CN112920095B - 新型聚集诱导发光内质网荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型聚集诱导发光内质网荧光探针及其制备方法与应用，荧光探针的化学结构通式为：
Figure DDA0002922998380000011
本发明的荧光探针分子为具有新型D‑π‑A结构的聚集诱导发光内质网荧光探针，该荧光探针以不同取代的三苯胺结构单元作为分子体系中的电子给体，以噻吩环及双建为π共轭桥，氰基结构单元作为电子受体，N‑(环己基氨甲酰基)苯磺酰胺作为内质网靶向基团来构建具有聚集诱导发光性质的内质网荧光探针，合成路线简单，反应条件温和，产率高，成本低；聚集诱导发光荧光探针通过N‑(环己基氨甲酰基)苯磺酰胺与内质网表明敏感性钾通道结合实现内质网靶向，细胞毒性小，光稳定性高，内质网定位特异性好，可用于活细胞实时动态高分辨荧光成像。

Description

新型聚集诱导发光内质网荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及荧光分子探针技术领域，具体涉及新型聚集诱导发光内质网荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
内质网是真核细胞中非常重要的一种细胞器，内质网参与细胞的多个生理过程，例如：蛋白质的后修饰与加工，磷脂、胆固醇等脂类物质的合成与代谢，钙离子的储存，新生肽链的折叠、组装与运输等。内质网腔内错误折叠、钙离子平衡紊乱以及病毒感染等内外因素会诱导产生内质网应激反应，从而诱发糖尿病、神经退行性疾病和癌症等多种疾病。
目前商用内质网荧光探针主要是ER-Tracker系列，该类荧光探针存在合成步骤繁琐、价格昂贵、荧光背景干扰大、染色操作复杂、容易在细胞质中团聚以及无法用于活细胞长时间成像等。并且由于ER-tracker系列为ACQ染料，在聚集状态下容易发生荧光淬灭，极大地限制了其在生物成像领域的应用。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种新型聚集诱导发光内质网荧光探针及其制备方法与应用，旨在解决现有内质网荧光探针合成步骤繁琐、价格昂贵、荧光背景干扰大、染色操作复杂，在细胞质中容易团聚和发生荧光淬灭，无法用于活细胞长时间成像的问题。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：一种新型聚集诱导发光内质网荧光探针，其中，所述荧光探针的化学结构通式为：
Figure BDA0002922998360000021
所述的新型聚集诱导发光内质网荧光探针，其中，所述荧光探针的化学结构通式中，R1为氢、甲基和甲氧基中的一种，R2为氢、甲基和甲氧基中的一种。
一种所述的新型聚集诱导发光内质网荧光探针的制备方法，其中，包括：
将化合物A、4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯、碳酸钾与四三苯基膦钯依次加入四氢呋喃和水的混合溶剂中，在惰性气体保护下进行加热搅拌，得到聚集诱导发光高尔基体荧光探针；其中，化合物A的化学结构通式为：
Figure BDA0002922998360000022
将所述聚集诱导发光高尔基体荧光探针与氯化亚铜溶解于N,N-二甲基甲酰胺溶液中，得到混合溶液；
在惰性气体保护下，将环己基异氰酸酯滴加到所述混合溶液中，滴加完成后进行室温搅拌，得到新型聚集诱导发光内质网荧光探针。
所述的新型聚集诱导发光内质网荧光探针的制备方法，其中，所述聚集诱导发光高尔基体荧光探针的化学结构通式为：
Figure BDA0002922998360000031
所述的新型聚集诱导发光内质网荧光探针的制备方法，其中，所述将化合物A、4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯、碳酸钾与四三苯基膦钯依次加入四氢呋喃和水的混合溶液中，在惰性气体保护下进行加热搅拌，得到聚集诱导发光高尔基体荧光探针的步骤包括：
将化合物A、4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯、碳酸钾与四三苯基膦钯依次加入四氢呋喃和水的混合溶剂中，在惰性气体保护下进行搅拌回流，得到反应溶液；
