CN112930185A - 护发活性剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含紫杉叶素葡糖苷和N‑乙酰基酪氨酸的护发活性剂以及包含所述护发活性剂的护发组合物。所述护发剂能够减少个体中灰发和白发的出现。

Description

护发活性剂
本发明涉及包含紫杉叶素(taxifolin)葡糖苷和N-乙酰基酪氨酸的护发活性剂、包含它们的护发组合物及其用途和应用。
毛发干中色素沉着的消失，导致毛发变灰白或灰发症，这是最明显的衰老迹象之一。随着年龄的增长，它也是主要的美容问题之一。实际上，在45岁至65岁之间，全世界约74％的人口受到灰发的影响。色素沉着的缺失典型地在35至45岁之间逐渐出现。尽管影响了男性和女性，但男性显然显示出更多的灰发。毛发变灰白随地理和种族的起源而不同，在亚洲和非洲人群中而不是在白种人中发生率更低。
人的毛发由三层构成：表皮(外壳)，皮质(含有黑素颗粒的内部部分；负责发色)和髓质(仅存在于成熟的白发中的软芯)。人发的颜色取决于其结构以及其所含黑素的类型和百分比。
毛发中黑素的产生由位于毛球基质中的黑素细胞控制。黑素细胞的活性由正常的毛发周期调节：在毛发生长初期(生长)阶段，由活性黑素细胞产生的黑素被转移到皮质角质形成细胞中，导致整个毛干的色素沉着。在毛发生长中期阶段，黑素细胞进入凋亡状态，而在毛发生长终期阶段消失。为了在新的毛发生长初期阶段产生着色的毛发，新的黑素细胞池从毛囊干细胞库(特别是包含外根鞘细胞(ORSc))迁移并分化为毛球，从而自然地为新的毛发着色。
毛发变灰白的原因由与年龄相关的从ORSc刺激和迁移干细胞中的功能改变、还有环境因素来解释。实际上，衰老时黑素细胞中活性氧(ROS)的积累会导致突变的积累，抗氧化保护的降低，炎症，脱发和灰白。头皮中产生的ROS减少了黑素母细胞向黑素细胞的分化，导致毛球(bulb)区域中缺乏成熟的黑素细胞。ROS还会减少毛球水平上的黑素生成，从而导致转移到皮质角质形成细胞的黑素色素减少。
当开始发生色素沉着减少时，可以识别出三种类型的毛发：有色发(黑素含量高)，灰发(黑素细胞数量低且黑素含量低)和白发(黑素细胞完全缺乏)。
在老龄化社会中，缓解衰老迹象的抗衰老产品越来越受欢迎。因此，许多人选择给他们的灰发或白发上色。然而，化学染发剂通常具有攻击性，并会损坏毛发。此外，使用者经常抱怨缺乏耐受性(发痒，烧灼，刺感)和可持续性(需要定期重新着色)。
为了避免这些缺点，期望找到一种积极影响毛发的天然色素沉着过程的方法。
为此，US2012/0114583描述了一种毛发处理剂，其包含(a)二氢槲皮素和/或二氢槲皮素衍生物；和(b)至少一种氨基酸。一个优选的实施方案包括牛磺酸，脯氨酸，缬氨酸，精氨酸，赖氨酸和甘氨酸的六种氨基酸混合物。
二氢槲皮素(DHQ)或紫杉叶素是在某些针叶树中发现的类黄酮。其为抗氧化剂和干细胞增殖和维持的刺激物。紫杉叶素先前已用于化妆品中，用于各种目的，包括美白皮肤(例如US2011/0038968)和刺激色素沉着。
此外，已知紫杉叶素抑制黑素生成(Sang Mi An等人，Phytother.Res.22，1200-1207(2008))。
本发明的一个目的在于提供高效护发活性剂，其用于减少个体的灰发和白发的出现并且用于恢复自然发色。
该目的通过本发明的护发活性剂和包含它们的护发组合物实现。
在第一个方面，本发明提供了包含紫杉叶素葡糖苷和N-乙酰基酪氨酸的护发活性剂。
在第二个方面，本发明提供了包含本发明的护发活性剂和适合的载体的护发组合物。
在第三个方面，本发明涉及本发明的护发活性剂在刺激毛囊干细胞的增殖、刺激活性黑素细胞产生、刺激黑素生成、刺激毛发色素沉着的恢复、再激活灰发中的黑素产生、激活毛囊中的抗氧化剂防御、保护黑素细胞免受氧化性应激、毛发再次色素沉着和/或降低白发或灰发的比例和/或密度中的非治疗用途。
在第四个方面，本发明提供了刺激毛囊干细胞的增殖、刺激活性黑素细胞产生、刺激黑素生成、刺激毛发色素沉着的恢复、再激活灰发中的黑素产生、激活毛囊中的抗氧化剂防御、保护黑素细胞免受氧化性应激、毛发再次色素沉着和/或降低白发或灰发的比例和/或密度的方法，所述方法包括对人体毛发局部施用本发明的护发活性剂的步骤。
紫杉叶素葡糖苷和N-乙酰基酪氨酸的组合通过刺激黑素合成且由此增强毛发的天然着色提供了最佳的抗衰老活性。发现在四个月内，本发明的护发活性剂显著地降低了白发和灰发的比例和密度(至多减少50％的灰发)。
作用方式完全不受性别、毛发类型或头色影响，使得它成为普遍针对毛发灰发的理想解决方案。
在几个体外和体内研究中研究了本发明的护发活性剂和护发组合物的作用(见以下实施例)。
发现本发明的护发活性剂刺激干细胞增殖、刺激毛囊中黑素生成、激活毛囊中的抗氧化剂防御、保护黑素细胞免受氧化性应激、再激活灰发中的黑素产生、降低灰发/白发的比例密度并且使毛发再上色。因此，它特别有用地用作抗毛发衰老剂和抗灰发和抗白发剂。
尽管紫杉叶素和/或紫杉叶素衍生物与至少一种氨基酸的组合如上所述具有黑素生成刺激作用(US2012/0114583)，但是发现，本发明的护发活性剂甚至更有效。
令人惊奇地发现，本发明的护发活性剂能够显著地刺激黑素细胞中的黑素合成，而单独的紫杉叶素葡糖苷无法产生任何影响，且紫杉叶素葡糖苷和L-酪氨酸的混合物仅导致轻度和不显著的增加(参见下文的实施例7)。
此外，本发明的护发活性剂还显示出改善的溶解性。
在一个优选的实施方案中，紫杉叶素葡糖苷的至少部分为紫杉叶素α-D-葡糖苷。例如，制备紫杉叶素α-D-葡糖苷的适合的方法描述在WO2007/144368中。
