGCGGCAGCCGTGATACCCATCCGGATGGTCCGGAACTGTTTAAAGCATACGATGCAGCCAAAGGTGCCAGCAATCCGAGCGCCGATGGTGCCCTGAAACGCCTGGGTATTAATGGTAAAATGAATGGCAGCATTCTGGAAATTAAGGATAGCGAAAAAGTTTTCTGTGGCAAAATTAAGAAGCTGCAGAATGATGCAGCCTGGCGTAAAGCAATGTGGGAAACCTTTTATAATGTTTATATCCGCTACAGCGTTGAACAGGCACGCCAGCGCGGTTTTGCAAGCGCCGTGACCATTGGTAGTTTTGTTGATACCGCCCTGAATCAGGGCGCCACCGGTGGCAGTAATACCCTGCAGGGTCTGCTGGCCCGCAGCGGTAGCAGTAGTAATGAAAAAACCTTTATGAAGAACTTCCACGCCAAACGTACCCTGGTGGTTGATACCAATAAGTATAATAAGCCGCCGAATGGTAAAAATCGCGTTAAACAGTGGGATACCCTGGTTGATATGGGTAAAATGAACCTGAAAAATGTTGATAGTGAGATTGCAAAAGTGACCGATTGGGAAATGAAA-3’。

OUC-CsnCA记载在申请人之前的发明专利申请中，公开号为：CN 111500555 A。

SEQ ID NO.7：

MMLSGLGLLAGACNAQGSAAGSSARHAARAEACSAGPHCTVAAARTAANPDDNFSPATLKFLKANTGLDGEQWNNIMKLINKPEQDSLDWTKFYGYCEDIGDKRGYTIGIFGATTGGPNDEGPDGPTLFKEFDAASGAANPSIEGGLSRIGAHGKMQGSILKISDSSKVFCGKIGGLQANAAWRQAMWNTFYKVYIQYSVSQARQRGFNSALTIGSFVDTALNQGAAGDSGTLQGLLSRSGNSADEKTFMTTFYAQRSKIVDTNDYNQPPNGKNRVKQWSTLLNMGETDLKNADAAVAKVTDWEMK。

SEQ ID NO.8：

5’-ATGATGCTGAGTGGCCTGGGTCTGCTGGCAGGCGCCTGCAATGCACAGGGTAGCGCAGCAGGTAGCAGCGCCCGTCATGCAGCCCGTGCCGAAGCATGCAGCGCAGGCCCTCATTGTACCGTTGCCGCCGCACGTACCGCAGCAAATCCGGATGATAATTTTAGCCCGGCCACCCTGAAATTTCTGAAAGCAAATACCGGCCTGGATGGCGAACAGTGGAATAATATTATGAAACTGATCAACAAGCCGGAACAGGATAGTCTGGATTGGACCAAATTTTATGGTTATTGTGAAGATATCGGCGATAAACGTGGCTATACCATTGGCATTTTTGGTGCCACCACCGGCGGCCCGAATGATGAAGGTCCGGATGGTCCGACCCTGTTTAAAGAATTTGATGCCGCCAGCGGCGCAGCAAATCCTAGCATTGAAGGCGGTCTGAGCCGTATTGGTGCCCACGGTAAAATGCAGGGCAGTATTCTGAAAATTAGCGATAGCAGTAAAGTGTTTTGCGGTAAAATTGGCGGTCTGCAGGCCAATGCAGCATGGCGTCAGGCCATGTGGAATACCTTTTATAAAGTGTATATCCAGTACAGCGTTAGCCAGGCACGTCAGCGTGGTTTTAATAGTGCCCTGACCATTGGCAGTTTTGTGGATACCGCCCTGAATCAGGGTGCCGCAGGCGATAGTGGCACCCTGCAGGGTCTGCTGAGCCGCAGCGGCAATAGCGCAGATGAAAAAACCTTTATGACCACCTTTTATGCACAGCGCAGCAAAATTGTTGATACCAATGATTATAACCAGCCGCCGAATGGCAAAAATCGTGTGAAACAGTGGAGCACCCTGCTGAATATGGGCGAAACCGATCTGAAAAATGCCGATGCCGCAGTTGCCAAAGTTACCGATTGGGAAATGAAA-3’。

(2)无引物PCR扩增壳聚糖酶片段

以回收得到的三个基因片段作为模板并互为引物，进行无引物PCR。由于OUC-CsnPa、OUC-CsnPT、OUC-CsnCA三个基因片段都是1000bp左右，反应结束后，将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，回收1000bp左右的片段。