对所述反应溶液进行萃取并合并有机相后，进行干燥及减压浓缩处理，得到粗产物A；
以石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法对所述粗产物A进行纯化，得到聚集诱导发光高尔基体荧光探针。
所述的新型聚集诱导发光内质网荧光探针的制备方法，其中，所述聚集诱导发光高尔基体荧光探针与所述氯化亚铜的质量比为50～55：1。
所述的新型聚集诱导发光内质网荧光探针的制备方法，其中，所述聚集诱导发光高尔基体荧光探针与所述环己基异氰酸酯的质量比为2.5～3：1。
所述的新型聚集诱导发光内质网荧光探针的制备方法，其中，所述在惰性气体保护下，将环己基异氰酸酯滴加到所述混合溶液中，滴加完成后进行室温搅拌，得到新型聚集诱导发光内质网荧光探针的步骤包括：
在惰性气体保护下，将环己基异氰酸酯滴加到所述混合溶液中，滴加完成后在室温下搅拌11～13h，并对搅拌后的反应溶液进行减压浓缩，得到粗产物B；
以二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法对所述粗产物B进行纯化，得到新型聚集诱导发光内质网荧光探针。
所述的新型聚集诱导发光内质网荧光探针的制备方法，其中，所述洗脱剂中二氯甲烷与甲醇的体积比为100：1～20：1。
一种所述的新型聚集诱导发光内质网荧光探针在内质网检测中的应用。
有益效果：本发明的荧光探针分子为具有新型D-π-A结构的聚集诱导发光内质网荧光探针，该荧光探针以不同取代的三苯胺结构单元作为分子体系中的电子给体，以噻吩环及双建为π共轭桥，氰基结构单元作为电子受体，N-(环己基氨甲酰基)苯磺酰胺作为内质网靶向基团来构建具有聚集诱导发光性质的新型内质网荧光探针，合成路线简单，反应条件温和，产率高，成本低；聚集诱导发光荧光探针通过N-(环己基氨甲酰基)苯磺酰胺与内质网表明敏感性钾通道结合实现内质网靶向，细胞毒性小，光稳定性高，内质网定位特异性好，可用于活细胞实时动态高分辨荧光成像。
附图说明
图1是本发明实施例提供的新型聚集诱导发光内质网荧光探针的合成路线图；
图2是本发明实施例提供的聚集荧光淬灭内质网荧光探针的合成路线图；
图3是本发明实施例1中制备的荧光探针AIE-Golgi在二甲基亚砜中的核磁共振氢谱图；
图4是本发明实施例1中制备的荧光探针AIE-Golgi在二甲基亚砜中的核磁共振碳谱图；
图5是本发明实施例1中制备的荧光探针AIE-ER在二甲基亚砜中的核磁共振氢谱图；
图6是本发明实施例1中制备的荧光探针AIE-ER在二甲基亚砜中的核磁共振碳谱图；
图7是本发明实施例2中制备的荧光探针ACQ-Golgi在二甲基亚砜中的核磁共振氢谱图；
图8是本发明实施例2中制备的荧光探针ACQ-Golgi在二甲基亚砜中的核磁共振碳谱图；
图9是本发明实施例2中制备的荧光探针ACQ-ER在二甲基亚砜中的核磁共振氢谱图；
图10是本发明实施例2中制备的荧光探针ACQ-ER在二甲基亚砜中的核磁共振碳谱图；
图11是本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-ER和ACQ-ER在二甲基亚砜中的紫外吸收光谱图；
图12是本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-ER和ACQ-ER固体的荧光发射光谱图；
图13是本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-ER和ACQ-ER在不同比例的四氢呋喃/水的混合溶剂中的荧光发射光谱图；
图14是本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-ER和ACQ-ER在不同比例的四氢呋喃/水的混合溶剂中的最大荧光强度比值图；
图15是本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-ER和ACQ-ER与商业内质网探针(ER-Tracker Red)在Hela细胞内共孵育后的共聚焦荧光成像图；
图16是本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-ER和ACQ-ER对Hela细胞的毒性实验图；