在本发明的护发活性剂中，紫杉叶素葡糖苷和N-乙酰基酪氨酸可以单独使用或与其它适用于化妆品的活性成分、助剂和/或溶剂联用。
在一个优选的实施方案中，本发明的护发活性剂还包含紫杉叶素。令人惊奇地发现，在紫杉叶素葡糖苷存在下紫杉叶素的溶解性得到改善：紫杉叶素在水中的溶解度典型地为约1g/L，但在适量的紫杉叶素葡糖苷存在下可以增加至20g/L或更高。紫杉叶素葡糖苷在水溶液中的浓度越高，则紫杉叶素在水中的溶解度越高，典型地具有约1:1的摩尔比。这使得能够制备更浓的且由此更具有活性的制剂。此外，由于存在紫杉叶素，则护发活性剂的起始活性可以增加。
例如，在完全转化前，例如在已经转化约一半紫杉叶素后，可以通过停止根据WO2007/144368的反应制备紫杉叶素和紫杉叶素葡糖苷的混合物，得到约1:1的混合物。
紫杉叶素葡糖苷和紫杉叶素可以以100:0至约40:60的重量比存在。优选地，紫杉叶素葡糖苷与紫杉叶素的重量比为90:10至40:60，更优选70:30至50:50，且最优选约60:40。
在一个优选的实施方案中，本发明的护发活性剂还包含甘氨酸和/或表棓儿茶素棓酸酯(Epigallocatechin gallate)和/或表棓儿茶素棓基葡糖苷(epigallocatechingallatyl glucoside)。
甘氨酸为最简单可能的氨基酸。甘氨酸典型地作为缓冲剂用于化妆品。此外，甘氨酸为胶原蛋白前体。
表棓儿茶素棓酸酯(EGCG，也称作表棓儿茶素-3-棓酸酯)为表棓儿茶素和棓酸的酯，并且为一种类型的儿茶素。已知表棓儿茶素棓酸酯刺激毛发生长。例如，制备表棓儿茶素棓基α-D-葡糖苷的适合的方法描述在WO2007/144368中。
本发明的护发活性剂还可以包含另外的有益活性剂，例如，氯化锌。锌为有利于毛发生长的酶辅因子。
在本发明的护发活性剂中，紫杉叶素葡糖苷和N-乙酰基酪氨酸可以以任何适合的浓度范围和比例使用。特别地，期望适当改变浓度范围，以确保足够的活性和溶解性。
紫杉叶素葡糖苷在本发明的护发活性剂中的浓度可以为，例如0.01-0.50wt％，更优选0.05-0.25wt％，且最优选0.7-0.15wt％，例如约0.10wt％。
N-乙酰基酪氨酸在本发明的护发活性剂中的浓度可以为，例如1.0-30wt％，更优选10-20wt％，且最优选13.5-16.5wt％，例如约15.0wt％。
在本发明的护发活性剂中，紫杉叶素葡糖苷与N-乙酰基酪氨酸的重量比优选为1:5’100至1:3.4，更优选1:340至1:70，且最优选1:200至1:100，例如约1:150。
此外，所有另外的活性成分、助剂和/或溶剂可以以任何适当的浓度范围和比例用于本发明的护发活性剂中。特别地。期望适当改变浓度范围以确保足够的活性、溶解性、稳定性和易于配制。
例如，甘氨酸可以以0.01-0.50wt％的浓度使用，更优选0.10-0.30wt％，且最优选0.12-0.18wt％，例如约0.15wt％。
例如，表棓儿茶素棓基葡糖苷可以以0.001-0.60wt％的浓度使用，更优选0.010-0.060wt％，且最优选0.015-0.045wt％，例如约0.03wt％。
例如，偏亚硫酸氢钠可以以0.01-1.00wt％的浓度使用，更优选0.10-0.750wt％，且最优选0.45-0.55wt％，例如约0.50wt％。偏亚硫酸氢钠防止多酚的氧化。
在一个优选的实施方案中，本发明的护发活性剂包含13.5-16.5wt％的N-乙酰基酪氨酸、0.12-0.18wt％的甘氨酸、0.05-0.09wt％的氯化锌、0.08-0.12wt％的紫杉叶素葡糖苷、0.5-0.08wt％的紫杉叶素、0.015-0.045wt％的表棓儿茶素棓基葡糖苷、0.45-0.55wt％的偏亚硫酸氢钠和47.5-52.5wt％的甘油。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的护发活性剂包含约15.0wt％的N-乙酰基酪氨酸、约0.15wt％的甘氨酸、约0.07wt％的氯化锌、约0.10wt％的紫杉叶素葡糖苷、约0.07wt％的紫杉叶素、约0.03wt％的表棓儿茶素棓基葡糖苷、约0.50wt％的偏亚硫酸氢钠和约50.0wt％的甘油。
在上述本发明的护发活性剂中，部分紫杉叶素葡糖苷可以被紫杉叶素替代。特别地，至多60％的紫杉叶素葡糖苷可以被紫杉叶素替代，优选至多50％且甚至更优选至多40％。
在一个优选的实施方案中，本发明的护发活性剂包含13.5-16.5wt％的N-乙酰基酪氨酸、0.12-0.18wt％的甘氨酸、0.05-0.09wt％的氯化锌、0.14-0.20wt％的60:40紫杉叶素葡糖苷和紫杉叶素的混合物、0.015-0.045wt％的表棓儿茶素棓基葡糖苷、0.45-0.55wt％的偏亚硫酸氢钠和47.5-52.5wt％的甘油。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的护发活性剂包含约15.0wt％的N-乙酰基酪氨酸、约0.15wt％的甘氨酸、约0.07wt％的氯化锌、约0.17wt％的60:40的紫杉叶素葡糖苷和紫杉叶素的混合物、约0.03wt％的表棓儿茶素棓基葡糖苷、约0.50wt％的偏亚硫酸氢钠和约50.0wt％的甘油。
或者，可以将紫杉叶素与所示量的紫杉叶素葡糖苷添加到上述本发明的护发活性剂中。在这种情况下，紫杉叶素的添加量可以至多为0.24wt％，更优选0.07-0.20wt％，且最优选0.10-0.15wt％。优选地，紫杉叶素与紫杉叶素葡糖苷的重量比为1.5:1或更低。