(3)有引物PCR扩增磷脂酶D片段

以(2)中回收的片段为模板，分别以引物①OUC-CsnPa-F和OUC-CsnPT-R，②OUC-CsnPa-F和OUC-CsnCA-R，③OUC-CsnPa-F和OUC-CsnPa-R，④OUC-CsnPT-F和OUC-CsnPa-R，⑤OUC-CsnPT-F和OUC-CsnCA-R，⑥OUC-CsnPT-F和OUC-CsnPT-R⑦OUC-CsnCA-F和OUC-CsnPT-R,⑧OUC-CsnCA-F和OUC-CsnPa-R,⑨OUC-CsnCA-F和OUC-CsnCA-R 9对互组引物进行PCR扩增得到全长突变文库。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，并切胶回收1000bp左右目的产物(图1)。

9个重组片段与与pET28a进行无缝连接，构建重组质粒，连接产物首先转化至DH5α感受态细胞，用无菌水清洗平板长出的所有菌落，转入LB液体培养基中过夜培养后提取混合质粒。将提取的混合质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，涂布到含Kana抗性的5052自诱导培养基筛选平板(在ZYM-5052培养基的基础上加入琼脂粉和pH 5.0左右的胶体壳聚糖底物)上进行表达，为下一步的筛选做准备。

实施例2高活性重组壳聚糖酶突变体的筛选

将实施例1中固体平板上通过透明圈比对，透明圈相比亲本更大的克隆子接种到5mL5052培养基试管中培养48h，经过离心和缓冲液清洗菌体后与胶体壳聚糖进行全细胞催化筛选高活性突变体。并进行测序筛选出相对于OUC-CsnPa突变的高活性阳性株。将筛选的高活性阳性株在高密度自诱导培养基ZYP-5052中放大发酵，经过超声破碎得到上清粗酶，以看壳聚糖酶的水解活力作为筛选标准，通过酶活性比较(图2)，重组酶OUC-T613的酶活提高最高，提高了近104％，这说明经过DNA改组及筛选后成功获得了更高活性的壳聚糖酶突变体。经过纯化，得到单一条带的蛋白，测定比酶活为1576.36U/mg，比野生型提高1.92倍。

实施例3高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613性质测定

亲本和突变体OUC-T613的热稳定性主要通过参数T₅₀值进行评价。T₅₀定义为50％的酶在10分钟内灭活的温度。详细地，纯化的酶(0.01mg/mL)在各种温度(30～70℃)下孵育10分钟，然后测量剩余的活性。确定T₅₀值通过将移位的S型函数拟合到热失活曲线。从结果(图3)可以看出突变体融合了亲本OUC-CsnPT和OUC-CsnCA优异的热稳定性，相比于野生OUC-CsnPa的热稳定性都有所增强。

实施例4高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613催化水解壳聚糖

为了验证本发明的高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613与亲本酶酶解壳聚糖的能力，检测水解过程中壳聚糖的水解速率。首先，将5ml的2％(w/v)可溶性壳聚糖与纯化壳聚糖酶Pa和T613混合(最终为30u/mL)。然后，将混合物在恒温水浴振荡器中以200rpm的振荡速度在50℃下培养24h。在孵育10、30分钟以及1、2、4、8、12和24小时后，取200ul混合物。将样品煮沸10分钟以停止反应并冷却至室温。然后，将混合物的pH调至8.0，静置30min，使未经酶水解的壳聚糖充分沉淀。最后，混合物在12 000g下离心2min；收集沉淀并干燥至恒重，以分析水解速率。以2％壳聚糖与未经孵育的灭活壳聚糖酶混合液作为对照。根据式1计算壳聚糖水解速率。

式1：水解率(％)＝(W₀-W)*100/W₀

W₀为加入壳聚糖的平均干重，W为水解后调pH后析出的固体干重。

以水解时间为横坐标，水解率为纵坐标。由图4可以得到水解速率在10min-1h迅速增加，此后趋于稳定。在1h内突变株OUC-T613水解速率的急剧增加，1h时水解速率就达到了98.27％，此时野生壳聚糖酶OUC-CsnPa的水解率只有54.9％。OUC-T613在1h就相对达到100％的转化率，而OUC-CsnPa在2h时才达到90％的转化率，在4小时之后，水解率都几乎达到了100％。证明了突变株OUC-T613极大地提高了对壳聚糖的水解能力。