图17是本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-ER和ACQ-ER与商业内质网探针(ER-Tracker Red)在Hela细胞中的光稳定性实验图。
具体实施方式
本发明提供一种新型聚集诱导发光内质网荧光探针及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
内质网是真核细胞中非常重要的一种细胞器，根据内质网膜外表面是否有核糖体附着，通常将内质网分为粗面内质网(rough endoplasmic reticulum，RER)和滑面内质网(smooth endoplasmic reticulum，SER)两种基本类型。内质网参与细胞的多个生理过程，例如：蛋白质的后修饰与加工，磷脂、胆固醇等脂类物质的合成与代谢，钙粒子的储存，新生肽链的折叠、组装与运输等。内质网腔内错误折叠、钙离子平衡紊乱以及病毒感染等内外因素会诱导产生内质网应激反应，从而诱发糖尿病、神经退行性疾病和癌症等多种疾病。
目前商用内质网荧光探针主要是ER-Tracker系列，包括ER-Tracker Red和ER-Tracker Green。该类荧光探针存在合成步骤繁琐、价格昂贵、荧光背景干扰大、染色操作复杂、容易在细胞质中团聚以及无法用于活细胞长时间成像等。并且由于ER-tracker系列为ACQ染料，在聚集状态下容易发生荧光淬灭，极大地限制了其在生物成像领域的应用。
2001年，香港科技大学唐本忠院士首次提出“聚集诱导发光(aggregation-induced emission,AIE)”的新概念，引发了发光材料的革命。不同于传统的有机荧光染料，聚集诱导发光材料在溶液中不发光或者发很弱的荧光，但在聚集状态下发出强烈的荧光，发光效率高，斯托克斯位移大，光稳定性好，检测背景低，并且在检测过程中可以实现荧光从无到有的显著变化，在长时生物示踪、活体成像、脑部血管3D成像和光声、光动力治疗等方面具有更广泛的应用。因此，开发聚集诱导发光性质的内质网荧光探针，从而实现内质网形态和分布的实时动态成像，对揭示相关疾病的发生和发展机制具有十分重要的意义。
为了解决上述问题，本发明实施例提供了一种新型聚集诱导发光内质网荧光探针，其中，所述荧光探针的化学结构通式为：
Figure BDA0002922998360000081
其中，R1为氢、甲基和甲氧基中的一种，R2为氢、甲基和甲氧基中的一种。由上述荧光探针的化学结构通式可以看出，本发明实施例提供的荧光探针为具有新型D-π-A结构的聚集诱导发光内质网荧光探针，该荧光探针以不同取代的三苯胺结构单元作为分子体系中的电子给体(D,Donor)及转子，以噻吩环及双键为π共轭桥(π-bridge)，氨基结构单元作为电子受体(A,Acceptor)，N-(环己基氨甲酰基)苯磺酰胺作为内质网靶向基团。不同于商用内质网荧光探针，本发明实施例提供的聚集诱导发光内质网荧光探针通过N-(环己基氨甲酰基)苯磺酰胺与内质网表明ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)结合实现内质网靶向，具有细胞毒性小、光稳定性高、内质网定位特异性好等显著优势。
本发明还提供了一种上述新型聚集诱导发光内质网荧光探针的制备方法，包括步骤：
S1、将化合物A、4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯、碳酸钾与四三苯基膦钯依次加入四氢呋喃和水的混合溶剂中，在惰性气体保护下进行加热搅拌，得到聚集诱导发光高尔基体荧光探针。
考虑到现有商用内质网荧光探针合成步骤繁琐、价格昂贵、内质网定位特异性不高，在细胞质中容易团聚和发生荧光淬灭，而聚集诱导发光材料普遍发光效率高，斯托克斯位移大，光稳定性好，检测背景低，并且在检测过程中可以实现荧光从无到有的显著变化。本实施例中以化合物A和4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯为原料制备聚集诱导发光高尔基体荧光探针，然后以聚集诱导发光高尔基体荧光探针为原料制备聚集诱导发光内质网荧光探针，其中，化合物A的化学结构通式为：
Figure BDA0002922998360000091
聚集诱导发光高尔基体荧光探针的化学结构通式为：
Figure BDA0002922998360000092