在另一个方面，本发明还提供了护发组合物，其包含上述护发活性剂和适合的载体。
如本文所用，“毛发”是指人体毛发，包括头皮发、面毛和体毛，特别是人头部和头皮上的毛发，包括眼眉、胡须和髭。
术语“护发组合物”包括驻留型产品和冲洗型产品，例如香波(shampoos)、喷雾剂、洗剂(lotions)等。
例如，存在清洁组合物、毛发调理组合物和毛发定型组合物，例如香波，调理剂，喷雾剂，护理剂，面膜，增强剂，前香波，洗剂，浆液，乳霜，泡沫，摩丝和凝胶。具体实例包括但不限于抗灰发洗剂，抗白发香波，自然重新上色毛发面膜，用于胡须和髭的抗灰发剂，毛色恢复喷雾剂和过早的灰/白毛发处理凝胶。这些已知的许多组合物是基于水的制剂。
毛发清洁组合物通常有效地从毛发上去除污垢。污垢包括来自头皮的自然分泌物、环境因子和定型产品。污垢会覆盖或沉积在毛发和头皮上。被覆这种污垢的毛发典型地在感觉和外观上油腻，触摸发重，可能是恶臭的，并且通常不能保持期望的样式。已知的清洁组合物典型地包括水和表面活性成分(例如肥皂或合成表面活性剂)的组合，并且还可以包含淀粉的非水共混物。水和表面活性剂的组合可乳化毛发和头皮上的污垢，使其被冲洗掉。
清洁组合物还可以包含在用水冲洗期间沉积在头发和头皮上的调理剂。这样的调理剂可以包括聚合物，油，蜡，蛋白水解产物，硅氧烷及其混合物和衍生物。另外，调理组合物可以为与清洁组合物分开且不同的产品。
本领域已知的调理组合物典型地为基于水的制剂。然而，还已知调理组合物，其包括如下的至少一种：硅氧烷；动物油、矿物油或植物油；蜡；凡士林油和油脂。基于水的调理组合物典型地包括取代的阳离子蜡，脂肪醇，阳离子聚合物，水解蛋白及其衍生物和香料。这样的调理制剂赋予被处理的毛发以梳理性和易处理性，从而使定型过程中的断裂最小化，并产生光泽、健康和易于处理的毛发。调理组合物也可以有效地润湿毛发。随后的干燥和定型过程可包括风干或加热。
适合的载体必须为化妆品可接受的。
如本文所用，“化妆品可接受的”是指载体适合与人角质组织接触而没有过度的毒性，不相容性，不稳定性，过敏反应等。目的在于直接施用于角质组织的本文所述的所有组合物限于化妆品上可接受的那些。
护发组合物典型地包含约20wt％至约99wt％水平的载体。载体可以包含水，有机溶剂(与水可混溶或不可混溶)硅氧烷溶剂，和/或其混合物。溶剂应是皮肤病学可接受的。载体通常不包含超过约2wt％的非挥发性溶剂，因为明显更高的浓度会增加毛发的压低和油腻感。沸点低于或等于250℃的水、有机和硅氧烷溶剂被视为挥发性溶剂。适合的载体典型地包括水和低级烷基醇的水溶液，例如具有1-6个碳的一元醇(例如乙醇和/或异丙醇)，以及多元醇，例如二醇、甘油和其他二醇。
本发明的护发组合物可以进一步包含一种或多种选自以下的材料：溶剂，表面活性剂，增稠剂，定型聚合物，去头皮屑活性物质，抗微生物材料，皮肤和头皮活性物质，维生素，盐，缓冲剂，毛发生长剂，调理材料，毛发定型聚合物，香料，色素/着色剂，染料，颜料，遮光剂，珠光助剂，油，蜡，防腐剂，增感剂，防晒剂，药剂，消泡剂，抗氧化剂，粘合剂，生物添加剂，缓冲剂，填充剂，螯合剂，化学添加剂，成膜剂或材料，pH调节剂，推进剂，氧化剂和还原剂。
所有添加剂应与护发组合物的基本成分在物理和化学上相容，并且否则不应过度损害稳定性、美观性或性能。最重要地，它们在化妆品上也应是可接受的。
作为增稠剂，护发组合物可包含流变调节剂以改善感觉、使用性能和悬浮稳定性。例如，可以调节流变性质，使得护发组合物在其储存和运输期间保持均匀，并且在其使用过程中不会不期望地滴落到身体、衣物或家居装饰的其他区域上。可以使用任何适合的流变调节剂。典型地，包括约0.01至约3wt％的增稠剂。适合的增稠剂的实例在WO2015/035164和US2001/0043912中公开。
本发明的护发组合物还可以根据需要还包含任何适合的任选成分。此类任选成分应与护发组合物的成分在物理和化学上相容，并且否则不应过分损害稳定性、美观性或性能。CTFA Cosmetic Ingredient Handbook第十版(由Cosmetic，Toiletry，and FragranceAssociation，Inc.，Washington D.C.出版)(2004年)描述了可以添加到本发明护发组合物中的多种非限制性材料。
例如，本发明的护发组合物可包含定型聚合物。定型聚合物可以选自丙烯酸酯聚合物及其酯，甲基丙烯酸酯聚合物及其酯，丙烯酸酯共聚物及其酯，甲基丙烯酸酯共聚物及其酯，聚氨酯聚合物及其共聚物，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，PVT-聚醋酸乙烯酯共聚物，PVP-聚乙烯醇共聚物，聚酯和其他聚合物。
本发明的护发组合物还可包含感觉剂。如本文所用，术语“感觉剂”是指当施用于皮肤上时引起状态变化例如但不限于热、清凉、清爽等的可感觉到的感觉的物质。优选以占消费品约0.001至约10重量％的水平使用感觉剂。适合的感觉剂的实例包括樟脑、薄荷醇、L-异胡薄荷醇、乙基薄荷烷甲酰胺和三甲基异丙基丁酰胺。
本发明的护发组合物还可包含任选的成分，其改变物理和性能特征。这样的成分包括表面活性剂，盐，缓冲剂，增稠剂，溶剂，遮光剂，珠光助剂，防腐剂，香料，着色剂，染料，颜料，螯合剂，防晒剂，维生素和药剂。在本文有用的成分中的任选成分在US4,387,090中公开。
本发明的护发组合物还可任选地包含用于提供抗微生物活性的去头皮屑剂。去头皮屑剂可以是颗粒状的或可溶的。优选的去头皮屑剂包括但不限于颗粒状结晶去头皮屑剂，例如硫，硫化硒和吡啶硫酮的重金属盐。特别优选的是巯氧吡啶锌。可溶性去头皮屑剂、例如酮康唑也是本领域已知的。去头皮屑剂优选以约0.1-4wt％的浓度存在。