实施例5高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613序列分析

对高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613重组酶进行序列分析，发现OUC-T613相比野生型OUC-CsnPa的远离活性位点的C端部分发生了缺失和突变。但末端14个氨基酸发生了改变，影响了蛋白整个结构的变化。图5结构对齐显示在野生型末端氨基酸的形成的空间结构在氨基酸发生变化之后，结构也发生了变化，从一侧转到了另一侧。该酶通过远端14个氨基酸的突变，造成了结构的巨大变化，形成一种新型酶。

实施例6高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613结构对比

对比高活性壳聚糖酶突变体OUC-T613重组酶和野生型OUC-CsnPa的结构(图6)，发现远端残基对酶的功能活性有着巨大的影响。远端残基的变化诱导酶分子结构的变化，导致活性位点裂口的更加开放，从而改善催化活性。

实施例7利用重组壳聚糖酶制备酶制剂

利用实施例2制备的重组壳聚糖酶制备酶制剂：发酵破碎后的溶液纯化后，用缓冲液置换咪唑，冻干后保存酶粉。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 壳聚糖酶OUC-T613及其应用

<141> 2021-02-22

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 317

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Met Leu Ser Gly Leu Ser Gly Pro Ser Pro Ala Lys Ala Phe Ala

1 5 10 15

Glu Glu Asn Gly Thr Thr Val Gln Glu Thr Val Asp Leu Asn Glu Gly

20 25 30

Asp Asn Ser Asn Glu Ala Ser Thr Glu Ser Leu Ser Leu Thr Asn Glu

35 40 45

Glu Ala Thr Ser Gln Ala Ala Val Thr Ala Thr Asp His Asp Ala Asn

50 55 60

Phe Ser Pro Ser Thr Leu Gln Phe Leu Lys Ala Asn Thr Gly Leu Asp

65 70 75 80

Gly Glu Gln Trp Asp Asn Ile Met Lys Leu Val Asn Lys Pro Glu Gln

85 90 95

Asp Ser Leu Lys Trp Thr Glu Phe Tyr Gly Tyr Ala Glu Asp Ile Gly

100 105 110

Asp Asn Arg Gly Tyr Thr Ile Gly Ile Phe Gly Ala Thr Thr Gly Gly

115 120 125

Ser Asn Asp Thr Gly Pro Asp Gly Pro Asp Leu Phe Lys Ala Phe Asp

130 135 140

Ala Ala Ser Gly Ala Ser Ser Pro Ser Ile Ala Gly Gly Leu Thr Arg

145 150 155 160

Ala Gly Leu Lys Gly Lys Met Ser Gly Ser Ile Leu Lys Leu Ser Asp

165 170 175

Ser Asp Ser Val Ile Lys Lys Lys Ile Lys Ala Leu Gln Asn Asn Glu

180 185 190

Ala Trp Arg Glu Ala Met Trp Arg Thr Phe Tyr Asp Thr Tyr Ile Lys

195 200 205

Tyr Ser Val Gln Gln Ala Gln Lys Arg Gly Phe Asn Thr Ala Leu Thr

210 215 220

Ile Gly Ser Phe Val Asp Thr Ala Leu Asn Gln Gly Ala Thr Gly Asp

225 230 235 240

Ser Gly Ser Leu Glu Gly Ile Leu Ser Arg Ser Gly Ser Ser Thr Asn

245 250 255

Glu Lys Thr Phe Met Thr Asn Phe Tyr Ala Lys Arg Thr Leu Ile Val

260 265 270

Asp Thr Asn Asp Tyr Asn Gln Pro Pro Asn Gly Lys Asn Arg Val Lys

275 280 285

Gln Trp Ser Ser Leu Leu Ala Ser Gly Glu Thr Asp Leu Lys Asn Ala

290 295 300

Asp Ala Ala Val Ile Lys Val Thr Asn Trp Glu Met Lys

305 310 315

<210> 2

<211> 951

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgatgctga gtggcctgag tggtccgagt ccggccaaag catttgccga agaaaatggt 60