其中，R1为氢、甲基和甲氧基中的一种，R2为氢、甲基和甲氧基中的一种。由上述聚集诱导发光高尔基体荧光探针的化学结构通式可以看出，聚集诱导发光高尔基体荧光探针中的不同取代的三苯胺结构单元可以作为分子体系中的电子给体(D,Donor)及转子，噻吩环及双建可以作为分子体系中的π共轭桥(π-bridge)，氰基结构单元可以作为电子受体(A,Acceptor)，通过聚集诱导发光高尔基体荧光探针可以合成具有新型D-π-A结构的聚集诱导发光内质网荧光探针。
在一具体实施方式中，步骤S1具体包括：
S11、将化合物A、4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯、碳酸钾与四三苯基膦钯依次加入四氢呋喃和水的混合溶剂中，在惰性气体保护下进行搅拌回流，得到反应溶液；
S12、对所述反应溶液进行萃取并合并有机相后，进行干燥及减压浓缩处理，得到粗产物A；
S13、以石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法对所述粗产物A进行纯化，得到聚集诱导发光高尔基体荧光探针。
如图1所示，为本发明实施例中新型聚集诱导发光内质网荧光探针的合成路线图，本实施例中首先将化合物A、4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯、碳酸钾与四三苯基膦钯依次加入四氢呋喃和水的混合溶液中，在惰性气体保护下进行搅拌回流，在搅拌回流过程中，化合物A和4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯在碳酸钾与四三苯基膦钯的催化作用下发生反应，化合物A脱去卤素基团，4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯脱去硼酸频哪醇酯基团，得到聚集诱导发光高尔基体荧光探针。
在一具体实施方式中，所述搅拌回流的温度为70～90℃，所述搅拌回流的时间为11～13h，化合物A与4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯的质量比为1.3～1.4：1，混合溶液中四氢呋喃与水的体积比为3～5：1，碳酸钾与四三苯基膦钯的质量比为4.5～5：1，在此反应条件和反应物比例下能够制备出性能稳定的聚集诱导发光高尔基体荧光探针。
考虑到搅拌回流结束后得到的反应溶液中含有溶剂、催化剂等，本实施例中反应完成后，首先利用二氯甲烷对反应溶液进行萃取，并对萃取后的反应溶液中的有机相进行合并，然后使用无水硫酸钠对合并有机相后的反应溶液进行干燥，并对干燥后的反应溶液进行减压浓缩处理，得到粗产物A。
考虑到粗产物A中除了反应生成的新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针外，还含有萃取无法去除的杂质物如反应原料等，本实施例中获得粗产物后，以石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法对所述粗产物进行纯化，得到纯净的新型聚集诱导发光高尔基体荧光探针。其中，所述洗脱剂中石油醚与乙酸乙酯的体积比为100:1～20：1。
S2、将所述聚集诱导发光高尔基体荧光探针与氯化亚铜溶解于N,N-二甲基甲酰胺溶液中，得到混合溶液。
为了得到内质网靶向基团N-(环己基氨甲酰基)苯磺酰胺，本实施例中得到聚集诱导发光高尔基体荧光探针后，将聚集诱导发光高尔基体荧光探针与氯化亚铜溶解于N,N-二甲基甲酰胺溶液中，得到聚集诱导发光高尔基体荧光探针与氯化亚铜的混合溶液，以便后续步骤中合成带有N-(环己基氨甲酰基)苯磺酰胺基团的新型聚集诱导发光内质网荧光探针。
S3、在惰性气体保护下，将环己基异氰酸酯滴加到所述混合溶液中，滴加完成后进行室温搅拌，得到新型聚集诱导发光内质网荧光探针。
具体地，得到聚集诱导发光高尔基体荧光探针与氯化亚铜的混合溶液后，本实施例中在惰性气体保护下，将环己基异氰酸酯滴加到所述混合溶液中，滴加完成后进行室温搅拌，在室温搅拌过程中，聚集诱导发光高尔基体荧光探针和环己基异氰酸酯在氯化亚铜的催化作用下发生反应，得到带有N-(环己基氨甲酰基)苯磺酰胺基团的新型聚集诱导发光内质网荧光探针。
在一具体实施方式中，步骤S3具体包括：
S31、在惰性气体保护下，将环己基异氰酸酯滴加到所述混合溶液中，滴加完成后在室温下搅拌11～13h，并对搅拌后的反应溶液进行减压浓缩，得到粗产物B；