本发明的护发组合物还可任选地包含毛发生长剂，例如巯氧吡啶锌。本发明的组合物和消费品还可任选地包含用于调节毛发生长和脱发的化合物。本领域已知的此类化合物包括白羽扇扁豆三萜及其衍生物、齐墩果烷三萜和乌斯烷三萜的衍生物，以及它们的盐和混合物，米诺地尔(6-(1-哌啶基)-2,4-嘧啶二胺3-氧化物)或非那雄胺。
本发明的护发组合物还可以任选地包含盐和/或缓冲剂以改变流变性。例如，盐例如氯化钾和氯化钠可以以约0.001至约1wt％的水平添加。还可以使用缓冲剂，例如柠檬酸盐或磷酸盐缓冲剂。优选地，将本消费品的pH改变为约3至约10、优选约3至约7的pH。
本发明的护发组合物还可以任选地包含另外的调理聚合物，特别是阳离子调理聚合物。如果存在，则以约0.5至约10wt％的水平使用它们。适合的阳离子调理聚合物公开在US2001/0043912中。
可以将多种其他附加成分配制到本发明的护发组合物中。这些包括：其他调理剂，例如水解胶原蛋白，维生素E，泛醇，泛烯基乙醚，水解角蛋白，蛋白质，植物提取物和营养物；毛发固定聚合物，例如两性、非离子、阳离子和阴离子固定聚合物，以及硅氧烷接枝的共聚物；防腐剂，例如苄醇，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯和咪唑烷基戊基脲；pH调节剂，例如谷氨酸，柠檬酸，柠檬酸钠，琥珀酸，磷酸，乳酸，氢氧化钠和碳酸钠；通常的盐，例如乙酸钾和氯化钠；着色剂；毛发氧化(漂白)剂，例如过氧化氢，过硼酸盐和过硫酸盐；毛发还原剂，例如硫乙醇酸盐；香精；和螯合剂，例如乙二胺四乙酸二钠；紫外线和红外线和屏蔽吸收剂，例如水杨酸辛酯；及其混合物。
其他任选成分包括但不限于：皮肤和头皮活性物质，油，蜡，消泡剂，抗氧化剂，粘合剂，生物添加剂，填充剂，螯合剂，化学添加剂，成膜剂或材料以及推进剂。
在另一个方面，本发明涉及本发明的护发活性剂在刺激毛囊干细胞的增殖、刺激活性黑素细胞产生、刺激黑素生成、刺激毛发色素沉着的恢复、再激活灰发中的黑素产生、激活毛囊中的抗氧化剂防御、保护黑素细胞免受氧化性应激、毛发再次色素沉着和/或降低白发或灰发的比例和/或密度中的非治疗用途。
在另一个方面，本发明涉及刺激毛囊干细胞的增殖、刺激活性黑素细胞产生、刺激黑素生成、刺激毛发色素沉着的恢复、再激活灰发中的黑素产生、激活毛囊中的抗氧化剂防御、保护黑素细胞免受氧化性应激、毛发再次色素沉着和/或降低白发或灰发的比例和/或密度的方法，所述方法包括局部施用本发明的护发活性剂的步骤。
本发明的护发活性剂可以施用于湿润或干燥毛发，视制剂的不同而定。
优选地，本发明的护发活性剂以上述本发明的护发组合物的形式施用。
已经通过广泛的体外、离体和临床研究证实了本发明的护发活性剂的上述有益效果，其中的一些描述在如下实施例中。
本专利申请包含如下附图：
图1:正常人黑素细胞(NHM)与正常人表皮角质形成细胞(NHEK)在不存在和存在来自实施例1的测试溶液在1:1NHM/NHK培养基中以0.01％温育72h后共培养产生的黑素含量。斯氏t-检验＊＊p-值<0.01和＊p-值<0.05。
图2:通过对来自实施例1的1％标准溶液处理的灰色显微分割的毛囊的FontanaMasson染色对黑素的含量进行评价。
图3:通过对来自实施例1的1％标准溶液处理的灰色显微分割的毛囊的FontanaMasson染色对黑素的含量进行评价。斯氏t-检验＊p-值<0.05。
图4:在完全离体头皮中诱导氧化性应激后的基因表达分析。使用Fisher's LSD检验的ANOVA＊＊＊p-值<0.01，＊p-值<0.05和#p-值<0.1。
图5:来自实施例1的标准溶液预处理1小时、然后用50μM的氢过氧化枯烯处理1h后ROS的产生的评价。使用置换检验的一种方式ANOVA，F(2,33)31.33；＊p-值<0.05和＊＊p-值<0.01，然后进行使用排列的t-检验。
图6:来自实施例1的1％标准溶液预处理或不进行预处理以50μM氢过氧化枯烯诱导后显微分割的毛囊中的ROS产生分析的有代表性的照片。
图7:氧化性应激后、接着用来自实施例1的1％标准溶液处理的NKI/beteb阳性细胞百分比。使用置换检验的一种方式ANOVA，F(2,33)7.91；＊＊p-值<0.01，然后进行使用排列的t-检验。
图8:代表用DAPI对比染色(蓝色)的HF黑素细胞和黑素母细胞的NKI/beteb(红色)免疫染色的代表性照片。呈现的不同条件为在50μM的氢过氧化枯烯诱导下、用或不用来自施例1的1％标准溶液处理后对毛囊进行显微分割。
图9:A.白发比例的评分(以％计的T4M)
B.在减少白发比例的情况下，含有1％本发明活性成分的洗发剂(hair lotion)的代表性图像
图10:A.白发密度的评分(T4M)
B.白发密度减少的有代表性的照片
图11:％未处理条件中的黑素含量
因此，通过以下非限制性实施例进一步示例本发明：
实施例1:本发明的护发活性剂
标准溶液
下列标准溶液可以用于制备本发明的护发活性剂:
Figure BDA0003041530580000121
本发明的护发活性剂可以由所述标准溶液组成，或可以包含所述标准溶液与其它成分的组合。
因此，所述标准溶液可以照此使用。
或者，还可以用溶剂、缓冲剂或培养基稀释所述标准溶液。
测试溶液
对于以下某些实施例(参见实施例中的指示)，通过在William’s E介质中将上述标准溶液稀释至0.01-1％v/v的终浓度来制备测试溶液。
INCI