acaaccgttc aggaaaccgt tgatctgaat gaaggcgata atagcaatga agcaagcacc 120

gaaagcctga gtctgaccaa tgaagaagca accagtcagg ccgcagtgac cgccaccgat 180

catgatgcaa attttagccc gagcaccctg cagtttctga aagccaatac cggcctggat 240

ggtgaacagt gggataatat tatgaaactg gttaataagc cggaacagga tagcctgaaa 300

tggaccgaat tttatggtta tgccgaagat attggtgaca atcgcggtta taccattggc 360

atttttggcg ccaccaccgg cggtagtaat gataccggcc cggatggccc ggatctgttt 420

aaagcatttg atgccgcaag tggcgccagc agtccgagta ttgcaggtgg tctgacccgt 480

gccggtctga aaggtaaaat gagcggtagc attctgaaac tgagcgatag cgatagcgtg 540

attaagaaaa agattaaggc actgcagaat aatgaagcct ggcgtgaagc catgtggcgc 600

accttttatg atacctatat taagtatagc gtgcagcagg cccagaaacg tggctttaat 660

accgcactga ccattggtag ttttgttgat accgcactga atcagggcgc caccggtgac 720

agcggtagcc tggaaggtat tctgagtcgt agtggcagca gtaccaatga aaaaaccttt 780

atgaccaatt tctacgccaa acgtaccctg attgtggata ccaatgatta taatcagccg 840

ccgaatggca aaaatcgcgt taaacagtgg agtagtctgc tggccagcgg tgaaaccgat 900

ctcaaaaatg cagatgcagc cgtgattaag gttaccaatt gggaaatgaa a 951

<210> 3

<211> 326

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Ile Leu Leu Ser Phe Thr Val Ile Ala Ser Phe Ser Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Pro Ser Pro Ala Lys Ala Phe Ala Glu Glu Asn Gly Thr Thr Val

20 25 30

Gln Glu Thr Val Asp Leu Asn Glu Gly Asp Asn Ser Asn Glu Ala Ser

35 40 45

Thr Glu Ser Leu Ser Leu Thr Asn Glu Glu Ala Thr Ser Gln Ala Ala

50 55 60

Val Thr Ala Thr Asp His Asp Ala Asn Phe Ser Pro Ser Thr Leu Gln

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ala Asn Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gln Trp Asp Asn Ile