S32、以二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法对所述粗产物B进行纯化，得到新型聚集诱导发光内质网荧光探针。
在制备新型聚集诱导发光内质网荧光探针过程中，本实施例中首先在惰性气体保护下，将环己基异氰酸酯滴加到聚集诱导发光高尔基体荧光探针与氯化亚铜的混合溶液中，滴加完成后在室温下搅拌11～13h，待反应完成后，对反应溶液进行减压浓缩直接去除溶剂，得到粗产物B；考虑到粗产物B中除含有新型聚集诱导发光内质网荧光探针外，还含有未反应完成的原料和催化剂等，在得到粗产物B后，以二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法对粗产物B进行纯化，得到纯度较高的新型聚集诱导发光内质网荧光探针。其中，所述洗脱剂中二氯甲烷与甲醇的体积比为100：1～20：1。
本发明还提供一种上述所述新型聚集诱导发光内质网荧光探针在内质网检测中的应用。本发明制备出的新型聚集诱导发光内质网荧光探针具有细胞毒性小、光稳定性高、内质网定位特异性好等显著优势，对揭示内质网相关疾病的发病机制，推动内质网相关疾病的早期诊断和后期治疗具有非常重要的研究意义。
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。
实施例1
(1)如图1所示，在N2的保护下，将100mg化合物A、75mg 4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯、122mg碳酸钾与25mg四三苯基膦钯依次加入4mL四氢呋喃和1ml水的混合溶剂中，在80℃下搅拌回流12h，待反应完全后通过二氯甲烷萃取反应溶液，合并萃取后的反应溶液中的有机相并用无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得到粗产物A；以石油醚/乙酸乙酯(100:1→20:1)作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法对粗产物A进行纯化，得到85mg黄色固体粉末状产物，即聚集诱导发光高尔基体荧光探针(AIE-Golgi)，其中，AIE-Golgi的产率为73％。
(2)如图1所示，在N2的保护下，将53mg聚集诱导发光高尔基体荧光探针、1.0mg氯化亚铜溶解于2ml N,N-二甲基甲酰胺溶液中，得到混合溶液；然后将19mg环己基异氰酸酯于室温下缓慢滴加入上述混合溶液中，滴完后室温下连续搅拌反应12h，待反应完全后减压浓缩直接除去溶剂，所得粗产物B用二氯甲烷/甲醇(100:1→20:1)作为洗脱剂通过硅胶柱色谱法纯化，得到58mg黄色固体粉末状产物，即聚集诱导发光内质网荧光探针(AIE-ER)，其中，AIE-ER的产率为89％。
实施例2
(1)如图2所示，在N2的保护下，将60mg化合物B、50mg 4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯、82mg碳酸钾与17mg四三苯基膦钯依次加入4mL四氢呋喃和1ml水的混合溶剂中，在80℃下搅拌回流12h，待反应完全后通过二氯甲烷萃取反应溶液，合并萃取后的反应溶液中的有机相并用无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得到粗产物C；以二氯甲烷/甲醇(100:1→20:1)作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法对粗产物C进行纯化，得到66mg黄色固体粉末状产物，即聚集荧光淬灭高尔基体荧光探针(ACQ-Golgi)，其中，ACQ-Golgi的产率为92％。
(2)如图2所示，在N2的保护下，将49mg聚集荧光淬灭高尔基体荧光探针、1.0mg氯化亚铜溶解于2ml N,N-二甲基甲酰胺溶液中，得到混合溶液；然后将19mg环己基异氰酸酯于室温下缓慢滴加入上述混合溶液中，滴完后室温下连续搅拌反应12h，待反应完全后减压浓缩直接除去溶剂，所得粗产物D用二氯甲烷/甲醇(100:1→20:1)作为洗脱剂通过硅胶柱色谱法纯化，得到53mg黄色固体粉末状产物，即聚集荧光淬灭内质网荧光探针(ACQ-ER)，其中，ACQ-ER的产率为87％。
实施例3