包含本发明的护发活性剂的护发组合物可以由下列INCI(InternationalNomenclature of Cosmetic Ingredients)的指示描述:
水，甘油/乙酰基酪氨酸/偏亚硫酸氢钠/LARIX EUROPAE木材提取物/甘油/氯化锌/表棓儿茶素棓基葡糖苷，苯甲酸钠，柠檬酸，柠檬酸钠，PPG-26BUTETH-26，PEG-40氢化蓖麻油，AQUA/水，香精，丁基苯基，甲基丙醛，D-苧烯，α-异甲基紫罗兰酮。
实施例2:黑素产生的评价：体外共培养模型
培养和实验设计
本研究中使用的细胞是正常人角质形成细胞(NHK)和8岁白种男性供体(表型III/IV)的皮肤手术(包皮)后提取的正常人黑素细胞(NHM)的原代培养物。
将孔分别以200’000NHK/9.6cm2和50’000NHM/9.6cm2铺板，并在补充培养基(1:1NHM补充培养基/NHK补充培养基)中生长24小时。培养24小时后，将细胞处理(条件：未处理；在NHM补充培养基和NHK补充培养基(不含补充剂)；和1μM雷帕霉素)的1:1混合物中0.01％来自实施例1的测试溶液)3次24小时。
黑素的比色测定
细胞沉淀中黑素的含量与蛋白质测定平行进行。
将细胞沉淀物在60℃下溶于NaOH 30分钟。使用合成的黑素作为对照，通过在405nm讲授(lecture)确定上清液中黑素的浓度以及黑素合成物的标准范围内的浓度。
蛋白质测定(BCA)
细胞沉淀中的总蛋白测定通过基于二辛可宁酸的比色法平行进行。使用BSA(牛血清白蛋白)制备标准范围。
将细胞沉淀在60℃溶于NaOH中30分钟。剂量通过将试剂(二辛可宁酸+CuSO4)的混合物添加到裂解液(裂解的细胞沉淀)的等分试样中来实现。将板在37℃下温育30分钟，然后在570nm下进行讲授(lecture)。
结果的表达
对于黑素和蛋白质剂量，将原始数据，即针对各个标准品获得的OD测量值绘制在图上，以获得标准校准曲线。然后，测定样品中测得的蛋白质或黑素的含量/浓度。
将每种条件的定量值取平均值。数据以数量/浓度(μg/mL)的形式用图形表示。每种条件下获得的结果也相对于未处理的设置为100％对照表示：
％《样品》＝(平均值OD《样品》/平均值OD《对照》)x100
为了获得报告为总蛋白质量(μg/mL/mg蛋白质)的黑素浓度，将每个浓度值(μg/mL)分别除以每个蛋白质数据(mg)。然后将每个条件的值取平均值。
结果的统计显著性由斯氏t-检验决定。
结果
处理72小时后，在共培养模型中发现阳性参比物(1μM雷帕霉素)显著刺激了黑素的产生(+282％＊)，证实了该模型的稳定性和响应性(图1)。
0.01％的来自实施例1的测试溶液的存在也显示出对黑素生成的刺激作用。实际上，黑素的量增加了363％＊＊。
实施例3:黑素产生的评价：离体灰发毛囊
组织样品
在获得知情同意和道德批准后(University of Muenster，n.2015-602-f-S)，显微分割的毛囊(HF)得自枕骨健康的人毛囊单位皮肤，其得自进行毛发移植手术的健康女性供体(35岁；供体1)或得自男性供体(53岁；供体2)的头皮活检物。
毛囊器官培养
将显微分割的人毛发生长初期VI头皮HF(分别为60和26HF/实验)在37℃与5％CO2在William’s E培养基的最小培养基(Gibco，Life Technologies)中培养，该培养基补充有2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、10ng/mL氢化可的松(Sigma-Aldrich)，10μg/mL胰岛素(Sigma-Aldrich)和1％青霉素/链霉素混合物(Gibco)以构成Williams完全培养基(WCM；J CellSci.1990年11月；97(Pt 3)：463-71.Human hair growth in vitro.Philpott MP1，GreenMR，Kealey T；Exp Dermatol.2010Mar；19(3)：305-12.Methods in hair research：how toobjectively distinguish between anagen and catagen in human hair follicleorgan culture.Kloepper JE1，Sugawara K，Al-Nuaimi Y，Gáspár E，van Beek N，Paus R；Exp Dermatol.2015年12月；24(12)：903-11.Human hair follicle organ culture：theory，application and perspectives.Langan EA，Philpott MP，Kloepper JE，PausR)。24小时后，用新鲜培养基替代该培养基，所述新鲜培养基包含WCM(媒介物)或用WCM稀释的1％终浓度的测试溶液。每个实验组培养了11个“灰色”(由低色素沉着定义)的毛发生长初期VI HF。将HF总计共培养3天。
冷冻毛囊处理
将冷冻样品用低温恒温器(CM3050S，Leica Biosystems)切片，并收集6μm切片。谨慎地定向HF，以获得完整的毛囊切片和开放的真皮乳头。收集毛囊的连续切片，并将载玻片保存在-80℃。
Masson Fontana组织化学染色