85 90 95

Met Lys Leu Val Asn Lys Pro Glu Gln Asp Ser Leu Lys Trp Thr Glu

100 105 110

Phe Tyr Gly Tyr Ala Glu Asp Ile Gly Asp Asn Arg Gly Tyr Thr Ile

115 120 125

Gly Ile Phe Gly Ala Thr Thr Gly Gly Ser Asn Asp Thr Gly Pro Asp

130 135 140

Gly Pro Asp Leu Phe Lys Ala Phe Asp Ala Ala Ser Gly Ala Ser Ser

145 150 155 160

Pro Ser Ile Ala Gly Gly Leu Thr Arg Ala Gly Leu Lys Gly Lys Met

165 170 175

Ser Gly Ser Ile Leu Lys Leu Ser Asp Ser Asp Ser Val Ile Lys Lys

180 185 190

Lys Ile Lys Ala Leu Gln Asn Asn Glu Ala Trp Arg Glu Ala Met Trp

195 200 205

Arg Thr Phe Tyr Asp Thr Tyr Ile Lys Tyr Ser Val Gln Gln Ala Gln

210 215 220

Lys Arg Gly Phe Asn Thr Ala Leu Thr Ile Gly Ser Phe Val Asp Thr

225 230 235 240

Ala Leu Asn Gln Gly Ala Thr Gly Asp Ser Gly Ser Leu Glu Gly Ile

245 250 255

Leu Ser Arg Ser Gly Ser Ser Thr Asn Glu Lys Thr Phe Met Thr Asn

260 265 270

Phe Tyr Ala Lys Arg Thr Leu Ile Val Asp Thr Asn Asp Tyr Asn Gln

275 280 285

Pro Pro Asn Gly Lys Asn Arg Val Lys Gln Trp Ser Ser Leu Leu Ala

290 295 300

Ser Gly Glu Thr Asp Leu Lys Asn Ala Asp Ala Ala Val Ile Lys Val

305 310 315 320

Thr Asn Trp Glu Met Lys

325

<210> 4

<211> 978

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

atgatcctgc tgagctttac cgttattgca agttttagta gcctgagtgg tccgagtccg 60

gccaaagcat ttgccgaaga aaatggtaca accgttcagg aaaccgttga tctgaatgaa 120

ggcgataata gcaatgaagc aagcaccgaa agcctgagtc tgaccaatga agaagcaacc 180

agtcaggccg cagtgaccgc caccgatcat gatgcaaatt ttagcccgag caccctgcag 240

tttctgaaag ccaataccgg cctggatggt gaacagtggg ataatattat gaaactggtt 300

aataagccgg aacaggatag cctgaaatgg accgaatttt atggttatgc cgaagatatt 360

ggtgacaatc gcggttatac cattggcatt tttggcgcca ccaccggcgg tagtaatgat 420

accggcccgg atggcccgga tctgtttaaa gcatttgatg ccgcaagtgg cgccagcagt 480

ccgagtattg caggtggtct gacccgtgcc ggtctgaaag gtaaaatgag cggtagcatt 540

ctgaaactga gcgatagcga tagcgtgatt aagaaaaaga ttaaggcact gcagaataat 600

gaagcctggc gtgaagccat gtggcgcacc ttttatgata cctatattaa gtatagcgtg 660

cagcaggccc agaaacgtgg ctttaatacc gcactgacca ttggtagttt tgttgatacc 720

gcactgaatc agggcgccac cggtgacagc ggtagcctgg aaggtattct gagtcgtagt 780

ggcagcagta ccaatgaaaa aacctttatg accaatttct acgccaaacg taccctgatt 840

gtggatacca atgattataa tcagccgccg aatggcaaaa atcgcgttaa acagtggagt 900

agtctgctgg ccagcggtga aaccgatctg aaaaatgcag atgcagccgt gattaaggtt 960

accaattggg aaatgaaa 978

<210> 5

<211> 299

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 5

Met Ser Asn Ala Arg Pro Ser Lys Ser Gln Thr Lys Phe Leu Leu Ala

1 5 10 15

Phe Leu Cys Phe Thr Leu Val Ala Ser Leu Phe Gly Ala Thr Ala Leu

20 25 30

Phe Gln Pro Ser Lys Ala Ala Ala Ala Ser Pro Asp Asp Asn Phe Ser

35 40 45

Pro Glu Thr Leu Gln Phe Leu Arg Asn Asn Thr Gly Leu Asp Gly Glu

50 55 60

Gln Trp Asn Asn Ile Met Lys Leu Ile Asn Lys Pro Glu Gln Asp Asp

65 70 75 80

Leu Asn Trp Ile Glu Tyr Tyr Gly Tyr Cys Glu Asp Ile Thr Asp Glu

85 90 95

Arg Gly Tyr Thr Ile Gly Leu Phe Gly Ala Thr Thr Gly Gly Ser Arg

100 105 110

Asp Thr His Pro Asp Gly Pro Glu Leu Phe Lys Ala Tyr Asp Ala Ala

115 120 125

Lys Gly Ala Ser Asn Pro Ser Ala Asp Gly Ala Leu Lys Arg Leu Gly

130 135 140

Ile Asn Gly Lys Met Asn Gly Ser Ile Leu Glu Ile Lys Asp Ser Glu

145 150 155 160

Lys Val Phe Cys Gly Lys Ile Lys Lys Leu Gln Asn Asp Ala Ala Trp

165 170 175

Arg Lys Ala Met Trp Glu Thr Phe Tyr Asn Val Tyr Ile Arg Tyr Ser

180 185 190

Val Glu Gln Ala Arg Gln Arg Gly Phe Ala Ser Ala Val Thr Ile Gly

195 200 205

Ser Phe Val Asp Thr Ala Leu Asn Gln Gly Ala Thr Gly Gly Ser Asn

210 215 220

Thr Leu Gln Gly Leu Leu Ala Arg Ser Gly Ser Ser Ser Asn Glu Lys

225 230 235 240

Thr Phe Met Lys Asn Phe His Ala Lys Arg Thr Leu Val Val Asp Thr

245 250 255