将Hela细胞接种在玻璃底共聚焦细胞培养皿(NEST Biotechnology Co.Ltd)中，培养24小时，将1uM商业内质网探针(ER-Tracker Red)与细胞在培养基中于37℃孵育30分钟，然后分别将实施例1和实施例2中制备的AIE-ER和ACQ-ER加入培养基中于37℃孵育30分钟，孵育后细胞用PBS生理盐水洗涤三次，随后加入1ml无血清的培养基待成像用。荧光成像通过CLSM,ZEISS-LSM880共聚焦激光扫描显微镜观察。通过405nm蓝紫色泵浦激光器激发，收集450-560nm波段的探针AIE-ER和ACQ-ER的荧光，通过543nm橙红色泵浦激光器激发，收集560-680nm波段的商业内质网探针的荧光，使用100x油物镜获取图像(800×800像素)并由Olympus FV31S-SW viewer软件处理。
图3和图4为本发明实施例1制备的荧光探针AIE-Golgi在二甲基亚砜中的核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图，图5和图6为本发明实施例1制备的荧光探针AIE-ER在二甲基亚砜中的核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图，图7和图8为本发明实施例2制备的荧光探针ACQ-Golgi在二甲基亚砜中的核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图，图9和图10为本发明实施例2制备的荧光探针ACQ-ER在二甲基亚砜中的核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图。从图3～图10可以看出本发明实施例1和实施例2制备的荧光探针AIE-Golgi、AIE-ER、ACQ-Golgi和ACQ-ER的分子结构。
图11为本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-ER和ACQ-ER在二甲基亚砜中的紫外吸收光谱图，图12为本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-ER和ACQ-ER固体的荧光发射光谱图，图13为本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-ER和ACQ-ER在不同比例的四氢呋喃/水的混合溶剂中的荧光发射光谱图。从图11～图13可以看出，本发明实施例1制备的AIE-ER的最大吸收峰在410nm左右，发光峰在550nm左右，本发明实施例2制备的ACQ-ER的最大吸收峰在385nm左右，发光峰在510nm左右，且当混合溶剂体积比达到80％以上时，荧光发射光强明显增强。
图14为本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-ER和ACQ-ER在不同比例的四氢呋喃/水的混合溶剂中的最大荧光强度比值(I/I0)图，从图14可以看出，荧光探针AIE-ER为聚集诱导发光的探针分子，荧光探针ACQ-ER为聚集荧光淬灭的探针分子。
图15为本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-ER和ACQ-ER与商业内质网探针(ER-Tracker Red)在Hela细胞内共孵育后的共聚焦荧光成像图，从图15可以看出，荧光探针AIE-ER与商业内质网探针共定位的皮尔逊系数为0.94，荧光探针ACQ-ER与商业内质网探针共定位的皮尔逊系数为0.85，表明荧光探针AIE-ER具有非常高的内质网定位能力。
图16为本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-ER和ACQ-ER对Hela细胞的毒性实验图，从图16可以看出，AIE-ER探针比ACQ-ER具有更低的细胞毒性。
图17为本发明实施例1和实施例2中制备的荧光探针AIE-ER和ACQ-ER与商业内质网探针(ER-Tracker Red)在Hela细胞中的光稳定性实验图，从图17可以看出AIE-ER探针比ACQ-ER探针具有更好的光稳定性。
综上所述，本发明公开了一种新型聚集诱导发光内质网荧光探针及其制备方法与应用，荧光探针的化学结构通式为：