为了评价黑素作为HF色素沉着的标志物，按照上述描述对冷冻载玻片进行MassonFontana(MF)染色(Exp Dermatol.2010年3月；19(3)：305-12.Methods in hair research：how to objectively distinguish between anagen and catagen in human hairfollicle organ culture.Kloepper JE1，Sugawara K，Al-Nuaimi Y，Gáspár E，van BeekN，Paus R)。简言之，将黑素用硝酸银(Caesar&Loretz，Hilden，Germany)基于氨的溶液染色，并用5％硫代硫酸钠水溶液(Merck Millipore，Darmstadt，Germany)显影。
定量(免疫-)组织形态测定
使用Keyence Biozero显微镜8100和9000以200x的原始放大倍数拍摄照片。
毛发生长初期VI毛囊中的黑素含量
使用ImageJ软件(Rasband，W.S.，ImageJ，U.S.National Institutes of Health，Bethesda，Maryland，USA，https://imagej.nih.gov/ij/)，在Auber线上方测量了三个100x175或113x159像素区域，以分别评价毛发生长初期HF中供体1或2的色素沉着强度。
数据管理
将所有数据均表示为平均值或平均值±SEM的倍数变化。用Shapiro-Wilk正态性检验来检验高斯分布。通过供体1和2的汇总数据的双侧Grubbs检验对异常值进行分析。除去明显的异常值，然后使用GraphPad Prism 6(GraphPad软件)将每个测试组的结果与媒介物比较的斯氏t检验进行统计学分析。p值<0.05被认为具有统计学显著性(＊)。
结果
通过Fontana Masson染色定量评价黑素产生的诱导。
正如在图2和图3可以观察到的，来自实施例1的测试溶液能够诱导灰色毛囊中的黑素生成，并刺激黑素生成15％(p<0.05)。
这些结果表明，本发明的护发活性剂不仅能够刺激黑素细胞中的黑素生成，而且还能够刺激变灰头发毛囊中的黑素生成。
实施例4:完整离体头皮中的转录组学分析
皮肤外植体培养
该测试对皮肤外植体
Figure BDA0003041530580000161
进行，
Figure BDA0003041530580000162
是一种全层皮肤活检组织，其中包埋有坚实而营养丰富的基质，而其表皮表面则保持与空气接触。皮肤活检物牢固地包埋入基质中，从而防止了局部应用制剂的任何侧向扩散。
本研究对来自3个供体的举升外植体(lift explant)进行，其中来自同一供体的样品之间存在足够的毛囊和相等的数量：
-供体1：66岁的白种女性，其具有18个未处理的毛囊，19个用于氧化处理的毛囊和19个用于使用
Figure BDA0003041530580000163
中1％来自实施例1的测试溶液氧化处理的毛囊。
-供体2：58岁的白种女性，其具有10个未处理的毛囊，10个用于氧化处理的毛囊和9个用于使用
Figure BDA0003041530580000164
中1％来自实施例1的测试溶液氧化处理的毛囊。
-供体3：64岁的白种女性，其具有30个未处理的毛囊，30个用于氧化处理的毛囊和31个用于使用
Figure BDA0003041530580000171
中1％来自实施例1的测试溶液氧化处理的毛囊。
Figure BDA0003041530580000172
由交联烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇的丙烯酸组成。
产品评价和研究设计
本研究对3个供体进行(每种条件1个外植体)。
通过在反应1h期间添加9mg的次黄嘌呤+10个单位的黄嘌呤氧化酶，每天一次，将氧化性应激施加3天，以在皮肤表面产生游离的O2˙ˉ自由基。
-外植体+氧化性应激+安慰剂
Figure BDA0003041530580000173
48h
-外植体+氧化性应激+1％来自实施例1的测试溶液48h
处理后，通过显微外科手术去除每个外植体的真皮，使基因定量集中在表皮细胞上。
分析方法
使用根据
Figure BDA0003041530580000175
的方案的qPCR微流体技术(BMC Genomics.2011Mar 9；12:144.Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidicsdynamic arrays.Jang JS1，Simon VA，Feddersen RM，Rakhshan F，Schultz DA，ZschunkeMA，Lingle WL，Kolbert CP，Jen J)。微流体技术来自跨越纳米技术和通过q-PCR的基因分析的世界。系统小型化导致了芯片的开发，该芯片目前允许分析48个条件与48个基因。
目标基因覆盖下列功能：
-毛发生理学
-抗氧化剂活性
-色素沉着
将皮肤外植体收集在特定的裂解溶液中以提取mRNA。将裂解物转移到板上以纯化mRNA。此后，使用逆转录系统。根据
Figure BDA0003041530580000174
方案，启动48x48芯片制备的特定阶段。用芯片中使用的引物进行预扩增步骤。使预扩增的cDNA/PCR混合物和引物沉积在芯片上。由IFC控制器进行混合物共混，然后将芯片放入BioMarkTM系统中以进行实时PCR。
为了证实激活或抑制作用，将这些值与仅用
Figure BDA0003041530580000181
处理的对照外植体进行比较。将结果表示为相对表达率。
结果
在转录组水平上研究了氧化性应激的影响。用黄嘌呤和次黄嘌呤的混合物反复刺激头皮，以模仿毛囊在人类生命中毛囊经历的氧化性应激。然后，将测试溶液施加48小时作为根治处理。