Asn Lys Tyr Asn Lys Pro Pro Asn Gly Lys Asn Arg Val Lys Gln Trp

260 265 270

Asp Thr Leu Val Asp Met Gly Lys Met Asn Leu Lys Asn Val Asp Ser

275 280 285

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290 295

<210> 6

<211> 897

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

atgagcaatg cccgcccgag caaaagccag accaaatttc tgctggcctt tctgtgtttt 60

accctggtgg ccagcctgtt tggcgcaacc gccctgtttc agccgagtaa agcagcagca 120

gcaagcccgg atgataattt tagtccggaa accctgcagt ttctgcgtaa taataccggt 180

ctggatggcg aacagtggaa taatattatg aaactgatca acaagccgga acaggatgat 240

ctgaattgga ttgaatatta tggctattgc gaagatatca ccgatgaacg tggctatacc 300

attggtctgt ttggtgcaac caccggcggc agccgtgata cccatccgga tggtccggaa 360

ctgtttaaag catacgatgc agccaaaggt gccagcaatc cgagcgccga tggtgccctg 420

aaacgcctgg gtattaatgg taaaatgaat ggcagcattc tggaaattaa ggatagcgaa 480

aaagttttct gtggcaaaat taagaagctg cagaatgatg cagcctggcg taaagcaatg 540

tgggaaacct tttataatgt ttatatccgc tacagcgttg aacaggcacg ccagcgcggt 600

tttgcaagcg ccgtgaccat tggtagtttt gttgataccg ccctgaatca gggcgccacc 660

ggtggcagta ataccctgca gggtctgctg gcccgcagcg gtagcagtag taatgaaaaa 720

acctttatga agaacttcca cgccaaacgt accctggtgg ttgataccaa taagtataat 780

aagccgccga atggtaaaaa tcgcgttaaa cagtgggata ccctggttga tatgggtaaa 840

atgaacctga aaaatgttga tagtgagatt gcaaaagtga ccgattggga aatgaaa 897

<210> 7

<211> 306

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 7

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1 5 10 15

Gly Ser Ala Ala Gly Ser Ser Ala Arg His Ala Ala Arg Ala Glu Ala

20 25 30

Cys Ser Ala Gly Pro His Cys Thr Val Ala Ala Ala Arg Thr Ala Ala

35 40 45

Asn Pro Asp Asp Asn Phe Ser Pro Ala Thr Leu Lys Phe Leu Lys Ala

50 55 60

Asn Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gln Trp Asn Asn Ile Met Lys Leu Ile

65 70 75 80

Asn Lys Pro Glu Gln Asp Ser Leu Asp Trp Thr Lys Phe Tyr Gly Tyr

85 90 95

Cys Glu Asp Ile Gly Asp Lys Arg Gly Tyr Thr Ile Gly Ile Phe Gly

100 105 110

Ala Thr Thr Gly Gly Pro Asn Asp Glu Gly Pro Asp Gly Pro Thr Leu

115 120 125

Phe Lys Glu Phe Asp Ala Ala Ser Gly Ala Ala Asn Pro Ser Ile Glu

130 135 140

Gly Gly Leu Ser Arg Ile Gly Ala His Gly Lys Met Gln Gly Ser Ile

145 150 155 160

Leu Lys Ile Ser Asp Ser Ser Lys Val Phe Cys Gly Lys Ile Gly Gly

165 170 175

Leu Gln Ala Asn Ala Ala Trp Arg Gln Ala Met Trp Asn Thr Phe Tyr

180 185 190

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Asn Ser Ala Leu Thr Ile Gly Ser Phe Val Asp Thr Ala Leu Asn Gln

210 215 220

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Gly Asn Ser Ala Asp Glu Lys Thr Phe Met Thr Thr Phe Tyr Ala Gln

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Arg Ser Lys Ile Val Asp Thr Asn Asp Tyr Asn Gln Pro Pro Asn Gly

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Met Lys

305

<210> 8

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<212> DNA

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gttgatacca atgattataa ccagccgccg aatggcaaaa atcgtgtgaa acagtggagc 840

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accgattggg aaatgaaa 918

Claims

1.壳聚糖酶OUC-T613，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述的壳聚糖酶OUC-T613的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的壳聚糖酶OUC-T613在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用；在制备降解壳聚糖/制备壳寡糖的酶制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：在降解壳聚糖时，生成部分乙酰基壳寡糖。

5.一种酶制剂，其特征在于：包含有权利要求1所述的壳聚糖酶OUC-T613。

6.权利要求5所述的酶制剂在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用。

7.一种降解壳聚糖/制备壳寡糖的方法，其特征在于：采用权利要求1所述的壳聚糖酶OUC-T613降解壳聚糖。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在降解壳聚糖时，生成部分乙酰基壳寡糖。

9.一种重组工程菌，其特征在于：其基因组中插入有权利要求2所述的编码壳聚糖酶OUC-T613的基因，其能表达权利要求1所述的壳聚糖酶OUC-T613。

10.权利要求9所述的重组工程菌在制备壳聚糖酶OUC-T613中的应用。