Figure BDA0002922998360000171
本发明的荧光探针分子为具有新型D-π-A结构的聚集诱导发光内质网荧光探针，该荧光探针以不同取代的三苯胺结构单元作为分子体系中的电子给体，以噻吩环及双建为π共轭桥，氰基结构单元作为电子受体，N-(环己基氨甲酰基)苯磺酰胺作为内质网靶向基团来构建具有聚集诱导发光性质的新型内质网荧光探针，合成路线简单，反应条件温和，产率高，成本低；聚集诱导发光荧光探针通过N-(环己基氨甲酰基)苯磺酰胺与内质网表明敏感性钾通道结合实现内质网靶向，细胞毒性小，光稳定性高，内质网定位特异性好，可用于活细胞实时动态高分辨荧光成像。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种新型聚集诱导发光内质网荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的化学结构通式为：
Figure FDA0003548258800000011
所述荧光探针的化学结构通式中，R1为氢、甲基和甲氧基中的一种，R2为氢、甲基和甲氧基中的一种。
2.一种如权利要求1所述的新型聚集诱导发光内质网荧光探针的制备方法，其特征在于，包括：
将化合物A、4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯、碳酸钾与四三苯基膦钯依次加入四氢呋喃和水的混合溶剂中，在惰性气体保护下进行加热搅拌，得到聚集诱导发光高尔基体荧光探针；其中，化合物A的化学结构通式为：
Figure FDA0003548258800000012
R1为氢、甲基和甲氧基中的一种，R2为氢、甲基和甲氧基中的一种；
将所述聚集诱导发光高尔基体荧光探针与氯化亚铜溶解于N,N-二甲基甲酰胺溶液中，得到混合溶液；
在惰性气体保护下，将环己基异氰酸酯滴加到所述混合溶液中，滴加完成后进行室温搅拌，得到新型聚集诱导发光内质网荧光探针。
3.根据权利要求2所述的新型聚集诱导发光内质网荧光探针的制备方法，其特征在于，所述聚集诱导发光高尔基体荧光探针的化学结构通式为：
Figure FDA0003548258800000021
4.根据权利要求2所述的新型聚集诱导发光内质网荧光探针的制备方法，其特征在于，所述将化合物A、4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯、碳酸钾与四三苯基膦钯依次加入四氢呋喃和水的混合溶液中，在惰性气体保护下进行加热搅拌，得到聚集诱导发光高尔基体荧光探针的步骤包括：
将化合物A、4-氨基磺酰基苯硼酸频哪醇酯、碳酸钾与四三苯基膦钯依次加入四氢呋喃和水的混合溶剂中，在惰性气体保护下进行搅拌回流，得到反应溶液；
对所述反应溶液进行萃取并合并有机相后，进行干燥及减压浓缩处理，得到粗产物A；
以石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法对所述粗产物A进行纯化，得到聚集诱导发光高尔基体荧光探针。
5.根据权利要求2所述的新型聚集诱导发光内质网荧光探针的制备方法，其特征在于，所述聚集诱导发光高尔基体荧光探针与所述氯化亚铜的质量比为50～55：1。
6.根据权利要求2所述的新型聚集诱导发光内质网荧光探针的制备方法，其特征在于，所述聚集诱导发光高尔基体荧光探针与所述环己基异氰酸酯的质量比为2.5～3：1。
7.根据权利要求2所述的新型聚集诱导发光内质网荧光探针的制备方法，其特征在于，所述在惰性气体保护下，将环己基异氰酸酯滴加到所述混合溶液中，滴加完成后进行室温搅拌，得到新型聚集诱导发光内质网荧光探针的步骤包括：
在惰性气体保护下，将环己基异氰酸酯滴加到所述混合溶液中，滴加完成后在室温下搅拌11～13h，并对搅拌后的反应溶液进行减压浓缩，得到粗产物B；
以二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法对所述粗产物B进行纯化，得到新型聚集诱导发光内质网荧光探针。
8.根据权利要求7所述的新型聚集诱导发光内质网荧光探针的制备方法，其特征在于，所述洗脱剂中二氯甲烷与甲醇的体积比为100：1～20：1。
9.一种如权利要求1所述的新型聚集诱导发光内质网荧光探针在内质网检测中的应用。
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