图4中显示的结果显示了与氧化性应激对照相比的相对表达的差异。
发现来自实施例1的测试溶液对保持黑素含量中的重要的各种生物学功能产生了积极的反应。
实际上，发现来自实施例1的测试溶液刺激牵涉黑素小体生物来源和转运的蛋白质表达，例如AP3B1(+37.8％#)、CTNS(+130.4％＊＊＊)、HPS5(+105.14＊＊)、KRT5(+58.7％＊)和MYO5A(+55.07％＊＊)。
还发现刺激牵涉黑素合成调节的主要基因的表达，例如EDN1(+165.56％＊＊＊)、MC1R(+72.64％#)、MITF(+80.51％＊)和POMC(+130.51％＊＊)。
此外，来自实施例1的测试溶液对牵涉更新和自体吞噬的基因表达具有影响，例如FST(150.95％＊＊)、KRT19(+119.28％＊＊)和MAP1LC3A(+73.47％#)。
最终，来自实施例1的测试溶液在不同水平上诱导对参与抗氧化剂反应的基因表达，例如HMOX1(+110.47％＊＊)、GLRX(+37.47％＊)、GSS(+39.70％＊＊)、MGST1(+118.63％＊＊)和NRF2(+30.41％#)。
实施例5:氧化性应激对显微分割的毛囊的影响评价
显微分割和毛干伸长
从头皮上分割毛发生长初期VI人体毛囊(HF)(供体：女，1962年出生)。在预培养18小时后选择所用的HF。在选择过程中评价以下参数：生长速率(>0.18mm/18小时)，形态(无营养不良迹象)。
从第1天开始，在第0天进行选择后，将测试化合物溶解在培养基中，并将HF培养至计划的终点。对于每个读出的参数，每次处理使用十二个毛囊。每隔一天更新一次培养基。
ROS评价
选择后，将HF与溶解在William’s E培养基中的来自实施例1的标准溶液一起温育1小时。此后，将HF在二乙酸二氯荧光素酯(DCFH-DA)存在下培养30min，该二乙酸二氯荧光素酯(DCFH-DA)探针与ROS反应以发出荧光。在DCFH-DA温育后，将HF用PBS冲洗并与氢过氧化枯烯在50μM(氧化刺激物)下温育1小时。在实验阶段结束时，收获HF，冷冻固定并在冷冻切片机上切割，以进行随后的图像采集和切片内荧光的图像分析。通过图像采集和相关分析(即每种处理12张图像)处理每种HF的载玻片。
NKI/Beteb评价
在冷冻切片的NKI/beteb-DAPI双重免疫染色后，获得了总的黑素细胞定量。NKI/beteb抗体(Monosan的#MON7006-1)识别存在于所有黑素细胞(即活跃的黑素细胞和黑素母细胞)中的(前)黑素小体抗原。
在免疫染色的切片上，进行图像分析以定量每个毛囊内的NKI-beteb阳性细胞的数量。将获得的值相对于所考虑区域的单元总数校准。
图像和统计学分析
使用ImageJ软件(NIH，USA)进行图像分析。
所有定量数据均以每种处理方法的平均值评分、标准偏差和平均值的标准误差的形式进行汇总。
组间的差异通过具有置换检验的一种方式ANOVA方差分析进行评价，然后进行使用并排的Tukey和t-检验。
结果：来自实施例1的标准溶液在显微分割的毛囊中对氧化性应激的限制
以50μM氢过氧化枯烯处理代表的氧化性应激导致ROS产生显著增加(与未处理条件相比，+256％＊＊)。用来自实施例1的标准溶液进行的预处理使ROS的产生显著降低了53％。因此，与过氧化枯烯对照相比，该降低具有显著性，p<0.01，表明该活性物质具有预防作用(图5)。
有代表性的图如图6中所示。
结果：氧化性应激对显微分割的毛囊中的黑素细胞的影响
观察到与未处理的情况相比，氢过氧化枯烯将黑素细胞的数量显著减少了78％＊＊。当用来自实施例1的标准溶液处理时，氧化性应激诱导黑素细胞略有减少，但是活性物质的存在显著减轻了其有害作用。实际上，与氢过氧化枯烯对照相比，来自实施例1的标准溶液使NKI/beteb阳性细胞的百分比增加了+189％＊＊，证实了对毛囊黑素细胞和黑素母细胞保护的重要影响(图7)。
有代表性的照片如图8中所示。
实施例6:临床研究
引言
为了证明含有本发明的护发活性剂的洗剂相对于安慰剂洗剂的体内功效，进行了两种临床评价方法：
-使用计分方法减少白发比例
-使用白发密度(毛发数量/cm2)的计数方法减少白发比例。
所用组合物的描述
包含1％的本发明的护发活性剂的洗发剂:
水，甘油/乙酰基酪氨酸/偏亚硫酸氢钠/LARIX EUROPAE木材提取物/甘油/氯化锌/表棓儿茶素棓基葡糖苷，苯甲酸钠，柠檬酸，柠檬酸钠，PPG-26BUTETH-26，PEG-40氢化蓖麻油，AQUA/水，香精，丁基苯基，甲基丙醛，D-苧烯，α-异甲基紫罗兰酮。
安慰剂洗发剂：
水，苯甲酸钠，柠檬酸，柠檬酸钠，PPG-26BUTETH-26，PEG-40氢化蓖麻油，AQUA/水，香精，丁基苯基，甲基丙醛，D-苧烯，α-异甲基紫罗兰酮
小组和研究条件
对44名白发的白人男性志愿者(18岁及以上)进行了双盲、个体间和安慰剂对照的临床评价。
第一组的22位志愿者测试了安慰剂洗发剂，第二组的22位志愿者测试了包含1％本发明的护发活性剂的洗发剂。
通过每天一次在头皮上按摩处理，持续四个月。
结果：白发比例的减少(以％计的评分)
在测试的第一天和每天施用该产品4个月后，使用Nikon D7100与Canfield
Figure BDA0003041530580000211
系统组合拍摄头皮照片。根据白发的位置定义头发的分开区域。进行盲式评分以评价图片中的白发比例。
结果如下表中所示：
Figure BDA0003041530580000212
施用4个月后，观察到白发比例显著降低了-17％，即比安慰剂多2.1倍。
目视明显减少了白发的比例，其中对于最佳应答者，白发减少了-50％(图9)。
在结果：白发密度降低(数量/cm2)
处理前，在刮剃1cm2的头皮区域后两天拍摄图像。所使用的仪器为Nikon D7100数码相机与配备接触镜的Canfield
Figure BDA0003041530580000213
系统的组合。接触镜可以使头皮上的毛发变平。
然后使用Photoshop的专用工具在图像上限定的0.7cm2测试区域(1x0.7cm)上进行白发计数。计数区域内具有白色根的所有毛发。
在所有评价时间内，研究区域的大小和位置均相同。如果发生偏移，则调整测试区域的位置。
在结果如下表中所示：
Figure BDA0003041530580000221
含有1％本发明的护发活性剂的洗发剂可显著减少白发的数量/cm2，即比安慰剂多2.8倍。
4个月后，白发的密度明显降低，其中最佳响应者的白发减少量为-55.7/cm2(图10)。
实施例7:通过体外共培养模型的黑素产生评价：对比
引言
本研究的目的在于比较包含紫杉叶素葡糖苷和N-乙酰基酪氨酸的本发明的护发活性剂与L-酪氨酸(阳性参比物)、紫杉叶素葡糖苷和紫杉叶素葡糖苷和L-酪氨酸混合物的作用。用于该比较的模型是正常人表皮角质形成细胞(NHEK)和正常人黑素细胞(NHM)的共培养物。
细胞培养
用从人皮肤活检物中分离的原代细胞进行细胞培养。
将正常人角质形成细胞(NHK)以每孔60000个细胞接种在预先涂覆胶原蛋白I的6-孔板中。4小时后，将正常人黑素细胞(NHM)以每孔60000个细胞接种在相同的6-孔中。将细胞在完全培养基(补充有HKGS的
Figure BDA0003041530580000222
＝人角质形成细胞生长补充剂)中温育48小时。
培养48小时后，用下列组合物刺激细胞5天:
-L-酪氨酸450μg/mL(Sigma)
-紫杉叶素葡糖苷0.13μg/mL
-紫杉叶素葡糖苷0.13μg/mL+N-乙酰基酪氨酸15μg/mL(类似于实施例1)
-紫杉叶素葡糖苷0.13μg/mL+L-酪氨酸15μg/mL(Sigma)
将所述组合物在不含补充剂
Figure BDA0003041530580000231
的基础培养基中稀释。每2天更新一次处理。
黑素提取和剂量
处理5天后，用PBS冲洗细胞。然后，在每个孔中加入200μL 0.5NNaOH溶液。将细胞裂解液收集在带固定盖的1.5mL微管中。平行地，制备标准范围的黑素(100至0μg/mL)。将样品和标准范围的微管在干浴中于80℃加热1小时。加热后，将100μL的每个样品转移到96孔-板中。
在405nm处测量光密度以确定黑素含量。
统计学分析
全部实验均按照至少一式三份进行。
进行了Shapiro-Wilk正态性检验，以评价数据是否遵循高斯定律。
如果不具有显著性，则使用统计参数检验(ANOVA，然后是Dunnett多重比较检验)对数据进行评价。
如果具有显著性，则使用统计非参数检验(Kruskall-Wallis的ANOVA，然后水Mann-Whitney U检验)评价数据。
结果
结果如图11中所示。
与未处理的条件相比，阳性参比物(450μg/ml的L-酪氨酸)诱导的黑素合成+35％(p<0.001)。这证实了共培养模型有响应并且能够产生黑素。
然而，单独的紫杉叶素葡糖苷不能诱导黑素合成。
用紫杉叶素葡糖苷和N-乙酰基酪氨酸的组合处理导致与未处理的条件相比黑素含量增加+18％(p<0.001)。
另一方面，紫杉叶素葡糖苷和L-酪氨酸的组合仅导致黑素含量适度和不显著地增加。
用紫杉叶素葡糖苷和N-乙酰基酪氨酸刺激与紫杉叶素葡糖苷和L-酪氨酸刺激刺激之间也存在显著性差异。

Claims (11)

1.护发活性剂，包含紫杉叶素葡糖苷和N-乙酰基酪氨酸。
2.权利要求1的护发活性剂，其中至少部分紫杉叶素葡糖苷为紫杉叶素α-D-葡糖苷。
3.权利要求1或2的护发活性剂，还包含紫杉叶素。
4.权利要求3的护发活性剂，其中紫杉叶素葡糖苷与紫杉叶素的重量比为90:10至40:60，更优选70:30至50:50，且最优选约60:40。
5.权利要求1-4中任一项的护发活性剂，还包含甘氨酸和/或表棓儿茶素棓酸酯和/或表棓儿茶素棓基葡糖苷。
6.权利要求1-5中任一项的护发活性剂，包含0.01-0.50wt％，更优选0.10-0.25wt％，且最优选0.08-0.12wt％的紫杉叶素葡糖苷。
7.权利要求1-6中任一项的护发活性剂，包含1.0-30wt％，更优选10-20wt％，且最优选13.5-16.5wt％的N-乙酰基酪氨酸。
8.权利要求1-7中任一项的护发活性剂，其中紫杉叶素葡糖苷与N-乙酰基酪氨酸的重量比为1:5’100至1:2，更优选1:340至1:70，且最优选1:200至1:150。
9.护发组合物，包含权利要求1-8中任一项的护发活性剂和适合的载体。
10.权利要求1-9中任一项的护发活性剂的非治疗用途，用于刺激毛囊干细胞的增殖、刺激活性黑素细胞产生、刺激黑素生成、刺激毛发色素沉着的恢复、再激活灰发中的黑素产生、激活毛囊中的抗氧化剂防御、保护黑素细胞免受氧化性应激、毛发再次色素沉着和/或降低白发或灰发的比例和/或密度。
11.刺激毛囊干细胞的增殖、刺激活性黑素细胞产生、刺激黑素生成、刺激毛发色素沉着的恢复、再激活灰发中的黑素产生、激活毛囊中的抗氧化剂防御、保护黑素细胞免受氧化性应激、毛发再次色素沉着和/或降低白发或灰发的比例和/或密度的方法，所述方法包括对人体毛发局部施用权利要求1-8中任一项的护发活性剂的步骤。
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